Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Generering av naturliga mördarceller från mänskliga expanderade potentiella stamceller

Published: January 13, 2023 doi: 10.3791/64608
Automatic Translation
1, 2, 2, 2,3, 2,3
1Major in Molecular Biology and Biotechnology, School of Biological Sciences, The University of Hong Kong, 2School of Biomedical Sciences, The University of Hong Kong, 3Centre for Translational Stem Cell Biology

Summary

Detta protokoll visar hur man differentierar CD3−/CD45+CD56+-celler med mild cytotoxicitet från humana expanderade potentiella stamceller (hEPSC) under både 3D- och 2D-odlingsförhållanden. Detta möjliggör rutinmässig fenotypisk validering utan förstörelse av den komplexa mikromiljön.

Abstract

Differentieringen av naturliga mördarceller (NK) från humana pluripotenta stamceller möjliggör forskning om och tillverkning av cellulära produkter av klinisk kvalitet för immunterapi. Här beskrivs ett tvåfasprotokoll som använder ett serumfritt kommersiellt medium och en cocktail av cytokiner (interleukin [IL]-3, IL-7, IL-15, stamcellsfaktor [SCF] och FMS-liknande tyrosinkinas 3-ligand [Ftl3L]) för att differentiera humana expanderade potentiella stamceller (hEPSC) till celler som har NK-cellegenskaper in vitro med både 3-dimensionell (3D) och 2-dimensionell (2D) odlingsteknik. Efter detta protokoll genereras CD3−CD56+ eller CD45+CD56+ NK-celler konsekvent. Vid samodling med tumörmål i 3 timmar uppvisar de differentierade produkterna mild cytotoxicitet jämfört med en IL-2-oberoende permanent cellinje, NK92mi-celler. Protokollet bevarar komplexiteten hos differentieringsmikromiljön genom generering av 3D-strukturer, vilket underlättar studien av de rumsliga relationerna mellan immunceller och deras nischer. Samtidigt möjliggör 2D-odlingssystemet rutinmässig fenotypisk validering av celldifferentiering utan att skada den känsliga differentieringsnischen.

Introduction

Jämfört med konventionella pluripotenta stamceller som mänskliga embryonala stamceller (hESC) och humant inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs) ligger humana expanderade potentiella stamceller (hEPSC) närmare tillståndet för totipotens eftersom de kan differentieras till både extraembryonala och embryonala linjer1. Till exempel kan hEPSC differentieras i trofoblaster1 och äggula sac-liknande celler2. För att uppnå den unika styrkan hos hEPSC: er odlas en enskild blastomeren i ett medium som innehåller flera små molekyler som hämmar härstamningsåtagandesignalering1, vilket kallas EPSC-medium (EPSCM). Odling av hESC och hiPSC i EPSCM expanderar deras tidigare begränsade styrka för att differentiera dem till trofoblastceller1.

Pluripotenta stamceller är ett värdefullt forskningsverktyg för att experimentera med nya genetiska modifieringar. På grund av pluripotenta stamcellers självförnyelse- och differentieringsförmåga kan en transformerad klon av en pluripotent stamcell producera differentierade cellulära produkter som har samma genetiska modifiering på samma plats. Zhu och Kaufman etablerade standarden för NK-celldifferentiering från konventionella pluripotenta stamceller (hESC och hiPSCs)3. Först inducerade de hematopoetiska stamceller (HSC) från en embryoidkropp härrörande från pluripotenta stamceller. Tillsatsen av stamcellsfaktor (SCF), FMS-liknande tyrosinkinas 3-ligand (Ftl3L), interleukin (IL)-7, IL-15 och ett tidigt tillskott av IL-3 förspände HSC: erna att utvecklas till naturliga mördarceller (NK). Därefter expanderade de NK-cellerna med artificiella antigenpresenterande celler (aAPC), som presenterar membranbunden IL-21, med kontinuerlig tillskott av IL-2. Forskare har tillämpat detta tillvägagångssätt på immunterapi för att generera iPSC-härledda naturliga mördarceller utrustade med den chimära antigenreceptorn (CAR-iNK)4.

Humana NK-celler definieras som CD3-CD56 + leukocyter i perifert blod. De är effektorer mot virusinfekterade celler och tumörceller5. Vissa hämmande receptorer på NK-celler känner igen molekyler som uttrycks allestädes närvarande i normala celler. Som ett exempel känner NKG2A / CD94-heterodimeren uttryckt på NK-celler igen MHC klass I-molekyler5. Samtidigt känner de aktiverande receptorerna på NK-celler igen stressinducerade ligander, som hur NKG2D känner igen transformationsinducerad MHC klass I polypeptidrelaterad sekvens A (GLIMMER / MICB)6. Vissa transformerade celler nedreglerar sina "självligander" för att undkomma immunövervakning och uppreglera avvikande ligander, vilket utlöser NK-cellerna att utföra sitt lytiska maskineri. De inneboende antitumörförmågorna hos NK-celler har uppmärksammat denna immuncelltyp.

Förmågan att samtidigt ge upphov till både embryonala och extraembryonala linjer kan göra hEPSC till en mer trogen rekapitulation av den embryonala utvecklingsnischen än konventionella pluripotenta stamceller. Av erfarenhet är det lättare att bibehålla styrkan hos hEPSC än hiPSC. I den aktuella studien utvecklades ett protokoll (figur 1) för att bias hEPSC för att utvecklas till hematopoetiska linjer och senare differentiera stamceller till naturliga mördarceller (NK) in vitro. I protokollet används kommersiella medier för att undvika seruminkonsekvenser, följt av stegvis tillsats av cytokiner till biasdifferentiering i lymfoida linjer. Detta protokoll har två system för att bevara den komplexa 3D-mikromiljön samtidigt som CD3-CD56 + / CD45 + CD56 + -celler som fenotypiskt och funktionellt liknar mänskliga NK-celler.

Detta protokoll kan vara användbart för att studera interaktionen mellan immunceller med deras differentieringsnischer och kan ha potential att rena cellulära produkter för immunterapeutisk användning.

Protocol

Den aktuella studien involverade in vitro-experiment ; Därför är etiskt godkännande inte tillämpligt. De etablerade cellinjer som användes i denna studie erhölls från kommersiella källor (se materialtabellen).

1. Generering av 3D-organoidstrukturer från hEPSC

  1. Behåll hEPSC genom att odla dem med 1 ml EPSC-medium (12-brunnsplatta) på SNL-matarceller1.
    OBS: Kupolformade kolonier observeras (figur 2A) om deras expanderade styrka kvarstår.
  2. Utför fördifferentiering av hEPSC: erna.
    1. Ta bort hEPSC-mediet och tillsätt 1 ml DFK-medium (DMEM/F12 + 10 % serumersättningsmedium, se materialtabellen). Inkubera i 2-3 dagar vid 37 °C och 5 %CO2. Utför en medelförändring på andra dagen om du fortsätter inkubationen i 3 dagar.
      OBS: Under mikroskopet plattas de kupolformade kolonierna (figur 2B).
  3. Kontrollera bildandet av embryoidkroppar med hängande droppteknik 7,8.
    1. Ta bort DFK-mediet och tvätta med 1 ml PBS en gång. Tillsätt 500 μL 0,05% trypsin och inkubera plattan vid 37 °C och 5%CO2 i 3-7 minuter baserat på morfologin.
      Anmärkning: hEPSC måste kunna lossas från matarcellerna när plattan störs något.
    2. Ta bort trypsinet och tillsätt 2 ml DFK-medium för att skörda cellerna. Snurra ner cellerna vid 300 x g i 3 min vid rumstemperatur.
    3. Ta bort supernatanten med en pipett. Tillsätt 1 ml DFK-medium och 1 μL Y27632 (se materialtabellen) för att suspendera cellerna igen genom att snärta.
    4. Räkna antalet celler i cellsuspensionen med en hemocytometer9. Späd cellsuspensionen med DFK-medium och Y27632 (1 000x) så att det finns 4 000 celler/25 μL DFK-medium.
    5. Fyll locket på en 10 cm petriskål med cirka 30-40 droppar 25 μL cellsuspension per lock. Häll lite PBS i den nedre skålen för att förhindra avdunstning av dropparna. Vänd försiktigt locket och täck skålen. Inkubera skålen vid 37 °C och 5 %CO2 i 3 dagar.

2. Mesoderm och hemato-endotelial mönstring av embryoidkroppen (EB)

  1. Samla EB i droppen.
    1. Samla alla EB från droppen i ett 15 ml rör med en 1 ml pipett och lite PBS. Pumpa lite PBS i droppen och aspirera sedan ut mediet, inklusive EB, med pipetten.
      OBS: Droppar som är mer gula indikerar mer framgångsrik bildning och tillväxt än rosa droppar.
    2. Snurra ner de uppsamlade EB: erna vid 100 x g i 1 min vid rumstemperatur och använd en pipett för att ta bort supernatanten. Tillsätt 1 ml medium A (från ett kommersiellt tillgängligt celldifferentieringskit, se materialtabellen) för att överföra de uppsamlade EB: erna till en icke-vidhäftande 24-brunnsplatta. Märk denna dag som dag 0 (bild 1).
      OBS: Vanligtvis grupperas alla EB som samlas in från en 10 cm skål och överförs till en brunn på en 24-brunnsplatta.
  2. Utför mesodermmönstring av EB: erna.
    1. Inkubera plattan i 3 dagar vid 37 °C med 5 %CO2. På dag 2, avlägsna 500 μL medium A (från satsen, steg 2.1.2) samtidigt som du undviker pipettering av EB: erna. Tillsätt sedan 500 μL färskt medium A.
  3. Utför hemato-endotelial specifikation av embryoidkroppen.
    1. Ta bort 700 μl medium A från brunnen och tillsätt 700 μl medium B (från satsen, steg 2.1.2). Kultur i 7 dagar. Utför ett halvbyte av medium B på dag 5, dag 7 och dag 9.

3. NK-celldifferentiering

  1. Överför de mönstrade EB: erna till ett luft-vätskegränssnitt.
    1. Luta plattan något så att EB: erna aggregerar på botten. Använd en 1 ml pipett för att ta bort så mycket av medium B som möjligt samtidigt som EB: erna undviks.
    2. Plocka upp EB: erna med en pipett genom att aspirera det återstående mediet. Överför dem till en transwell i en platta med 24 brunnar (se materialtabellen).
      OBS: Begränsa antalet till två till tre EB per transwell för optimal densitet.
  2. Utför lymfoid stamfaderutvidgning.
    1. Tillsätt 500 μL NK-1-medium (kommersiellt tillgängligt lymfoidt expansionsmedium + 14 IE/ml IL-3, 4 500 IE/ml IL-15, 8 800 IE/ml IL-7, 26 IE/ml SCF och 12 IE/ml ftl3L, se materialtabellen) till transwellens nedre del. Kultur i 14 dagar, och utför en medelstor förändring varannan dag.
  3. Skörda och överför cellerna dag 7-10 till en belagd platta.
    1. För att belägga plattan, späd beläggningsmaterialet (kommersiellt tillgängligt lymfoiddifferentieringsbeläggningsmaterial, 100x, se materialtabellen) i PBS. Tillsätt 1 ml utspädd beläggningslösning till varje brunn på en platta med 12 brunnar och inkubera plattan vid 4 °C över natten. Täck plattans öppning med omslagsfilm.
    2. Tillsätt 200 μL PBS i transbrunnen och pipettera långsamt upp och ner cirka fem till sex gånger för att skörda cellerna som frigörs från organoiderna. Undvik pipettering av organoiderna.
      OBS: Runda celler frigörs kontinuerligt från organoiderna (figur 2D).
    3. Överför den skördade cellsuspensionen till ett 2 ml rör och snurra ner cellerna vid 500 x g i 5 minuter vid rumstemperatur. Ta bort supernatanten med en pipett och tillsätt 1 ml NK-1-medium (steg 3.2.1) för att suspendera cellerna igen genom pipettering.
    4. Ta bort all beläggningslösning från brunnen och tvätta varje brunn på en 12-brunnsplatta med 1 ml PBS två gånger.
    5. Dela de skördade cellerna i förhållandet 1: 2. Överför cellsuspensionen till en belagd platta med 12 brunnar (steg 3.3.1). Tillsätt 1 ml NK-1-medium så att varje brunn har 1,5 ml medium.
    6. För att utföra en medelförändring, låt cellerna sitta i 1-2 minuter så att cellerna sjunker till botten. Aspirera försiktigt ut 750 μL medium. Snurra ner den uppsamlade supernatanten vid 500 x g i 5 minuter vid rumstemperatur.
    7. Kassera det mesta av supernatanten och återsuspendera i 750 μL NK-1-medium med pipettering fem till sex gånger. Tillsätt cellerna som återsuspenderats i det färska mediet i den ursprungliga brunnen.
      OBS: Detta parallella system kallas 2D-systemet i figur 1. Följ medieförändringsschemat för brunnen hos organoiderna som cellerna härstammar från.
  4. Utför NK-cellmognad enligt stegen nedan.
    1. Ta bort det gamla mediet i 3D-systemet och tillsätt 500 μL NK-2 (kommersiellt tillgängligt NK-celldifferentieringsmedium + 4 500 IE / ml IL-15, 8 800 IE / ml IL-7, 26 IE / ml SCF och 12 IE / ml ftl3L, se materialtabellen) i transwellens nedre fack. Inkubera vid 37 °C och 5 %CO2 i 14 dagar.
      OBS: Se till att mediet vidrör botten av transwellen.
    2. Utför en fullständig medieförändring på cellerna i 2D-systemet. Samla alla 1,5 ml celler från en brunn och centrifugera den vid 500 x g i 5 minuter vid rumstemperatur. Ta bort det mesta av supernatanten med en pipett och suspendera pelleten igen med 1,5 ml NK-2-medium (steg 3.4.1).
    3. Utför en medeländring varannan dag. Luta plattan på 3D-systemet något och ta bort allt gammalt medium utanför transbrunnen. Tillsätt 500 μL NK-2-medium utanför transwellen.
    4. För att utföra en halv medelförändring på en brunn på en 12-brunnsplatta för 2D-systemet, låt cellerna sitta i 1-2 minuter så att cellerna sjunker till botten. Aspirera försiktigt ut 750 μl av mediet.
    5. Snurra ner den uppsamlade supernatanten vid 500 x g i 5 minuter vid rumstemperatur för att förhindra cellförlust. Kassera det mesta av supernatanten och återsuspendera i 750 μL NK-2-medium genom pipettering fem till sex gånger. Tillsätt cellerna återsuspenderade i färskt medium i den ursprungliga brunnen.

4. Skörda mogna celler

  1. Skörda cellerna odlade i 2D-systemet.
    1. Skörda cellerna genom pipettering upp och ner under dag 38-45. Tvätta med 1 ml PBS två gånger. Centrifugera cellsuspensionen vid 500 x g i 5 min vid rumstemperatur.
    2. Ta bort supernatanten med en pipett och suspendera den igen i valfri buffert (dvs. PBS + 2% FBS för flödescytometri, se materialtabellen).
  2. Skörda cellerna inbäddade i organoiden.
    1. Samla upp mediet från utsidan av transbrunnen till ett 15 ml rör under dag 38-45. Tvätta organoiden två gånger genom att tillsätta 200 μL PBS inuti transbrunnen och pipettera upp och ner fem till sex gånger. Överför suspensionen till 15 ml röret.
    2. Tillsätt 500 μL PBS i en brunn på en 12-brunnsplatta. Överför organoiden från transbrunnen till brunnen på 12-brunnsplattan med pincett.
    3. Skär organoid 20 gånger med en sax och pincett. Spola de återstående cellerna på pincetten och saxen i brunnen med PBS. Samla så mycket PBS som möjligt och överför det till 15 ml röret som användes i steg 4.2.1 utan att aspirera organoidstrukturen.
    4. Tillsätt 500 μL av dissociationsreagenset (se materialtabellen) i transbrunnen för att smälta organoiden enzymatiskt. Inkubera med en kommersiell cellavskiljningslösning (se materialtabellen) i 7-10 min vid 37 °C och 5%CO2. Släck reaktionen genom att tillsätta 1 ml PBS med 2% FBS och samla lösningen i ett annat 15 ml rör. Tvätta brunnen med 1 ml PBS med 2% FBS två gånger.
      OBS: Bestäm inkubationens längd baserat på morfologin. Försök att uppnå den punkt där enskilda celler börjar frigöras från membranet i 3D-strukturen.
    5. Tillsätt 1 ml PBS med 2% FBS och pipettera upp och ner 8-10 gånger. Samla alla lösningar, inklusive organoidstrukturerna. Överför dem till 15 ml röret som användes i steg 4.2.3 med en cellsil.
    6. Centrifugera båda rören vid 500 x g i 5 min vid rumstemperatur. Kassera supernatanten med en pipett. Återsuspendera cellpelleten med valfri buffert (steg 4.1.2).

Representative Results

Det antogs att de nuvarande in vitro-differentieringsprodukterna (IVD) skulle ha liknande ytmarkörer och antitumörförmåga som humana NK-celler.

Den definierande markören för humana NK-celler användes för att testa om differentieringsprodukterna från 3D-odlingssystemet gav celler som fenotypiskt liknade humana NK-celler. Cirka 15% av cellerna som dissocierades från 3D-odlingssystemet från två satser inducerade vid olika tidpunkter (n = 2) var CD3−CD56+ (figur 3A). CD3 ersattes med CD45 (en pan-leukocytmarkör) i testpanelen på grund av frånvaron av CD3 och svårigheten att inducera T-celler in vitro. Cirka 16% av cellerna dissocierade från 3D-strukturen var CD45 + CD56 + (figur 3B, n = 1), vilket är i linje med procentandelarna av CD3−CD56 + -celler som setts i tidigare försök. Procentandelarna av CD3−CD56+-celler i cellerna som skördats från 2D-odlingssystemet varierade från 30% till 6%, från mer framgångsrika induktioner (Figur 3C, n = 3) till mindre framgångsrika induktioner (Figur 3D, n = 2). Funktionaliteten och fenotyperna hos cellerna som skördats från 2D-odlingssystemet validerades. Under dag 18-kulturen från 2D-systemet uttryckte cirka 12% av cellerna både ektopisk CD56 och CD107a efter 2 timmar 50 ng / ml IL-18, 455 IE / ml IL-2 och 20 ng / ml anti-CD244-antikroppsstimulering (figur 4C, n = 1). Cirka 28% av de skördade cellerna var CD94 + CD159a + (figur 4B, n = 1). Det ektopiska uttrycket av CD107a, ett proteinfoder på membranet av granulat, indikerar degranulering10, medan CD94 / NKG2A (CD159a) heterodimeren är en annan definierande markör för NK-celler. Detta ger ett exempel på fenotypisk och funktionsvalidering av IVD-produkter.

IVD-produkternas funktionalitet testades av deras cytotoxicitet mot humana erytroleukemiceller-K562-celler. Omfattande ligandprofilering på K562-celler avslöjar deras nedreglerade stora histokemiska komplex I (MHC-I) och relativt starka NKG2D-liganduttryck (såsom ULBP-1, ULBP-2/5/6 och ULBP-3)11; Således är K562-celler mottagliga för den lytiska aktiviteten hos NK-celler12. Både IVD-slutpunktsprodukter och NK92mi-celler grundades med 50 ng / ml IL-18, 455 IE / ml IL-2 och 20 ng / ml anti-CD244-antikroppar över natten. GFP+ K562-cellerna samodlades med antingen skördade celler från IVD- eller NK92mi-celler vid olika effektor-till-mål-förhållanden (E: T) i närvaro av 50 ng / ml (IE ej tillhandahållen) IL-18, 455 IE / ml IL-2 och 20 ng / ml anti-CD244-antikroppar i samma volym H5100-medium i 3 timmar. Avläsningen av NK-celldödande aktivitet var uttrycket av den döda cellmarkören på GFP + -delmängder. K562-cellerna transducerades med en kommersiellt tillgänglig kontrollvektor (se materialtabellen) för att uttrycka GFP konstitutivt, och transduktionens effektivitet var cirka 80% (kompletterande figur 1A). Procentandelarna av GFP-signalen som tillsattes var proportionella mot antalet GFP + K562-celler som tillsattes, vilket tyder på specifikt GFP-uttryck från de transducerade K562-cellerna (kompletterande figur 1B).

Procentandelarna av döende målceller som visas i figur 5 beräknades med följande formel13:

Procentandel döende celler = (FITC + DAPI + % av samodling [till exempel figur 5A]) - (FITC + DAPI + % av transducerade K562-celler)

Av alla tre E: T-förhållanden som bedömdes (0.1: 1, 0.33: 1, 1: 1) var procentandelarna av döende GFP + -celler positivt korrelerade med E: T-förhållandena när de odlades tillsammans med IVD-produkter (figur 5B, hEPSC-NK) eller NK92mi-celler (figur 5B, NK92mi), vilket indikerar den specifika dödningen av tumörmål. Cytotoxiciteten hos IVD-produkterna var dock jämförelsevis blygsam inom den testade tidsramen (figur 5C).

Slutligen jämfördes den lymfoida stamcellsgenereringen mellan 3D- och 2D-kulturerna. Det visade sig att 3D-odlingstillståndet genererade fler stamceller (55 000 celler) än 2D-odlingstillståndet (36 000 celler) (kompletterande figur 2). Detta tyder på att sammanhanget med vävnadsarkitektur och cellulära komponenter i 3D-kulturen stödde genereringen av lymfoida stamceller.

Figure 1
Figur 1: Schematiskt diagram som visar differentieringsstrategin för att skilja NK-celler från hEPSC . (A) Här visas tidslinjen för 3D-kultursystemen, med detaljer om kulturförhållandena och korta nyckelord från varje steg. 3D-systemets luft-vätskegränssnitt upprätthålls under NK-cellinduktionen. (B) Här visas tidslinjen för 2D-kultursystemen. De frigjorda cellerna som skördas från dag 7-10 från strukturer i 3D-systemet sås på en belagd platta utan luft-vätskegränssnittet. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Cellernas morfologi observerad vid olika differentieringsstadier. (A) Morfologin hos hEPSC när den bibehålls i EPSCM. hEPSC bildar kupolformade kolonier. (B) Morfologin hos hEPSC efter predifferentiering. De kupolformade kolonierna är platta. hEPSC skördas och bildar EB med hängande droppteknik. EB samlas in och odlas i medium A och sedan medium B. (C) Morfologin hos en EB på dag 10. Under denna period börjar EB expandera och blåsa upp och bilda membranstrukturer. d) Morfologin hos en cellfrisättande EB. Efter sådd på transbrunnen växer EB och släpper ständigt runda celler till omgivningen. Några av de frigjorda cellerna samlas in och odlas på en 12-brunnsplatta belagd med lymfoida differentieringsbeläggningsmaterial. Cellpopulationerna är morfologiskt heterogena och tenderar att aggregera tillsammans. E) Morfologin hos de celler som observerats vid endpointen för den medicintekniska produktens diagnostik. Små, cirkulära suspensionsceller (svart pil) observeras. Skalstapeler: (A,B,E) = 100 μm; (C,D) = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Representativa FACS-diagram för hEPSC-härledda produkter vid endpointen. Cellerna inkuberas med fluoroskopkonjugerade antikroppar på is i 30 minuter. Proverna färgas med DAPI innan de laddas i FACS-provinjektionsporten. Ofärgade celler används för att etablera den negativa grinden. (A) Representativt FACS-diagram på CD3- och CD56-uttryck i celler som är dissocierade från 3D-odlingssystemet från två satser (n = 2). (B) Representativt FACS-diagram på CD45- och CD56-uttryck i celler separerade från 3D-kulturen (n = 1). (C) Representativt FACS-diagram på CD3- och CD56-uttryck i celler som skördats från den belagda plattan från en lyckad induktion (n = 3). (D) Representativt FACS-diagram på CD3- och CD56-uttryck från den belagda plattan när induktionen är suboptimal (n = 2). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Representativt FACS-diagram på hEPSC-härledda produkter under odling dag 18 (n = 1). (A) FACS-plot på CD56- och CD107a-uttryck efter 2 timmars stimulering med IL2-, IL-18- och anti-CD244-antikroppar. (B) FACS-diagram på CD159a- och CD94-uttryck. Proverna färgas med DAPI innan de laddas i FACS-provinjektionsporten. Ofärgade celler används för att etablera den negativa grinden. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: Diagram över procentandelen döende celler mot olika E: T-förhållanden från samkulturen av GFP + K562-celler med antingen IVD-slutpunktsprodukten eller NK92mi-celler (n = 1). Uttrycket av FITC+ DAPI+-celler utvärderades med en cellanalysator och dataanalysen utfördes med kompatibel programvara. (A) Ett representativt FACS-diagram som visar grinden mellan FITC + DAPI + undergrupper från samkulturen av IVD-produkter och K562-celler med ett E:T-förhållande på 1. (B) Enskilda observationsområden från samodlingsförsöket med GFP+-produkter för in vitro-diagnostik (vänster) eller NK92mi-celler (höger) under 3 timmar. Båda återspeglar ett positivt proportionellt förhållande mellan andelen döende celler och E: T-förhållandet. (C) Ett diagram som visar dödskurvorna för IVD-produkter och NK92mi-celler i samma skala. IVD-produkterna uppvisade mild cytotoxicitet jämfört med NK92mi-cellerna. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Kompletterande figur 1: Funktionell analys av NK-celler från hEPSC. (A) FACS-histogram av transducerade K562-celler. FITC+ K562-cellerna uttryckte GFP. (B) FACS-histogram från samodling av GFP+ K562-celler och endpointprodukten för IVD vid tre E:T-förhållanden (n = 1). Procentandelarna av FITCH+-celler i samkulturen motsvarade antalet tillsatta transducerade K562-celler. Grindarna etablerades med otransducerade K562-celler. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 2: Lymfoid stamskillnad i 2D kontra 3D-kultur. Det nuvarande organoidbaserade protokollet användes för att inducera lymfoida stamceller från humana expanderade potentiella stamceller. Två villkor upprättades: (1) lymfoida förfäder hölls i odling inom organoiderna (3D) och (2) lymfoida förfäder isolerades och hölls på odlingsskålen (2D). Efter 2 veckors ytterligare odling bestämdes cellnumren för att jämföra 2D kontra 3D-kulturen. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Discussion

Det finns några viktiga steg för att säkerställa en framgångsrik differentiering av CD45 + CD56 + -celler från hEPSC. Fördifferentieringen (steg 1.2) är avgörande eftersom EPSC-mediet innehåller hämmare av härstamningsåtagande1. Efter fördifferentiering plattas de kupolformade kolonierna av hEPSC (figur 2B). Tillsatsen av Y27632, en rhokinashämmare (ROCKi), under bildandet av EB från hEPSC (steg 1.3) är oumbärlig för hEPSCs överlevnad efter dissociation. En annan viktig faktor är antalet EB planterade på varje transwell. Eftersom det är ett småskaligt system är två till tre EB per transwell den optimala densiteten för att förhindra överkonsumtion av mediet. Luft-vätskegränssnittet upprätthålls under hela NK-celldifferentieringen för 3D-systemet, vilket antas bibehålla stromacellernas polaritet och stödja expansionen av de AGM-härledda hematopoetiska förfäderna14,15.

Som tidigare nämnts är densiteten hos EB på transbrunnen en avgörande faktor för framgångsrik differentiering. Nyckeltecknet för detta är mediets färg 1 dag efter implantationen av EB på transbrunnen. Om färgen snabbt blir gul indikerar detta antingen förorening eller överbeläggning. För att lösa problemet bör en 1 ml pipett användas för att manuellt plocka upp extra EB och överföra dem till en annan transwell.

En stor begränsning av detta protokoll är renheten hos CD3−/CD45+ CD56+-celler i IVD-produkterna, vilket tros vara delvis ansvarigt för den sämre cytotoxiciteten jämfört med rena NK92mi-celler. Ett 3D-odlingssystem användes för att inducera hematopoetiska förfäder via generering av en EB som liknar de tre embryonala könslagren. Denna strategi efterliknar utvecklingen av blodceller i benmärgens mikromiljö, vilket eliminerar behovet av stromaceller för att stödja differentieringen3. Utan ett sorteringssteg för att rena de hematopoetiska progenitorerna förväntas renheten hos IVD-produkterna minska. En strategi för att behålla den komplexa differentieringsnischen och samtidigt öka renheten hos slutpunktsprodukten utvecklar en expansionsmetod för de sorterade CD3−CD56+ IVD-produkterna. Till exempel kan de sorterade CD3−CD56+ IVD-produkterna odlas på artificiella antigenpresenterande celler (aAPC), såsom bestrålade K562-celler konstruerade med membranbunden IL-21. Med tillförseln av IL-2 i kulturen kan denna metod uppnå en 1000-faldig ökning av NK-cellnummer3.

En annan begränsning är den begränsade tillgången till bona fide humana NK-celler som en positiv referens. NK92mi är den positiva referensen som används i samkulturanalysen, men den är inte tillräckligt exakt. NK92mi-celler är konstruerade från NK92-celler, en permanent cellinje som uttrycker aktiverade NK-cellfenotyper16, för att autonomt producera IL-2 för att uppfylla odlingskraven. NK92-celler visar överlägsen dödande aktivitet mot K562-celler in vitro än humana primära NK-celler17. En rättvisare jämförelse av tumördödande kapacitet hos IVD-produkter skulle kunna uppnås genom att jämföra cytotoxiciteten hos NK-celler i perifert blod parallellt, men tyvärr saknas tillgång till blodbanker.

Detta tvåsystemkulturprotokoll syftar till att generera CD3−/CD45+CD56+-celler från hEPSC. Bedömningen av ytmarkörer och cytotoxicitet med FACS kan rutinmässigt utföras på celler från 2D-system utan att störa differentieringsnischen. Trots skillnaderna i procentandelen CD3−CD56+-celler kan 3D- och 2D-systemen härleda CD3−CD56+-celler med liknande variationer i CD56-uttryck (figur 3), och 2D-systemet återspeglar förekomsten av lymfoida stamfäder från 3D-odlingstillståndet.

Betydelsen av att använda 3D-odlingssystemet är att det möjliggör användning av högupplösta profileringsanalyser, såsom rumslig transkriptomik eller avbildande masspektrometri, för att undersöka de rumsliga relationerna och cell-cellinteraktionerna inom den komplexa differentieringsnischen.

Disclosures

Författarna deklarerar inga intressekonflikter.

Acknowledgments

Vi vill tacka Dr. Handi Cao, Sanxing GAO, David Xiang, Yiming Chao, Ritika Jogani, Owen Chan, Stephanie Cheung och Celine Chan för deras tekniska hjälp och användbara diskussioner. Detta arbete stöddes av Platform Technology Fund. Figur 1 har skapats med BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
30 w/v% Albumin Solution, from Bovine Serum(BSA), Fatty Acid Free Wako Chemicals 017-22231 For resuspending cytokines. 
ACCUMAX STEMCELL Technologies  07921
Anti-human-CD159a-PE BD 375104 During antibody staining, 0.5 µL of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 5% FBS)
Anti-human-CD3-APC antibodies BD 555355 During antibody staining, 0.5 µL of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 2% FBS) 
Anti-human-CD45-APC antibodies BD 555485 During antibody staining, 0.5 µL of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 3% FBS)
Anti-human-CD56-PE antibodies BD 555516 During antibody staining, 0.5 µL of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 4% FBS)
Anti-human-CD56-PEcy7 antibodies BD 335826 During antibody staining, 0.5 µL of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 5% FBS)
Anti-human-CD94-APC  BD 559876 During antibody staining, 0.5 µL of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 5% FBS)
Bemis Parafilm M Laboratory Wrapping Film Thermo Scientific 11772644
Cd244 Monoclonal Antibody (eBioC1.7 (C1.7)), Functional Grade, eBioscience Thermo Scientific 16-5838-85
Costar 6.5 mm Transwell, 0.4 µm Pore Polyester Membrane Inserts STEMCELL Technologies 3470
Dapi Solution, 1 mg/mL BD 564907 It is resuspended with ddH2O so the concentration is 10 µM/mL. Add 1 µL of the aliquot in 300 µL of FACS buffer (PBS + 2% FBS) 
DMEM CPOS-Bioreagent core 11965092
DMEM/F12 Thermo Scientific 11320033
FcX, human Biolengend 422302
Fetal Bovine Serum(FBS) qualified E.U.-approved South America CPOS-Bioreagent core 10270106
FlowJo v10.8.0 BD
Gibco  PBS (10x) pH 7.4 CPOS-Bioreagent core 70011044 10x concentrated PBS is manufactured as follows: without calcium, magnesium or phenol red
K562 cells  ATCC  CCL-243
Knockout Serum Replacement Thermo Scientific 10828-028
MyeloCult H5100 medium  STEMCELL Technologies 5150
NK92mi cells  ATCC  CRL-2408 Lot: 70045208. Once thawed, they are cultured in MyeloCult H5100 medium, and maintained the density between 2 x 105 to 1 x 106 cell/mL.
Nunc Cell-Culture Treated Multidishes 12 well plate Thermo Scientific 150628 flat bottom
Nunc Cell-Culture Treated Multidishes 24 well plate Thermo Scientific 142475
Nunc EasYDish Dishes Thermo Scientific 150460
pLenti-GFP Lentiviral Control Vector  CELL BIOLABS LTV-400 It is packaged as the manufactuer suggested (https://www.cellbiolabs.com/sites/default/files/LTV-400-gfp- lentiviral-plasmid.pdf). 40 μL of 50x lentivirus is added with 1 μL 10 mg/mL polybrene per 1 mL of cell suspension. Complete medium change is performed 24 h after the addition of lentivirus. Cells are incubated undisputedly for 3 days at 37 °C, 5% CO2.
Polybrene  EMD Millipore TR-1003-G
Recombinant Human Flt-3 Ligand/FLT3L Protein R&D Systems 308-FK-005 It is resuspend with PBS + 0.2% BSA. Thr working concentration is 10 ng/mL or 12 IU/mL.
Recombinant Human IL-15 Protein R&D Systems 247-ILB-005 It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 10 ng/mL or 4500 IU/mL. 
Recombinant Human IL-18/IL-1F4 Protein R&D Systems 9124-IL-010 It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 50 ng/mL. The IU is not provided by the company. 
Recombinant Human IL-2 Protein R&D Systems 202-IL-010 It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 50 ng/mL or 455 IU/mL. 
Recombinant Human IL-3 Protein, 50ug PeproTech 200-03 It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 5 ng/mL or 14 IU/mL. 
Recombinant Human IL-7 Protein R&D Systems 207-IL-010 It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 20 ng/mL or 8800 IU/mL. 
Recombinant Human SCF Protein R&D Systems 255-SC-010 It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 20 ng/mL or 26 IU/mL. 
STEMdiff Hematopoietic Kit STEMCELL Technologies 5310 Medium A: 45 mL STEMdiff Hematopoietic Basal Medium + STEMdiff Hematopoietic Supplement A ; Medium B: 75 STEMdiff Hematopoietic Basal Medium + STEMdiff Hematopoietic Supplement B
StemSpan lymphoid differentiation coating material STEMCELL Technologies 9950 It is resuspended in PBS (100x)
StemSpan NK cell differentiation medium  STEMCELL Technologies 9960 It is prepared by adding 500 µL StemSpan NK Cell Differentiation Supplement (100x)  into 49.5 mL of SFEM II. Both are provided in StemSpan NK Cell Generation Kit. 
StemSpan lymphoid expansion medium  STEMCELL Technologies 9960 It is prepared by adding 5 mL StemSpan Lymphoid Progenitor Expansion Supplement (10x) into 45 mL of StemSpan SFEM II. Both are provided in StemSpan NK Cell Generation Kit. 
StemSpan NK Cell Generation Kit STEMCELL Technologies 9960 Thaw the medium and materials in room temperature and the medium is stored in 4 °C once thawed. 
The BD LSRFortessa cell analyzer BD
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Thermo Scientific 25300054
Y-27632 dihydrochloride Tocris 1254 working concentration: 10 µM

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gao, X., et al. Establishment of porcine and human expanded potential stem cells. Nature Cell Biology. 21 (6), 687-699 (2019).
  2. Mackinlay, K. M. L., et al. An in vitro stem cell model of human epiblast and yolk sac interaction. eLife. 10, 63930 (2021).
  3. Zhu, H., Kaufman, D. S. An improved method to produce clinical-scale natural killer cells from human pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 2048, 107-119 (2019).
  4. Li, Y., Hermanson, D. L., Moriarity, B. S., Kaufman, D. S. Human iPSC-derived natural killer cells engineered with chimeric antigen receptors enhance anti-tumor activity. Cell Stem Cell. 23 (2), 181-192 (2018).
  5. Vivier, E., Tomasello, E., Baratin, M., Walzer, T., Ugolini, S. Functions of natural killer cells. Nature Immunology. 9 (5), 503-510 (2008).
  6. Dhar, P., Wu, J. D. NKG2D and its ligands in cancer. Current Opinion in Immunology. 51, 55-61 (2018).
  7. Dang, S. M., Kyba, M., Perlingeiro, R., Daley, G. Q., Zandstra, P. W. Efficiency of embryoid body formation and hematopoietic development from embryonic stem cells in different culture systems. Biotechnology and Bioengineering. 78 (4), 442-453 (2002).
  8. Rungarunlert, S., Techakumphu, M., Pirity, M. K., Dinnyes, A. Embryoid body formation from embryonic and induced pluripotent stem cells: Benefits of bioreactors. World Journal of Stem Cells. 1, 11-21 (2009).
  9. Counting cells using a hemocytometer. abcam. , Available from: https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer (2022).
  10. Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity. Journal of Immunological Methods. 294, 15-22 (2004).
  11. Tremblay-McLean, A., Coenraads, S., Kiani, Z., Dupuy, F. P., Bernard, N. F. Expression of ligands for activating natural killer cell receptors on cell lines commonly used to assess natural killer cell function. BMC Immunology. 20, 8 (2019).
  12. Inoue, T., Swain, A., Nakanishi, Y., Sugiyama, D. Multicolor analysis of cell surface marker of human leukemia cell lines using flow cytometry. Anticancer Research. 34 (8), 4539 (2014).
  13. Mhatre, S. Rapid flow cytometry based cytotoxicity assay for evaluation of NK cell function. Indian Journal of Experimental Biology. 52 (10), 983-988 (2014).
  14. Medvinsky, A., Dzierzak, E. Definitive hematopoiesis is autonomously initiated by the AGM region. Cell. 86 (6), 897-906 (1996).
  15. Motazedian, A., et al. Multipotent RAG1+ progenitors emerge directly from haemogenic endothelium in human pluripotent stem cell-derived haematopoietic organoids. Nature Cell Biology. 22 (1), 60-73 (2020).
  16. Gong, J. H., Maki, G., Klingemann, H. G. Characterization of a human cell line (NK-92) with phenotypical and functional characteristics of activated natural killer cells. Leukemia. 8 (4), 652-658 (1994).
  17. Yan, Y., et al. Antileukemia activity of a natural killer cell line against human leukemias. Clinical Cancer Research. 4 (11), 2859-2868 (1998).

Tags

Utvecklingsbiologi nummer 191
Generering av naturliga mördarceller från mänskliga expanderade potentiella stamceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yu Ching, P., Wang, C., Hang, S.,… More

Yu Ching, P., Wang, C., Hang, S., Liu, P., Sugimura, R. Generation of Natural Killer Cells from Human Expanded Potential Stem Cells. J. Vis. Exp. (191), e64608, doi:10.3791/64608 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter