Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

Analys av tomrum i realtid

Published: February 10, 2023 doi: 10.3791/64621
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1,2
1Renal-Electrolyte Division, Department of Medicine, University of Pittsburgh, 2Department of Cell Biology, University of Pittsburgh

Summary

Den här artikeln beskriver en ny metod för att studera mustömningsbeteende genom att införliva videoövervakning i den konventionella tomrumspunktanalysen. Den här metoden ger tidsmässig, rumslig och volymetrisk information om tömningshändelser och detaljer om musbeteende under dagens ljusa och mörka faser.

Abstract

Normalt tömningsbeteende är resultatet av den samordnade funktionen hos urinblåsan, urinröret och urinrörssfinkterna under korrekt kontroll av nervsystemet. För att studera frivilligt tömningsbeteende i musmodeller har forskare utvecklat void spot assay (VSA), en metod som mäter antalet och arean av urinfläckar som deponeras på ett filterpapper som kantar golvet i ett djurs bur. Även om det är tekniskt enkelt och billigt, har denna analys begränsningar när den används som en slutpunktsanalys, inklusive brist på tidsmässig upplösning av tömningshändelser och svårigheter att kvantifiera överlappande urinfläckar. För att övervinna dessa begränsningar utvecklade vi en videoövervakad VSA, som vi kallar realtids-VSA (RT-VSA), och som gör det möjligt för oss att bestämma tömningsfrekvens, bedöma tömd volym och tömningsmönster och göra mätningar över 6 timmars tidsfönster under både de mörka och ljusa faserna av dagen. Metoden som beskrivs i denna rapport kan tillämpas på en mängd olika musbaserade studier som undersöker de fysiologiska och neurobehavioral aspekterna av frivillig micturition i hälsa och sjukdomstillstånd.

Introduction

Urinlagring och urinering samordnas av en central krets (centrala nervsystemet) som tar emot information om blåsans fyllningsstatus genom bäcken- och hypogastriska nerver. Urotelet, epitelet som leder urinvägarna från njurbäckenet till den proximala urinröret, bildar en tät barriär mot de metaboliska avfallsprodukterna och patogenerna som finns i urinen. Det är en integrerad del av en sensorisk bana, som känner av och kommunicerar blåsans fyllningstillstånd till underliggande vävnader och afferenta nerver 1,2. Störning av urotelbarriären, eller förändringar i uroteliala mekanotransduktionsvägar, kan leda till tömningsdysfunktion tillsammans med nedre urinvägssymtom som frekvens, brådskande, nokturi och inkontinens 3,4,5,6,7. På samma sätt är åldrande, diabetes, nedre urinvägsinfektioner, interstitiell cystit och andra sjukdomsprocesser som påverkar urinblåsan, eller tillhörande kretsar som styr dess funktion, kända för att orsaka blåsdysfunktion 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17, 18,19. En bättre förståelse av normalt och onormalt tömningsbeteende beror på utvecklingen av metoder som på ett tillförlitligt sätt kan skilja mellan olika urineringsmönster.

Traditionellt har mössens frivilliga tömningsbeteende studerats med hjälp av tomrumsfläckanalysen (VSA), utvecklad av Desjardins och kollegor 20, och allmänt antagen på grund av dess enkelhet, låga kostnad och icke-invasiva tillvägagångssätt 8,21,22,23,24. Denna analys utförs vanligtvis som en slutpunktsanalys, där en mus tillbringar en definierad tid i en bur fodrad av ett filterpapper, som därefter analyseras genom att räkna antalet och bedöma storleken på urinfläckar när filterpapperet placeras under ultraviolett (UV) ljus (urinfläckarna fluorescerar under dessa förhållanden)20. Trots dessa många fördelar presenterar den traditionella VSA några stora begränsningar. Eftersom möss ofta urinerar i samma områden måste utredarna begränsa analysens varaktighet till en relativt kort tidsperiod (≤4 timmar)25. Även när VSA utförs under kortare tidsperioder är det nästan omöjligt att lösa små tomrumsfläckar (SVS) som faller över stora tomrumsfläckar eller att diskriminera SVS från överföring av urin vidhäftad till svansar eller tassar. Det är också mycket svårt att skilja om SVS är en följd av frekventa men individuella tömningshändelser (en fenotyp som ofta observeras som svar på cystit 4,26) eller på grund av dribbling efter miktion (en fenotyp associerad med blåsutloppsobstruktion27). Dessutom begränsar önskan att slutföra analysen under arbetstid, i kombination med svårigheter att komma åt bostadsanläggningar när lamporna är avstängda, ofta dessa analyser till ljusperioden för den 24 timmar långa cirkadiska cykeln. Således förhindrar dessa tidsbegränsningar utvärderingen av mustömningsbeteende under deras aktiva nattfas, vilket minskar förmågan att analysera specifika gener eller behandlingar som styrs av cirkadiska rytmer.

För att övervinna några av dessa begränsningar har forskare utvecklat alternativa metoder för att bedöma tömningsbeteende i realtid 26,28,29,30,31,32. Några av dessa tillvägagångssätt innebär användning av dyr utrustning såsom metaboliska burar26,28,29 eller användning av värmekameror30; Men även dessa har begränsningar. Till exempel, i metaboliska burar tenderar urin att fästa vid trådarna i nätgolvet och till trattens väggar, vilket minskar mängden urin som samlas in och mäts. Således kan det vara svårt att exakt samla in data om små tomrum. Dessutom ger metaboliska burar inte information om den rumsliga fördelningen av tömningshändelserna (dvs. urinering i hörnen kontra mitten av kammaren). Med tanke på att infraröd strålning med lång våglängd som används av de termografiska kamerorna inte tränger igenom fasta ämnen, måste tömningsaktivitet bedömd med videotermografi utföras i ett öppet system, vilket kan vara utmanande med aktiva möss, eftersom de kan hoppa flera tum i luften. Ett annat system är den automatiserade voided stain on paper (aVSOP) approach33, som består av rullat filterpapper som lindas upp med konstant hastighet under trådnätsgolvet i en musbur. Detta tillvägagångssätt förhindrar pappersskador och överlappning av urinfläckar som uppstår i den klassiska VSA, och dess genomförande gör det möjligt för utredaren att utföra experiment under flera dagar. Det ger emellertid inte utredaren exakt tidpunkt för tömningshändelserna, och det finns ingen förmåga att undersöka beteende och hur det korrelerar med spotting. För att få denna information har forskare införlivat videoövervakning till tömningsanalyser, ett tillvägagångssätt som möjliggör samtidig bedömning av musaktivitet och urineringshändelser31,32. Ett tillvägagångssätt består av att placera en blå ljusdiod (LED) och en videokamera med ett grönt fluorescensproteinfilter under experimentburen för att visualisera tömningshändelserna, och en infraröd LED och en videokamera ovanför buren för att fånga musposition32. Denna inställning har använts för att övervaka tömningsbeteende när fiberfotometri utförs; Den starkt upplysta miljön i detta system krävde emellertid att utredarna behandlade sina möss med ett diuretikum för att stimulera tömning. I en annan experimentell design placerades vidvinkelkameror ovanför och under experimentburen för att visualisera musmotorisk aktivitet respektive urineringshändelser. I detta fall avslöjades urinfläckar som deponerats på ett filterpapper som kantade burens golv genom att belysa filterpapperet med UV-lampor placerade under buren31. Denna inställning användes i korta analyser, 4 min i varaktighet, under dagens ljusfas för att studera hjärnstamneuronerna som är involverade i frivilligt tömningsbeteende31. Systemets lämplighet för användning under den mörka fasen eller under perioder >4 minuter rapporterades inte.

I den här artikeln beskrivs en metod som förbättrar det traditionella leverantörsspecifika attributet genom att möjliggöra långsiktig videoövervakning av mustömningsbeteende. Den här kostnadseffektiva metoden ger tidsmässig, rumslig och volymetrisk information om tömningshändelser under längre tidsperioder under dagens ljusa och mörka faser, tillsammans med detaljer relaterade till musbeteende 3,4,34. Detaljerad information för konstruktion av tömningskamrarna, implementering av en realtids VSA (RT-VSA) och analys av data tillhandahålls. RT-VSA är värdefull för forskare som vill förstå de fysiologiska mekanismer som styr urinvägarnas funktion, att utveckla farmakologiska metoder för att kontrollera urinering och att definiera den molekylära grunden för sjukdomsprocesser som påverkar de nedre urinvägarna.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Urotelial Piezo1/2 dubbla knockoutmöss (Pz1/2-KO, genotyp: Piezo1 fl/fl; Piezo2 fl/fl; Upk2CRE+/-) och kontroller (Pz1/2-C, genotyp: Piezo1 fl/fl; Piezo2 fl/fl; Upk2CRE-/-) genererades internt från föräldrastammar erhållna från Jax-laboratorierna (Piezo1 fl/fl stam # 029213; Piezo2 fl/fl stam # 027720; Upk2CRE+/- stam # 029281). Både kvinnliga (1,5–3 månader gamla och 17–20 g i vikt) och manliga (2–4 månader gamla och 23–29 g i vikt) möss användes i experimenten. För cyklofosfamidinducerad cystitexperiment användes vildtyp C57Bl / 6J-honor (3 månader gamla och ~ 20 g i vikt) (Jackson-laboratorierna, stam # 000664). Djur hölls och experimenten utfördes vid University of Pittsburgh Animal Care Facility under godkännande av University of Pittsburgh Institutional Animal Care and Use Committee. Alla djurförsök utfördes i enlighet med relevanta riktlinjer och föreskrifter i folkhälsomyndighetens policy för human vård och användning av försöksdjur och djurskyddslagen.

1. Montering av burar för tomrumsanalys i realtid (RT-VSA)

  1. RT-VSA-riggen består av ett UV-stativ som rymmer två UV-glödlampor och två vidvinkelkameror (bottenkameror), som används för att registrera tömningsaktivitet under dagens ljusfas. Ordna två muskammare för att vila på stativet. Fäst vidvinkelkameror (övre kameror) på locket på varje muskammare, som används för att registrera tömningsaktivitet under dagens mörka fas (figur 1A).
  2. Konstruera ramen på UV-stativet och muskamrarna från 1 i x 1 i T-slitsade aluminiumprofiler. Se tabell 1 för en lista över de komponenter som används för att bygga två muskammare och UV-stativet och figur 1B–D för de olika vyerna av de monterade komponenterna och dimensionerna.
  3. Konstruera varje muskammare med åtta T-slitsade aluminiumprofiler skurna till 10 tum och fyra skurna till 14,75 tum. Börja med att montera muskammarens botten och använd standardändfästen (tabell 1) för att montera de T-slitsade profilerna enligt figur 1. Montera 38,5 cm x 26,5 cm UV-överförande akryl i profilernas inre kanal för att bygga golvet i muskamrarna.
    OBS: För detaljerad information om hur man monterar T-slitsade profiler med standardändfästen, besök företagets hemsida.
  4. Bygg muskammarens väggar med resten av profilerna. Montera de nötningsbeständiga (AR) polykarbonatpanelerna på 38,5 cm x 21,5 cm och 26,5 cm x 21,5 cm i profilerna för att montera muskammarens ytterväggar. Använd 37,5 cm x 23,9 cm och 24,4 cm x 23,9 cm AR polykarbonatpaneler för att bygga in muskammaren.
  5. Säkra AR-polykarbonatpanelerna med standardändfäste 1/4-20 slitbana. Se instruktioner för hur man monterar panelerna i profilerna på webbsidan i ANMÄRKNING till steg 1.3. Använd kommersiell silikontätning för att täta korsningarna mellan de inre panelerna.
  6. Använd två 12-tumsprofiler och två 14,75-tumsprofiler med T-slits för att montera burens lock enligt figur 1B. Montera en 38,5 cm x 26,5 cm AR-polykarbonatpanel i profilernas inre kanal för att komplettera locket.
  7. Montera 12-tums kameraprofilstöd vinkelrätt mot de långa axlarna på toppen av buren och säkra med två lite övergång inuti hörnfästen (markerade 3 i figur 1B). Använd en rak platt platta (märkt 2) som stöd för webbkamerans montering och montera den enligt bild 1B. Fäst kameran på stödet med kamerans monteringsskruv.
  8. Använd 10-seriens standardlyftgångjärn till höger för att fästa locket på muskammarens kropp (markerad 1 i figur 1B).
  9. Konstruera UV-stativet med fyra T-slitsade profiler skurna till 40 tum, fyra T-slitsade profiler skurna till 32 tum och fyra T-slitsade profiler skurna till 10 tum, enligt figur 1C, D. Montera en 82,5 cm x 26,5 cm akrylspegelskiva i profilerna för att bygga botten av UV-kammaren.
  10. Använd akrylspegelarket 82,5 cm x 30,5 cm och 26,5 cm x 30,5 cm för att konstruera UV-stativets vägg.
  11. Fäst 10-seriens femhåliga T-planplattor (märkta 2 i figur 1 C), 10-seriens femhåliga L-planplattor (märkta 3 i figur 1 C) och 10-seriens femhåliga tee-platta (märkta 1 i figur 1C) för att säkra UV-stativet.
  12. Montera de nedre kamerorna i en T-slitsad profil som skärs till 32 tum och fästs på stativets undersida med två lite övergångshörnfästen som visas i figur 1D. Använd raka platta plattor för att fästa webbkamerorna på T-slitsprofilen.
  13. Montera UV-lamporna på insidan, framsidan och baksidan och fäst dem på de raka platta plattorna enligt figur 1D.
  14. Anslut de fyra webbkamerorna till USB-portarna på en dator som kör ett videoövervakningsprogram.

2. Djurstallar före försök

  1. Husexperimentella möss, antingen uppfödda eller erhållna från en extern plats, i grupper om fyra. När det är möjligt, använd åldersmatchade kvinnliga eller manliga möss för dessa experiment. Om djur erhålls från en extern källa, låt dem acklimatisera i minst 7 dagar innan de utför några experimentella förfaranden.
  2. Under hela sin tid i djuranläggningen ska djuren hållas i standardburar som innehåller strö och berikning (t.ex. plastigloo, hjul, papper för fragmentering) och förvara dem under en 12 timmars dag/natt-cykel, med tillgång till vatten och torr muschow ad libitum.

3. RT-VSA-inspelningar under dagens ljusa och mörka faser

OBS: Protokollet nedan beskriver användningen av RT-VSA för att bedöma mustömningsbeteende under dagens ljusa och mörka faser. Djuren hålls på en 12 timmars ljus och 12 timmars mörk cykel med Zeitgeber-tid (ZT) = 0 klockan 07:00. Inspelningarna börjar mellan 10:30 och 11:00 (ZT = 3,5–4,0) för ljusfasexperimenten och mellan 18:00 och 18:30 (ZT = 11,0–11,5) för mörkfasexperimenten. När djur testas under båda betingelserna utförs försöken vanligtvis på två separata dagar, med minst 5 på varandra följande dagar mellan de ljusa och mörka testerna. Försök bör inte utföras på dagar då djurrummen städas eller burarna byts, eftersom dessa kan leda till påfrestningar som påverkar tömningsbeteendet. Alla steg bör utföras under förhållanden med minimal stress för mössen.

  1. Transportera försöksdjuren från deras inhysningsplats till procedurrummet där RT-VSA-registreringskamrarna finns.
  2. RT-VSA inspelningskammare förberedelse
    1. Placera en bit filterpapper (24,3 cm x 36,3 cm) i botten av varje RT-VSA-inspelningsbur. Beroende på tid på dagen, använd tunt (ljusfasexperiment) eller tjockt (mörkfasexperiment) filterpapper.
      OBS: Tjockt filterpapper används under den aktiva mörka fasen eftersom det är mer motståndskraftigt mot fragmentering än tunt filterpapper. Toppkameror används för att visualisera urinfläckar som deponeras på tjockt filterpapper under den mörka fasen. Däremot används de nedre kamerorna under ljusfasen eftersom det omgivande ljuset förhindrar att de övre kamerorna upptäcker urinfläckar som deponeras på filterpapperet. I detta fall används tunt filterpapper. Vi fann att de nedre kamerorna är ineffektiva för att upptäcka små tömningshändelser avsatta på tjockt filterpapper.
    2. Placera följande föremål ovanpå filterpapperet: en plastigloo (som ger ett sovutrymme), ett sterilt 1,5 ml mikrocentrifugrör för anrikningsändamål och en 60 mm x 15 mm plastskål innehållande två eller tre bitar mus torr chow och 14-16 g vatten i form av ett gelpaket (icke-vätande vattengel; Figur 2).
      OBS: Användningen av 1,5 ml mikrocentrifugrör för anrikningsändamål var specifik för kapslingen som användes i denna studie.
    3. När inspelningskamrarna är klara, placera försiktigt experimentmössen inuti genom att lägga dem mjukt på filterpapperet. Se till att överföringen av djuren från buren till registreringsburarna sker med minimal stress.
    4. När alla försöksdjur är inne i sina inspelningsburar, med locken stängda, täck toppen av locken med en absorberande bänkblå dyna för att minimera direkta omgivande ljusreflektioner på plexiglaslockets yta.
    5. Slå på UV-lamporna i den nedre kammaren.
      OBS: Djuren har ingen direkt kontakt med UV-ljuset. Det rekommenderade UV-ljuset beskrivs i materialavsnittet.
  3. RT-VSA-inspelningar
    1. För att spela in video från de övre och nedre kamerorna, använd en videoövervakningsinspelningsprogramvara, som kan konfigureras för att spela in från flera webbkameror eller nätverkskameror samtidigt.
    2. När du öppnar programmet startar du inspelningen genom att trycka på Kommando och R i programfönstret. Utför videoinspelningar med en hastighet av 1 bild per s.
    3. Omedelbart efter att inspelningarna har påbörjats, lämna rummet och stäng dörren försiktigt. Se till att rummet förblir tyst under hela experimentets varaktighet.
  4. Avsluta RT-VSA-inspelningar
    1. Återvänd till procedurrummet efter 7 timmar (ljusfasexperiment) eller nästa morgon (mörkfasexperiment).
    2. Stoppa inspelningarna genom att trycka på Kommando och T. Stäng av UV-lamporna.
    3. Efter att ha stoppat inspelningen genererar programvaran automatiskt en filmfil (i .m4v format) för varje kamera och sparar den under kamerans namn i en tidigare vald målmapp. Kontrollera att experimenten är ordnade i mappar efter datum i varje kameramapp.
    4. I varje datum-/experimentmapp kontrollerar du att det finns en .m4v fil och alla enskilda .jpeg filer som motsvarar var och en av filmrutorna.
    5. OBS: De .jpeg filerna kan användas för att återställa experimentet om filmfiler skadas.
    6. Skapa en mapp på skrivbordet med namn och datum för experimentet och överför alla .m4v filer till den här mappen. Om det behövs tar du bort de .jpeg filerna när filmfilerna har sparats och säkerhetskopierats.
    7. OBS: För ljusfasexperiment genererar programvaran en film per kamera, medan den för mörka fasexperiment genererar två filmer för varje kamera. Detta beror på att en ny .m4v fil genereras efter midnatt när datumet ändras.
    8. Kopiera mappen som innehåller filmerna till en flash-enhet för analys i en extern dator. Det här steget kan ta flera minuter och kan utföras parallellt med steg 3.5.1 till 3.5.3.
  5. Rengöring av registreringsburar och förflyttning av försöksmöss tillbaka till deras bostadsplats
    1. Ta bort bluepad som täcker burarnas lock. Överför djuren från registreringsburarna till deras inhysningsbur.
    2. Ta bort tillbehören och livsmedlen i registreringskamrarna (dvs. igloor av plast, plaströr, fat med stöd av chow och vattengel och filterpapper) och kassera dem i biofarligt avfall.
    3. Rengör burarna med en handdammsugare, ta bort chow och fekala pellets som finns på botten av buret. Spraya sedan golvet och innerväggarna i buret med 70% etanol och rengör inredningen med en bit mjuk trasa. Lämna locket på burarna öppet så att de kan lufttorka.
    4. Placera buren med djuren i en sekundär behållare och transportera djuren tillbaka till deras inhysningsplats.

4. Generering av kalibreringskurvor

OBS: En kalibreringskurva behövs för att omvandla tomrumsområden till urinvolymer. Om du utför experiment under dagens ljusa och mörka faser bör två kalibreringskurvor genereras, en för varje typ av filterpapper som används (tunna och tjocka filterpapper). Kalibreringskurvor genereras i två exemplar. Varje replikat körs på ett filterpapper placerat i en RT-VSA-registreringskammare. Med tanke på dess komplexa sammansättning och UV-retbarhet, använd musurin för att göra kalibreringskurvorna.

  1. Musurinsamling
    1. Ta en bit flexibel transparent film (10 cm x 15 cm) och placera den på en bänk.
    2. Välj en mus i svansen och skrubba den. Massera underlivet mjukt för att framkalla urinering. Samla urin på ytan av det genomskinliga filmplastarket.
    3. Släpp djuret försiktigt inuti buret. Överför urinen med en pipett från ytan av den transparenta filmen till ett sterilt 1,5 ml mikrocentrifugrör. Upprepa proceduren med flera möss tills ~ 10 ml musurin samlas in, slå samman urinen och förvara vid -20 ° C.
      OBS: Totalt ~ 10 ml musurin krävs för att generera dubbla kalibreringskurvor för ljusa och mörka faser. För att undvika att stressa experimentella möss, använd inte möss som kommer att utsättas för RT-VSA-experiment för urinuppsamling.
  2. Inspelningar av kalibreringskurvor
    1. Tina urinen som samlats in i steg 4.1 och blanda den genom att försiktigt virvla i 10–15 sekunder.
    2. Placera en bit tunt filterpapper (24,3 cm x 36,3 cm) i var och en av de två RT-VSA-inspelningsburarna.
    3. Pipettera följande urinvolymer (i μL) på vart och ett av filterpapperen: 2, 5, 10, 25, 50, 80, 100, 200, 300, 400, 500 och 750. För att förhindra punktöverlappning som ett resultat av diffusion, fördela fläckarna på ett tillräckligt avstånd från varandra.
    4. Stäng locket på burarna och täck dem med dynor.
    5. Börja inspelningen genom att trycka på Kommando och R, tillämpa samma programvaruparametrar som används för att spela in experimenten (steg 3.3.).
    6. Registrera kalibreringskurvan i 1 timme för att möjliggöra maximal diffusion av urinfläckarna. Tryck på Kommando och T för att stoppa inspelningen.
    7. Skapa en ny mapp på skrivbordet, placera de .m4v filerna i den och överför sedan data till en flash-enhet för efterföljande analys.
    8. Utför en liknande procedur för att generera dubbla kurvor med tjockt filterpapper. Lägg i så fall till extra lager av dynor för att mörka interiören och simulera mörka fasförhållanden.
  3. Analys av kalibreringskurvregistreringar
    1. Öppna .m4v filerna i en filmspelarprogramvara och maximera fönstret så att det fyller skärmen. För att analysera kalibreringskurvorna som utförs på tjockt filterpapper, använd filerna som erhållits med de övre kamerorna (figur 3A). För att analysera kalibreringskurvorna som utförs på tunt filterpapper, använd filerna som erhållits med de nedre kamerorna (figur 3B).
    2. Spela upp .m4v-filen och flytta tidsreglaget framåt och bakåt för att få en översikt över hela 1 timmes kalibreringskurvfilm.
    3. Identifiera det tidsintervall där de mindre urinfläckarna (<25 μL) har störst intensitet och har spridit sig maximalt. Ta en skärmdump inom detta tidsintervall. Namnge skärmbildsfilen och spara den som en .png fil (bild 3A, övre panelen).
      OBS: Skärmdumpar tas genom att trycka på knappen F6. För att ställa in F6 för skärmdump, välj: Systeminställningar > Tangentbord > genvägar och skriv F6 i rutan till höger om Spara bild av skärmen som en fil alternativ.
    4. Identifiera tidsintervallet där de medelstora och stora urinfläckarna (>50 μL) har maximal yta och ta en skärmdump. Det är möjligt att några av de mindre urinfläckarna inte kommer att synas när de större urinfläckarna uppvisar maximal diffusion. Namnge filen och spara skärmbilden som en .png fil (bild 3A, nedre panelen).
    5. Öppna ImageJ-programvaran (NIH) och dra och släpp sedan filikonen .png som du fick i steg 4.3.3 för att öppna bildfilen (bild 4A).
    6. I verktygsfältet väljer du ikonen Polygonval och avgränsar filterpapperets kantlinje.
    7. Välj sedan Analysera från menyraden, välj Ställ in mått från den utökade menyn och välj Område i fönstret som dyker upp. Klicka på OK. Detta gör det möjligt att få värden på området när steg 4.3.8 utförs.
    8. Välj sedan Analysera igen från menyraden och välj Mät från de utökade alternativen. Ett resultatfönster dyker upp som innehåller ett kolumnområde som visar områdesvärdena i pixel2 (bild 4B–D).
    9. Välj ikonen Freehand Selections från verktygsfältet och använd den för att rita en linje runt omkretsen av en enskild tomrumspunkt. Mät arean enligt steg 4.3.8. Programvaran uppdaterar resultattabellen när nya mätningar utförs. Den nya uppsättningen siffror visas under de föregående. Anteckna numret som visas under kolumnområdet i resultatfönstret för varje analyserad plats (figur 4E–G).
    10. Upprepa steg 4.3.5 till 4.3.7 för var och en av replikatpunkterna.
    11. Ställ in filterpapperets totala yta som 100% och beräkna procentandelen av ytan (% area) för varje urinfläck. Denna normalisering korrigerar fel som kan uppstå till följd av skillnader i zoom eller placering av kamerorna.
    12. Skapa en ny XY-tabell i ett grafprogram och infoga värdena för urinvolym (i μL) i X-kolumnen och dubblettvärdena för % area i Y-kolumnen.
    13. Välj sedan Analys > Analysera > XY-analys > icke-linjär regression (kurvanpassning). I parameterfönstret som visas väljer du Modell > Polynom > Andra ordningens polynom (kvadratisk).
    14. Klicka sedan på metodfliken för att markera följande val: Minsta kvadratregression, Ingen viktning och betrakta varje replikerat Y-värde som en enskild punkt.
    15. På fliken Begränsa väljer du B0, Begränsningstyp > Konstant lika med och skriver 0 under kolumnen Värde. Klicka på OK.

5. Analys av experimentella mössinspelningar

  1. Öppna en filmfil som samlats in under ljusfasen (nedre kameran) eller mörka fasen (övre kameran) för analys.
  2. Bedöm filmfilens kvalitet genom att flytta tidsrullaren framåt och bakåt, bekräfta att filterpapperet förblir intakt (utan att riva eller tugga) under det 6-timmarsfönster som ska analyseras. Om papperet är sönderrivet, utför ingen ytterligare analys, eftersom musen kan ha urinerat på den exponerade plasten som inte kan kvantifieras (figur 5).
  3. Om du vill analysera experiment som samlats in i ljusa eller mörka faser använder du snabbspolningskommandot eller skjutreglaget i tidsfältet för att flytta till önskat tidsfönster. Tömningsaktivitet under ljusfasen registreras mellan 11:00 och 17:00 (ZT = 4,0–10,0) och under den mörka fasen mellan midnatt och 06:00 (ZT = 17,0–23,0).
  4. Spela filmen i snabbspolningsläge genom att klicka på ikonen >> (eller bläddra manuellt genom filmen) och leta efter bevis på att musen töms. Det enklaste sättet att berätta att detta inträffar är att leta efter det plötsliga utseendet på ljusa fläckar av urin på filterpapperet. En annan indikator är att leta efter beteendeförändringar, inklusive rörelse till burens hörn och en kort period av inaktivitet när musen tömmer.
    OBS: När man blir bättre på att upptäcka tomrum kan man öka hastigheten på rullning eller snabbspolning framåt. Men hos möss med bakteriell och kemiskt inducerad cystit, som har ett mycket stort antal små tomrum 4,34, kan man missa tömningshändelser om man rör sig för snabbt genom filmen.
  5. Registrera den tidpunkt då varje tomrum inträffar. Som en konvention registreras tomrummets tid vid det första tecknet på att urin detekteras (figur 6A, B).
  6. För att göra mätningar av tomrummet, använd först rullningslisten för att gå framåt (eller bakåt) i tiden och leta efter den tidpunkt då maximal diffusion av urinfläcken har inträffat. Pausa filmen nu och ta en skärmbild enligt beskrivningen i steg 4.3.3. Placera datormuspilen på platsen under analys, så att platsen av intresse markeras på skärmdumpen (figur 6C, D).
  7. Namnge skärmbildsfilen med korrelativa siffror för att ta hänsyn till ordningen på utseendet i filmen.
  8. Fortsätt analysera filen och upprepa steg 5.5 och 5.7 för varje tomrum i filmen. När alla tomrumsfläckar har analyserats, mät filterpapperets totala yta genom att ta en skärmdump och använda stegen som beskrivs i 4.3.6.
  9. Beräkna den procentuella arean för var och en av urinfläckarna enligt beskrivningen i steg 4.3.9. Omvandla värdena för % area till volym urin (μL) för varje hålrumsfläck med hjälp av kalibreringskurvorna som genereras i steg 4 och interpoleringsfunktionen i grafprogrammet.
    1. Öppna XY-tabellen som innehåller data från kalibreringskurvan i grafprogrammet och infoga %-areavärdena i Y-kolumnen under kalibreringskurvans sista värde (figur 7A).
    2. Klicka på fliken Resultattabell och klicka under modellfliken för att välja Interpolera okända från Standardkurva och tryck på OK. En flik med interpolerade X-medelvärden visas bredvid resultattabellen. Denna flik innehåller en tabell med de interpolerade värdena som motsvarar volymen urin i μL för varje hålrumsplats. (Figur 7A,B).
  10. Upprepa steg 5.1 till 5.9 för att analysera alla experimentella möss.
  11. Skapa en arbetsboksfil som innehåller data från steg 5.5 till 5.10 med ett kalkylblad per mus (bild 7C). Skapa en fil för ljusfasexperimenten och en annan för de mörka faserna. Dessa huvudfiler innehåller alla rådata och nödvändiga beräkningar som används i ytterligare analyser.

6. Analys av urineringsmönstret hos experimentella möss

  1. Generera primära och sekundära hålrumsprofiler (figur 8A, B och figur 9).
    OBS: Enligt frekvensfördelningsstudier 23 representerar tomrumsfläckar som är ≥20 μL vanligtvis >95% av den totala tömda volymen och anses vara primära hålrumsfläckar (PVS) 8,23,35. Hålrumsfläckar som är ≤20 μL betraktas som sekundära eller små tomrumsfläckar (SVS). Diskriminering mellan PVS och SVS har visat sig vara ett användbart tillvägagångssätt för att karakterisera tömningsfenotyper. Ett förhöjt antal SVS indikerar tömningsdysfunktion35.
    1. Från huvudfilen som innehåller tömningsspotdata av intresse (ljus fas eller mörk fas), klassificera fläckarna baserat på deras volym som PVS när deras volym är ≥20 μL eller SVS när deras volym är <20 μL.
    2. Räkna antalet och beräkna den genomsnittliga ogiltiga volymen och den totala volymen för PVS: erna. Räkna antalet och beräkna den totala volymen för SVS: erna.
    3. Generera en grafstapel som jämför kontrollen med de behandlade mössen för var och en av de beräknade parametrarna: antal PVS, ogiltigförklarad volym PVS, total volym PVS, antal SVS, total volym SVS.
  2. Valfritt: Generera ett kumulativt tomt volymdiagram (trappfunktion) för att visa tömningsbeteende över tid (bild 10 och figur 11).
    1. Öppna arbetsbokens huvudfil och konvertera tiden för annullering, som uttrycks i timmar, minuter och sekunder, till decimalformen. Beräkna den kumulativa urinvolymen (i μL) för varje tidpunkt.
    2. Generera en XY-tabell i grafprogrammet med tid i decimalform i X-kolumnen och kumulativa urinvolymer i Y-kolumnen. Kopiera data om tid och urinvolym till tabellen. Lägg till (0; 0) och (6; högsta värde) datapunkter. Dessa punkter är nödvändiga för att slutföra de horisontella linjerna i diagrammet i början av experimentet (tid: 0 h) när den tömda volymen är noll (0; 0) och i slutet av experimentet (tid: 6 h) när det kumulativa värdet av den tömda urinen är lika med det värde som erhållits för den sista tömningshändelsen (6; maximivärde).
    3. Dubbelklicka på diagrammet; Fönstret Formatera diagram ska visas. Välj fliken Utseende , klicka för att avmarkera knappen för Visa symboler och klicka för att välja Visa anslutande linje/kurva. Klicka på alternativet Stil och välj Överlevnad.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tömningsbeteende hos urotelial Piezo1/2 knockoutmöss

Under lagringsfasen av urineringscykeln antas urotelet känna av spänningen som utövas av urinen som ackumuleras i urinblåsan och att transducera denna mekaniska stimulans till cellulära svar såsom serosal ATP-frisättning 1,3. Vi har tidigare visat att mekaniskt aktiverade PIEZO1- och PIEZO2-kanaler uttrycks i musurotelet 3,36. För att avgöra om uroteliala PIEZO-kanaler är viktiga för normalt tömningsbeteende utförde vi RT-VSA på urotelial-villkorade Piezo1/2 dubbla knockoutmöss (Pz1/2-KO) möss och ålders- och könsmatchade kontroller (Pz1/2-C; Figur 9). Vi testade både hon- och hanmöss i 6 timmar under dagens mörka och ljusa faser och analyserade data enligt beskrivningen i steg 6.1. När vi jämförde tömningsaktiviteten mellan dagens ljusa och mörka faser för kontrollgrupperna noterades att både honor och hanar uppvisade en ökning av antalet och den totala volymen PVS under sin aktiva period. Denna observation indikerar att, även om mössen befann sig i en främmande miljö, bevarades den cirkadiska karaktären av mustömningsbeteende (högst under deras aktiva mörka fas). Under deras inaktiva ljusfas observerade vi inga signifikanta skillnader i någon av parametrarna som analyserades för kvinnliga eller manliga Pz1 / 2-KO-möss jämfört med kontrollkomponenterna (Pz1 / 2-C). Men när vi testade djuren under den aktiva mörka fasen visade både kvinnliga och manliga Pz1 / 2-KO-möss en förändrad tömningsfenotyp, kännetecknad av en signifikant ökning av antalet och den totala volymen av SVS (figur 9). Det fanns inga signifikanta skillnader i PVS-antal, genomsnittlig volym per PVS eller total PVS-volym i kvinnlig eller manlig Pz1/2-KO jämfört med motsvarande kontroller. Dessa resultat indikerar att uroteliala PIEZO1/2-kanaler inte spelar någon signifikant roll för tömningsfunktionen under musens inaktiva ljusfas men är viktiga för att förhindra frekvent spotting under deras aktiva mörka fas.

Resultaten som presenteras i figur 9 illustrerar två av fördelarna med att använda RT-VSA jämfört med slutpunkten VSA. För det första, om analysen endast utfördes under ljusfasen, skulle vi ha dragit slutsatsen att uroteliala PIEZO1/2-kanaler inte hade någon roll i tömningsfunktionen. För det andra behandlades SVS i de flesta VSA-studierna som experimentellt buller och uteslöts i vissa fall från efterföljande analys23. I RT-VSA kunde vi bestämma att SVS: erna var enskilda händelser, inte sekundära till PVS (överföring eller slutmiktionsdribbling) och var frivilliga i den meningen att djuren flyttade till burens periferi, ogiltigförklarades och sedan lämnades. Denna observation gav oss värdefull information om fenotypen hos Pz1/2-KO-möss som annars skulle ha missats.

Tömningsbeteende hos kvinnliga möss under basala förhållanden och efter cyklofosfamidbehandling

I detta pilotexperiment testade vi effekterna av cyklofosfamid (CYP) på musens frivilliga tömningsbeteende. Cyklofosfamid, ett läkemedel som används för att behandla vissa former av cancer eller immunologiska störningar, är känt för att orsaka cystit hos patienter och försöksdjur, vilket resulterar i en överaktiv blåsfenotyp som kännetecknas av flera, små tömningshändelser 26,37,38. För att bestämma utgångsutgångstömningsbeteendet placerade vi en obehandlad honmus i RT-VSA under den mörka fasen. Samma mus injicerades intraperitonealt med en dos CYP (150 mg/kg) 5 dagar senare för att orsaka akut cystit. Omedelbart efter injektionen placerades musen i en RT-VSA-bur för inspelning. Tömningsbeteendet representeras i ett stegdiagram (figur 11), där de vertikala linjerna representerar volymen urin som tömts och de horisontella linjerna representerar tiden. Jämfört med de resultat som erhållits under basala förhållanden är det uppenbart att mängden urin som frigörs per tomrum är mindre efter CYP-behandling och att urineringshändelserna är mycket vanligare. Detta kan bättre uppskattas i diagrammets infällning, där de första 30 minuterna av den analyserade perioden (motsvarande midnatt till 00:30 [7,0 till 7,5 timmar efter injektion]) förstoras.

Figure 1
Figur 1: RT-VSA-registreringskammaren. (A) RT-VSA-inspelningssystemet omfattar en övre del, som består av två sida vid sida, klara, akrylkammare och tillhörande övre kameror. Den nedre halvan av enheten är ett enda enhetsstativ som håller de övre muskamrarna och innehåller de nedre kamerorna och UV-lamporna. Insidan av stativets väggar är gjorda av spegelpaneler som reflekterar UV-ljuset för att ge jämn belysning till botten av burarna. Inte avbildad är en dator som tar emot ett videoflöde från kamerorna och registrerar data. (B) Modell av muskammaren med komponenter och mått. 1) standard lyft gångjärn; 2) kamerans monteringsfäste; och 3) lite övergångshörnfäste. Främre (C) och övre (D) vyer av UV-stativet med komponenter och mått. UV-lampor monteras inuti fram- och bakprofilerna med raka platta plattor. En 32-tums profil fäst vid stativets huvudram med två lite övergångshörnfästen används för att montera kamerorna. Raka platta plattor används för att fästa kamerorna på 32-profilen. En speglad panel är monterad inuti stativet (visas inte). 1) femhåls tee plattplatta; 2) femhåls T-plattplatta; och 3) femhåliga L-platta plattor. Alla värden som presenteras är i tum. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: RT-VSA-muskammare. Före experimentella förfaranden förbereds varje experimentell muskammare genom att fodra den med en bit filterpapper (numrerad 1). Beroende på vilken period på dagen experimentet utförs är filterpapperet som används antingen tjockt (mörk fas) eller tunt (ljusfas). En plastkupol placeras i mitten av kammaren (numrerad 2), en plastskål med vatten (i form av icke-vätande vattengel) och chow placeras på ena sidan av kupolen (numrerad 3) och ett plast-1,5 ml mikrocentrifugrör, en form av anrikning, placeras på motsatt sida (numrerad 4). Det ursprungliga arrangemanget av element i buret hålls konsekvent i alla experiment. Observera att en bit filterpapper placeras mellan de två angränsande burarna och är markerad i figuren med en asterisk. Detta för att förhindra påverkan av visuella signaler som uppstår från den närliggande musen. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Kalibreringskurva. Representativa bilder av tjocka (A, vänstra paneler) och tunna (B, vänster panel) filterpapper fläckade med kända mängder musurin. Bilder är skärmdumpar från videoinspelningar som erhållits med hjälp av de övre (A, vänstra panelerna) eller nedre (B, vänstra panelen) kamerorna. Röda pilar pekar på 2 μL urinfläckar, och siffrorna under fläckarna är punktvolymvärdena i μL. Observera att de små urinfläckarna (<50 μL) i den övre bilden av panel A som är synliga strax efter urinspotting (5 min) inte längre märks efter 30 min (nedre panelen). Högra paneler: Diagram över tomrumsfläckens yta (uttryckt som procentandelen av filtrets totala pappersyta) som en funktion av urinvolymen. Som noterats av andra följer data om tomrumsområdet som en funktion av urinvolymen inte ett linjärt förhållande30. Således anpassar vi data till ett andra ordningens polynom med icke-linjär regression. Data begränsades så att X = 0 till Y = 0. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Bestämning av filterpapper och urinfläckområden med hjälp av ImageJ. (A) En skärmdump av kalibreringskurvan som visas i figur 3A öppnad i bild J. Det inramade området i (A) visas mer detaljerat i (B). (B) Polygonvalsikonen väljs (inringad i rött) för att rita en polygon längs filterpapperets omkrets (partiell vy; gul linje med röda pilar som pekar på noderna som genereras av urvalsverktyget). (C) Polygonens yta återspeglar filterpapperets totala yta och mäts genom att välja Analysera > mått (röd cirkel). (D) Värdet på området (i pixlar) visas i ett resultatfönster (röd cirkel). (E) För att mäta arean för en enskild tomrumsfläck väljs verktyget för frihandsval (röd cirkel) och i (F) används för att rita en linje runt platsens kant (den röda pilen pekar på platsen). Med samma kommando som i (C) mäts hålrumspunktens area, med resultatet som ett nytt värde i resultatfönstret, omedelbart under den senaste mätningen (panel G, röd cirkel). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: Bedömning av filterpappersstatus efter avslutade RT-VSA-experiment. Representativa bilder av muskammaren som visar olika förhållanden för filterpapperet under eller efter ett RT-VSA-experiment. Filterpapper som förblev intakt fram till slutet av testperioden visas i (A) och representerar den vanligaste situationen och det tillstånd under vilket ett experiment kan analyseras ytterligare (grön bock). Exempel på skadat filterpapper visas i (B) och (C) och är representativa för experiment som inte får analyseras ytterligare (rött X). I (B) strimlades filterpapperet av musen (röd pil) i ett av hörnen. Den streckade gula linjen markerar gränsen till burens golv. Det inramade området förstoras i bilden till höger. I (C) äventyrades experimentets integritet som ett resultat av att icke-vätande vattengel (röd pil) flyttades av musen in i hörnet och lämnade tre stora vattenfläckar (röda asterisker). Dessa rörelser bekräftades genom att titta på videon. Bilder är skärmdumpar från filmfiler som erhållits under den mörka fasen, med hjälp av den övre kameran och med buren fodrad med tjockt filterpapper. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 6
Figur 6: Bestämning av tidpunkten för annullering och förvärv av skärmdumpar för mätningar av tomrumsområdet. (A,B) Skärmdump av en mus i ett hörn av kammaren, med en tomrum som just har blivit synlig. Tiden för denna ram kommenteras som tidpunkten för annulleringen. (C,D) När tomrummet når maximal diffusion tas en skärmdump för att bestämma tomrummets volym. Bilder är skärmdumpar från filmfiler som erhållits med den övre kameran, med tjockt filterpapper och under den mörka fasen. Analysperioden var midnatt till 06:00. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 7
Figur 7: Omvandling av tomrumsområde till urinvolym och generering av en kalkylbladsfil med experimentella rådata. (A) Skärmbild av grafprogrammets fönster som visar värden för tomrumsfläckar uttryckta som procentandelen av filtrets totala pappersyta (data som visas i grönt). Kalkylbladet (grön pil) sparas under avsnittet datatabeller. (B) Omvandling av procentandelen av den totala ytan till urinvolym (data markerade med rött). De senare värdena visas i resultatsektionen (röd pil) och beräknas från kalibreringskurvan med hjälp av interpolera okända från standardkurvfunktionen. (C) Skärmdump av ett kalkylblad med sammanställda råa och beräknade data. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 8
Figur 8: Klassificering av hålrumsfläckar i PVS och SVS och deras analys. Skärmdumpar av kalkylblad (genererade enligt figur 7C) från en mus under basala förhållanden (A) och 7 timmar efter att ha fått en dos cyklofosfamid (150 mg/kg) (B). Hålrumsfläckar klassificeras som primära tomrumsfläckar (PVS) om volymen är ≥20 μL, eller som små tomrumsfläckar (SVS) om volymen är <20 μL. Observera att i den obehandlade musen (A) är alla tömningshändelser PVS, medan i det cyklofosfamidbehandlade djuret är de flesta tomrum SVS. Den inringade tabellen i varje panel (röd kontur) innehåller följande sammanfattande statistik: antal hålrum, genomsnittlig tömd volym och total tömd volym. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 9
Figur 9: Tömningsbeteende hos Piezo1/2 knockout och kontrollmöss. Tömningsbeteendet hos honmöss (A) och hanmöss (B) Piezo1/2 knockout (Pz1/2-KO) och kontrollmöss ( Pz1/2-C ) registrerades under ett tidsfönster på 6 timmar under den mörka eller ljusa fasen av dagen och resultaten analyserades enligt beskrivningen i steg 6.1. Data visas som medelvärde ± medelmedelfel (S.E.M.). Data jämfördes med hjälp av ett Mann-Whitney-test. Förkortningar: PVS = primära tomrumsfläckar; SVS = små tomrumsfläckar; NS = inte signifikant; * p < 0,05; ** p < 0,01. Denna siffra har ändrats från3. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 10
Figur 10: Arbetsblad för beräkning och grafisk representation av den kumulativa ogiltiga volymen som en funktion av tiden. (A) Skärmdump av kalkylbladet som genereras i figur 7C som visar de beräkningar som behövs för att generera ett trappfunktionsdiagram över den kumulativa volymen urin som tömts som en funktion av tiden. Tiden måste anges i decimalformat (kolumn G, röd fyrkant). För att omvandla tiden till decimalformat lades tre kolumner (röda pilar) till höger om kolumnen för tid för annullering för att separat kommentera värdena för timmar (kolumn D), minuter (kolumn E) och sekunder (kolumn F) och det slutliga resultatet av tiden i decimalformat (kolumn G). För att omvandla tidsannulleringen till ett decimalformat, använd följande funktion: (h) + (min / 60) + (s / 3,600). En kolumn lades till till höger om urinvolymkolumnen för att visa den kumulativa urinvolymen (blå rektangel), som beräknas som summan av alla urinvolymer (kolumn J) som erhållits fram till tidpunkten för en ny tömningshändelse (inklusive det nya händelsevärdet). (B) Skärmdump som visar data som kopierats från kalkylbladet i panel A och klistrats in i kolumn X (tid i decimalformat) och kolumn Y (kumulativa urinvolymer) i ett grafprogramprojekt. De första och sista tidspunkterna i diagrammet är inställda på 0 och 6 (maxvärde) rader som indikeras av de röda pilarna. (C) För att generera ett stegdiagram formateras diagrammet genom att avmarkera fältet visa symboler, aktivera alternativet visa anslutningslinjen / kurvan och välja överlevnadsstil, som visas i fälten omgivna av rött. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 11
Figur 11: Representativa resultat av mustömningsbeteende under basala förhållanden eller efter administrering av cyklofosfamid. Det frivilliga tömningsbeteendet hos en mus bedömdes med RT-VSA under den mörka fasen före (basal) och 7 timmar efter administrering av cyklofosfamid (CYP), enligt beskrivningen i de representativa resultaten. Tid och volym för tömningshändelserna visas i ett stegdiagram som genererades enligt beskrivningen i steg 6.2. Diagrammets infällning representerar området i diagrammet markerat med en grön rektangel och motsvarar de första 30 minuterna av den analyserade perioden. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 12
Figur 12: Identifiering av överlappande urinfläckar med RT-VSA. Skärmbilder av videobildrutor som tagits med den övre kameran i den mörka fasen av ett RT-VSA-experiment (bild 1 och 2). Det inramade området i bild 2 förstoras i bild 3. Musen tömdes i samma övre högra hörn ytterligare två gånger under de närmaste timmarna (bild 4–6). Trots överlappningen av tomrumsfläckar upptäcktes de enskilda tömningshändelserna lätt med RT-VSA. För att visualisera hur dessa händelser skulle se ut som en slutpunktsanalys exponerade vi filterpapperets hörn för olika ljusförhållanden. Under synligt, omgivande ljus kunde endast en enda, stor tomrumsfläck identifieras (bild 7). På samma sätt, om samma region undersöktes under UV-ljus, kunde endast en enda mörk fläck urskiljas (bild 8). Således detekteras flera hålrum i samma region lätt av RT-VSA, men sådan diskriminering är inte möjlig om analysen utförs som en slutpunktsanalys. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Införlivandet av videoövervakning är en kostnadseffektiv modifiering som ger flera fördelar jämfört med den klassiska VSA. I den klassiska VSA, som vanligtvis används som en slutpunktsanalys, är det svårt att skilja överlappande tomrumsfläckar. Detta är inte ett trivialt problem, eftersom möss tenderar att urinera flera gånger i samma område när analysen förlängs i flera timmar, vanligtvis i hörnen av buret. Således är den första fördelen med RT-VSA att utredaren lätt kan identifiera enskilda fläckar som har deponerats delvis eller helt ovanpå varandra. Detta illustreras väl i experimentet som visas i figur 12. I det här fallet bekräftar videoinspelning att musen tömdes tre gånger i samma hörn och deponerade överlappande tomrum. Om filterpapperet analyserades först i slutet av experimentet, på det sätt som är typiskt för en VSA, kunde endast en plats särskiljas. Så även om den klassiska slutpunkten VSA kan vara användbar för att identifiera stora skillnader i tömningsbeteende, kan den misslyckas med att skilja mellan mer subtila fenotyper. Med de nuvarande framstegen inom genetik och generering av transgena djur är utvecklingen av metoder som exakt kan bedöma tömningsbeteende avgörande.

För det andra ger RT-VSA utredaren tidsmässig information om tömningshändelserna. Således kan man bestämma sanna micturitionsfrekvenser, samt upprätta relationer mellan tömningshändelser. Till exempel, i en situation där ett kluster av SVS observeras bredvid en enda stor PVS, i den klassiska VSA, kan man inte lätt diskriminera om musen tömdes flera gånger under experimentet (med tre små och ett stort tomrum) eller om djuret deponerade en stor urinvolym, och de tre mindre fläckarna är ett resultat av dribbling eller överföring efter miktion från päls. RT-VSA kan användas för att ta itu med dessa frågor.

För det tredje tillåter RT-VSA att man analyserar beteendet hos en mus före, under och efter tömningshändelsen. Utredaren kan också övervaka musens övergripande aktivitetsprofil genom att analysera RT-VSA-inspelningar med fritt tillgänglig programvara som Mouse Behavior Tracker39. Dessutom kan man urskilja om ett djur slutar urinera (typiskt beteende hos honor), om djuret är i rörelse under tömning (vilket hos män kan resultera i efterföljande tomrum), eller om det tömmer sig under sin sömn / vilofas. Vi har observerat det senare beteendet, även om det normalt är sällsynt. Således, om det valideras och tolkas korrekt, kan observation av tömningsbeteende ge utredaren värdefulla insikter om tömningsdysfunktion, inklusive till exempel nokturi eller inkontinens. RT-VSA (och VSA) gör det möjligt för utredare att bestämma fraktionen av tomrumshändelser som inträffar i det centrala området i en bur, i motsats till hörnen. Normalt är centrumtömning sällsynt, och ökat antal sådana händelser är ett tecken på blåsdysfunktion 8,22. Det enda undantaget är dominanta alfahannar, som urinerar ofta och över hela inhägnaden20. För att utföra en analys av central tömning med RT-VSA bör man överväga att flytta matskålen till en sidovägg och ta bort kupolen (eller fixera den till en viss region i buren), så att rumsliga urineringsmönster lättare kan fastställas.

För det fjärde tillåter RT-VSA en att mer effektivt hantera de spänningar som är förknippade med burbyte jämfört med klassisk VSA. Möss är skygga av naturen och att hantera dem eller överföra dem till en ny miljö orsakar stress, vilket är känt för att påverka tömningsbeteendet35. Det är till sin natur svårt att införliva en acklimatiseringsperiod i standard VSA. Däremot kan en acklimatiseringsperiod i RT-VSA enkelt införlivas i varje experiment, och eventuella tömningshändelser under denna period ignoreras under analysen. En ytterligare stressavlastande aspekt av RT-VSA implementerad i detta protokoll är duplicering av förhållanden under vilka möss normalt är inrymda (dvs. tillgång till mat och vatten ad libitum, en kupol och en leksak). Detta är, så vitt vi vet, en av de rikaste miljöerna som beskrivs för denna typ av experiment. I en typisk endpoint VSA berövas möss vatten (och ibland också från mat)8,22, vilket vi tillhandahåller ad libitum.

För det femte, förutom den positiva effekten som denna berikade miljö kan ha på stressnivåerna hos möss, tillåter det utredaren att utföra RT-VSA under längre tidsperioder, vanligtvis i 6 timmars tidsfönster; Men på senare tid har vi utfört experiment som körs i 24 timmar (data visas inte). Detta är idealiskt när man bedömer effekterna av dygnsrytmicitet eller när man studerar möss som kan uppvisa en fenotyp för underaktiv blåsa och därmed urinera sällan.

För 24 timmars videoövervakning rekommenderar vi att du använder tunt filterpapper och analyserar experimenten med de nedre kamerorna. Denna kombination av typ av papper och kamera är det bästa alternativet som möjliggör detekteringskänslighet i mörka och ljusa faser. Som tidigare nämnts kan bottenkameror inte lätt upptäcka tomrum på det tjocka filterpapperet och de övre kamerorna upptäcker inte på ett tillförlitligt sätt tomrum under ljusfasen. Om du utför dessa utökade analyser föreslår vi att djuren placeras i inspelningsburarna klockan 17:00, analyserar från 18:00 dag 1 och slutför experimentet klockan 18:00 följande dag.

Medan RT-VSA har många positiva aspekter, finns det några försiktighetsåtgärder som är värda att notera. Medan vi gör alla försök att begränsa stress när vi utför dessa analyser, kan vi inte helt replikera musens livsmiljö, eftersom djuren normalt är grupphus. De dricker också vatten från en flaska istället för att få vatten från icke-vätande vattengel. Vår observation att möss har färre tomrum under sin inaktiva ljusfas jämfört med deras aktiva mörka fas indikerar dock för oss att mössen behåller sina normala mönster av cirkadiskt tömningsbeteende40. Med tanke på deras lättstressade natur fann vi att möss uppvisar stört tömningsbeteende på dagarna med burrengöring. Således måste man begränsa analysen till tidsperioder då djuren kommer att påverkas mindre av rutinmässig djurhållning. En viktig faktor att tänka på är om UV-ljuset har någon inverkan på tömningsfunktionen. Eftersom våra resultat visar en distinkt cirkadisk skillnad i VSA-parametrar mellan ljusa och mörka faser, som överensstämmer med andra tekniker som beskriver ett liknande fenomen men inte använder UV-ljus40, drar vi slutsatsen att UV-ljusbelysning inte påverkar tömningsfunktionen. Observera att filterpapperet förhindrar att ljus passerar från den nedre kammaren till den övre kammaren.

En ytterligare varning är att ju längre man håller mössen i kammaren, desto mer sannolikt är det att de tuggar eller skadar filterpapperet (oavsett papperets tjocklek). Medan inget av djuren störde papperet under ljusfasen, skadade nästan 30% av mössen papperet under den mörka aktiva fasen. I analysen av 24-timmarsexperimenten observerade vi att en liknande andel (en tredjedel) av experimenten inte kunde analyseras på grund av pappersskador, vilket innebär att inte bara tiden utan också dagens fas påverkar djurets fragmenteringsbeteende. Tyvärr har vi enligt vår erfarenhet märkt att ett djur som stör burens papper kommer att fortsätta att göra det även vid omtestning. Som nämnts ovan urinerar möss ibland på det nakna akrylgolvet, och därmed förlust av papperet gör analysen ofullständig och av begränsat värde.

Vidare kan analysen av manligt tömningsbeteende vara svårare eftersom de tenderar att tömma oftare, de kan dribbla efter tömning, och det finns en population av män (20%) med en mer aggressiv alfa-manlig fenotyp som kännetecknas av ett stort antal små tomrum som är fördelade över buren, vilket diskuterades i en tidigare publikation3. Eftersom detta alfa-manliga beteende kan utgöra en förvirrande faktor för att fastställa tömningsfenotyper, utesluter vi djur med ≥50 (ljusfasexperiment) eller ≥100 (mörkfasexperiment) tomrum från analys.

Det finns situationer där diskriminering av tomrum baserat på deras volym (dvs. PVS vs SVS) inte nödvändigtvis är motiverad. Till exempel, enligt vår erfarenhet, tenderar möss med bakteriell eller kemisk cystit att tömma mindre volymer än kontroller 4,34. Det finns dock stora skillnader i den tömda volymen mellan enskilda möss; i vissa har de flesta hålrum en volym ≤20 μL, medan i andra är majoriteten >20 μL. Följaktligen ger diskrimineringen av den tömda volymen ingen fördel för karakteriseringen av dessa fenotyper.

Sammanfattningsvis är RT-VSA ett lättimplementerat verktyg för att analysera mustömningsbeteende hos fritt mobila möss. Till skillnad från verktyg som cystometri kräver det inte kirurgisk implantation av en kateter eller icke-fysiologiska blåsfyllningshastigheter. Det möjliggör bestämning av tömningsbeteende hos båda könen av möss, under längre tidsperioder och under de ljusa och mörka faserna i dagcykeln. Det är också relativt överkomligt, särskilt jämfört med mer specialiserade och dyra enheter som metaboliska burar. Även om det finns försiktighetsåtgärder associerade med detta verktyg är de i allmänhet lätta att hantera. Slutligen kan denna teknik lätt anpassas till andra djurarter, inklusive andra gnagare.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av ett NIH-bidrag R01DK119183 (till GA och MDC), ett pilotprojektpris genom P30DK079307 (till M.G.D.), ett American Urology Association Career Development-pris och ett Winters Foundation-bidrag (till NM) och av Cell Physiology and Model Organisms Kidney Imaging Cores i Pittsburgh Center for Kidney Research (P30DK079307).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots –  cut to 10 inches 80/20 1010 Amount: 20
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots –  cut to 12 inches 80/20 1010 Amount: 6
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots –  cut to 40 inches 80/20 1010 Amount: 4
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots – cut to 14.75 inches 80/20 1010 Amount: 12
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots – cut to 32 inches 80/20 1010 Amount: 5
1/4-20 Double Slide-in Economy T-Nut 80/20 3280 Amount: 16
1/4-20 Triple Slide-in Economy T-Nut 80/20 3287 Amount: 18
10 & 25 Series 2 Hole - 18mm Slotted Inside Corner Bracket with Dual Support 80/20 14061 Amount: 6
10 Series 3 Hole - Straight Flat Plate 80/20 4118 Amount: 8
10 Series 5 Hole - "L" Flat Plate 80/20 4081 Amount: 8
10 Series 5 Hole - "T" Flat Plate 80/20 4080 Amount: 8
10 Series 5 Hole - Tee Flat Plate 80/20 4140 Amount: 2
10 Series Standard Lift-Off Hinge - Right Hand Assembly 80/20 2064 Amount: 2
10 to 15 Series 2 Hole - Lite Transition Inside Corner Bracket 80/20 4509 Amount: 6
24”-long UV tube lights ADJ Products LLC T8-F20BLB24 Amount: 2
20W bulb – 24” Wavelength: 365nm
Acrylic Mirror Sheet Profesional Plastics Amount: 1
82.5 cm x 26.5 cm
Acrylic Mirror Sheet Profesional Plastics Amount: 2
26.5 cm X 30.5 cm
Acrylic Mirror Sheet Profesional Plastics Amount: 2
82.5 cm x 30.5 cm
AR polycarbonate (UV resistance) 80/20 65-2641 Amount: 2
4.5mm Thick, Clear, 38.5 cm x 26.5 cm
AR polycarbonate (UV resistance) 80/20 65-2641 Amount: 4
4.5mm Thick, Clear, 38.5 cm x 21.5 cm
AR polycarbonate (UV resistance) 80/20 65-2641 Amount: 4
4.5mm Thick, Clear, 26.5 cm x 21.5 cm
AR polycarbonate (UV resistance) 80/20 65-2641 Amount: 4
4.5mm Thick, Clear 37.5 cm x 23.9 cm
AR polycarbonate (UV resistance) 80/20 65-2641 Amount: 4
4.5mm Thick, Clear , 24.4 cm x 23.9 cm
Chromatography paper (thin paper)  Thermo Fisher Scientific 57144
Cosmos blotting paper (thick paper) Blick Art Materials 10422-1005
Excel Microsoft Corporation
GraphPad Prism GraphPad Software Version 9.4.0 graphing and statistics software
ImageJ FIJI NIH
Parafilm Merck transparent film
Quick Time Player 10.5 software  Apple multimedia player
Security spy Ben software video surveillance software system
Standard End Fastener, 1/4-20 80/20 3381 Amount: 80
UV transmitting acrylic Spartech Polycast Solacryl SUVT Amount: 2
38.5 cm x 26.5 cm 
Water gel: HydroGel ClearH2O   70-01-5022 (https://www.clearh2o.com/product/hydrogel/)
Webcam Logitech C930e Amount: 4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. The urothelium: life in a liquid environment. Physiological Reviews. 100 (4), 1621 (2020).
  2. de Groat, W. C., Griffiths, D., Yoshimura, N. Neural control of the lower urinary tract. Comprehensive Physiology. 5 (1), 327 (2015).
  3. Dalghi, M. G., et al. Functional roles for PIEZO1 and PIEZO2 in urothelial mechanotransduction and lower urinary tract interoception. JCI Insight. 6 (19), (2021).
  4. Montalbetti, N., et al. Bladder infection with uropathogenic Escherichia coli increases the excitability of afferent neurons. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 322 (1), 1 (2022).
  5. Montalbetti, N., et al. Increased urothelial paracellular transport promotes cystitis. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 309 (12), 1070 (2015).
  6. Montalbetti, N., et al. Urothelial tight junction barrier dysfunction sensitizes bladder afferents. eNeuro. 4 (3), (2017).
  7. Montalbetti, N., Stocker, S. D., Apodaca, G., Bastacky, S. I., Carattino, M. D. Urinary K+ promotes irritative voiding symptoms and pain in the face of urothelial barrier dysfunction. Scientific Reports. 9 (1), 5509 (2019).
  8. Kim, A. K., Hamadani, C., Zeidel, M. L., Hill, W. G. Urological complications of obesity and diabetes in males and females of three mouse models: temporal manifestations. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 318 (1), 160 (2020).
  9. Bartolone, S. N., et al. Micturition defects and altered bladder function in the klotho mutant mouse model of aging. American Journal of Clinical and Experimental Urology. 8 (3), (2020).
  10. de Rijk, M. M., et al. Aging-associated changes in oxidative stress negatively impacts the urinary bladder urothelium. International Neurourology Journal. 26 (2), 111 (2022).
  11. Coyne, K. S., et al. The prevalence of lower urinary tract symptoms (LUTS) and overactive bladder (OAB) by racial/ethnic group and age: results from OAB-POLL. Neurourology and Urodynamics. 32 (3), 230 (2013).
  12. Wittig, L., Carlson, K. V., Andrews, J. M., Crump, R. T., Baverstock, R. J. Diabetic bladder dysfunction: a review. Urology. 123, (2019).
  13. Irwin, D. E., et al. Population-based survey of urinary incontinence, overactive bladder, and other lower urinary tract symptoms in five countries: results of the EPIC study. European Urology. 50 (6), 1314 (2006).
  14. Bogart, L. M., Berry, S. H., Clemens, J. Q. Symptoms of interstitial cystitis, painful bladder syndrome and similar diseases in women: a systematic review. The Journal of Urology. 177 (2), 450 (2007).
  15. Foxman, B. Urinary tract infection syndromes: occurrence, recurrence, bacteriology, risk factors, and disease burden. Infectious Disease Clinics of North America. 28 (1), 1 (2014).
  16. Fall, M., Logadottir, Y., Peeker, R. Interstitial cystitis is bladder pain syndrome with Hunner's lesion. International Journal of Urology. 21, 79 (2014).
  17. Birder, L. A. Urinary bladder, cystitis and nerve/urothelial interactions. Autonomic Neuroscience: Basic & Clinical. 182, 89 (2014).
  18. Rosen, J. M., Klumpp, D. J. Mechanisms of pain from urinary tract infection. International Journal of Urology. 21 Suppl. 1, 26 (2014).
  19. Birder, L., et al. Neural control of the lower urinary tract: peripheral and spinal mechanisms. Neurourology and Urodynamics. 29 (1), 128 (2010).
  20. Desjardins, C., Maruniak, J. A., Bronson, F. H. Social rank in house mice: differentiation revealed by ultraviolet visualization of urinary marking patterns. Science. 182 (4115), 939 (1973).
  21. Sugino, Y., et al. Voided stain on paper method for analysis of mouse urination. Neurourology and Urodynamics. 27 (6), 548 (2008).
  22. Hill, W. G., Zeidel, M. L., Bjorling, D. E., Vezina, C. M. Void spot assay: recommendations on the use of a simple micturition assay for mice. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 315 (5), (2018).
  23. Rajandram, R., et al. Intact urothelial barrier function in a mouse model of ketamine-induced voiding dysfunction. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 310 (9), (2016).
  24. Ruetten, H., et al. A uropathogenic E. coli UTI89 model of prostatic inflammation and collagen accumulation for use in studying aberrant collagen production in the prostate. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 320 (1), 31 (2021).
  25. Wegner, K. A., et al. Void spot assay procedural optimization and software for rapid and objective quantification of rodent voiding function, including overlapping urine spots. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 315 (4), (2018).
  26. Wood, R., Eichel, L., Messing, E. M., Schwarz, E. Automated noninvasive measurement of cyclophosphamide-induced changes in murine voiding frequency and volume. The Journal of Urology. 165 (2), 653 (2001).
  27. Dmochowski, R. R. Bladder outlet obstruction: etiology and evaluation. Reviews in Urology. 7 (Suppl 6), S3–S13. , (2005).
  28. Aizawa, N., Homma, Y., Igawa, Y. Influence of high fat diet feeding for 20 weeks on lower urinary tract function in mice. Lower Urinary Tract Symptoms. 5 (2), 101 (2013).
  29. Wang, Z., et al. Void sorcerer: an open source, open access framework for mouse uroflowmetry. American Journal of Clinical and Experimental Urology. 7 (3), 170 (2019).
  30. Verstegen, A. M., Tish, M. M., Szczepanik, L. P., Zeidel, M. L., Geerling, J. C. Micturition video thermography in awake, behaving mice. Journal of Neuroscience Methods. 331, 108449 (2020).
  31. Keller, J. A., et al. Voluntary urination control by brainstem neurons that relax the urethral sphincter. Nature Neuroscience. 21 (9), (2018).
  32. Hou, X. H., et al. Central control circuit for context-dependent micturition. Cell. 167 (1), 73 (2016).
  33. Negoro, H., et al. Involvement of urinary bladder Connexin43 and the circadian clock in coordination of diurnal micturition rhythm. Nature Communication. 3, (2012).
  34. Montalbetti, N., Carattino, M. D. Acid-sensing ion channels modulate bladder nociception. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 321 (5), (2021).
  35. Chen, H., Zhang, L., Hill, W. G., Yu, W. Evaluating the voiding spot assay in mice: a simple method with complex environmental interactions. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 313 (6), (2017).
  36. Dalghi, M. G., et al. Expression and distribution of PIEZO1 in the mouse urinary tract. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 317 (2), 303 (2019).
  37. Birder, L., Andersson, K. E. Animal modelling of interstitial cystitis/bladder pain syndrome. International Neurourology Journal. 22, (2018).
  38. Okinami, T., et al. Altered detrusor gap junction communications induce storage symptoms in bladder inflammation: a mouse cyclophosphamide-induced model of cystitis. PLoS One. 9 (8), (2014).
  39. Tungtur, S. K., Nishimune, N., Radel, J., Nishimune, H. Mouse Behavior Tracker: An economical method for tracking behavior in home cages. Biotechniques. 63 (5), (2017).
  40. Negoro, H., Kanematsu, A., Yoshimura, K., Ogawa, O. Chronobiology of micturition: putative role of the circadian clock. The Journal of Urology. 190 (3), (2013).

Tags

Retraktion utgåva 192 analys av tomrumsfläckar urinblåsa tömningsfunktion urinering cystometri
Analys av tomrum i realtid
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dalghi, M. G., Montalbetti, N.,… More

Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Wheeler, T. B., Apodaca, G., Carattino, M. D. Real-Time Void Spot Assay. J. Vis. Exp. (192), e64621, doi:10.3791/64621 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter