Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Генерация модели спонтанного аутоиммунного тиреоидита мыши

Published: March 17, 2023 doi: 10.3791/64609
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 3, 1
1Thyroid and Parathyroid Surgery Center, West China Hospital of Sichuan University, 2The Laboratory of Thyroid and Parathyroid Disease, West China Hospital of Sichuan University, 3State Key Laboratory of Biotherapy and Cancer Center, West China Hospital, Sichuan University and Collaborative Innovation Center

ERRATUM NOTICE

Summary

Было установлено несколько типов животных моделей тиреоидита Хашимото, а также спонтанного аутоиммунного тиреоидита у мышей NOD. Мыши H-2h4 являются простой и надежной моделью для индукции HT. В этой статье описан этот подход и оценен патологический процесс для лучшего понимания мышиной модели SAT.

Abstract

В последние годы тиреоидит Хашимото (ГТ) стал наиболее распространенным аутоиммунным заболеванием щитовидной железы. Характеризуется инфильтрацией лимфоцитов и выявлением специфических сывороточных аутоантител. Хотя потенциальный механизм до сих пор не ясен, риск тиреоидита Хашимото связан с генетическими факторами и факторами окружающей среды. В настоящее время существует несколько типов моделей аутоиммунного тиреоидита, включая экспериментальный аутоиммунный тиреоидит (EAT) и спонтанный аутоиммунный тиреоидит (SAT).

EAT у мышей является распространенной моделью ГТ, которая иммунизируется липополисахаридом (ЛПС) в сочетании с тиреоглобулином (Tg) или дополняется полным адъювантом Фройнда (CFA). Модель мыши EAT широко распространена на многих типах мышей. Однако прогрессирование заболевания, скорее всего, связано с ответом антител Tg, который может варьироваться в разных экспериментах.

SAT также широко используется при изучении ГТ в НОД. Мышь H-2h4. НОД. Мышь H2h4 - это новый штамм, полученный в результате скрещивания мыши с диабетом без ожирения (NOD) с B10. A (4R), который значительно индуцируется для ГТ с питанием йодом или без него. Во время индукции НОД. Мышь H-2h4 имеет высокий уровень TgAb, сопровождающийся инфильтрацией лимфоцитов в фолликулярной ткани щитовидной железы. Однако для этого типа мышиной модели существует мало исследований, позволяющих всесторонне оценить патологический процесс при индукции йода.

В этом исследовании установлена модель мыши SAT для исследования ГТ, и патологический процесс изменения оценивается после длительного периода индукции йода. С помощью этой модели исследователи могут лучше понять патологическое развитие ГТ и выявить новые методы лечения ГТ.

Introduction

Тиреоидит Хашимото (ГТ), также известный как хронический лимфоцитарный тиреоидит или аутоиммунный тиреоидит, был впервые зарегистрирован в 1912 году1. ГТ характеризуется инфильтрацией лимфоцитов и повреждением фолликулярной ткани щитовидной железы. Лабораторные тесты в основном проявляются в повышении специфических антител к щитовидной железе, включая антитела к тиреоглобулину (TgAb) и антитела к тиреоидной пероксидазе (TPOAb)2. Заболеваемость ГТ находится в диапазоне 0,4-1,5%, что составляет 20-25% всех заболеваний щитовидной железы, и это значение увеличилось в последние годы3. Кроме того, в большом количестве исследований сообщалось, что ГТ связана с онкогенезом и рецидивом папиллярной карциномы щитовидной железы (ПТК)4,5; Потенциальные механизмы до сих пор остаются спорными. Аутоиммунный тиреоидит также является важным фактором женского бесплодия6. Следовательно, патогенез ГТ должен быть ясным, для чего необходима стабильная и простая животная модель.

Для изучения этиологии ГТ были использованы два основных вида мышиных моделей, включая экспериментальный аутоиммунный тиреоидит (EAT) и спонтанный аутоиммунный тиреоидит (SAT) в настоящих исследованиях 7,8. Восприимчивых мышей иммунизировали специфическими антигенами щитовидной железы (включая сырую щитовидную железу, очищенный тиреоглобулин [ТГ], тиреоидную пероксидазу [ТПО], рекомбинантный эктодомен ТПО и выбранные пептиды ТПО) для создания мышиной модели EAT. Кроме того, адъюванты, в том числе липополисахарид (ЛПС), полный адъювант Фройнда (CFA) и другие необычные адъюванты, также используются во время иммунизации для нарушения иммунной толерантности 9,10,11,12,13,14,15,16,17.

Модель SAT является важной моделью для изучения спонтанного развития аутоиммунного тиреоидита, в основе которого лежит NOD. Мыши H-2h4. НОД. Мышь H-2h4 - это новый штамм, полученный в результате скрещивания NOD и B10. Мыши A(4R) с последующим множественным обратным скрещиванием с NOD с геном предрасположенности к аутоиммунному тиреоидиту IAk18,19. КИВОК. У мышей H-2h4 диабет не развивается, но отмечается высокая заболеваемость аутоиммунным тиреоидитом и синдромом Шегрена (SS)19. Исследования показали, что молекула внутриклеточной адгезии-1 (ICAM-1) высоко экспрессируется в ткани щитовидной железы NOD. Мыши H-2h4 в возрасте 3-4 недель. Более того, с увеличением потребления йода усиливается иммуногенность молекулы тиреоглобулина, что еще больше повышает экспрессию ICAM-1, играющего важную роль в процессе инфильтрации моноцитов21. Эта модель имитирует аутоиммунный процесс, проверяя взаимосвязь между дозой йода и тяжестью заболевания. Установленный метод стабилен, с высокой вероятностью успеха. Модель SAT применяется для индуцирования аутоиммунного тиреоидита в течение многих лет и продолжает оставаться эффективным методом изучения патогенеза аутоиммунного тиреоидита. Однако нынешний метод построения модели EAT является более сложным и дорогим; В разных лабораториях используются разные методы иммунизации и места инъекций. Кроме того, мыши с разным генетическим фоном имеют разные показатели индукции, которые нуждаются в дальнейшем изучении, чтобы выявить мощный механизм.

Однако развитие тиреоидита в модели SAT связано с йодидом натрия, половым диморфизмом и условиями выращивания. Чтобы выявить соответствующую процедуру аутоиммунного тиреоидита в модели SAT, в этой статье описан метод индукции аутоиммунного тиреоидита при различных состояниях. Кроме того, это позволяет изучать патогенез и иммунологический прогресс аутоиммунного тиреоидита на разных стадиях этого заболевания.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Протокол, описанный ниже, был одобрен руководящими принципами по уходу и использованию, установленными Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию Сычуаньского университета.

1. Подготовка

  1. Размещайте всех мышей в определенных условиях, свободных от патогенов, в течение 12-часовых циклов свет-темнота (начиная с 07:00 и 19:00 соответственно). Поддерживайте температуру в помещении на уровне 22 °C. Меняйте постельные принадлежности каждую неделю. Обеспечьте достаточное количество стандартного корма для грызунов и воды.
  2. При приготовлении исходного раствора NaI в воде взвесьте 2,5 г соединения и растворите его в 50 мл стерильной чистой воды при вихретании, чтобы получить исходный раствор 5%. Храните этот исходный раствор в морозильной камере при температуре 4 °C, избегая света, до 8 недель.
  3. Чтобы приготовить рабочий раствор NaI, наберите 2,5 мл исходного раствора и растворите его в 250 мл обычной воды в качестве ежедневной питьевой воды для NOD. Н-2н4 мышам, дать рабочий раствор 0,05%.

2. Индукция тиреоидита

  1. Модель SAT
    1. Подготовьте НОД. Мышей H-2h4 (возраст 8 недель) для исследования путем размещения всех мышей одного пола (без полового диморфизма) в барьерных клетках (пять животных в клетке) с условиями кормления, описанными на шаге 1.1.
    2. Индуцировать аутоиммунный тиреоидит при НОД. Мышей H-2h4 кормите всех мышей 0,05% NaI в течение 8 недель. Меняйте воду NaI каждую неделю и еженедельно оценивайте состояние мышей, включая внешний вид, вес, аппетит, психическое состояние и подвижность.
  2. Модель EAT
    1. Подготовьте мышей BALB/c (8-недельный возраст) к исследованию, разместив всех мышей одного пола (без полового диморфизма) в барьерных клетках (по пять животных в клетке) с условиями кормления, описанными на шаге 1.1. Кормите всех мышей 0,05% NaI в течение 8 недель.
    2. В течение первых 2 недель подкожно вводят смесь CFA и Tg (200 мкл) один раз в неделю.
    3. Начиная с третьей недели, подкожно вводят смесь ИФА и Тг (200 мкл) один раз в неделю в течение 3 недель.

3. Измерения

  1. Подготовка образцов периферической крови
    1. После индукции обезболивают мышей объемом 0,01 мл/г анестетика внутрибрюшинной инъекцией. Приготовьте анестетик, смешав мидазолам (40 мкг/100 мкл для седации), медетомидин (7,5 мкг/100 мкл для седации) и тартрат буторфанола (50 мкг/100 мкл для обезболивания) в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Конкретные концентрации каждого компонента в анестезиологической смеси составляют: мидазолам 13,33 мкг / 100 мкл, медетомидин 2,5 мкг / 100 мкл и буторфанол 16,7 мкг / 100 мкл. Для конкретных дозировок, используемых на мышах, дозы: мидазолам 4 мкг / г, медетомидин 0,75 мкг / г и буторфанол 1,67 мкг / г. Глубина анестезии была подтверждена, когда мышцы конечностей мыши расслабились, усы не реагировали на прикосновения, и произошла потеря педального рефлекса.
    2. После того, как мыши будут анестезированы, подготовьте образцы периферической крови, зафиксировав мышь одной рукой и нажав на кожу глаза, чтобы выпячивать глазное яблоко. Затем вставьте капиллярную трубку во внутренний угол глаза и проникните под углом 30-45 градусов к плоскости ноздри. Надавите, осторожно вращая капиллярную трубку. Кровь будет поступать в трубку через капиллярное действие.
    3. Поместите кровь в холодильник с температурой 4 ° C на 2 часа, а затем центрифугу при 1000 × г в течение 10 минут при 4 ° C, чтобы получить образец. Для дальнейшего анализа храните остальную часть образца при температуре -80 °C.
  2. Подготовка образцов ткани щитовидной железы
    1. Гуманно усыпить животное в соответствии с институциональной политикой. Затем рассеките стенку грудной клетки, чтобы обнажить сердце, разрежьте правое предсердие и введите физиологический раствор в левый желудочек с помощью внутривенной инфузионной иглы, прикрепленной к шприцу объемом 20 мл, пока ткань не станет белой.
    2. Закрепите мышь на диссекционном столе с помощью булавок. Стерилизуйте горлышко 75% этанолом. Разрежьте кожу мыши по срединной линии шеи от верхней части грудины до нижней челюсти тканевыми ножницами, чтобы полностью обнажить ткани шеи.
    3. Понаблюдайте за парой розовых желез, подчелюстными железами, под которыми находится передняя мышца трахеи. Разделите железы и мышцы глазными ножницами и щипцами, чтобы обнажить трахею и щитовидный хрящ.
    4. Отделите ткань под хрящом, используя изогнутые щипцы, чтобы собрать хрящ и трахею вместе. Разрежьте дистальный и проксимальный концы хряща и трахеи соответственно и удалите щитовидную железу вместе с трахеей.
    5. Погрузить железы в 4% параформальдегид на 12-24 ч. Затем переведите ткань на 70% этанол.
    6. Поместите отдельные доли биопсийного материала щитовидной железы в технологические кассеты и обезвоживайте через следующий последовательный градиент спирта: 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 100%, этанол в течение 40 мин каждый; 1/2 ксилола + 1/2 абсолютного этанола в течение 2 ч; 100% ксилол в течение 1,5 ч; 100% ксилол в течение 1,5 ч; 1/2 ксилола + 1/2 парафина на 2 ч; духовка при температуре 40°С в течение 40 мин; парафин I в течение 30 мин; и парафин II в течение 30 мин. Встройте их в блоки парафина.
    7. Перед окрашиванием депарафинируют срезы ткани щитовидной железы толщиной 5 мкм в ксилоле (как показано ниже) и регидратируют через следующие снижающиеся концентрации этанола: ксилол I в течение 10 мин; ксилол II в течение 10 мин; ксилол III в течение 10 мин; абсолютный этанол I в течение 5 мин; абсолютный этанол II в течение 5 мин; 90% спирт в течение 5 мин; 80% спирт в течение 5 мин; 70% спирт в течение 5 мин; и 50% спирт в течение 5 мин.
    8. Окрашивание тканей гематоксилином и эозином (H&E). Пятнить гематоксилином в течение 15 мин, промыть водопроводной водой в течение 15 мин, добавить 1% солянокислый этанол в течение 10 с, промыть проточной водой, а затем 50%, 70% и 80% этанолом каждый в течение 3 мин. Проведите окрашивание эозином эозином в течение 2 мин и смойте проточной водой. Поместите парафиновые секции последовательно в 75% этанол на 2 мин, 85% этанол на 2 мин, абсолютный этанол на 5 мин и ксилол на 5 мин. Закрепите срезы нейтральной резинкой и предметными стеклами.
    9. Чтобы оценить степень лимфоцитарного тиреоидита, оцените срезы щитовидной железы следующим образом: 0: незначительная инфильтрация лимфоцитов в ткани щитовидной железы или ее отсутствие; 1+: более 1/8 железы инфильтрировано в одном или нескольких очагах; 2+: не более 1/4 железы инфильтрировано лимфоцитами; 3+: 1/4-1/2 железы инфильтрировано лимфоцитами; 4+: разрушается более 1/2 железы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется удалить щитовидный хрящ, чтобы сохранить всю структуру щитовидной железы мыши, которая слишком мала для удаления из трахеи.
  3. Измерение TPOAb
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки яичников китайского хомяка (CHO), стабильно экспрессирующие ТПО мыши, были созданы в нашей лаборатории. КДНК TPO мыши была удалена XbaI и NheI. Затем кДНК переносили на pcDNA5/FRT. После того, как плазмида была успешно построена, ее трансфицировали в клетки СНО и отбирали гигромицином B (100 г / мл).
    1. После построения клеток mTPO-CHO разбавьте сыворотки мыши из шага 3.1.3 (1:50) и инкубируйте с клетками mTPO-CHO в течение 2 часов. После инкубации исключите окрашивание клеток йодидом пропидия (1 г/мл) и проанализируйте образец методом проточной цитометрии с использованием флуоресцеин-изотиоцианат-конъюгированного, аффинно-очищенного козьего антимышиного IgG. Скрининг выживших одноклеточных популяций по каналам FSC-A и SSC-A и выбор клеток, помеченных FITC и PI, из одноклеточных популяций21.
    2. Включите сыворотку неиммунизированных мышей BALB/c или C57BL/6, связанных с IgG, в качестве отрицательного контроля. Включите мышиные моноклональные антитела к человеческому TPO22 в качестве положительного контроля, который распознает TPO23 мыши. Выразите данные привязки ТПО в виде геометрических средств.
  4. Измерение TgAb
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте набор для ИФА для обнаружения тиреоглобулина, следуя инструкциям производителя.
    1. Разведите стандартные образцы в микроцентрифужной пробирке согласно инструкции. Достаньте набор из холодильника и держите его при комнатной температуре в течение 30 минут.
    2. Установите стандартные скважины, пустые колодцы и испытательные скважины. Пустые скважины получают только буфер, в то время как стандартные скважины получают стандартные растворы. Добавьте 10 мкл образцов в испытательные лунки. При добавлении образцов старайтесь не касаться стенок лунок и осторожно встряхивайте пластину, чтобы переместить образцы на дно лунок.
    3. Включите сыворотку от мышей BALB/c, иммунизированных Tg, CFA и IFA24 , в качестве положительного контроля и сыворотку от NOD 8-недельного ребенка. Мыши H-2h4 на обычной воде в качестве отрицательного контроля.
    4. Инкубируйте образцы на водяной бане при температуре 37 °C в течение 30 минут. Разбавьте моющий буфер дистиллированной водой в соотношении 1:30. Затем снимите герметизирующую пленку, стряхните жидкость внутри ферментной пластины, высушите на впитывающей бумаге и добавьте 350 мкл моющего буфера в течение 30 с. Повторите эту процедуру пять раз, а затем промокните лунки насухо.
    5. В каждую лунку, кроме глухих лунок, добавляют по 50 мкл ферментирующего реагента и выдерживают на водяной бане при 37° в течение 30 мин. Снимите герметизирующую пленку, стряхните жидкость внутри ферментной пластины и промокните насухо на впитывающей бумаге.
    6. Добавьте 50 мкл проявителя А в каждую лунку, а затем 50 мкл проявителя B и осторожно встряхните лунки для перемешивания в течение 5 минут. Добавьте 50 мкл раствора в каждую лунку в течение 15 мин, чтобы остановить реакцию. Измерьте коэффициент поглощения (OD) каждой лунки на длине волны 450 нм с помощью считывателя микропланшетов. Представьте данные TgAb в виде оптической плотности (OD) на длине волны 490 нм.
  5. Измерение Т4 и тиреотропного гормона (ТТГ)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Измерьте уровни Т4 и ТТГ (в аликвотах 10 мкл) с помощью ИФА, следуя инструкциям производителя.
    1. Разбавьте конъюгат фермента до 1:11 с разбавителем анализа; разбавить измеряемые образцы (1:100) с помощью 0,01 М PBS.
    2. Добавляют 10 мкл стандарта и образца в соответствующие лунки, добавляют по 100 мкл конъюгата фермента в каждую лунку и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 часа.
    3. Слейте жидкость в лунки и трижды очистите ее промывочным буфером.
    4. Добавьте 100 мкл 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (ТМБ) и инкубируйте при комнатной температуре в течение 15 мин.
    5. Добавьте 50 мкл раствора и аккуратно перемешайте в течение 15-20 с.
    6. Определите коэффициент поглощения (OD) с помощью считывателя микропланшетов на длине волны 450 нм и рассчитайте концентрацию образца.
    7. Используйте статистическое программное обеспечение для выполнения t-критерия или теста ранговой суммы и построения графика результатов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Гистологические изменения разительно различались у женщин и мужчин, продолжительности приема йода и раствора NaI. Как показано на рисунке 1, ~ 10% NOD. У мышей H-2h4 развился SAT даже без индукции йода в возрасте 24 недель, и у всех мышей в конечном итоге развился тиреоидит. При регулярном приеме воды не было существенной разницы в гистологических изменениях между самцами и самками. Добавление NaI в питьевую воду ускоряло развитие тиреоидита. В растворах 0,005%, 0,05% и 0,5% SAT достигал максимальной выраженности на 16, 8 и 8 неделях соответственно после введения воды NaI. После того, как тиреоидит был индуцирован, инфильтрация лимфоцитов продолжалась на протяжении всей жизни мыши. Во время индукции у самок мышей, по-видимому, была тенденция к развитию более тяжелого тиреоидита, чем у самцов в том же состоянии, но не было существенных различий в тяжести лимфоцитарной инфильтрации, которая могла бы быть ограничена количеством образцов.

При регулярном приеме воды без добавления йода уровень TgAb существенно не повышался в возрасте 16 недель, и не было обнаружено существенной разницы между мужчинами и женщинами. Уровни TgAb в NOD. Уровень мышей H-2h4 начал расти на 24 неделе, без разницы между полами, а уровни TgAb продолжали расти до 72 недель (рис. 2A). С добавлением NaI в питьевую воду уровни TgAb начали повышаться на 16-й, 8-й и 8-й неделях с растворами 0,005%, 0,05% и 0,5% NaI соответственно. Тем не менее, уровни TgAb не показали различий между мужчинами и женщинами ни в одном из растворов (рис. 2B-D). Независимо от того, давалась ли вода NaI, уровни TgAb достигали самого высокого уровня в возрасте 72 недель (или через 64 недели после того, как вода NaI была впервые введена).

Наблюдалась более длительная задержка в выявляемости уровней TPOAb по сравнению с TgAb. Эти антитела редко обнаруживались в НОД. Мышей H-2h4 с обычной водой в возрасте 24 недель. При регулярном кормлении водой самки демонстрировали гораздо более высокие уровни TPOAb, чем самцы через 72 недели (рис. 2E). Та же тенденция к межполовым различиям наблюдалась и в НОД. Мыши H-2h4 в течение 16, 8 и 8 недель при введении воды NaI 0,005%, 0,05% и 0,5% соответственно (рис. 2F-H) Примечательно, однако, что, когда концентрация NaI превышала 0,05% во время индукции, уровни TPOAb достигали своего максимума через 64 недели после первого введения воды NaI, и не было никакой разницы между самцами и самками (рис. 2G, З).

Кроме того, уровень ТТГ в сыворотке крови у мужчин НОД. Мышей H-2h4 было значительно выше, чем у самок на разных стадиях кормления, независимо от того, давалась ли вода NAI или нет. При регулярном приеме воды уровень ТТГ NOD. Количество мышей H-2h4 начало увеличиваться в возрасте 24 недель, и аналогичная тенденция наблюдалась в группах йодной диеты с концентрациями 0,005%, 0,05% и 0,5% через 16, 8 и 8 недель соответственно после раздельного приема йода. Уровень ТТГ продолжал расти на протяжении всего периода индукции, достигнув пика на 64 неделе. Кроме того, наблюдалась значительная разница в уровнях ТТГ между мужчинами и женщинами в остальной части НОД. Мыши H-2h4 (рис. 3A-D). КИВОК. У мышей H-2h4 не наблюдалось зоба или гипотиреоза после приема йода. Независимо от того, вводились ли йодные агенты, не было связанных с полом различий в уровнях Т4 в NOD. Мыши H-2h4. Однако с увеличением продолжительности индукции уровни Т4 имели тенденцию к снижению у обоих полов в группах йодистой воды (без существенной разницы) (рис. 3E-H).

Половой диморфизм в патологическом процессе и уровни TPOAb были обнаружены у потомства NOD. Мыши H-2h4, но не TgAb. Как и в других исследованиях25,26, уровни TPOAb были значительно увеличены у модельных мышей после приема йодида с пищей в течение 2-4 месяцев, и наблюдалась разница, связанная с полом. Кроме того, уровни ТТГ были выше у мужчин, чем у женщин. Мыши H-2h4 с пищевыми добавками йодида или без них, что аналогично другим штаммам мышей. Эта разница сохранялась на протяжении всей жизни животных, на которых, возможно, не влияли уровни TPOAb или TgAb.При воздействии 0,05% NaI у большинства мышей через 8 недель развился тиреоидит, который имел аналогичный эффект с 0,5% NaI. В то время как 0,005% NaI оказывал аналогичное влияние на NOD. У мышей H-2h4, которых кормили обычной водой, концентрация 0,05% NaI (после 8 недель индукции) может быть предпочтительным условием для индукции аутоиммунного тиреоидита. Уровни Т4 в НОД. Мыши H-2h4 не имели половых различий и не подвергались воздействию йодных агентов, что согласуется с другими исследованиями27,28. Это может быть связано с относительно коротким временем начала заболевания и компенсаторной функцией щитовидной железы у мышей, что приводит к явлению, аналогичному субклиническому гипотиреозу у мышей. Мы предполагаем, что ось ТТГ мышей в конечном итоге станет декомпенсированной и со временем приведет к различиям.

Figure 1
Рисунок 1: Патологические изменения лимфоцитарной инфильтрации и воспалительные показатели щитовидной железы при НОД. Мыши H-2h4 с йодной диетой или без нее. (А, С, Э, Г) Патологические изменения щитовидной железы при йодной диете 0%, 0,005%, 0,05% и 0,5% при окрашивании ПЭ; 200-кратное увеличение, N = 10/группа. (Б,Д,Ф,Г) Воспаление щитовидной железы определяли по площади инфильтрации лимфоцитов; градация степени лимфоцитарной инфильтрации: 0: почти отсутствует лимфоцитарная инфильтрация; 1+: инвазировано более одной восьмой части железы; 2+: вторгается четверть железы; 3+: поражается от четверти до половины железы; 4+: разрушается более половины железы. N = 10/группа. Значимые отличия: *p < 0,05; **p < 0,01. Сокращения: F = женский; M = мужчина; СЗ = N недель. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Аутоантитела в NOD. Мыши H-2h4 на обычной и йодсодержащей воде. (А-Д) Аутоантитела к Tg в NOD. Мыши H-2h4 на обычной воде (в возрасте 8, 16, 24 и 72 недель отдельно) и йодидной воде - 0,005%, 0,05% и 0,5% (через 0, 8, 16 и 64 недели после начала приема йода). (Е-Х) Аутоантитела к ТПО в НОД. Мыши H-2h4 на обычной воде (в возрасте 8, 16, 24 и 72 недель отдельно) и йодидной воде - 0,005%, 0,05% и 0,5% (через 0, 8, 16 и 64 недели после начала приема йода). Значения для TgAb сообщаются как оптическая плотность ИФА (OD) 490 нм (среднее значение ± стандартной ошибки среднего SEM), а значения для TPOAb сообщаются как среднее геометрическое при проточной цитометрии. N = 8/группа. Значимые отличия: *p < 0,05; **p < 0,01; p < 0,001. Сокращения: Tg = тиреоглобулин; TgAb = аутоантитела к Tg; ТПО = тиреоидная пероксидаза; TPOAb = аутоантитела к ТПО; F = женщина; M = мужчина; СЗ = N недель. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Уровни ТТГ и Т4 в НОД. Мыши H-2h4 на обычной и йодсодержащей воде. (А-Д) Уровни ТТГ и (E-H) Т4 на обычной воде (в возрасте 8, 16, 24 и 72 недель отдельно) и йодидной воде - 0,005%, 0,05% и 0,5% (через 0, 8, 16 и 64 недели после начала приема йода). Значения ТТГ измеряли методом радиоиммунного анализа (мЕд/л, среднее ± стандартная ошибка среднего СЭМ). N = 8/группа. Значимые отличия: *p < 0,05; **p < 0,01; p < 0,001; *p < 0,0001. Сокращения: ТТГ = тиреотропный гормон; F = женщина; M = мужчина; СЗ = N недель. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ГТ возникает из-за расстройства аутоиммунной системы, вызванного лимфоцитами, проникающими в щитовидную железу, что еще больше ухудшает функцию щитовидной железы, вырабатывая при этом специфические для щитовидной железы антитела. Уровни ТТГ, TgAb и TPOAb в сыворотке крови у пациентов с ГТ значительно повышены27. В настоящее время для изучения этиологии аутоиммунного тиреоидита широко используются два основных вида мышиных моделей: EAT и SAT29. Мышей EAT в основном иммунизируют с использованием белков и адъювантов для создания аномальной иммунной среды in vivo. Такой подход используется уже много лет и продолжает оставаться эффективным30,31. Кроме того, новые подходы к индуцированию тиреоидита включают инъекцию дендрических клеток (ДК), импульсно вводимых Tg32, экспрессию Tg или TPO in vivo аденовирусными векторами или плазмидами31, трансплантацию щитовидной железы аллогенных мышей и инъекцию ЛПС. Однако успешное построение модели тиреоидита обычно более ограничено генетическим фоном экспериментальной мышиной модели, сингенными антигенами и технологиями клеточной биологии. Кроме того, специфические адъюванты могут индуцировать более сложную иммунную среду, что затрудняет исследование иммунологического процесса аутоиммунного тиреоидита. Поэтому мы считаем, что SAT NOD. Мыши H-2h4 могут лучше проиллюстрировать патогенез тиреоидита Хашимото по сравнению с моделью EAT. В частности, иммунизация сильнодействующими адъювантами и тиреоглобулином не требуется для SAT33. Чтобы ускорить прогрессирование SAT, йод добавляют в питьевую воду NOD. Мыши H-2h4. Хотя возникающий тиреоидит не имеет того же механизма, по которому тиреоидит возникает у людей, йод действительно является важным фактором, влияющим на тиреоидит. Кроме того, в этой модели йодные агенты могут быстро вызвать тиреоидит при НОД. Мыши H-2h4 и NOD. У мышей H-2h4, которые не получают йод, в конечном итоге также может развиться тиреоидит. Поскольку экспериментальный протокол в большинстве лабораторий отличается, мы провели более всестороннюю оценку NOD. H-2h4 мышей во время индукции тиреоидита.

В процессе построения модели некоторые моменты требуют пристального внимания. Регулярное добавление питьевой воды и оценка общего состояния мышей позволяет избежать случайной гибели мышей. Рекомендуется держать не более пяти мышей в клетке во время индукции, чтобы обеспечить достаточное кормление NaI каждой мыши. Тем не менее, количество мышей также может меняться в соответствии с правилами и положениями конкретного учреждения для животных. Поскольку в нашей лаборатории обнаружен половой диморфизм, для эксперимента предлагаются однополые мыши (для экспериментов с особыми требованиями к выявлению тиреоспецифических антител рекомендуются самки). Предлагается выбирать 8-недельных мышей, так как у 10% мышей развивается спонтанный тиреоидит в возрасте 16 недель, и у всех мышей развивается тиреоидит в конечном итоге без воды NaI. Поражения щитовидной железы сохраняются на протяжении всей жизни мышей, и у следующего поколения развивается тиреоидит при рождении. Поэтому для сохранения мышей рекомендуется использовать 8-недельных мышей. Важно отметить, что TPOAb больше подходит в качестве индикатора обнаружения, чем TgAb при использовании NOD. Мыши H-2h4 имитируют тиреоидит. Однако при измерении уровней TPOAb продолжительность индукции должна быть более отсроченной, чем TgAb.

В заключение в этой статье описывается создание модели SAT с NOD. Мыши H-2h4 и исследование влияния различных факторов на эту модель. Хотя он не идеально имитирует патогенез и механизм аутоиммунного заболевания щитовидной железы, NOD. Мышь H-2h4 является стабильной животной моделью с большим потенциалом в области аутоиммунных заболеваний щитовидной железы. Учитывая, что это простая в построении модель на животных и она очень воспроизводима, есть надежда, что этот метод поможет улучшить применение мышиных моделей SAT в различных исследовательских институтах.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Все авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.

Acknowledgments

Мышиные моноклональные антитела к человеческому ТПО (используемые в качестве положительного контроля) были предоставлены доктором. Карайоном и доктором Ж. Руфом (Марсель, Франция). Авторы благодарят всех участников этого исследования и членов нашей исследовательской группы. Эта работа была частично поддержана грантами Фонда постдокторантуры Западно-Китайской больницы, Сычуаньский университет, Китай (2020HXBH057) и Программы научно-технической поддержки провинции Сычуань (проект No 2021YFS0166)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Butorphanol tartrate Supelco L-044 
Dexmedetomidine hydrochloride  Sigma-Aldrich 145108-58-3
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) well Sigma-Aldrich M9410-1CS
Ethanol macklin 64-17-5 
Freund’s Adjuvant, Complete  Sigma-Aldrich F5881 
Freund’s Adjuvant, Incomplete  Sigma-Aldrich F5506
Goat anti-Mouse IgG  invitrogen SA5-10275 
Midazolam solution  Supelco M-908 
Mouse/rat thyroxine (T4) ELISA Calbiotech DKO045
Paraformaldehyde macklin 30525-89-4 
Propidium iodide Sigma-Aldrich P4864
Sodium Iodine Sigma-Aldrich  7681-82-5
Thyroglobulin Sigma-Aldrich  T1126
Thyroglobulin  ELISA Kit Thermo Scientific EHTGX5
TSH ELISA Calbiotech DKO200
Xylene macklin 1330-20-7

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ralli, M., et al. Hashimoto's thyroiditis: An update on pathogenic mechanisms, diagnostic protocols, therapeutic strategies, and potential malignant transformation. Autoimmunity Reviews. 19 (10), 102649 (2020).
  2. Zhang, Q. Y., et al. Lymphocyte infiltration and thyrocyte destruction are driven by stromal and immune cell components in Hashimoto's thyroiditis. Nature Communications. 13 (1), 775 (2022).
  3. Ruggeri, R. M., et al. Autoimmune comorbidities in Hashimoto's thyroiditis: different patterns of association in adulthood and childhood/adolescence. European Journal of Endocrinology. 176 (2), 133-141 (2017).
  4. Resende de Paiva, C., Grønhøj, C., Feldt-Rasmussen, U., von Buchwald, C. Association between Hashimoto's thyroiditis and thyroid cancer in 64,628 patients. Frontiers in Oncology. 7, 53 (2017).
  5. Ehlers, M., Schott, M. Hashimoto's thyroiditis and papillary thyroid cancer: are they immunologically linked. Trends in Endocrinology and Metabolism. 25 (12), 656-664 (2014).
  6. Medenica, S., et al. The role of cell and gene therapies in the treatment of infertility in patients with thyroid autoimmunity. International Journal of Endocrinology. 2022, 4842316 (2022).
  7. Rose, N. R. The genetics of autoimmune thyroiditis: the first decade. Journal of Autoimmunity. 37 (2), 88-94 (2011).
  8. Kolypetri, P., King, J., Larijani, M., Carayanniotis, G. Genes and environment as predisposing factors in autoimmunity: acceleration of spontaneous thyroiditis by dietary iodide in NOD.H2(h4) mice. International Reviews of Immunology. 34 (6), 542-556 (2015).
  9. Terplan, K. L., Witebsky, E., Rose, N. R., Paine, J. R., Egan, R. W. Experimental thyroiditis in rabbits, guinea pigs and dogs, following immunization with thyroid extracts of their own and of heterologous species. The American Journal of Pathology. 36 (2), 213-239 (1960).
  10. Alexopoulos, H., Dalakas, M. C. The immunobiology of autoimmune encephalitides. Journal of Autoimmunity. 104, 102339 (2019).
  11. Noviello, C. M., Kreye, J., Teng, J., Prüss, H., Hibbs, R. E. Structural mechanisms of GABA receptor autoimmune encephalitis. Cell. 185 (14), 2469-2477 (2022).
  12. Pudifin, D. J., Duursma, J., Brain, P. Experimental autoimmune thyroiditis in the vervet monkey. Clinical and Experimental Immunology. 29 (2), 256-260 (1977).
  13. Esquivel, P. S., Rose, N. R., Kong, Y. C. Induction of autoimmunity in good and poor responder mice with mouse thyroglobulin and lipopolysaccharide. The Journal of Experimental Medicine. 145 (5), 1250-1263 (1977).
  14. Kong, Y. C., et al. HLA-DRB1 polymorphism determines susceptibility to autoimmune thyroiditis in transgenic mice: definitive association with HLA-DRB1*0301 (DR3) gene. The Journal of Experimental Medicine. 184 (3), 1167-1172 (1996).
  15. Kotani, T., Umeki, K., Hirai, K., Ohtakia, S. Experimental murine thyroiditis induced by porcine thyroid peroxidase and its transfer by the antigen-specific T cell line. Clinical and Experimental Immunology. 80 (1), 11-18 (1990).
  16. Ng, H. P., Banga, J. P., Kung, A. W. C. Development of a murine model of autoimmune thyroiditis induced with homologous mouse thyroid peroxidase. Endocrinology. 145 (2), 809-816 (2004).
  17. Ng, H. P., Kung, A. W. C. Induction of autoimmune thyroiditis and hypothyroidism by immunization of immunoactive T cell epitope of thyroid peroxidase. Endocrinology. 147 (6), 3085-3092 (2006).
  18. Ellis, J. S., Braley-Mullen, H. Mechanisms by which B cells and regulatory T Cells influence development of murine organ-specific autoimmune diseases. Journal of Clinical Medicine. 6 (2), 13 (2017).
  19. Fang, Y., Yu, S., Braley-Mullen, H. Contrasting roles of IFN-gamma in murine models of autoimmune thyroid diseases. Thyroid. 17 (10), 989-994 (2007).
  20. Fang, Y., Zhao, L., Yan, F. Chemokines as novel therapeutic targets in autoimmune thyroiditis. Recent Patents on DNA & Gene Sequences. 4 (1), 52-57 (2010).
  21. Chen, C. R., et al. Antibodies to thyroid peroxidase arise spontaneously with age in NOD.H-2h4 mice and appear after thyroglobulin antibodies. Endocrinology. 151 (9), 4583-4593 (2010).
  22. Ruf, J., et al. Relationship between immunological structure and biochemical properties of human thyroid peroxidase. Endocrinology. 125 (3), 1211-1218 (1989).
  23. McLachlan, S. M., Aliesky, H. A., Chen, C. R., Chong, G., Rapoport, B. Breaking tolerance in transgenic mice expressing the human TSH receptor A-subunit: thyroiditis, epitope spreading and adjuvant as a 'double edged sword'. PLoS One. 7 (9), e43517 (2012).
  24. McLachlan, S. M., Aliesky, H. A., Chen, C. R., et al. Breaking tolerance in transgenic mice expressing the human TSH receptor A-subunit: thyroiditis, epitope spreading and adjuvant as a 'double edged sword’[J]. PLoS One. 7 (9), e43517 (2012).
  25. Hutchings, P. R., et al. Both CD4(+) T cells and CD8(+) T cells are required for iodine accelerated thyroiditis in NOD mice. Cellular Immunology. 192 (2), 113-121 (1999).
  26. Xue, H., et al. Dynamic changes of CD4+CD25 + regulatory T cells in NOD.H-2h4 mice with iodine-induced autoimmune thyroiditis. Biological Trace Element Research. 143 (1), 292-301 (2011).
  27. Hou, X., et al. Effect of halofuginone on the pathogenesis of autoimmune thyroid disease in different mice models. Endocrine, Metabolic & Immune Disorders Drug Targets. 17 (2), 141-148 (2017).
  28. McLachlan, S. M., et al. Dissociation between iodide-induced thyroiditis and antibody-mediated hyperthyroidism in NOD.H-2h4 mice. Endocrinology. 146 (1), 294-300 (2005).
  29. Danailova, Y., et al. Nutritional management of thyroiditis of hashimoto. International Journal of Molecular Sciences. 23 (9), 5144 (2022).
  30. Carayanniotis, G. Molecular parameters linking thyroglobulin iodination with autoimmune thyroiditis. Hormones. 10 (1), 27-35 (2011).
  31. Verginis, P., Li, H. S., Carayanniotis, G. Tolerogenic semimature dendritic cells suppress experimental autoimmune thyroiditis by activation of thyroglobulin-specific CD4+CD25+ T cells. Journal of Immunology. 174 (11), 7433-7439 (2005).
  32. Flynn, J. C., et al. Superiority of thyroid peroxidase DNA over protein immunization in replicating human thyroid autoimmunity in HLA-DRB1*0301 (DR3) transgenic mice. Clinical and Experimental Immunology. 137 (3), 503-512 (2004).
  33. Akeno, N., et al. IFN-α mediates the development of autoimmunity both by direct tissue toxicity and through immune cell recruitment mechanisms. Journal of Immunology. 186 (8), 4693-4706 (2011).

Tags

Опровержение выпуск 193

Erratum

Formal Correction: Erratum: Generation of a Mouse Spontaneous Autoimmune Thyroiditis Model
Posted by JoVE Editors on 06/05/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Generation of a Mouse Spontaneous Autoimmune Thyroiditis Model. The Protocol section was updated.

Step 3.1.1 of the Protocol was updated from:

After the induction, anesthetize the mice with a volume of 0.01 mL/g anesthetic by intraperitoneal injection. Prepare the anesthetic by mixing midazolam (40 µg/100 µL for sedation), medetomidine (7.5 µg/100 µL for sedation), and butorphanol tartrate (50 µg/100 µL for analgesia) in phosphate-buffered saline (PBS).

to

After the induction, anesthetize the mice with a volume of 0.01 mL/g anesthetic by intraperitoneal injection. Prepare the anesthetic by mixing midazolam (40 µg/100 µL for sedation), medetomidine (7.5 µg/100 µL for sedation), and butorphanol tartrate (50 µg/100 µL for analgesia) in phosphate-buffered saline (PBS).
NOTE: The specific concentrations of each component in the anesthesia mixture are: midazolam 13.33µg/100µL, medetomidine 2.5µg/100µL, and butorphanol 16.7µg/100µL. For specific dosages used in mice, the doses are: midazolam 4µg/g, medetomidine 0.75µg/g, and butorphanol 1.67µg/g. Anesthesia depth was confirmed when the mouse's limb muscles relaxed, the whiskers had no touch response, and there was loss of  pedal reflex.

Step 3.1.2 of the Protocol was updated from:

After the mice are anesthetized, cut off their whiskers with ophthalmic scissors to prevent blood from flowing down the whiskers and causing hemolysis. Fix the mouse with one hand and press the skin of the eye to make the eyeball protrude. Quickly remove the eyeball and draw 1 mL of blood into the microcentrifuge tube via a capillary tube.

to

After the mice are anesthetized, prepare the peripheral blood samples, by fixing the mouse with one hand and pressing the eye skin to protrude the eyeball. Then, insert the capillary tube into the inner corner of the eye and penetrate at a 30-45 degree angle to the plane of the nostril. Apply pressure while gently rotating the capillary tube. Blood will flow into the tube via capillary action.

Step 3.2.1 of the Protocol was updated from:

Dissect the chest wall to expose the heart, cut open the right atrium, and infuse saline into the left ventricle by an intravenous infusion needle attached to a 20 mL syringe until the tissue turns white.

to

Humanely euthanize the animal according to the institutional policies. Then, dissect the chest wall to expose the heart, cut open the right atrium, and infuse saline into the left ventricle by an intravenous infusion needle attached to a 20 mL syringe until the tissue turns white.

Генерация модели спонтанного аутоиммунного тиреоидита мыши
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Qian, Y., He, L., Su, A., Hu, Y.,… More

Qian, Y., He, L., Su, A., Hu, Y., Zhu, J. Generation of a Mouse Spontaneous Autoimmune Thyroiditis Model. J. Vis. Exp. (193), e64609, doi:10.3791/64609 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter