Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

İnsan Genişletilmiş Potansiyel Kök Hücrelerden Doğal Öldürücü Hücrelerin Üretilmesi

Published: January 13, 2023 doi: 10.3791/64608
Automatic Translation
1, 2, 2, 2,3, 2,3
1Major in Molecular Biology and Biotechnology, School of Biological Sciences, The University of Hong Kong, 2School of Biomedical Sciences, The University of Hong Kong, 3Centre for Translational Stem Cell Biology

Summary

Mevcut protokol, hafif sitotoksisiteye sahip CD3-/CD45+CD56+ hücrelerinin, hem 3D hem de 2D kültür koşulları altında insan genişlemiş potansiyel kök hücrelerinden (hEPSC'ler) nasıl ayırt edileceğini göstermektedir. Bu, karmaşık mikro çevrenin tahrip edilmeden rutin fenotipik doğrulamaya izin verir.

Abstract

Doğal öldürücü (NK) hücrelerin insan pluripotent kök hücrelerinden farklılaşması, immünoterapi için klinik sınıf hücresel ürünlerin araştırılmasına ve üretilmesine izin verir. Burada açıklanan, insan genişlemiş potansiyel kök hücrelerini (hEPSC'ler) hem 3 boyutlu (3D) hem de 2 boyutlu (2D) kültür teknolojisi ile in vitro NK hücre özelliklerine sahip hücrelere ayırt etmek için serumsuz bir ticari ortam ve bir sitokin kokteyli (interlökin [IL]-3, IL-7, IL-15, kök hücre faktörü [SCF] ve FMS benzeri tirozin kinaz 3 ligand [Ftl3L]) kullanan iki fazlı bir protokoldür. Bu protokolü takiben, CD3-CD56+ veya CD45+CD56+ NK hücreleri sürekli olarak oluşturulur. 3 saat boyunca tümör hedefleriyle kokültürlendiğinde, farklılaşmış ürünler, IL-2'den bağımsız kalıcı hücre hattı olan NK92mi hücrelerine kıyasla hafif sitotoksisite gösterir. Protokol, 3D yapıların üretilmesiyle farklılaşma mikro ortamının karmaşıklığını korur, böylece bağışıklık hücreleri ve nişleri arasındaki mekansal ilişkilerin incelenmesini kolaylaştırır. Bu arada, 2D kültür sistemi, hassas farklılaşma nişine zarar vermeden hücre farklılaşmasının rutin fenotipik doğrulamasını sağlar.

Introduction

İnsan embriyonik kök hücreleri (hESC'ler) ve insan kaynaklı pluripotent kök hücreler (hiPSC'ler) gibi geleneksel pluripotent kök hücrelerle karşılaştırıldığında, insan genişlemiş potansiyel kök hücreleri (hEPSC'ler) hem embriyonik olmayan hem de embriyonik soylara farklılaşabildikleri için totipotens durumuna daha yakındır1. Örneğin, hEPSC'ler trofoblastlar1 ve yumurta sarısı kesesi benzeri hücreler2'ye ayırt edilebilir. hEPSC'lerin benzersiz gücünü elde etmek için, bireysel bir blastomer, EPSC ortamı (EPSCM) olarak adlandırılan soy bağlılığı sinyalini 1 inhibe eden birkaç küçük molekül içeren bir ortamdakültürlenir. EPSCM'deki hESC'lerin ve hiPSC'lerin kültürlenmesi, onları trofoblast hücrelerine ayırmak için daha önce kısıtlanmış potansiyellerini genişletir1.

Pluripotent kök hücreler, yeni genetik modifikasyonlarla deney yapmak için değerli bir araştırma aracıdır. Pluripotent kök hücrelerin kendini yenileme ve farklılaşma kapasiteleri nedeniyle, pluripotent bir kök hücrenin dönüştürülmüş bir klonu, aynı lokusta aynı genetik modifikasyona sahip farklılaşmış hücresel ürünler üretebilir. Zhu ve Kaufman, geleneksel pluripotent kök hücrelerden (hESC'ler ve hiPSC'ler) NK hücre farklılaşması standardını oluşturdular3. İlk olarak, pluripotent kök hücrelerden türetilen bir embriyoid gövdeden hematopoetik kök hücreleri (HSC'ler) indüklediler. Kök hücre faktörü (SCF), FMS benzeri tirozin kinaz 3 ligand (Ftl3L), interlökin (IL)-7, IL-15 ve IL-3'ün erken bir takviyesinin eklenmesi, HSC'lerin doğal öldürücü (NK) hücrelere dönüşmesi için önyargılı hale getirdi. Daha sonra, NK hücrelerini, membrana bağlı IL-21 sunan yapay antijen sunan hücrelerle (aAPC'ler) IL-2'nin sürekli takviyesi ile genişlettiler. Araştırmacılar, kimerik antijen reseptörü (CAR-iNK)4 ile donatılmış iPSC türevi doğal öldürücü hücreler üretmek için bu yaklaşımı immünoterapiye uygulamışlardır.

İnsan NK hücreleri, periferik kanda CD3-CD56+ lökositler olarak tanımlanır. Virüs bulaşmış hücrelere ve tümör hücrelerine karşı efektörlerdir5. NK hücreleri üzerindeki bazı inhibitör reseptörler, normal hücrelerde her yerde eksprese edilen molekülleri tanır. Örnek olarak, NK hücrelerinde eksprese edilen NKG2A / CD94 heterodimer, MHC sınıf I molekülleri5'i tanır. Bu arada, NK hücreleri üzerindeki aktive edici reseptörler, NKG2D'nin dönüşüme bağlı MHC sınıf I polipeptit ile ilgili dizi A (MICA / MICB)6'yı nasıl tanıdığı gibi, strese bağlı ligandları tanır. Bazı dönüştürülmüş hücreler, bağışıklık gözetiminden kaçmak ve NK hücrelerini litik makinelerini yürütmek için tetikleyen anormal ligandları yukarı regüle etmek için "kendi ligandlarını" aşağı regüle eder. NK hücrelerinin içsel anti-tümör yetenekleri bu bağışıklık hücresi tipine dikkat çekmiştir.

Aynı anda hem embriyonik hem de embriyonik olmayan soylara yol açma yeteneği, hEPSC'leri embriyonik gelişim nişinin geleneksel pluripotent kök hücrelerden daha sadık bir özeti haline getirebilir. Deneyimlere göre, hEPSC'lerin gücünü korumak hiPSC'lerden daha kolaydır. Bu çalışmada, hEPSC'lerin hematopoetik soylara dönüşmesi için önyargılı hale getirmek ve daha sonra progenitör hücreleri in vitro olarak doğal öldürücü (NK) hücrelere ayırmak için bir protokol geliştirilmiştir (Şekil 1). Protokolde, serum tutarsızlıklarını önlemek için ticari ortamlar kullanılmakta, bunu lenfoid soylara farklılaşmayı önyargılı hale getirmek için kademeli olarak sitokinler eklenmektedir. Bu protokol, fenotipik ve işlevsel olarak insan NK hücrelerine benzeyen CD3-CD56 + / CD45 + CD56 + hücrelerini türetirken karmaşık 3D mikro çevreyi korumak için iki sisteme sahiptir.

Bu protokol, bağışıklık hücrelerinin farklılaşma nişleri ile etkileşimini incelemede yararlı olabilir ve immünoterapötik kullanımlar için hücresel ürünleri saflaştırma potansiyeline sahip olabilir.

Protocol

Bu çalışmada in vitro deneyler yer almaktadır; bu nedenle, etik onay geçerli değildir. Bu çalışmada kullanılan yerleşik hücre hatları ticari kaynaklardan elde edilmiştir (bkz.

1. hEPSC'lerden 3D organoid yapıların oluşturulması

  1. hEPSC'leri SNL besleyici hücreler 1 üzerinde 1 mL EPSC ortamı (12 delikli plaka) ile kültürleyerek koruyun1.
    NOT: Kubbe şeklindeki koloniler, genişlemiş potansiyelleri kalırsa gözlenir (Şekil 2A).
  2. hEPSC'lerin ön farklılaştırmasını gerçekleştirin.
    1. hEPSC ortamını çıkarın ve 1 mL DFK ortamı ekleyin (DMEM / F12 + % 10 serum değiştirme ortamı, Malzeme Tablosuna bakın). 37 ° C'de 2-3 gün boyunca inkübe edin ve% 5 CO2. Kuluçkaya 3 gün boyunca devam ediyorsanız, ikinci günde orta bir değişiklik yapın.
      NOT: Mikroskop altında, kubbe şeklindeki koloniler düzleştirilir (Şekil 2B).
  3. Embriyoid cisimlerin oluşumunu asılı damla tekniği 7,8 ile kontrol edin.
    1. DFK ortamını çıkarın ve bir kez 1 mL PBS ile yıkayın. 500 μL% 0.05 tripsin ekleyin ve plağı morfolojiye bağlı olarak 3-7 dakika boyunca 37 ° C'de ve% 5 CO2'de inkübe edin.
      NOT: hEPSC'ler, plaka hafifçe bozulduğunda besleyici hücrelerden ayrılabilmelidir.
    2. Tripsini çıkarın ve hücreleri toplamak için 2 mL DFK ortamı ekleyin. Hücreleri oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 300 x g'da döndürün.
    3. Süpernatantı bir pipetle çıkarın. Hücreleri hafifçe vurarak yeniden askıya almak için 1 mL DFK ortamı ve 1 μL Y27632 ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakın).
    4. Bir hemositometre9 ile hücre süspansiyonu içindeki hücre sayısını sayın. Hücre süspansiyonunu DFK ortamı ve Y27632 (1.000x) ile seyreltin, böylece 4.000 hücre / 25 μL DFK ortamı olur.
    5. 10 cm'lik bir Petri kabının kapağını, kapak başına yaklaşık 30-40 damla 25 μL hücre süspansiyonu ile doldurun. Damlacıkların buharlaşmasını önlemek için alt kaba biraz PBS dökün. Kapağı yavaşça ters çevirin ve çanağı örtün. Çanağı 37 ° C'de ve% 5 CO2'de 3 gün boyunca inkübe edin.

2. Embriyoid cismin mezodermi ve hemato-endotel paternlenmesi (EB)

  1. EB'leri damlacık içinde toplayın.
    1. Damlacıktan tüm EB'leri 1 mL'lik pipet ve bazı PBS kullanarak 15 mL'lik bir tüpe toplayın. Damlacığa biraz PBS pompalayın ve ardından EB'ler de dahil olmak üzere ortamı pipetle aspire edin.
      NOT: Daha sarı olan damlacıklar, pembe damlacıklardan daha başarılı oluşum ve büyüme gösterir.
    2. Toplanan EB'leri oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 100 x g'da döndürün ve süpernatanı çıkarmak için bir pipet kullanın. Toplanan EB'leri yapışkan olmayan 24 delikli bir plakaya aktarmak için 1 mL orta A ekleyin (ticari olarak temin edilebilen bir hücre farklılaştırma kitinden, Malzeme Tablosuna bakın). Bu günü 0. Gün olarak etiketleyin (Şekil 1).
      NOT: Genellikle, 10 cm'lik bir tabaktan toplanan tüm EB'ler gruplandırılır ve 24 delikli bir tabağın bir kuyucuğuna aktarılır.
  2. EB'lerin mezoderm desenlemesini gerçekleştirin.
    1. Plakayı 3 gün boyunca 37 ° C'de% 5 CO2 ile inkübe edin. 2. Günde, EB'leri pipetlemekten kaçınırken 500 μL orta A'yı (kitten, adım 2.1.2) çıkarın. Ardından, 500 μL taze ortam A ekleyin.
  3. Embriyoid cismin hemato-endotel spesifikasyonunu gerçekleştirin.
    1. Kuyudan 700 μL orta A çıkarın ve 700 μL orta B ekleyin (kitten, adım 2.1.2). 7 gün boyunca kültür. 5. Gün, 7. Gün ve 9. Gün'de orta B'nin yarısını değiştirin.

3. NK hücre farklılaşması

  1. Desenli EB'leri bir hava-sıvı arayüzüne aktarın.
    1. EB'lerin altta toplanması için plakayı hafifçe eğin. EB'lerden kaçınırken orta B'nin mümkün olduğunca çoğunu çıkarmak için 1 mL'lik bir pipet kullanın.
    2. Kalan ortamı aspire ederek EB'leri bir pipetle alın. Bunları 24 delikli bir plakadaki bir transwell'e aktarın ( Malzeme Tablosuna bakınız).
      NOT: Optimum yoğunluk için sayıları transwell başına iki ila üç EB ile sınırlandırın.
  2. Lenfoid progenitör genişlemesi gerçekleştirin.
    1. Transwellin alt bölmesine 500 μL NK-1 ortamı (ticari olarak temin edilebilen lenfoid genleşme ortamı + 14 IU / mL IL-3, 4.500 IU / mL IL-15, 8.800 IU / mL IL-7, 26 IU / mL SCF ve 12 IU / mL ftl3L, Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin. 14 gün boyunca kültür yapın ve her gün orta bir değişim gerçekleştirin.
  3. 7-10. günlerde hücreleri hasat edin ve kaplanmış bir tabağa aktarın.
    1. Plakayı kaplamak için, PBS'deki kaplama malzemesini (ticari olarak temin edilebilen lenfoid farklılaşma kaplama malzemesi, 100x, Malzeme Tablosuna bakınız) seyreltin. 12 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna 1 mL seyreltilmiş kaplama çözeltisi ekleyin ve plakayı gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin. Plakanın açıklığını sarma filmi ile örtün.
    2. Transkuyu içine 200 μL PBS ekleyin ve organoidlerden salınan hücreleri toplamak için yaklaşık beş ila altı kez yavaşça yukarı ve aşağı pipet yapın. Organoidleri pipetlemekten kaçının.
      NOT: Yuvarlak hücreler organoidlerden sürekli olarak salınır (Şekil 2D).
    3. Hasat edilen hücre süspansiyonunu 2 mL'lik bir tüpe aktarın ve hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 500 x g'de döndürün. Süpernatantı bir pipetle çıkarın ve pipetle pipetleyerek hücreleri yeniden askıya almak için 1 mL NK-1 ortamı (adım 3.2.1) ekleyin.
    4. Tüm kaplama çözeltisini kuyudan çıkarın ve 12 delikli bir plakanın her bir kuyusunu 1 mL PBS ile iki kez yıkayın.
    5. Hasat edilen hücreleri 1: 2 oranında bölün. Hücre süspansiyonunu kaplanmış 12 delikli bir plakaya aktarın (adım 3.3.1). 1 mL NK-1 ortamı ekleyin, böylece her bir kuyucuk 1,5 mL ortama sahip olur.
    6. Orta bir değişiklik yapmak için, hücrelerin dibe batmasına izin vermek için hücrelerin 1-2 dakika oturmasına izin verin. 750 μL ortamı dikkatlice aspire edin. Toplanan süpernatantı oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 500 x g'da döndürün.
    7. Süper nantantın çoğunu atın ve 750 μL NK-1 ortamında beş ila altı kez pipetleme ile yeniden askıya alın. Taze ortamda yeniden askıya alınan hücreleri orijinal kuyucuğa ekleyin.
      NOT: Bu paralel sistem Şekil 1'de 2B sistem olarak anılmaktadır. Hücrelerin kaynaklandığı organoidlerin kuyusunun orta değişim programını takip edin.
  4. Aşağıdaki adımları izleyerek NK hücresi olgunlaşması gerçekleştirin.
    1. 3D sistemin eski ortamını çıkarın ve transwellin alt bölmesine 500 μL NK-2 (piyasada bulunan NK hücre farklılaşma ortamı + 4.500 IU / mL IL-15, 8.800 IU / mL IL-7, 26 IU / mL SCF ve 12 IU / mL ftl3L, Malzeme Tablosuna bakın) ekleyin. 14 gün boyunca 37 ° C'de ve% 5 CO2'de inkübe edin.
      NOT: Ortamın transwell'in dibine dokunduğundan emin olun.
    2. 2B sistemdeki hücreler üzerinde tam bir ortam değişikliği gerçekleştirin. 1,5 mL'lik hücrelerin tümünü bir kuyucuktan toplayın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj yapın. Süpernatantın çoğunu bir pipetle çıkarın ve peleti 1,5 mL NK-2 ortamı ile yeniden askıya alın (adım 3.4.1).
    3. Her alternatif günde bir orta düzeyde değişiklik yapın. 3D sistemin plakasını hafifçe eğin ve transwell'in dışındaki tüm eski ortamları çıkarın. Transwellin dışına 500 μL NK-2 ortamı ekleyin.
    4. 2D sistem için 12 delikli bir plakanın bir kuyucuğunda yarım orta bir değişim gerçekleştirmek için, hücrelerin dibe batmasına izin vermek için hücrelerin 1-2 dakika oturmasına izin verin. Ortamın 750 μL'sini dikkatlice aspire edin.
    5. Hücre kaybını önlemek için toplanan süpernatantı oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 500 x g'da döndürün. Süper natantın çoğunu atın ve beş ila altı kez pipetleyerek 750 μL NK-2 ortamında yeniden askıya alın. Taze ortamda yeniden askıya alınan hücreleri orijinal kuyucuğuna ekleyin.

4. Olgun hücrelerin toplanması

  1. 2B sistemde kültürlenmiş hücreleri toplayın.
    1. 38-45. günlerde yukarı ve aşağı pipetleme yaparak hücreleri toplayın. 1 mL PBS ile iki kez yıkayın. Hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj yapın.
    2. Süpernatantı bir pipetle çıkarın ve seçtiğiniz tamponda yeniden askıya alın (yani, akış sitometrisi için PBS +% 2 FBS, Malzeme Tablosuna bakınız).
  2. Organoide gömülü hücreleri toplayın.
    1. Ortamı transvelin dışından 38-45. günlerde 15 mL'lik bir tüpe toplayın. Transvelin içine 200 μL PBS ekleyerek ve beş ila altı kez yukarı ve aşağı pipetleyerek, organoidi iki kez yıkayın. Süspansiyonu 15 mL tüpe aktarın.
    2. 12 delikli bir plakanın kuyucuğuna 500 μL PBS ekleyin. Organoidi transvilden forsepsli 12 delikli plakanın kuyusuna aktarın.
    3. Bir çift makas ve forseps kullanarak organoidi 20 kez kesin. Forseps ve makas üzerinde kalan hücreleri PBS ile kuyuya yıkayın. Mümkün olduğunca fazla PBS toplayın ve organoid yapıyı aspire etmeden adım 4.2.1'de kullanılan 15 mL tüpe aktarın.
    4. Organoidi enzimatik olarak sindirmek için transwell'e 500 μL ayrışma reaktifi ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız). Ticari bir hücre ayırma çözeltisi ( Malzeme Tablosuna bakınız) ile 37 ° C'de 7-10 dakika ve% 5 CO2'de inkübe edin. % 2 FBS ile 1 mL PBS ekleyerek reaksiyonu söndürün ve çözeltiyi başka bir 15 mL tüpte toplayın. Kuyuyu iki kez% 2 FBS ile 1 mL PBS ile yıkayın.
      NOT: Morfolojiye göre inkübasyonun uzunluğunu belirleyin. Tek hücrelerin 3B yapının zarından salınmaya başladığı noktaya ulaşmaya çalışın.
    5. %2 FBS ile 1 mL PBS ekleyin ve 8-10 kez yukarı ve aşağı pipet ekleyin. Organoid yapılar da dahil olmak üzere tüm çözeltileri toplayın. Bunları bir hücre süzgeci ile adım 4.2.3'te kullanılan 15 mL tüpe aktarın.
    6. Her iki tüpü de oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj yapın. Süpernatantı bir pipetle atın. Hücre peletini tercih edilen tamponla yeniden askıya alın (adım 4.1.2).

Representative Results

Mevcut in vitro farklılaşma (IVD) ürünlerinin insan NK hücrelerine benzer yüzey belirteçlerine ve anti-tümör yeteneklerine sahip olacağı varsayılmıştır.

İnsan NK hücrelerinin tanımlayıcı belirteçlerine, 3D kültür sisteminden farklılaşma ürünlerinin fenotipik olarak insan NK hücrelerine benzeyen hücreler verip vermediğini test etmek için erişildi. Farklı zaman noktalarında (n = 2) indüklenen iki partiden 3D kültür sisteminden ayrılan hücrelerin yaklaşık% 15'i CD3-CD56 + idi (Şekil 3A). CD3, CD3'ün yokluğu ve in vitro T hücrelerini indüklemenin zorluğu nedeniyle test panelinde CD45 (bir pan-lökosit belirteci) ile değiştirildi. 3D yapıdan ayrılan hücrelerin yaklaşık% 16'sı CD45 + CD56 + idi (Şekil 3B, n = 1), bu da daha önceki çalışmalarda görülen CD3-CD56 + hücrelerinin yüzdeleriyle uyumludur. 2D kültür sisteminden toplanan hücrelerdeki CD3-CD56+ hücrelerinin yüzdeleri, daha başarılı indüksiyonlardan (Şekil 3C, n = 3) daha az başarılı indüksiyonlara (Şekil 3D, n = 2) kadar% 30 ila% 6 arasında değişmiştir. 2D kültür sisteminden toplanan hücrelerin işlevselliği ve fenotipleri doğrulandı. 2D sistemden 18. Gün kültürü sırasında, hücrelerin yaklaşık% 12'si 2 saat 50 ng / mL IL-18, 455 IU / mL IL-2 ve 20 ng / mL anti-CD244 antikor stimülasyonundan sonra hem ektopik CD56 hem de CD107a eksprese etti (Şekil 4C, n = 1). Hasat edilen hücrelerin yaklaşık %28'i CD94+CD159a+ idi (Şekil 4B, n=1). Granüllerin zarı üzerinde bir protein astarı olan CD107a'nın ektopik ekspresyonu, degranülasyon10'u gösterirken, CD94 / NKG2A (CD159a) heterodimer, NK hücrelerinin bir başka tanımlayıcı belirtecidir. Bu, IVD ürünlerinin fenotipik ve işlevsellik doğrulamasına bir örnek sağlar.

IVD ürünlerinin işlevselliği, insan eritrolösemi hücreleri-K562 hücrelerine karşı sitotoksisiteleri ile test edildi. K562 hücreleri üzerinde kapsamlı ligand profillemesi, aşağı regüle edilmiş majör histokimya kompleksi I (MHC-I) ve nispeten güçlü NKG2D ligand ekspresyonunu (ULBP-1, ULBP-2/5/6 ve ULBP-3 gibi) ortaya koymaktadır11; Bu nedenle, K562 hücreleri NK hücrelerinin litik aktivitesine duyarlıdır12. Hem IVD son nokta ürünleri hem de NK92mi hücreleri gece boyunca 50 ng / mL IL-18, 455 IU / mL IL-2 ve 20 ng / mL anti-CD244 antikorları ile astarlandı. GFP + K562 hücreleri, 50 ng / mL (IU sağlanmadı) IL-18, 455 IU / mL IL-2 ve 20 ng / mL anti-CD244 antikorlarının varlığında IVD veya NK92mi hücrelerinden toplanan hücrelerle farklı efektör-hedef oranlarında (E: T) 3 saat boyunca aynı hacimde H5100 ortamında kokültüre alındı. NK hücre öldürme aktivitesinin okunması, GFP + alt kümeleri üzerindeki ölü hücre belirtecinin ekspresyonuydu. K562 hücreleri, GFP'yi yapısal olarak ifade etmek için ticari olarak temin edilebilen bir kontrol vektörü ( Malzeme Tablosuna bakınız) ile dönüştürüldü ve transdüksiyonun verimliliği yaklaşık% 80 idi (Ek Şekil 1A). Eklenen GFP sinyalinin yüzdeleri, eklenen GFP + K562 hücrelerinin sayısıyla orantılıydı, bu da dönüştürülmüş K562 hücrelerinden spesifik GFP ekspresyonunu düşündürüyordu (Ek Şekil 1B).

Şekil 5'te gösterilen ölmekte olan hedef hücrelerin yüzdeleri aşağıdaki formül13 ile hesaplanmıştır:

Ölmekte olan hücrelerin yüzdesi = (FITC + DAPI + kokültürün % 'si [örneğin, Şekil 5A]) - (FITC + DAPI + dönüştürülmüş K562 hücrelerinin % 'si)

Değerlendirilen üç E: T oranının hepsinden (0.1: 1, 0.33: 1, 1: 1), ölmekte olan GFP + hücrelerinin yüzdeleri, IVD ürünleri (Şekil 5B, hEPSC-NK) veya NK92mi hücreleri (Şekil 5B, NK92mi) ile birlikte kültürlendiğinde E: T oranları ile pozitif korelasyon gösterdi ve tümör hedeflerinin spesifik olarak öldürüldüğünü gösterdi. Bununla birlikte, IVD ürünlerinin sitotoksisitesi, test edilen zaman dilimi içinde nispeten mütevazıydı (Şekil 5C).

Son olarak, lenfoid progenitör hücre üretimi 3D ve 2D kültürler arasında karşılaştırıldı. 3D kültür koşulunun, 2D kültür koşulundan (36.000 hücre) daha fazla progenitör hücre (55.000 hücre) ürettiği bulunmuştur (Ek Şekil 2). Bu, 3D kültürdeki doku mimarisi ve hücresel bileşenlerin bağlamının lenfoid progenitör hücrelerin oluşumunu desteklediğini göstermektedir.

Figure 1
Şekil 1: NK hücrelerini hEPSC'lerden ayırt etmek için farklılaştırma stratejisini gösteren şematik diyagram . (A) Burada, kültür koşullarını ve her adımdan kısa anahtar kelimeleri ayrıntılandıran 3B kültür sistemlerinin zaman çizelgesi gösterilmektedir. 3D sistemin hava-sıvı arayüzü, NK hücre indüksiyonu sırasında korunur. (B) Burada, 2B kültür sistemlerinin zaman çizelgesi gösterilmektedir. 3D sistemdeki yapılardan 7-10. Günlerden toplanan serbest bırakılan hücreler, hava-sıvı arayüzü olmadan kaplanmış bir plaka üzerine tohumlanır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Farklı farklılaşma aşamalarında gözlenen hücrelerin morfolojisi. (A) EPSCM'de muhafaza edildiğinde hEPSC'lerin morfolojisi. hEPSC'ler kubbeli şekilli koloniler oluşturur. (B) Ön farklılaşmadan sonra hEPSC'lerin morfolojisi. Kubbeli koloniler düzleştirilmiştir. hEPSC'ler hasat edilir ve asılı damla tekniği ile EB'ler oluşturur. EB'ler orta A ve daha sonra orta B'de toplanır ve kültürlenir. (C) 10. Günde bir EB'nin morfolojisi. Bu dönemde, EB genişlemeye ve şişmeye başlar, membranöz yapılar oluşturur. (D) Hücre salgılayan bir EB'nin morfolojisi. Transwell üzerinde tohumlama yapıldıktan sonra, EB büyür ve sürekli olarak yuvarlak hücreleri çevreye bırakır. Salınan hücrelerin bir kısmı, lenfoid farklılaşma kaplama malzemeleri ile kaplanmış 12 delikli bir plaka üzerinde toplanır ve kültürlenir. Hücre popülasyonları morfolojik olarak heterojendir ve birlikte toplanma eğilimindedir. (E) IVD'nin son noktasında gözlenen hücrelerin morfolojisi. Küçük, dairesel süspansiyon hücreleri (siyah ok) gözlenir. Ölçek çubukları: (A,B,E) = 100 μm; (C,D) = 100 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Uç noktadaki hEPSC türevi ürünlerin temsili FACS grafikleri. Hücreler 30 dakika boyunca buz üzerinde floroskop konjuge antikorlarla inkübe edilir. Numuneler, FACS numune enjeksiyon portuna yüklenmeden önce DAPI ile boyanır. Lekesiz hücreler negatif geçidi oluşturmak için kullanılır. (A) 3B kültür sisteminden iki partiden ayrılan hücrelerdeki CD3 ve CD56 ekspresyonu üzerine temsili FACS grafiği (n = 2). (B) 3B kültürden ayrışmış hücrelerdeki CD45 ve CD56 ekspresyonu üzerindeki temsili FACS grafiği (n = 1). (C) Başarılı bir indüksiyondan kaplanmış plakadan toplanan hücrelerde CD3 ve CD56 ekspresyonu üzerinde temsili FACS grafiği (n = 3). (D) İndüksiyon yetersiz olduğunda kaplanmış plakadan CD3 ve CD56 ekspresyonu üzerinde temsili FACS grafiği (n = 2). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: 18. Gün kültürü sırasında hEPSC türevi ürünler üzerinde temsili FACS grafiği (n = 1). (A) IL2, IL-18 ve anti-CD244 antikorları ile 2 saatlik stimülasyondan sonra CD56 ve CD107a ekspresyonu üzerinde FACS grafiği. (B) CD159a ve CD94 ifadesi üzerinde FACS grafiği. Numuneler, FACS numune enjeksiyon portuna yüklenmeden önce DAPI ile boyanır. Lekesiz hücreler negatif geçidi oluşturmak için kullanılır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: IVD son nokta ürünü veya NK92mi hücreleri (n = 1) ile GFP + K562 hücrelerinin kokültüründen farklı E: T oranlarına karşı ölmekte olan hücrelerin yüzdelerinin grafiği. FITC+ DAPI+ hücrelerinin ekspresyonu hücre analizörü ile değerlendirilmiş, uyumlu yazılımlarla veri analizi yapılmıştır. (A) IVD ürünlerinin ve E:T oranı 1 olan K562 hücrelerinin kokültüründen FITC + DAPI + alt kümelerinin geçişini gösteren temsili bir FACS grafiği. (B) GFP + IVD ürünleri (solda) veya NK92mi hücreleri (sağda) ile 3 saat boyunca kokültür deneyinden bireysel grafikler. Her ikisi de ölmekte olan hücrelerin yüzdesi ile E: T oranı arasındaki pozitif orantılı ilişkiyi yansıtır. (C) IVD ürünlerinin ve NK92mi hücrelerinin öldürme eğrilerini aynı ölçekte gösteren bir grafik. IVD ürünleri, NK92mi hücrelerine kıyasla hafif sitotoksisite gösterdi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: hEPSC'lerden NK hücrelerinin fonksiyonel analizi. (A) Dönüştürülmüş K562 hücrelerinin FACS histogramı. FITC+ K562 hücreleri GFP'yi ifade etti. (B) GFP+ K562 hücrelerinin kokültüründen ve üç E:T oranında (n = 1) sonlanım IVD ürünlerinden elde edilen FACS histogramları. Kokültürdeki FTICA + hücrelerinin yüzdeleri, eklenen dönüştürülmüş K562 hücrelerinin sayısına karşılık geliyordu. Geçitler, dönüştürülmemiş K562 hücreleri ile kuruldu. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 2: 2D ve 3D kültürde lenfoid progenitör farklılaşması. Mevcut organoid bazlı protokol, insan genişlemiş potansiyel kök hücrelerinden lenfoid progenitörleri indüklemek için kullanıldı. İki koşul oluşturuldu: (1) lenfoid progenitörler organoidler içinde kültürde tutuldu (3D) ve (2) lenfoid progenitörler izole edildi ve kültür kabında tutuldu (2D). 2 haftalık ek kültürden sonra, hücre sayıları 2B ve 3B kültürü karşılaştırmak için belirlendi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Discussion

CD45 + CD56 + hücrelerinin hEPSC'lerden başarılı bir şekilde ayırt edilmesini sağlamak için birkaç önemli adım vardır. Ön farklılaşma (adım 1.2) çok önemlidir, çünkü EPSC ortamı soy taahhüdü1 inhibitörleri içerir. Ön farklılaşmadan sonra, hEPSC'lerin kubbe şeklindeki kolonileri düzleştirilir (Şekil 2B). HEPSC'lerden EB oluşumu sırasında bir Rho-kinaz inhibitörü (ROCKi) olan Y27632'nin eklenmesi (adım 1.3), ayrışmadan sonra hEPSC'lerin hayatta kalması için vazgeçilmezdir. Bir diğer önemli husus, her bir transwell'e ekilen EB'lerin sayısıdır. Küçük ölçekli bir sistem olduğundan, transwell başına iki ila üç EB, ortamın aşırı tüketimini önlemek için en uygun yoğunluktur. Hava-sıvı arayüzü, stromal hücrelerin polaritesini koruduğuna ve AGM türevi hematopoetik progenitörlerin genişlemesini desteklediğine inanılan 3D sistemi için NK hücre farklılaşmasının tüm seyri boyunca korunur14,15.

Daha önce de belirtildiği gibi, transwell üzerindeki EB'lerin yoğunluğu, başarılı farklılaşma için belirleyici bir faktördür. Bunun anahtar işareti, EB'lerin transwell üzerine implantasyonundan 1 gün sonra ortamın rengidir. Renk hızla sararırsa, bu ya kirlenmeyi ya da aşırı kalabalıklaşmayı gösterir. Sorunu çözmek için, fazladan EB'leri manuel olarak almak ve bunları başka bir transwell'e aktarmak için 1 mL'lik bir pipet kullanılmalıdır.

Bu protokolün önemli bir sınırlaması, IVD ürünlerindeki CD3 - / CD45 + CD56 + hücrelerinin saflığıdır ve saf NK92mi hücrelerine kıyasla inferior sitotoksisiteden kısmen sorumlu olduğuna inanılmaktadır. Üç embriyonik germ tabakasına benzeyen bir EB üretimi yoluyla hematopoetik progenitörleri indüklemek için bir 3D kültür sistemi kullanılmıştır. Bu strateji, kemik iliği mikro ortamında kan hücrelerinin gelişimini taklit eder, böylece farklılaşmayı desteklemek için stromal hücrelere olan ihtiyacı ortadan kaldırır3. Hematopoetik progenitörleri saflaştırmak için bir ayıklama adımı olmadan, IVD ürünlerinin saflığının azaltılması beklenmektedir. Son nokta ürününün saflığını arttırırken karmaşık farklılaşma nişini korumaya yönelik bir strateji, sıralanmış CD3-CD56 + IVD ürünleri için bir genişletme yöntemi geliştirmektir. Örneğin, sıralanmış CD3-CD56+ IVD ürünleri, membrana bağlı IL-21 ile tasarlanmış ışınlanmış K562 hücreleri gibi yapay antijen sunan hücreler (aAPC'ler) üzerinde kültürlenebilir. Kültürde IL-2 arzı ile bu yöntem NK hücre sayılarında 1.000 kat artışsağlayabilir 3.

Diğer bir sınırlama, olumlu bir referans olarak iyi niyetli insan NK hücrelerine sınırlı erişimdir. NK92mi, kokültür testinde kullanılan olumlu referanstır, ancak yeterince doğru değildir. NK92mi hücreleri, kültür gereksinimlerini karşılamak için IL-2'yi otonom olarak üretmek için aktive edilmiş NK hücre fenotipleri16'yı eksprese eden kalıcı bir hücre hattı olan NK92 hücrelerinden tasarlanmıştır. NK92 hücreleri, in vitro K562 hücrelerine karşı, insan birincil NK hücrelerinden17 daha üstün öldürme aktivitesi göstermektedir. IVD ürünlerinin tümör öldürme kapasitesinin daha adil bir karşılaştırması, periferik kan NK hücrelerinin sitotoksisitesini paralel olarak test ederek elde edilebilir, ancak ne yazık ki, kan bankalarına erişim yoktur.

Bu iki sistemli kültür protokolü, hEPSC'lerden CD3−/CD45+CD56+ hücreleri üretmeyi amaçlamaktadır. FACS ile yüzey belirteçlerinin ve sitotoksisitenin değerlendirilmesi, farklılaşma nişini bozmadan 2D sistemlerden hücreler üzerinde rutin olarak gerçekleştirilebilir. CD3-CD56 + hücrelerinin yüzdelerindeki farklılıklara rağmen, 3D ve 2D sistemler CD56 ekspresyonunda benzer varyasyonlara sahip CD3-CD56 + hücrelerini türetebilir (Şekil 3) ve 2D sistem 3D kültür durumundan lenfoid progenitörlerin varlığını yansıtır.

3D kültür sistemini kullanmanın önemi, karmaşık farklılaşma nişi içindeki mekansal ilişkileri ve hücre-hücre etkileşimlerini araştırmak için mekansal transkriptomik veya görüntüleme kütle spektrometrisi gibi yüksek çözünürlüklü profil oluşturma testlerinin kullanılmasına izin vermesidir.

Disclosures

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Acknowledgments

Dr. Handi Cao, Sanxing GAO, David Xiang, Yiming Chao, Ritika Jogani, Owen Chan, Stephanie Cheung ve Celine Chan'a teknik yardımları ve faydalı tartışmaları için teşekkür ederiz. Bu çalışma Platform Teknoloji Fonu tarafından desteklenmiştir. Şekil 1 , BioRender.com ile oluşturulmuştur.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
30 w/v% Albumin Solution, from Bovine Serum(BSA), Fatty Acid Free Wako Chemicals 017-22231 For resuspending cytokines. 
ACCUMAX STEMCELL Technologies  07921
Anti-human-CD159a-PE BD 375104 During antibody staining, 0.5 µL of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 5% FBS)
Anti-human-CD3-APC antibodies BD 555355 During antibody staining, 0.5 µL of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 2% FBS) 
Anti-human-CD45-APC antibodies BD 555485 During antibody staining, 0.5 µL of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 3% FBS)
Anti-human-CD56-PE antibodies BD 555516 During antibody staining, 0.5 µL of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 4% FBS)
Anti-human-CD56-PEcy7 antibodies BD 335826 During antibody staining, 0.5 µL of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 5% FBS)
Anti-human-CD94-APC  BD 559876 During antibody staining, 0.5 µL of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 5% FBS)
Bemis Parafilm M Laboratory Wrapping Film Thermo Scientific 11772644
Cd244 Monoclonal Antibody (eBioC1.7 (C1.7)), Functional Grade, eBioscience Thermo Scientific 16-5838-85
Costar 6.5 mm Transwell, 0.4 µm Pore Polyester Membrane Inserts STEMCELL Technologies 3470
Dapi Solution, 1 mg/mL BD 564907 It is resuspended with ddH2O so the concentration is 10 µM/mL. Add 1 µL of the aliquot in 300 µL of FACS buffer (PBS + 2% FBS) 
DMEM CPOS-Bioreagent core 11965092
DMEM/F12 Thermo Scientific 11320033
FcX, human Biolengend 422302
Fetal Bovine Serum(FBS) qualified E.U.-approved South America CPOS-Bioreagent core 10270106
FlowJo v10.8.0 BD
Gibco  PBS (10x) pH 7.4 CPOS-Bioreagent core 70011044 10x concentrated PBS is manufactured as follows: without calcium, magnesium or phenol red
K562 cells  ATCC  CCL-243
Knockout Serum Replacement Thermo Scientific 10828-028
MyeloCult H5100 medium  STEMCELL Technologies 5150
NK92mi cells  ATCC  CRL-2408 Lot: 70045208. Once thawed, they are cultured in MyeloCult H5100 medium, and maintained the density between 2 x 105 to 1 x 106 cell/mL.
Nunc Cell-Culture Treated Multidishes 12 well plate Thermo Scientific 150628 flat bottom
Nunc Cell-Culture Treated Multidishes 24 well plate Thermo Scientific 142475
Nunc EasYDish Dishes Thermo Scientific 150460
pLenti-GFP Lentiviral Control Vector  CELL BIOLABS LTV-400 It is packaged as the manufactuer suggested (https://www.cellbiolabs.com/sites/default/files/LTV-400-gfp- lentiviral-plasmid.pdf). 40 μL of 50x lentivirus is added with 1 μL 10 mg/mL polybrene per 1 mL of cell suspension. Complete medium change is performed 24 h after the addition of lentivirus. Cells are incubated undisputedly for 3 days at 37 °C, 5% CO2.
Polybrene  EMD Millipore TR-1003-G
Recombinant Human Flt-3 Ligand/FLT3L Protein R&D Systems 308-FK-005 It is resuspend with PBS + 0.2% BSA. Thr working concentration is 10 ng/mL or 12 IU/mL.
Recombinant Human IL-15 Protein R&D Systems 247-ILB-005 It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 10 ng/mL or 4500 IU/mL. 
Recombinant Human IL-18/IL-1F4 Protein R&D Systems 9124-IL-010 It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 50 ng/mL. The IU is not provided by the company. 
Recombinant Human IL-2 Protein R&D Systems 202-IL-010 It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 50 ng/mL or 455 IU/mL. 
Recombinant Human IL-3 Protein, 50ug PeproTech 200-03 It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 5 ng/mL or 14 IU/mL. 
Recombinant Human IL-7 Protein R&D Systems 207-IL-010 It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 20 ng/mL or 8800 IU/mL. 
Recombinant Human SCF Protein R&D Systems 255-SC-010 It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 20 ng/mL or 26 IU/mL. 
STEMdiff Hematopoietic Kit STEMCELL Technologies 5310 Medium A: 45 mL STEMdiff Hematopoietic Basal Medium + STEMdiff Hematopoietic Supplement A ; Medium B: 75 STEMdiff Hematopoietic Basal Medium + STEMdiff Hematopoietic Supplement B
StemSpan lymphoid differentiation coating material STEMCELL Technologies 9950 It is resuspended in PBS (100x)
StemSpan NK cell differentiation medium  STEMCELL Technologies 9960 It is prepared by adding 500 µL StemSpan NK Cell Differentiation Supplement (100x)  into 49.5 mL of SFEM II. Both are provided in StemSpan NK Cell Generation Kit. 
StemSpan lymphoid expansion medium  STEMCELL Technologies 9960 It is prepared by adding 5 mL StemSpan Lymphoid Progenitor Expansion Supplement (10x) into 45 mL of StemSpan SFEM II. Both are provided in StemSpan NK Cell Generation Kit. 
StemSpan NK Cell Generation Kit STEMCELL Technologies 9960 Thaw the medium and materials in room temperature and the medium is stored in 4 °C once thawed. 
The BD LSRFortessa cell analyzer BD
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Thermo Scientific 25300054
Y-27632 dihydrochloride Tocris 1254 working concentration: 10 µM

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gao, X., et al. Establishment of porcine and human expanded potential stem cells. Nature Cell Biology. 21 (6), 687-699 (2019).
  2. Mackinlay, K. M. L., et al. An in vitro stem cell model of human epiblast and yolk sac interaction. eLife. 10, 63930 (2021).
  3. Zhu, H., Kaufman, D. S. An improved method to produce clinical-scale natural killer cells from human pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 2048, 107-119 (2019).
  4. Li, Y., Hermanson, D. L., Moriarity, B. S., Kaufman, D. S. Human iPSC-derived natural killer cells engineered with chimeric antigen receptors enhance anti-tumor activity. Cell Stem Cell. 23 (2), 181-192 (2018).
  5. Vivier, E., Tomasello, E., Baratin, M., Walzer, T., Ugolini, S. Functions of natural killer cells. Nature Immunology. 9 (5), 503-510 (2008).
  6. Dhar, P., Wu, J. D. NKG2D and its ligands in cancer. Current Opinion in Immunology. 51, 55-61 (2018).
  7. Dang, S. M., Kyba, M., Perlingeiro, R., Daley, G. Q., Zandstra, P. W. Efficiency of embryoid body formation and hematopoietic development from embryonic stem cells in different culture systems. Biotechnology and Bioengineering. 78 (4), 442-453 (2002).
  8. Rungarunlert, S., Techakumphu, M., Pirity, M. K., Dinnyes, A. Embryoid body formation from embryonic and induced pluripotent stem cells: Benefits of bioreactors. World Journal of Stem Cells. 1, 11-21 (2009).
  9. Counting cells using a hemocytometer. abcam. , Available from: https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer (2022).
  10. Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity. Journal of Immunological Methods. 294, 15-22 (2004).
  11. Tremblay-McLean, A., Coenraads, S., Kiani, Z., Dupuy, F. P., Bernard, N. F. Expression of ligands for activating natural killer cell receptors on cell lines commonly used to assess natural killer cell function. BMC Immunology. 20, 8 (2019).
  12. Inoue, T., Swain, A., Nakanishi, Y., Sugiyama, D. Multicolor analysis of cell surface marker of human leukemia cell lines using flow cytometry. Anticancer Research. 34 (8), 4539 (2014).
  13. Mhatre, S. Rapid flow cytometry based cytotoxicity assay for evaluation of NK cell function. Indian Journal of Experimental Biology. 52 (10), 983-988 (2014).
  14. Medvinsky, A., Dzierzak, E. Definitive hematopoiesis is autonomously initiated by the AGM region. Cell. 86 (6), 897-906 (1996).
  15. Motazedian, A., et al. Multipotent RAG1+ progenitors emerge directly from haemogenic endothelium in human pluripotent stem cell-derived haematopoietic organoids. Nature Cell Biology. 22 (1), 60-73 (2020).
  16. Gong, J. H., Maki, G., Klingemann, H. G. Characterization of a human cell line (NK-92) with phenotypical and functional characteristics of activated natural killer cells. Leukemia. 8 (4), 652-658 (1994).
  17. Yan, Y., et al. Antileukemia activity of a natural killer cell line against human leukemias. Clinical Cancer Research. 4 (11), 2859-2868 (1998).

Tags

Gelişim Biyolojisi Sayı 191
İnsan Genişletilmiş Potansiyel Kök Hücrelerden Doğal Öldürücü Hücrelerin Üretilmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yu Ching, P., Wang, C., Hang, S.,… More

Yu Ching, P., Wang, C., Hang, S., Liu, P., Sugimura, R. Generation of Natural Killer Cells from Human Expanded Potential Stem Cells. J. Vis. Exp. (191), e64608, doi:10.3791/64608 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter