Summary
本稿では、従来のボイドスポットアッセイにビデオモニタリングを組み込むことで、マウスの排尿行動を研究する新しい方法について説明します。このアプローチは、排尿イベントに関する時間的、空間的、および体積情報と、その日の明期と暗期におけるマウスの動作の詳細を提供します。
Abstract
正常な排尿行動は、神経系の適切な制御下にある膀胱、尿道、および尿道括約筋の協調機能の結果です。マウスモデルにおける随意排尿行動を研究するために、研究者は、動物のケージの床に並ぶろ紙に沈着した尿斑の数と面積を測定する方法であるボイドスポットアッセイ(VSA)を開発しました。技術的には単純で安価ですが、このアッセイをエンドポイントアッセイとして使用する場合、排尿イベントの時間的分解能の欠如や、重複する尿スポットの定量化の難しさなど、制限があります。これらの制限を克服するために、リアルタイムVSA(RT-VSA)と呼ばれるビデオ監視VSAを開発し、排尿頻度を決定し、排尿量と排尿パターンを評価し、その日の暗期と明期の両方で6時間の時間枠で測定を行うことができます。このレポートに記載されている方法は、健康状態および疾患状態における自発的排尿の生理学的および神経行動学的側面を調査するさまざまなマウスベースの研究に適用できます。
Introduction
尿の貯蔵と排尿は、骨盤神経と下腹部神経を介して膀胱充満状態に関する情報を受け取る中枢回路(中枢神経系)によって調整されます。尿路上皮は、尿路を腎盂から近位尿道まで裏打ちする上皮であり、尿中に存在する代謝老廃物や病原体に対する強固な障壁を形成します。これは感覚網の不可欠なコンポーネントであり、膀胱の充満状態を感知して下にある組織や求心性神経に伝えます1,2。尿路上皮関門の破壊、または尿路上皮メカノトランスダクション経路の変化は、頻度、切迫感、夜間頻尿、失禁などの下部尿路症状とともに排尿機能障害を引き起こす可能性があります3,4,5,6,7。同様に、老化、糖尿病、下部尿路感染症、間質性膀胱炎、および膀胱に影響を及ぼす他の疾患プロセス、またはその機能を制御する関連回路は、膀胱機能障害を引き起こすことが知られている8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18,19。正常な排尿行動と異常な排尿行動のより良い理解は、異なる排尿パターンを確実に区別できる方法の開発に依存します。
伝統的に、マウスの自発的な排尿行動は、Desjardinsら20によって開発されたボイドスポットアッセイ(VSA)を用いて研究され、その単純さ、低コスト、および非侵襲的アプローチのために広く採用されてきた8、21、22、23、24。このアッセイは通常、エンドポイントアッセイとして行われ、マウスはろ紙で裏打ちされたケージ内で定義された時間過ごし、その後、ろ紙を紫外線(UV)光の下に置いたときの尿スポットの数を数えてサイズを評価することによって分析されます(尿スポットはこれらの条件下で蛍光を発します)20.これらの多くの利点にもかかわらず、従来のVSAにはいくつかの大きな制限があります。マウスは同じ領域で排尿することが多いため、研究者はアッセイの期間を比較的短い期間(≤4時間)に制限する必要があります25。VSAを短時間で実施したとしても、大きな空洞に落ちる小空洞(SVS)を解消したり、尾や足に付着した尿のキャリーオーバーからSVSを判別したりすることはほとんど不可能です。また、SVSが頻繁ではあるが個々の排尿イベント(膀胱炎に反応してしばしば観察される表現型4,26)の結果であるか、排尿後のドリブル(膀胱出口閉塞に関連する表現型)によるものかを区別することも非常に困難です27)。さらに、勤務時間中にアッセイを完了したいという願望は、照明がオフのときに住宅施設にアクセスすることの難しさと相まって、これらのアッセイを24時間の概日周期の明期に制限することがよくあります。したがって、これらの時間的制約は、活動的な夜間のマウス排尿行動の評価を妨げ、概日リズムによって支配される特定の遺伝子または治療を分析する能力を低下させます。
これらの制限のいくつかを克服するために、研究者は排尿行動をリアルタイムで評価するための代替方法を開発しました26,28,29,30,31,32。これらのアプローチのいくつかは、メタボリックケージ26、28、29などの高価な機器の使用、またはサーマルカメラ30の使用を含む。ただし、これらにも制限があります。例えば、代謝ケージでは、尿はメッシュフロアのワイヤーおよび漏斗の壁に付着する傾向があり、収集および測定される尿の量を減少させる。したがって、小さなボイドに関するデータを正確に収集することは困難な場合があります。さらに、メタボリックケージは、排尿事象の空間分布(すなわち、腔の中心に対する隅の排尿)に関する情報を提供しない。サーモグラフィカメラで使用される長波長赤外線は固体を透過しないことを考えると、ビデオサーモグラフィによって評価される排尿活性は、空中で数インチジャンプする可能性があるため、アクティブなマウスでは困難なオープンシステムで実行する必要があります。別のシステムは、マウスケージの金網の床の下で一定の速度で巻き取られるロール状のろ紙で構成される自動ボイドステインオンペーパー(aVSOP)アプローチ33です。このアプローチは、古典的なVSAで発生する紙の損傷と尿の斑点の重なりを防ぎ、その実装により、研究者は数日間にわたって実験を行うことができます。ただし、排尿イベントの正確なタイミングを調査員に提供せず、行動とそれがスポッティングとどのように相関しているかを調べる能力はありません。この情報を得るために、研究者らは、マウスの活動と排尿事象の同時評価を可能にするアプローチである排尿アッセイにビデオモニタリングを組み込んだ31,32。1つのアプローチは、青色発光ダイオード(LED)と緑色蛍光タンパク質フィルターをセットしたビデオカメラを実験ケージの下に配置してボイディングイベントを視覚化し、赤外線LEDとビデオカメラをケージの上に配置してマウスの位置32をキャプチャすることで構成されます。この設定は、ファイバー測光の実行中に排尿動作を監視するために使用されています。しかし、このシステムの明るく照らされた環境では、研究者はマウスを利尿剤で治療して排尿を刺激する必要がありました。別の実験計画では、広角カメラを実験ケージの上下に設置して、マウスの運動活動と排尿イベントをそれぞれ視覚化しました。この場合、ケージ31の下に置かれたUVライトでろ紙を照らすことによって、ケージの床を裏打ちするろ紙に堆積した尿斑が明らかになった。このセットアップは、自発的な排尿行動に関与する脳幹ニューロンを研究するために、その日の明期に4分間の短いアッセイで使用されました31。暗期または>4分の期間の使用に対するこのシステムの適合性は報告されていません。
この記事では、マウスの排尿動作を長期間ビデオで監視できるようにすることで、従来のVSAを強化する方法について説明します。この費用対効果の高いアプローチは、マウスの行動に関連する詳細とともに、一日の明期と暗期の間の長時間の排尿イベントに関する時間的、空間的、および体積情報を提供します3、4、34。ボイディングチャンバーの建設、リアルタイムVSA(RT-VSA)の実装、およびデータの分析に関する詳細情報が提供されます。RT-VSAは、泌尿器系の機能を制御する生理学的メカニズムを理解し、排尿を制御するための薬理学的アプローチを開発し、下部尿路に影響を与える疾患プロセスの分子基盤を定義しようとしている研究者にとって価値があります。
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Protocol
尿路上皮ピエゾ1/2ダブルノックアウトマウス(Pz1/2-KO、遺伝子型:ピエゾ1 fl/fl;ピエゾ2 fl/fl;Upk2CRE+/-)およびコントロール(Pz1 / 2-C、遺伝子型:ピエゾ1 fl/ fl;ピエゾ2 fl/fl;Upk2CRE-/-)は、ジャックス研究所から得られた親株(Piezo1 fl/fl株#029213;ピエゾ2fl / flひずみ#027720;Upk2CRE+/-株#029281)。雌(1.5〜3ヶ月齢、体重17〜20g)と雄(2〜4ヶ月齢、体重23〜29g)の両方のマウスを実験に使用しました。シクロホスファミド誘発性膀胱炎の実験には、野生型C57Bl/6J雌(生後3ヶ月、体重~20g)を用いた(ジャクソン研究所、株#000664)。動物は収容され、実験はピッツバーグ大学施設動物管理使用委員会の承認の下でピッツバーグ大学動物管理施設で実施されました。すべての動物実験は、実験動物の人道的管理および使用に関する公衆衛生サービスポリシーおよび動物福祉法の関連するガイドラインおよび規制に従って実施されました。
1. リアルタイムボイドスポットアッセイ(RT-VSA)用ケージの組立
- RT-VSAリグは、2つのUV電球と2つの広角カメラ(ボトムカメラ)を保持するUVスタンドで構成されており、これらのデバイスは、その日の明期にボイド活動を記録するために使用されます。スタンドに置くために2つのマウスチャンバーを配置します。広角カメラ(トップカメラ)を各マウスチャンバーの蓋に取り付け、その日の暗期に排尿活動を記録するために使用します(図1A)。
- UVスタンドとマウスチャンバーのフレームを、Tスロット付きアルミニウムプロファイルの1 in x 1から構築します。2つのマウスチャンバーとUVスタンドを構築するために使用されるコンポーネントのリストについては 表1 を、組み立てられたコンポーネントと寸法のさまざまなビューについては 図1B–D を参照してください。
- 各マウスチャンバーを、8つのTスロット付きアルミニウムプロファイルを10インチにカットし、4つを14.75インチにカットして構築します。マウスチャンバーの底部を組み立てることから始め、標準のエンドファスナー(表1)を使用して、 図1に従ってTスロットプロファイルを組み立てます。38.5 cm x 26.5 cmのUV透過アクリルをプロファイルの内部チャネルに取り付けて、マウスチャンバーの床を構築します。
注意: 標準のエンドファスナーを使用してTスロットプロファイルを組み立てる方法の詳細については、会社のWebページを参照してください。 - 残りのプロファイルでマウスチャンバーの壁を構築します。38.5 cm x 21.5 cmおよび26.5 cm x 21.5 cmの耐摩耗性(AR)ポリカーボネートパネルをプロファイルに取り付けて、マウスチャンバーの外壁を組み立てます。37.5 cm x 23.9 cmおよび24.4 cm x 23.9 cmのARポリカーボネートパネルを使用して、マウスチャンバーの内部を構築します。
- ARポリカーボネートパネルを標準のエンドファスナー1 / 4-20トレッドで固定します。手順1.3の注のWebページのプロファイルにパネルを取り付ける方法の説明を参照してください。市販のシリコンコーキングを使用して、内部パネル間の接合部をシールします。
- 2つの12インチと2つの14.75インチTスロットプロファイルを使用して、図1Bに示すようにケージの蓋を組み立てます。38.5 cm x 26.5 cm ARポリカーボネートパネルをプロファイルの内部チャネルに取り付けて、蓋を完成させます。
- 12インチカメラプロファイルサポートをケージ上部の長軸に垂直に取り付け、コーナーブラケットの内側に2つのライトトランジションで固定します(図1Bの3とマークされています)。Webカメラの取り付けサポートとしてまっすぐな平板(マーク2)を使用し、図1Bに示すように取り付けます。カメラ取り付けネジでカメラをサポートに取り付けます。
- 10シリーズの標準リフトオフヒンジの右手アセンブリを使用して、蓋をマウスチャンバーの本体に取り付けます(図1Bの1とマークされています)。
- 図1C、Dに従って、4つのTスロットプロファイルを40インチにカットし、4つのTスロットプロファイルを32インチにカットし、4つのTスロットプロファイルを10インチにカットしてUVスタンドを構築します。プロファイルに82.5 cm x 26.5 cmのアクリルミラーシートを取り付けて、UVチャンバーの底部を構築します。
- 82.5cm×30.5cmと26.5cm×30.5cmのアクリルミラーシートを使用して、UVスタンドの壁を構築します。
- 10 シリーズ 5 穴 T 平板 (図 1 C の 2 とマーク)、10 直列 5 穴 L 平板 (図 1 C の 3 とマーク)、および 10 直列 5 穴 T 平板 (図 1C の 1 とマーク) を取り付けて、UV スタンドを固定します。
- 下部カメラを32インチにカットされたTスロットプロファイルに取り付け、 図1Dに示すように、2つのライトトランジションコーナーブラケットでスタンドの下部に取り付けます。まっすぐな平板を使用して、WebカメラをTスロットプロファイルに取り付けます。
- UVランプを内側、前面、背面のプロファイルに取り付け、図1Dに示すようにまっすぐな平板に取り付けます。
- 4台のWebカメラをビデオ監視ソフトウェアを実行しているコンピューターのUSBポートに接続します。
2.実験前の動物の飼育
- 実験用マウスを、目的を持って飼育するか、外部サイトから入手したものを4匹のグループに分けて飼育する。可能であれば、これらの実験には年齢を一致させた雌または雄のマウスを使用してください。動物が外部から入手された場合は、実験手順を実行する前に少なくとも7日間順応させてください。
- 動物施設にいる間は、寝具と濃縮物(プラスチックイグルー、ホイール、シュレッダー用の紙など)を含む標準的なケージに動物を収容し、水とドライマウスチャウを 自由に利用できるように、昼夜12時間のサイクルで飼育します。
3. RT-VSAによる明暗時の録画
注:以下のプロトコルは、RT-VSAを使用して、その日の明期と暗期にマウスの排尿行動を評価する方法を示しています。動物は、午前07:00にツァイトゲバー時間(ZT)= 0で12時間の明と12時間の暗サイクルで保持されます。記録は、明期実験の場合は午前10時30分から午前11時00分(ZT = 3.5〜4.0)、暗期実験の場合は午後6時00分から午後06時30分(ZT = 11.0〜11.5)の間に開始されます。動物が両方の条件下で試験される場合、実験は通常、明試験と暗試験の間に少なくとも5日間連続して、2つの別々の日に実行されます。動物の部屋を掃除したり、ケージを交換したりする日には、排尿行動に影響を与えるストレスが発生する可能性があるため、実験は行わないでください。すべてのステップは、マウスにとって最小限のストレスの条件下で実行する必要があります。
- 実験動物を収容場所からRT-VSA記録室のある処置室まで輸送します。
- RT-VSA記録チャンバーの準備
- 各RT-VSA記録ケージの底にろ紙(24.3 cm x 36.3 cm)を置きます。時間帯に応じて、薄い(明相実験)または厚い(暗相実験)ろ紙を使用してください。
注意: 厚いろ紙は、薄いろ紙よりも細断に対して耐性があるため、アクティブな暗期に使用されます。トップカメラは、暗期に厚いろ紙に沈着した尿の斑点を視覚化するために使用されます。対照的に、光の段階では、周囲の光が上のカメラがろ紙に沈着した尿のしみを検出するのを妨げるため、下部のカメラが使用されます。この場合、薄いろ紙が使用されます。ボトムカメラは、厚いろ紙に堆積した小さなボイドイベントを検出するのに効果がないことがわかりました。 - ろ紙の上に、次のアイテムを置きます:プラスチック製のイグルー(睡眠スペースを提供します)、濃縮用の滅菌1.5 mLマイクロ遠心チューブ、および2〜3個のマウスドライチャウと14〜16 gの水を含む60 mm x 15 mmのプラスチック皿ゲルパック(非湿潤水ゲル;図2)。
注:濃縮目的での1.5 mLマイクロ遠心チューブの使用は、この研究で使用されたエンクロージャーに固有のものでした。 - 記録チャンバーの準備ができたら、実験用マウスをろ紙の上にそっと置き、中に置きます。収容ケージから記録ケージへの動物の移動が最小限のストレスで行われることを確認してください。
- すべての実験動物が蓋を閉じた状態で記録ケージに入ったら、蓋の上部を吸収性ベンチブルーパッドで覆い、プレキシガラスの蓋の表面での直接の周囲光の反射を最小限に抑えます。
- 下部チャンバーのUVライトをオンにします。
注:動物は紫外線と直接接触しません。推奨されるUVライトは、材料のセクションで詳しく説明されています。
- 各RT-VSA記録ケージの底にろ紙(24.3 cm x 36.3 cm)を置きます。時間帯に応じて、薄い(明相実験)または厚い(暗相実験)ろ紙を使用してください。
- RT-VSA録画
- 上部と下部のカメラからビデオを録画するには、複数のWebカメラまたはネットワークカメラから一度に録画するように構成できるビデオ監視録画ソフトウェアを使用します。
- プログラムを開いたら、プログラムウィンドウで Command と R を押して録音を開始します。1秒あたり1フレームのレートでビデオ録画を実行します。
- 録音を開始した直後に、部屋を出て、ドアをそっと閉めます。実験中ずっと部屋が静かにしていることを確認してください。
- RT-VSA の録画を終了する
- 7時間後(明期実験)または翌朝(暗期実験)に処置室に戻る。
- コマンドとTを押して録音を停止します。UVライトをオフにします。
- 録画を停止すると、カメラごとに動画ファイル(.m4v形式)が自動的に生成され、以前に選択した保存先フォルダーにカメラ名で保存されます。各カメラ フォルダー内で、実験が日付別のフォルダーに整理されていることを確認します。
- 各日付/実験フォルダーに、1 つの.m4vファイルと、各ムービー フレームに対応するすべての個別の.jpeg ファイルがあることを確認します。
- 注:.jpegファイルは、ムービーファイルが破損した場合に実験を回復するために使用できます。
- 実験の名前と日付を含むフォルダーをデスクトップに作成し、すべての.m4vファイルをこのフォルダーに転送します。必要に応じて、ムービーファイルを保存してバックアップした後、.jpegファイルを削除します。
- 注:明期実験の場合、ソフトウェアはカメラごとに1つのムービーを生成しますが、暗相実験の場合、カメラごとに2つのムービーを生成します。これは、日付が変わる真夜中以降に新しい.m4vファイルが生成されるためです。
- ムービーを含むフォルダーをフラッシュドライブにコピーして、外部コンピューターで分析します。この手順には数分かかる場合があり、手順 3.5.1 から 3.5.3 と並行して実行できます。
- 記録ケージの清掃と実験マウスの収容場所への移動
- ケージの蓋を覆っているブルーパッドを取り外します。動物を記録ケージから収容ケージに移します。
- 記録チャンバー内の付属品と食品(つまり、プラスチックイグルー、プラスチックチューブ、固形飼料と水ゲルの残りが入った皿、ろ紙)を取り外し、バイオハザード廃棄物に廃棄します。
- ハンド掃除機を使用してケージを清掃し、ケージの底にあるチャウチャウと糞便のペレットを取り除きます。次に、ケージの床と内壁に70%エタノールをスプレーし、柔らかい布で内部を拭きます。ケージの蓋を開けたままにして、風乾させます。
- 動物と一緒に収容ケージを二次容器に入れ、動物を収容場所に戻します。
4. 検量線の作成
注意: 検量線は、ボイドスポット領域を尿量に変換するために必要です。その日の明期と暗期に実験を行う場合は、使用するろ紙の種類(薄いろ紙と厚いろ紙)ごとに1つずつ、2つの検量線を作成する必要があります。検量線は二重に生成されます。各複製は、RT-VSA記録チャンバーに置かれたろ紙上で実行されます。その複雑な組成とUV励起性を考慮して、マウスの尿を使用して検量線を作成します。
- マウスの尿採取
- 柔軟な透明フィルム(10 cm x 15 cm)を取り、ベンチに置きます。
- マウスの尻尾をつかんで首筋をかぶせます。下腹部をそっとマッサージして排尿を誘発します。透明フィルムプラスチックシートの表面に尿を集めます。
- 動物をケージの中にそっと放します。ピペットを使用して、透明フィルムの表面から滅菌済みの1.5 mLマイクロ遠心管に尿を移します。~10 mLのマウス尿が採取されるまで複数のマウスでこの手順を繰り返し、尿をプールし、-20°Cで保存します。
注:明期と暗期の検量線を重複して作成するには、合計~10 mLのマウス尿が必要です。実験マウスにストレスを与えないように、RT-VSA実験にかけるマウスを採尿に使用しないでください。
- 検量線の記録
- ステップ4.1で集めた尿を解凍し、10〜15秒間穏やかにボルテックスして混ぜます。
- 薄いろ紙(24.3 cm x 36.3 cm)を2つのRT-VSA記録ケージのそれぞれに入れます。
- 次の尿量(μL単位)を各ろ紙にピペットで移します:2、5、10、25、50、80、100、200、300、400、500、および750。拡散の結果としてスポットが重なり合うのを防ぐために、スポットを互いに十分な距離を置いて割り当てます。
- ケージの蓋を閉めてパッドで覆います。
- CommandとRを押して記録を開始し、実験の記録に使用したのと同じソフトウェアパラメータを適用します(手順3.3)。
- 尿スポットの最大拡散を可能にするために、1時間の検量線を登録します。 コマンド と T を押して録音を停止します。
- デスクトップに新しいフォルダを作成し、その中に.m4vファイルを配置してから、その後の分析のためにデータをフラッシュドライブに転送します。
- 同様の手順を実行して、厚いろ紙で複製曲線を生成します。この場合、パッドの層を追加して内部を暗くし、暗期の状態をシミュレートします。
- 検量線記録の分析
- ムービープレーヤーソフトウェアで.m4vファイルを開き、ウィンドウを最大化して画面全体に表示します。厚いろ紙で実行された検量線を分析するには、トップカメラで取得したファイルを使用します(図3A)。薄いろ紙で実行された検量線を分析するには、下部カメラで取得したファイルを使用します(図3B)。
- .m4vファイルを再生し、タイム スライダを前後に動かして、完全な 1 時間の検量線ムービーの概要を確認します。
- 小さな尿スポット(<25 μL)が最大の強度を持ち、最大限に広がっている時間範囲を特定します。この時間範囲内でスクリーンショットを撮ります。スクリーンショットファイルに名前を付け、.pngファイルとして保存します(図3A、上パネル)。
注:スクリーンショットは、キーF6を押して撮影されます。スクリーンショット取得用にF6を設定するには、[ システム環境設定]>[キーボード>ショートカット]を選択し、[ 画面の画像をファイルとして保存 ]オプションの右側にあるボックスにF6キーを押します。 - 中型および大型の尿スポット(>50 μL)が最大面積を持つ時間範囲を特定し、スクリーンショットを撮ります。大きな尿スポットが最大拡散を示すまでに、小さな尿スポットの一部が見えなくなる可能性があります。.ファイルに名前を付け、スクリーンショットを.pngファイルとして保存します(図3A、下のパネル)。
- ImageJソフトウェア(NIH)を開き、手順4.3.3で取得した.pngファイルアイコンをドラッグアンドドロップして、画像ファイルを開きます(図4A)。
- ツールバーから [ ポリゴン選択 ] アイコンを選択し、ろ紙の境界線を描きます。
- 次に、メニュー バーから [分析 ] を選択し、展開されたメニューから [ 測定値の設定 ] を選択し、ポップアップ表示されるウィンドウから [ 領域] を選択します。 OK をクリックします。これにより、ステップ4.3.8を実行したときに面積の値を取得できます。
- 次に、メニュー バーから [ 分析 ] をもう一度選択し、展開されたオプションから [ 測定] を選択します。ピクセル2 の面積値を示す列領域を含む結果ウィンドウがポップアップ表示されます(図4:B–D)。
- ツールバーから フリーハンド選択アイコン を選択し、それを使用して個々のボイドスポットの周囲に線を描画します。手順4.3.8のように面積を測定します。ソフトウェアは、新しい測定が実行されると結果テーブルを更新します。新しい番号のセットが前の番号の下に表示されます。分析された各スポットの結果ウィンドウの列領域の下に表示される番号を記録します(図4E–G)。
- レプリケート・スポットごとにステップ 4.3.5 から 4.3.7 を繰り返します。
- ろ紙の総面積を100%に設定し、各尿スポットの面積の割合(%面積)を計算します。この正規化により、カメラのズームまたは位置の違いの結果として発生する可能性のあるエラーが修正されます。
- グラフ作成プログラムで新しいXYテーブルを作成し、X列に尿量(μL単位)の値を挿入し、Y列に%面積の重複値を挿入します。
- 次に、[分析] > [XY 分析] > [非線形回帰 (曲線あて>)] を選択します。表示されるパラメータウィンドウで、[モデル]>[多項式]>[2次多項式(2次)]を選択します。
- 次に、[方法] タブで、[最小二乗回帰]、[重み付けなし]、および [各反復 Y 値を個別のポイントと見なす] をクリックしてマークします。
- [制約]タブで、[ B0]、[制約タイプ]>[定数が等しい]を選択し、[ 値 ]列に「0」と入力します。 OK をクリックします。
5. 実験マウス記録の解析
- 明期(下カメラ)または暗期(上カメラ)で収集したムービーファイルを解析用に開きます。
- タイムスクローラーを前後に動かしてムービーファイルの品質を評価し、分析する6時間の時間枠中にろ紙が無傷のままである(裂けたり噛んだりしない)ことを確認します。紙が破れた場合は、マウスが露出したプラスチックに排尿した可能性があり、定量化できないため、それ以上の分析は行わないでください(図5)。
- 明期または暗期に収集された実験を分析するには、早送りコマンドまたはタイム バー スライダーを使用して、目的のタイム ウィンドウに移動します。明期中の排尿活動は、午前11:00から午後05:00(ZT = 4.0〜10.0)および深夜から午前06:00までの暗期(ZT = 17.0〜23.0)に記録されます。
- >>アイコンをクリックして(または手動でムービーをスクロールして)、マウスが無効になっている証拠を探して、早送りモードでムービーを再生します。これが発生していることを知る最も簡単な方法は、ろ紙に尿の輝点が突然現れるのを探すことです。別の指標は、ケージの角への移動やマウスが排尿しているときの短時間の非アクティブなど、行動の変化を探すことです。
注:ボイドの検出が上手になると、スクロールまたは早送りの速度を上げることができます。ただし、細菌性および化学的に誘発性膀胱炎のマウスでは、非常に多数の小さなボイド4,34があり、ムービーを速く移動しすぎると、排尿イベントを見逃す可能性があります。 - 各ボイドが発生する時刻を登録します。慣例として、排尿の時間は、尿が検出された最初の兆候で記録されます(図6A、B)。
- ボイドの測定を行うには、最初にスクロールバーを使用して時間を前後に移動し、尿スポットの最大拡散が発生した時点を探します。この時点でムービーを一時停止し、手順4.3.3の説明に従ってスクリーンショットを撮ります。分析対象の場所にコンピューターのマウス矢印を置き、関心のあるスポットがスクリーンショットでマークされるようにします(図6C、D)。
- スクリーンショットファイルには、ムービーに表示される順序を考慮して相関番号を使用して名前を付けます。
- ファイルの分析を続行し、ムービー上の各ボイドスポットに対して手順5.5と5.7を繰り返します。すべてのボイドスポットを分析したら、スクリーンショットをキャプチャし、4.3.6で説明されている手順を使用して、ろ紙の総面積を測定します。
- 手順4.3.9の説明に従って、各尿スポットの%面積を計算します。ステップ4で生成された検量線とグラフ作成ソフトウェアの補間機能を使用して、%面積の値を各ボイドスポットの尿量(μL)に変換します。
- グラフ作成ソフトウェアで、検量線のデータを含むXYテーブルを開き、検量線の最後の値の下のY列に%面積値を挿入します(図7A)。
- [結果の表]タブをクリックし、[モデル]タブで[標準曲線から未知数を補間]をクリックして選択し、[OK]を押します。[補間された X 平均値] という名前のタブが、[結果] タブのテーブルの横に表示されます。このタブには、各ボイドスポットの尿量(μL)に対応する補間値を含むテーブルが含まれています。(図7A、B)。
- 手順5.1から5.9を繰り返して、すべての実験マウスを分析します。
- マウスごとに1つのスプレッドシートを使用して、手順5.5から5.10で取得したデータを含むワークブックファイルを作成します(図7C)。明期実験用に1つのファイルを作成し、暗相実験用にもう1つのファイルを作成します。これらのマスターファイルには、すべての生データと、さらなる分析で使用される必要な計算が含まれています。
6. 実験マウスの排尿パターンの解析
- 一次および二次ボイドスポットプロファイルを生成します(図8、A、B、 および図9)。
注:度数分布研究23によると、≥20 μLのボイドスポットは通常、ボイドの総体積の>95%を占め、一次ボイドスポット(PVS)と見なされます8,23,35。≤20 μLのボイドスポットは、二次または小さなボイドスポット(SVS)と見なされます。PVSとSVSの識別は、排尿表現型を特徴付けるための有用なアプローチであることが示されています。SVSの数の増加は、排尿機能障害を示します35。- 目的のボイディングスポットデータ(明期または暗期)を含むマスターファイルから、体積に基づいてスポットを、体積が≥20 μLの場合はPVSとして、体積が<20 μLの場合はSVSとして分類します。
- 数を数え、PVSの平均ボイド容積と総容積を計算します。 数を数え、SVSの総体積を計算します。
- 計算されたパラメータのそれぞれについて、対照を処置したマウスと比較するグラフバーを生成する:PVSの数、PVSの空隙容積、PVSの総体積、SVSの数、SVSの総体積。
- オプション: 時間の経過に伴う空隙動作を示す累積空隙体積プロット(階段関数)を生成します(図10および 図11)。
- ブックのマスター ファイルを開き、時間、分、秒で表される voiding の時間を 10 進形式に変換します。各時点の累積尿量(μL単位)を計算します。
- グラフ作成ソフトウェアでXYテーブルを生成し、X列に10進数の時間、Y列に累積尿量を表示します。時間と尿量のデータをテーブルにコピーします。(0; 0) と (6; 最大値) のデータ ポイントを追加します。これらの点は、排尿量がゼロ(0; 0)の実験開始時(時間:0時間)、および排尿尿の累積値が最後の排尿イベント(6;最大値)で得られた値と等しい実験終了時(時間:6時間)にプロットの水平線を完成させるために必要です。
- グラフをダブルクリックします。グラフの書式設定ウィンドウが表示されます。 [表示設定 ] タブを選択し、[ シンボルの表示 ] ボタンをクリックして選択を解除し、[ 接続線/曲線を表示] をクリックして選択します。[ スタイル ]オプションをクリックして、[ サバイバル]を選択します。
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Representative Results
尿路上皮 ピエゾ1/2 ノックアウトマウスの排尿行動
排尿サイクルの貯蔵段階では、尿路上皮は、膀胱に蓄積された尿によって加えられる張力を感知し、この機械的刺激を漿膜ATP放出などの細胞応答に変換すると仮定されます1,3。我々は以前に、機械的に活性化されたPIEZO1およびPIEZO2チャネルがマウス尿路上皮3,36で発現されることを示した。尿路上皮PIEZOチャネルが正常な排尿行動に重要であるかどうかを判断するために、尿路上皮条件ピエゾ1/2ダブルノックアウトマウス(Pz1/2-KO)マウスおよび年齢および性別を一致させた対照(Pz1/2-C;図9)。雌マウスと雄マウスの両方を、その日の暗期と明期に6時間テストし、ステップ6.1で説明したようにデータを分析しました。対照群の明期と暗期の排尿活動を比較すると、雌と雄の両方が活動期間中にPVSの数と総量の増加を示したことがわかりました。この観察結果は、マウスが異質な環境にあったとしても、マウスの排尿行動の概日的性質(活発な暗期に最も高い)が維持されたことを示しています。それらの不活性な明期の間、我々は対照対応物(Pz1/2-C)と比較して、雌または雄のPz1/2-KOマウスについて分析されたパラメータのいずれにおいても有意差を観察しなかった。しかし、活動的な暗期に動物を試験したところ、雌と雄の両方のPz1/2-KOマウスは、SVSの数と総体積の有意な増加を特徴とする排尿表現型の変化を示しました(図9)。雌または雄のPz1/2-KOでは、対応する対照と比較して、PVS数、PVSあたりの平均体積、または総PVS量に有意差はありませんでした。以上の結果から,尿路上皮PIEZO1/2チャネルは,マウスの不活性明期には排尿機能に有意な役割を果たさないが,活動期暗期における頻繁なスポッティング防止に重要であることが示唆された。
図 9 に示す結果は、エンドポイント VSA と比較して RT-VSA を使用する 2 つの利点を示しています。まず、分析が明期にのみ行われた場合、尿路上皮PIEZO1/2チャネルは排尿機能に関与していないと誤って結論付けたことになります。第二に、ほとんどのエンドポイントVSA研究では、SVSは実験ノイズとして扱われ、場合によっては後続の分析から除外されました23。RT-VSAでは、SVSはPVSの二次的なものではなく、個々のイベント(キャリーオーバーまたはエンド排尿ドリブル)であり、動物がケージの周辺に移動し、排尿してから離れたという意味で自発的であると判断できました。この観察は、Pz1/2-KOマウスの表現型に関する貴重な情報を提供してくれました。
基底条件下およびシクロホスファミド処理後の雌マウスの排尿行動
このパイロット実験では、マウスの自発的な排尿行動に対するシクロホスファミド(CYP)の効果をテストしました。ある種の癌または免疫学的障害を治療するために使用される薬物であるシクロホスファミドは、患者および実験動物に膀胱炎を引き起こすことが知られており、その結果、複数の小さな排尿イベントを特徴とする過活動膀胱表現型が生じます26,37,38。ベースラインの排尿行動を決定するために、暗期に未処理の雌マウスをRT-VSAに配置しました。同じマウスに5日後にCYP(150 mg / kg)の用量を腹腔内注射し、急性膀胱炎を引き起こしました。.注射直後に、マウスを記録のためにRT-VSAケージに入れた。排尿挙動はステッププロット(図11)で表され、縦線は排尿量を表し、水平線は時間を表します。基礎条件下で得られた結果と比較して、CYP治療後に空隙あたりに放出される尿の量が少なく、排尿イベントがはるかに頻繁であることは明らかです。これは、分析期間の最初の30分(深夜から午前0時30分[注射後7.0〜7.5時間]に対応)が拡大されるグラフの挿入図でよりよく理解できます。
図1:RT-VSA記録室の様子。(A)RT-VSA記録システムには上部があり、2つのサイドバイサイドの透明なアクリルチャンバーと関連する上部カメラで構成されています。デバイスの下半分は、上部のマウスチャンバーを保持し、下部カメラとUVライトを含む単一のユニットスタンドです。スタンドの壁の内部は、UV光を反射してケージの底に均一な照明を提供するミラーパネルで作られています。カメラからビデオフィードを受信し、データを記録するコンピューターは描かれていません。(B)コンポーネントと寸法を含むマウスチャンバーのモデル。1)標準リフトオフヒンジ。2)カメラ取り付けブラケット。3)ライトトランジションコーナーブラケット。コンポーネントと寸法を含むUVスタンドの正面図(C)と上面図(D)。UVライトは、まっすぐな平板で前面と背面のプロファイルの内部に取り付けられています。カメラを取り付けるために、2つのライトトランジションコーナーブラケットでスタンドメインフレームに固定された32インチのプロファイルが使用されます。ストレートフラットプレートは、カメラを32インチのプロファイルに取り付けるために使用されます。ミラーパネルは、スタンドの内部に取り付けられています(図示せず)。 1)5穴ティーフラットプレート。2)5穴Tフラットプレート。3)5穴L平板。表示される値はすべてインチ単位です。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:RT-VSAマウスチャンバー。 実験手順の前に、各実験マウスチャンバーは、一枚の濾紙(番号1)で裏打ちすることによって調製される。実験が行われる一日の期間に応じて、使用される濾紙は厚い(暗相)または薄い(明相)のいずれかである。プラスチック製のドームをチャンバーの中央に配置し(番号2)、水(非湿潤水ゲルの形態)とチャウを入れたプラスチック皿をドームの片側(番号3)に配置し、濃縮の一形態であるプラスチック製の1.5 mLマイクロ遠心管を反対側(番号4)に配置します。ケージ内の要素の初期配置は、すべての実験で一貫しています。1枚の濾紙が隣接する2つのケージの間に置かれ、図にアスタリスクでマークされていることに注意してください。これは、隣接するマウスから生じる視覚的な手がかりの影響を防ぐためです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:検量線。 既知の量のマウス尿でスポットされた厚い(A、左パネル)および薄い(B、左パネル)濾紙の代表的な画像。画像は、上(A、左パネル)または下(B、左パネル)のカメラを使用して取得したビデオ録画のスクリーンショットです。赤い矢印は2 μLの尿スポットを指し、スポットの下の数字はμL単位のスポット容量値です。 パネルAの上側の画像にある小さな尿スポット(<50 μL)は、尿スポッティング(5分)の直後に見え、30分後(下のパネル)には目立たなくなることに注意してください。右パネル:尿量の関数としてのボイドスポット面積(総ろ紙面積のパーセンテージとして表される)のプロット。他の人によって指摘されるように、尿量の関数としての空隙スポット面積のデータは、線形関係30に従わない。したがって、非線形回帰を使用してデータを2次多項式に適合させます。データは、X = 0 から Y = 0 になるように制約されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:ImageJを使用したろ紙と尿スポット領域の決定。 (a)ImageJで開いた図3Aに示す検量線のスクリーンショット。(A)のボックス化された領域は、(B)にさらに詳細を示しています。(B)ポリゴン選択アイコンが選択され(赤で囲まれた)、ろ紙の周囲に沿ってポリゴンが描画されます(部分ビュー、選択ツールによって生成されたノードを指す赤い矢印が付いた黄色の線)。(C)ポリゴンの面積はろ紙の総面積を反映しており、[分析]>[メジャー](赤い円)を選択して測定されます。(D) 領域の値 (ピクセル単位) が結果ウィンドウ (赤い円) に表示されます。(E)個々のボイドスポットの面積を測定するには、フリーハンド選択ツールが選択され(赤い円)、(F)を使用してスポットの境界の周りに線を引きます(赤い矢印はスポットを指します)。(C)と同じコマンドを使用して、ボイドスポットの面積が測定され、結果は結果ウィンドウの新しい値として、最後に行われた測定のすぐ下に表示されます(パネルG、赤い円)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:RT-VSA実験終了後のろ紙の状態評価。 RT-VSA実験中または実験後のろ紙の異なる条件を示すマウスチャンバーの代表的な画像。試験期間が終了するまで無傷のままであった濾紙は(A)に示されており、最も一般的な状況と実験をさらに分析できる条件(緑色のチェックマーク)を表しています。損傷したろ紙の例は(B)と(C)に示されており、これ以上分析してはならない実験の代表です(赤X)。(B)において、ろ紙は、片方の角部においてマウス(赤矢印)により細断された。黄色の破線は、ケージの床の境界を示しています。ボックス化された領域は、右側の画像で拡大されています。(C)では、マウスが濡れていない水ゲル(赤い矢印)を隅に移動し、3つの大きな水点(赤いアスタリスク)を残した結果、実験の完全性が損なわれました。これらの動きはビデオを見ることによって確認されました。画像は、暗期にトップカメラを使用し、ケージに厚いろ紙を敷いた状態で取得した動画ファイルのスクリーンショットです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:ボイドスポット面積測定のためのボイド時間の決定とスクリーンショットの取得。 (A,B)チャンバーの隅にあるマウスのスクリーンショットで、空隙が見えたばかりです。このフレームの時間には、ボイドの時間として注釈が付けられます。(C,D)ボイドスポットが最大拡散に達すると、スクリーンショットが撮影されてボイドの体積が決定されます。画像は、トップカメラで厚手のろ紙を使用し、暗期に取得した動画ファイルのスクリーンショットです。分析期間は深夜から午前6:00まででした。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図7:空隙領域を尿量に変換し、実験生データを含むワークシートファイルを生成する。 (A)全ろ紙面積に対する割合で表されるボイドスポットの値を示すグラフ作成ソフトウェアウィンドウのスクリーンショット(緑色で囲まれたデータ)。ワークシート(緑色の矢印)がデータテーブルセクションに保存されます。(B)総面積の割合の尿量への変換(赤で囲まれたデータ)。後者の値は結果セクション(赤い矢印)に表示され、検量線から検量線から補間された未知数関数を使用して計算されます。(C)コンパイルされた生データと計算されたデータを含むワークシートのスクリーンショット。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図8:ボイドスポットのPVSとSVSへの分類とその分析。 基礎条件下(A)およびシクロホスファミド(150 mg / kg)の投与後7時間(B)のマウスからのワークシート(図7Cに示すように生成)のスクリーンショット。ボイドスポットは、体積が≥20μLの場合は一次ボイドスポット(PVS)に分類され、容量が<20μLの場合はスモールボイドスポット(SVS)に分類されます。 未処理のマウス(A)では、すべてのボイドイベントがPVSであるのに対し、シクロホスファミド処理動物では、ほとんどのボイドがSVSであることに注意してください。各パネルの丸で囲まれたテーブル (赤いアウトライン) には、空隙数、平均空隙体積、および空隙総体積の要約統計量が含まれます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図9:ピエゾ1/2ノックアウトマウスとコントロールマウスの排尿挙動。雌(A)および雄(B)のピエゾ1/2ノックアウト(Pz1/2-KO)マウスおよび対照対応物(Pz1/2-C)の排尿行動を、その日の暗期または明期中の6時間の時間枠で記録し、結果をステップ6.1に記載するように分析した。データは、平均±平均の標準誤差(S.E.M.)として表示されます。データはマン・ホイットニー検定を用いて比較した。略語:PVS =一次ボイドスポット。SVS =小さなボイドスポット。NS = 有意ではありません。* p < 0.05;** p < 0.01。この図は3から変更されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図10:時間の関数としての累積ボイド体積の計算とグラフ表示のためのワークシート。 (A)時間の関数として排尿された尿の累積量の階段関数プロットを生成するために必要な計算を表示する 図7C で生成されたワークシートのスクリーンショット。時刻は 10 進形式 (列 G、赤い四角) で入力する必要があります。時間を 10 進形式に変換するために、無効時間の列の右側に 3 つの列 (赤い矢印) を追加して、時間 (列 D)、分 (列 E)、秒 (列 F) の値、および時間の最終結果を 10 進形式 (列 G) で個別に注釈付けしました。時間ボイドを 10 進形式に変換するには、(h) + (min/60) + (s/3,600) という関数を使用します。尿量列の右側に1列を追加し、新しい排尿イベント(新しいイベント値を含む)までに得られたすべての尿量(列J)の合計として計算された累積尿量(青い長方形)を表示します。(B)パネルAのワークシートからコピーされ、グラフ作成ソフトウェアプロジェクトの列X(10進形式の時間)と列Y(累積尿量)に貼り付けられたデータを示すスクリーンショット。プロットの最初と最後の時点は、赤い矢印で示されているように、0行と6行(最大値)に設定されます。(C)ステッププロットを生成するには、赤で囲まれたフィールドに示すように、シンボルの表示フィールドの選択を解除し、接続線/曲線の表示オプションを有効にして、 生存スタイルを選択することでグラフをフォーマットします。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図11:基礎条件下でまたはシクロホスファミド投与後のマウス排尿行動の代表的な結果。 マウスの随意排尿行動は、 代表的な結果に記載されているように、シクロホスファミド(CYP)投与前の暗期(基礎)および7時間後にRT-VSAによって評価されました。ボイドイベントの時間と量は、ステップ6.2で説明したように生成されたステッププロットで表されます。グラフの挿入図は、緑色の長方形でマークされたプロットの面積を表し、分析された期間の最初の30分に対応します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図12:RT-VSAによる重複する尿スポットの同定。 RT-VSA実験の暗期にトップカメラで撮影したビデオフレームのスクリーンショット(画像1と2)。画像2のボックス化された領域は、画像3で拡大されています。マウスは、次の数時間の間に同じ右上隅でさらに2回無効になりました(画像4〜6)。ボイドスポットの重なりにもかかわらず、個々のボイドイベントはRT-VSAを使用して容易に検出されました。これらのイベントがエンドポイントアッセイとしてどのように表示されるかを視覚化するために、ろ紙の角をさまざまな照明条件にさらしました。可視の周囲光の下では、単一の大きなボイドスポットしか識別できませんでした(画像7)。同様に、この同じ領域をUV光で調べた場合、単一のダークスポットのみが識別できました(画像8)。このように、RT-VSAでは同一領域内の複数のボイドを容易に検出できますが、エンドポイントアッセイとして解析を行う場合は、そのような識別は不可能です。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ビデオ監視の組み込みは、従来のVSAに比べていくつかの利点を提供する費用対効果の高い変更です。エンドポイントアッセイとして一般的に使用される従来のVSAでは、重複するボイドスポットを区別することは困難です。マウスは、アッセイが数時間延長されると、通常はケージの隅で同じ領域で複数回排尿する傾向があるため、これは些細な問題ではありません。したがって、RT-VSAの第一の利点は、研究者が部分的または全体的に互いに重ね合わされた個々のスポットを容易に識別できることである。このことは、 図12に示す実験でよく示されています。この場合、ビデオ録画は、マウスが同じコーナーで3回ボイドし、重なり合うボイドスポットを堆積させたことを確認します。実験の最後にのみろ紙を分析した場合、VSAの典型的な方法で、1つのスポットしか区別できませんでした。したがって、古典的なエンドポイントVSAは、排尿行動の大きな違いを特定するのに役立ちますが、より微妙な表現型を区別できない可能性があります。現在の遺伝学の進歩とトランスジェニック動物の生成に伴い、排尿行動を正確に評価できる方法の開発が不可欠です。
第二に、RT-VSAは、排尿イベントに関する時間的情報を調査員に提供します。したがって、真の排尿頻度を決定し、排尿イベント間の関係を確立することができます。例えば、SVSのクラスターが1つの大きなPVSの隣に観察される状況では、古典的なVSAでは、マウスが実験中に数回排尿したのか(3つの小さな空隙と1つの大きな空隙がある)、または動物が1つの大きな尿量を沈着させ、3つの小さな斑点が排尿後のドリブルまたは毛皮からのキャリーオーバーの結果であるかどうかを容易に区別することはできません。 RT-VSAは、これらの質問に対処するために使用できます。
第三に、RT-VSAでは、ボイドイベントの前、最中、後のマウスの動作を分析できます。調査員は、マウス行動トラッカー39などの無料で入手可能なソフトウェアを使用してRT-VSA記録を分析することにより、マウスの全体的な活動プロファイルを監視することもできます。さらに、動物が排尿を停止するかどうか(女性の典型的な行動)、排尿中に動物が動いているかどうか(男性では排尿スポットが続く可能性があります)、または睡眠/休息中に排尿するかどうかを区別することができます。後者の動作を観察しましたが、通常はまれです。したがって、適切に検証および解釈された場合、排尿行動を観察することは、研究者に、例えば夜間頻尿または失禁を含む排尿機能障害に関する貴重な洞察を提供することができます。RT-VSA(およびVSA)を使用すると、調査員は、コーナーではなく、ケージの中央領域で発生するボイドイベントの割合を決定できます。通常、センター排尿はまれであり、そのようなイベントの数の増加は膀胱機能障害の兆候です8,22。唯一の例外は優勢なアルファ男性で、頻繁に排尿し、囲い全体で排尿します20。RT-VSAを使用して中枢排尿の分析を行うには、食品皿を側壁に移動してドームを取り外す(またはケージの特定の領域に固定する)ことを検討して、排尿の空間パターンをより簡単に確立できるようにする必要があります。
第四に、RT-VSAは、従来のVSAと比較して、ケージ交換に関連するストレスをより効果的に管理することができます。マウスは本質的に巧妙であり、それらを扱ったり、新しい環境に移したりするとストレスが発生し、排尿行動に影響を与えることが知られています35。その性質上、標準VSAに順応期間を組み込むことは困難です。対照的に、RT-VSAでは、各実験に順応期間を簡単に組み込むことができ、この期間中の排尿イベントは分析中に無視されます。このプロトコルで実装されているRT-VSAの追加のストレス緩和の側面は、マウスが通常収容されている条件の重複です(すなわち、自由摂取の食物と水へのアクセス、ドーム、およびおもちゃ)。これは、私たちの知る限り、このタイプの実験で説明されている最も豊かな環境の1つです。典型的なエンドポイントVSAでは、マウスは水(時には食物からも)を奪われます8,22、私たちはそれを自由に提供します。
第五に、この濃縮された環境がマウスのストレスレベルに与える可能性のあるプラスの効果に加えて、研究者はRT-VSAを長期間、通常は6時間の時間枠で実行することができます。しかし、最近では24時間実行する実験を行っています(データは示されていません)。これは、概日リズムの影響を評価する場合、または活動不足の膀胱表現型を示す可能性があるため、排尿頻度が低いマウスを研究する場合に理想的です。
24時間のビデオモニタリングには、薄いろ紙を使用し、下部カメラを使用して実験を分析することをお勧めします。このタイプの紙とカメラの組み合わせは、暗相と明相での検出感度を可能にする最良のオプションです。前述のように、ボトムカメラは厚いろ紙上のボイドスポットを容易に検出できず、トップカメラは光相中にボイドスポットを確実に検出しません。これらの拡張分析を行う場合は、午後5:00に動物を記録ケージに入れ、1日目の午後06:00から分析し、翌日の午後06:00に実験を完了することをお勧めします。
RT-VSAには多くの良い面がありますが、注意すべき点がいくつかあります。これらの解析を行う際にはストレスを制限するためにあらゆる試みを行いますが、動物は通常グループハウスであるため、マウスの生息地を完全に再現することはできません。彼らはまた、濡れていない水ゲルから水を得る代わりに、ボトルから水を飲みます。しかし、マウスは活動的な暗期と比較して、不活性な明期の間にボイドが少ないという我々の観察は、マウスが概日排尿行動の通常のパターンを保持していることを示している40。ストレスを受けやすい性質を反映して、マウスはケージの清掃日に排尿行動を乱すことを発見しました。したがって、分析は、動物が日常的な畜産の影響を受けにくい期間に限定する必要があります。考慮すべき重要な要素は、UV光がボイド機能に影響を与えるかどうかです。我々の発見は、明期と暗期の間のVSAパラメータの明確な概日差を示しており、これは同様の現象を説明するがUV光40を使用しない他の技術と一致しているため、UV光照明はボイド機能に影響を与えないと結論付けています。ろ紙は、光が下部チャンバーから上部チャンバーに通過するのを防ぐことに注意してください。
追加の注意点は、マウスをチャンバー内に長く保持するほど、ろ紙を噛んだり損傷したりする可能性が高いことです(紙の厚さに関係なく)。どの動物も明期に紙を乱しませんでしたが、マウスのほぼ30%が暗期に紙を損傷しました。24時間実験の解析では、紙の損傷により同様の割合(3分の1)の実験が解析できず、時間だけでなく、その日の段階も動物の破砕行動に影響を与えることがわかりました。残念ながら、私たちの経験では、ケージの紙を乱す動物は、再テストしてもそうし続けることに気づきました。上記のように、マウスはむき出しのアクリルの床で排尿することがあり、したがって紙の損失は分析を不完全にし、価値が限られている。
さらに、男性の排尿行動の分析は、排尿がより頻繁に排尿する傾向があり、排尿後にドリブルする可能性があり、以前の出版物で議論されたように、ケージ全体に分布する多数の小さな空隙を特徴とする、より攻撃的なアルファ-男性の表現型を持つ男性の集団(20%)が存在するため、より困難になる可能性があります3.このアルファ-オスの行動は、排尿表現型を確立するための交絡因子を構成する可能性があるため、≥50(明期実験)または≥100(暗期実験)のボイドを持つ動物を分析から除外します。
体積に基づくボイドの識別(つまり、PVSとSVS)が必ずしも正当化されない状況があります。たとえば、私たちの経験では、細菌性または化学的膀胱炎のマウスは、対照よりも少量の排尿をする傾向があります4,34。ただし、個々のマウス間で排尿量には大きな違いがあります。一部のボイドの容量は≤20 μLですが、他のボイドでは大部分が>20 μLです。したがって、空隙体積の識別は、これらの表現型の特徴付けに何らの利点も提供しない。
以上をまとめると、RT-VSAは、自由に動くマウスのマウス排尿行動を解析するための実装が容易なツールです。膀胱測定などのツールとは異なり、カテーテルの外科的移植や非生理学的な膀胱充填率は必要ありません。これにより、マウスの雌雄、長期間にわたって、および日周期の明期と暗期に排尿行動を決定することができます。また、特にメタボリックケージなどのより専門的で高価なデバイスと比較した場合、比較的手頃な価格です。このツールに関連する注意点がありますが、一般的に管理は簡単です。最後に、この技術は、他のげっ歯類を含む他の動物種に容易に適応させることができる。
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Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
この研究は、NIH助成金R01DK119183(GAおよびMDCへ)、P30DK079307によるパイロットプロジェクト賞(MGDへ)、米国泌尿器科学会キャリア開発賞およびウィンターズ財団助成金(NMへ)、およびピッツバーグ腎臓研究センター(P30DK079307)の細胞生理学およびモデル生物腎臓イメージングコアによってサポートされました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots – cut to 10 inches | 80/20 | 1010 | Amount: 20 |
| 1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots – cut to 12 inches | 80/20 | 1010 | Amount: 6 |
| 1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots – cut to 40 inches | 80/20 | 1010 | Amount: 4 |
| 1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots – cut to 14.75 inches | 80/20 | 1010 | Amount: 12 |
| 1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots – cut to 32 inches | 80/20 | 1010 | Amount: 5 |
| 1/4-20 Double Slide-in Economy T-Nut | 80/20 | 3280 | Amount: 16 |
| 1/4-20 Triple Slide-in Economy T-Nut | 80/20 | 3287 | Amount: 18 |
| 10 & 25 Series 2 Hole - 18mm Slotted Inside Corner Bracket with Dual Support | 80/20 | 14061 | Amount: 6 |
| 10 Series 3 Hole - Straight Flat Plate | 80/20 | 4118 | Amount: 8 |
| 10 Series 5 Hole - "L" Flat Plate | 80/20 | 4081 | Amount: 8 |
| 10 Series 5 Hole - "T" Flat Plate | 80/20 | 4080 | Amount: 8 |
| 10 Series 5 Hole - Tee Flat Plate | 80/20 | 4140 | Amount: 2 |
| 10 Series Standard Lift-Off Hinge - Right Hand Assembly | 80/20 | 2064 | Amount: 2 |
| 10 to 15 Series 2 Hole - Lite Transition Inside Corner Bracket | 80/20 | 4509 | Amount: 6 |
| 24”-long UV tube lights | ADJ Products LLC | T8-F20BLB24 | Amount: 2 20W bulb – 24” Wavelength: 365nm |
| Acrylic Mirror Sheet | Profesional Plastics | Amount: 1 82.5 cm x 26.5 cm |
|
| Acrylic Mirror Sheet | Profesional Plastics | Amount: 2 26.5 cm X 30.5 cm |
|
| Acrylic Mirror Sheet | Profesional Plastics | Amount: 2 82.5 cm x 30.5 cm |
|
| AR polycarbonate (UV resistance) | 80/20 | 65-2641 | Amount: 2 4.5mm Thick, Clear, 38.5 cm x 26.5 cm |
| AR polycarbonate (UV resistance) | 80/20 | 65-2641 | Amount: 4 4.5mm Thick, Clear, 38.5 cm x 21.5 cm |
| AR polycarbonate (UV resistance) | 80/20 | 65-2641 | Amount: 4 4.5mm Thick, Clear, 26.5 cm x 21.5 cm |
| AR polycarbonate (UV resistance) | 80/20 | 65-2641 | Amount: 4 4.5mm Thick, Clear 37.5 cm x 23.9 cm |
| AR polycarbonate (UV resistance) | 80/20 | 65-2641 | Amount: 4 4.5mm Thick, Clear , 24.4 cm x 23.9 cm |
| Chromatography paper (thin paper) | Thermo Fisher Scientific | 57144 | |
| Cosmos blotting paper (thick paper) | Blick Art Materials | 10422-1005 | |
| Excel | Microsoft Corporation | ||
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Version 9.4.0 | graphing and statistics software |
| ImageJ FIJI | NIH | ||
| Parafilm | Merck | transparent film | |
| Quick Time Player 10.5 software | Apple | multimedia player | |
| Security spy | Ben software | video surveillance software system | |
| Standard End Fastener, 1/4-20 | 80/20 | 3381 | Amount: 80 |
| UV transmitting acrylic | Spartech | Polycast Solacryl SUVT | Amount: 2 38.5 cm x 26.5 cm |
| Water gel: HydroGel | ClearH2O | 70-01-5022 | (https://www.clearh2o.com/product/hydrogel/) |
| Webcam | Logitech | C930e | Amount: 4 |
References
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