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Behavior

Essai de vide en temps réel

Published: February 10, 2023 doi: 10.3791/64621
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1,2
1Renal-Electrolyte Division, Department of Medicine, University of Pittsburgh, 2Department of Cell Biology, University of Pittsburgh

Summary

Cet article décrit une nouvelle méthode pour étudier le comportement de vidange de la souris en incorporant la surveillance vidéo dans le test conventionnel de la tache vide. Cette approche fournit des informations temporelles, spatiales et volumétriques sur les événements de miction et les détails du comportement de la souris pendant les phases claires et sombres de la journée.

Abstract

Le comportement normal de miction est le résultat de la fonction coordonnée de la vessie, de l’urètre et des sphincters urétraux sous le contrôle approprié du système nerveux. Pour étudier le comportement de miction volontaire dans des modèles murins, les chercheurs ont mis au point le test de la tache vide (VSA), une méthode qui mesure le nombre et la surface des taches d’urine déposées sur un papier filtre tapissant le sol de la cage d’un animal. Bien que techniquement simple et peu coûteux, ce test présente des limites lorsqu’il est utilisé comme test final, notamment un manque de résolution temporelle des événements de miction et des difficultés à quantifier les taches d’urine qui se chevauchent. Pour surmonter ces limitations, nous avons développé un VSA vidéo-surveillé, que nous appelons VSA en temps réel (RT-VSA), et qui nous permet de déterminer la fréquence de vidage, d’évaluer le volume vidé et les modèles de vidage, et d’effectuer des mesures sur des fenêtres temporelles de 6 heures pendant les phases sombres et claires de la journée. La méthode décrite dans ce rapport peut être appliquée à une grande variété d’études sur souris qui explorent les aspects physiologiques et neurocomportementaux de la miction volontaire dans les états de santé et de maladie.

Introduction

Le stockage de l’urine et la miction sont coordonnés par un circuit central (système nerveux central) qui reçoit des informations sur l’état de remplissage de la vessie par les nerfs pelviens et hypogastriques. L’urothélium, l’épithélium qui tapisse les voies urinaires du bassinet du rein à l’urètre proximal, forme une barrière étroite contre les déchets métaboliques et les agents pathogènes présents dans l’urine. Il fait partie intégrante d’un réseau sensoriel, qui détecte et communique l’état de remplissage de la vessie aux tissus sous-jacents et aux nerfs afférents 1,2. La perturbation de la barrière urothéliale ou les altérations des voies de mécanotransduction urothéliale peuvent entraîner un dysfonctionnement de la miction ainsi que des symptômes des voies urinaires inférieures tels que la fréquence, l’urgence, la nycturie et l’incontinence 3,4,5,6,7. De même, le vieillissement, le diabète, les infections des voies urinaires inférieures, la cystite interstitielle et d’autres processus pathologiques qui affectent la vessie, ou les circuits associés qui contrôlent sa fonction, sont connus pour causer un dysfonctionnement de la vessie 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17, 18,19. Une meilleure compréhension du comportement mictionnel normal et anormal dépend du développement de méthodes capables de discriminer de manière fiable entre différents modèles de miction.

Traditionnellement, le comportement de miction volontaire des souris a été étudié à l’aide du test de la tache vide (VSA), développé par Desjardins et ses collègues 20, et largement adopté en raison de sa simplicité, de son faible coût et de son approche non invasive 8,21,22,23,24. Ce test est généralement effectué comme un test de point final, dans lequel une souris passe un temps défini dans une cage tapissée d’un papier filtre, qui est ensuite analysé en comptant le nombre et en évaluant la taille des taches d’urine lorsque le papier filtre est placé sous une lumière ultraviolette (UV) (les taches d’urine deviennent fluorescentes dans ces conditions)20. Malgré ces nombreux avantages, le VSA traditionnel présente quelques limitations majeures. Étant donné que les souris urinent souvent dans les mêmes zones, les chercheurs doivent limiter la durée de l’essai à une période relativement courte (≤4 h)25. Même lorsque le VSA est effectué sur des périodes de temps plus courtes, il est presque impossible de résoudre les petites taches de vide (SVS) qui tombent sur de grandes taches de vide ou de distinguer les SVS du transfert d’urine adhérant à la queue ou aux pattes. Il est également très difficile de distinguer si les SVS sont la conséquence d’événements mictionnels fréquents mais individuels (un phénotype qui est souvent observé en réponse à la cystite 4,26), ou en raison de dribbles post-miction (un phénotype associé à l’obstruction de la vessie27). De plus, le désir de terminer le test pendant les heures de travail, associé aux difficultés d’accès aux logements lorsque les lumières sont éteintes, limite souvent ces tests à la période de lumière du cycle circadien de 24 heures. Ainsi, ces contraintes de temps empêchent l’évaluation du comportement de miction des souris pendant leur phase nocturne active, ce qui diminue la capacité d’analyser des gènes ou des traitements spécifiques régis par les rythmes circadiens.

Pour surmonter certaines de ces limitations, les chercheurs ont développé des méthodes alternatives pour évaluer le comportement de miction en temps réel 26,28,29,30,31,32. Certaines de ces approches impliquent l’utilisation d’équipements coûteux tels que des cages métaboliques26,28,29 ou l’utilisation de caméras thermiques30; Cependant, ceux-ci aussi ont des limites. Par exemple, dans les cages métaboliques, l’urine a tendance à adhérer aux fils du sol en mailles et aux parois de l’entonnoir, ce qui réduit la quantité d’urine recueillie et mesurée. Ainsi, il peut être difficile de collecter avec précision des données sur les petits vides. De plus, les cages métaboliques ne fournissent pas d’informations sur la distribution spatiale des événements de miction (c’est-à-dire la miction dans les coins par rapport au centre de la chambre). Étant donné que le rayonnement infrarouge à grande longueur d’onde utilisé par les caméras thermographiques ne pénètre pas dans les solides, l’activité de vidange évaluée par vidéothermographie doit être effectuée dans un système ouvert, ce qui peut être difficile avec les souris actives, car elles peuvent sauter plusieurs pouces dans les airs. Un autre système est l’approche automatisée de la coloration vide sur papier (aVSOP)33, qui consiste en du papier filtre roulé qui s’enroule à une vitesse constante sous le plancher en treillis métallique d’une cage à souris. Cette approche prévient les dommages au papier et le chevauchement des taches d’urine qui se produisent dans le VSA classique, et sa mise en œuvre permet à l’investigateur d’effectuer des expériences sur plusieurs jours. Cependant, il ne fournit pas à l’enquêteur un calendrier précis des événements de miction, et il n’est pas possible d’examiner le comportement et sa corrélation avec le repérage. Pour obtenir ces informations, les chercheurs ont intégré la vidéosurveillance aux tests de miction, une approche qui permet l’évaluation simultanée de l’activité de la souris et des événements de miction31,32. Une approche consiste à placer une diode électroluminescente bleue (LED) et une caméra vidéo avec un filtre à protéines de fluorescence verte placé sous la cage expérimentale pour visualiser les événements de vidange, et une LED infrarouge et une caméra vidéo au-dessus de la cage pour capturer la position de la souris32. Cette configuration a été utilisée pour surveiller le comportement de vidage tout en effectuant une photométrie à fibre ; Cependant, l’environnement très éclairé de ce système a obligé les chercheurs à traiter leurs souris avec un agent diurétique pour stimuler la miction. Dans une autre conception expérimentale, des caméras grand angle ont été placées au-dessus et au-dessous de la cage expérimentale pour visualiser l’activité motrice de la souris et les événements de miction, respectivement. Dans ce cas, des taches d’urine déposées sur un papier filtre tapissant le sol de la cage ont été révélées en éclairant le papier filtre avec des lampes UV placées sous la cage31. Cette configuration a été utilisée dans des essais courts, d’une durée de 4 minutes, pendant la phase de lumière de la journée pour étudier les neurones du tronc cérébral impliqués dans le comportement de miction volontaire31. L’aptitude de ce système à être utilisé pendant la phase sombre ou pendant des périodes de temps >4 min n’a pas été rapportée.

Dans cet article, une méthode est décrite qui améliore le VSA traditionnel en permettant une surveillance vidéo à long terme du comportement de vidage de la souris. Cette approche rentable fournit des informations temporelles, spatiales et volumétriques sur les événements de miction pendant de longues périodes pendant les phases d’éclairage et d’obscurité de la journée, ainsi que des détails liés au comportement de la souris 3,4,34. Des informations détaillées pour la construction des chambres de vidange, la mise en œuvre d’un VSA en temps réel (RT-VSA) et l’analyse des données sont fournies. Le RT-VSA est précieux pour les chercheurs qui cherchent à comprendre les mécanismes physiologiques qui contrôlent la fonction du système urinaire, à développer des approches pharmacologiques pour contrôler la miction et à définir la base moléculaire des processus pathologiques qui affectent les voies urinaires inférieures.

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Protocol

Souris urothéliales Piezo1/2 double knockout (Pz1/2-KO, génotype: Piezo1 fl/fl; Piezo2 fl/fl; Upk2CRE+/-) et témoins (Pz1/2-C, génotype: Piezo1 fl/fl; Piezo2 fl/fl; Upk2CRE-/-) ont été générés en interne à partir de souches parentales obtenues des laboratoires Jax (souche Piezo1 fl/fl # 029213; Piezo2 fl/fl souche # 027720; Upk2CRE+/- souche # 029281). Des souris femelles (1,5 à 3 mois et pesant 17 à 20 g) et mâles (2 à 4 mois et 23 à 29 g de poids) ont été utilisées dans les expériences. Pour les expériences de cystite induite par le cyclophosphamide, des femelles C57Bl / 6J de type sauvage (3 mois et ~ 20 g de poids) ont été utilisées (laboratoires Jackson, souche # 000664). Les animaux ont été logés et les expériences ont été effectuées au Centre de soins aux animaux de l’Université de Pittsburgh sous l’approbation du Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université de Pittsburgh. Toutes les expériences sur les animaux ont été effectuées conformément aux directives et règlements pertinents de la politique du Service de santé publique sur les soins et l’utilisation sans cruauté des animaux de laboratoire et de la Loi sur le bien-être des animaux.

1. Assemblage de cages pour le test de taches vides en temps réel (RT-VSA)

  1. La plate-forme RT-VSA se compose d’un support UV qui contient deux ampoules UV et deux caméras grand angle (caméras inférieures), qui sont utilisées pour enregistrer l’activité de vidange pendant la phase lumineuse de la journée. Disposez deux chambres de souris pour reposer sur le support. Fixez des caméras grand angle (caméras supérieures) au couvercle de chaque chambre de souris, utilisées pour enregistrer l’activité de vidange pendant la phase sombre de la journée (Figure 1A).
  2. Construisez le cadre du support UV et des chambres de souris à partir de profilés en aluminium à fente en T de 1 po x 1 po. Voir le tableau 1 pour une liste des composants utilisés pour construire deux chambres de souris et le support UV et la figure 1B-D pour les différentes vues des composants assemblés et des dimensions.
  3. Construisez chaque chambre de souris avec huit profilés en aluminium fendus en T coupés à 10 po et quatre coupés à 14,75 po. Commencez par assembler le fond de la chambre de la souris et utilisez des attaches d’extrémité standard (tableau 1) pour assembler les profils à fente en T conformément à la figure 1. Montez l’acrylique transmettant UV de 38,5 cm x 26,5 cm dans le canal interne des profilés pour construire le sol des chambres à souris.
    REMARQUE: Pour plus d’informations sur la façon d’assembler les profilés à fentes en T avec des fixations d’extrémité standard, visitez la page Web de l’entreprise.
  4. Construisez les parois de la chambre de la souris avec le reste des profilés. Montez les panneaux de polycarbonate résistant à l’abrasion (RA) de 38,5 cm x 21,5 cm x 21,5 cm dans les profilés pour assembler les parois extérieures de la chambre de la souris. Utilisez les panneaux de polycarbonate AR de 37,5 cm x 23,9 cm et 24,4 cm x 23,9 cm pour construire l’intérieur de la chambre de la souris.
  5. Fixez les panneaux en polycarbonate AR avec une fixation d’extrémité standard 1/4-20 bande de roulement. Voir les instructions de montage des panneaux dans les profils de la page Web dans le NOTA de l’étape 1.3. Utilisez un calfeutrage en silicone commercial pour sceller les jonctions entre les panneaux internes.
  6. Utiliser deux profils à fentes en T de 12 po et deux de 14,75 po pour assembler le couvercle de la cage, comme indiqué à la figure 1B. Montez un panneau de polycarbonate AR de 38,5 cm x 26,5 cm dans le canal interne des profilés pour compléter le couvercle.
  7. Montez le support de profil de caméra 12 pouces perpendiculairement aux axes longs du haut de la cage et fixez-le avec deux supports d’angle légers à l’intérieur (marqués 3 dans la figure 1B). Utilisez une plaque plate droite (marquée 2) comme support de montage de la webcam et montez-la comme illustré à la Figure 1B. Fixez la caméra au support avec la vis de montage de la caméra.
  8. Utilisez la charnière de décollage standard de la série 10 pour fixer le couvercle au corps de la chambre de la souris (marqué 1 dans la Figure 1B).
  9. Construisez le support UV avec quatre profilés fendus en T coupés à 40 pouces, quatre profilés fendus en T coupés à 32 pouces et quatre profilés fendus en T coupés à 10 pouces, selon la figure 1C, D. Montez une feuille de miroir en acrylique de 82,5 cm x 26,5 cm dans les profilés pour construire le fond de la chambre UV.
  10. Utilisez la feuille de miroir en acrylique de 82,5 cm x 30,5 cm et 26,5 cm x 30,5 cm pour construire la paroi du support UV.
  11. Fixez les plaques plates T à cinq trous de la série 10 (marquées 2 à la figure 1 C), les plaques plates L à cinq trous de la série 10 (marquées 3 à la figure 1 C) et les plaques plates en T à cinq trous de la série 10 (marquées 1 à la figure 1C) pour fixer le support UV.
  12. Montez les caméras inférieures dans un profil fendu en T coupé à 32 po et fixez-les au bas du support avec deux supports d’angle de transition légers, comme illustré à la figure 1D. Utilisez des plaques plates droites pour fixer les webcams au profil à fentes en T.
  13. Montez les lampes UV à l’intérieur, à l’avant et à l’arrière, et fixez-les aux plaques plates droites comme illustré à la figure 1D.
  14. Connectez les quatre webcams aux ports USB d’un ordinateur exécutant un logiciel de vidéosurveillance.

2. Logement des animaux avant l’expérimentation

  1. Maison de souris expérimentales, élevées à cet effet ou obtenues à partir d’un site externe, en groupes de quatre. Dans la mesure du possible, utilisez des souris femelles ou mâles appariées selon l’âge pour ces expériences. Si les animaux proviennent d’une source externe, laissez-les s’acclimater pendant au moins 7 jours avant de procéder à toute procédure expérimentale.
  2. Tout au long de leur séjour dans l’animalerie, loger les animaux dans des cages standard contenant de la litière et de l’enrichissement (p. ex., igloo en plastique, roue, morceau de papier pour le déchiquetage) et les garder sous un cycle jour/nuit de 12 heures, avec accès à de l’eau et à un chow de souris sec ad libitum.

3. Enregistrements RT-VSA pendant les phases claires et sombres de la journée

REMARQUE: Le protocole ci-dessous décrit l’utilisation de RT-VSA pour évaluer le comportement de vidange de la souris pendant les phases claires et sombres de la journée. Les animaux sont maintenus sur un cycle de lumière de 12 h et 12 h d’obscurité avec l’heure Zeitgeber (ZT) = 0 à 07h00. Les enregistrements commencent entre 10h30 et 11h00 (ZT = 3,5-4,0) pour les expériences en phase lumineuse et entre 18h00 et 18h30 (ZT = 11,0-11,5) pour les expériences en phase sombre. Lorsque les animaux sont testés dans les deux conditions, les expériences sont généralement effectuées sur deux jours distincts, avec au moins 5 jours consécutifs entre les tests clairs et sombres. Les expériences ne doivent pas être effectuées les jours où les salles animalières sont nettoyées ou les cages changées, car cela peut entraîner des stress qui affectent le comportement de miction. Toutes les étapes doivent être effectuées dans des conditions de stress minimal pour les souris.

  1. Transporter les animaux de laboratoire de leur lieu de logement à la salle d’intervention où se trouvent les chambres d’enregistrement RT-VSA.
  2. Préparation de la chambre d’enregistrement RT-VSA
    1. Placez un morceau de papier filtre (24,3 cm x 36,3 cm) dans le fond de chaque cage d’enregistrement RT-VSA. Selon l’heure de la journée, utilisez du papier filtre mince (expériences en phase légère) ou épais (expériences en phase sombre).
      REMARQUE: Le papier filtre épais est utilisé pendant la phase sombre active car il est plus résistant au déchiquetage que le papier filtre mince. Les caméras supérieures sont utilisées pour visualiser les taches d’urine déposées sur du papier filtre épais pendant la phase sombre. En revanche, pendant la phase de lumière, les caméras inférieures sont utilisées car la lumière ambiante empêche les caméras supérieures de détecter les taches d’urine déposées sur le papier filtre. Dans ce cas, un papier filtre mince est utilisé. Nous avons constaté que les caméras inférieures sont inefficaces pour détecter les petits événements de miction déposés sur du papier filtre épais.
    2. Sur le papier filtre, placez les éléments suivants : un igloo en plastique (qui offre un espace de couchage), un tube microcentrifuge stérile de 1,5 mL à des fins d’enrichissement et un plat en plastique de 60 mm x 15 mm contenant deux ou trois morceaux de chow sec de souris et 14 à 16 g d’eau sous forme de gel-pack (gel d’eau non mouillant; Graphique 2).
      REMARQUE : L’utilisation de tubes microcentrifugeuses de 1,5 mL à des fins d’enrichissement était spécifique à l’enceinte utilisée dans cette étude.
    3. Une fois que les chambres d’enregistrement sont prêtes, placez délicatement les souris expérimentales à l’intérieur en les déposant doucement sur le papier filtre. Assurez-vous que le transfert des animaux de la cage de logement aux cages d’enregistrement se produit avec un minimum de stress.
    4. Une fois que tous les animaux de laboratoire sont à l’intérieur de leurs cages d’enregistrement, avec leurs couvercles fermés, couvrez le haut des couvercles avec un coussin bleu absorbant pour minimiser les réflexions directes de la lumière ambiante sur la surface du couvercle en plexiglas.
    5. Allumez les lumières UV dans la chambre inférieure.
      REMARQUE: Les animaux n’ont pas de contact direct avec la lumière UV. La lumière UV recommandée est détaillée dans la section matériaux.
  3. Enregistrements RT-VSA
    1. Pour enregistrer des vidéos à partir des caméras supérieure et inférieure, utilisez un logiciel d’enregistrement de vidéosurveillance, qui peut être configuré pour enregistrer à partir de plusieurs webcams ou caméras en réseau à la fois.
    2. Lors de l’ouverture du programme, lancez l’enregistrement en appuyant sur Commande et R dans la fenêtre du programme. Effectuez des enregistrements vidéo à une fréquence de 1 image par seconde.
    3. Immédiatement après avoir commencé les enregistrements, quittez la pièce en fermant doucement la porte. Assurez-vous que la pièce reste silencieuse pendant toute la durée de l’expérience.
  4. Terminer les enregistrements RT-VSA
    1. Retour à la salle d’intervention après 7 h (expériences en phase légère) ou le lendemain matin (expériences en phase sombre).
    2. Arrêtez les enregistrements en appuyant sur Commande et T. Éteignez les lumières UV.
    3. Après avoir arrêté l’enregistrement, le logiciel génère automatiquement un fichier vidéo (au format .m4v) pour chaque caméra et l’enregistre sous le nom de la caméra dans un dossier de destination précédemment sélectionné. Vérifiez que, dans chaque dossier de caméra, les tests sont organisés en dossiers par date.
    4. Dans chaque dossier de date/expérience, vérifiez qu’il existe un fichier .m4v et tous les fichiers .jpeg individuels qui correspondent à chacune des images vidéo.
    5. REMARQUE: Les fichiers .jpeg peuvent être utilisés pour récupérer l’expérience au cas où les fichiers vidéo seraient corrompus.
    6. Créez un dossier sur le bureau avec le nom et la date de l’expérience et transférez tous les fichiers .m4v dans ce dossier. Si nécessaire, supprimez les fichiers .jpeg une fois les fichiers vidéo enregistrés et sauvegardés.
    7. REMARQUE: Pour les expériences de phase de lumière, le logiciel générera un film par caméra, tandis que pour les expériences de phase sombre, il générera deux films pour chaque caméra. En effet, un nouveau fichier .m4v est généré après minuit lorsque la date change.
    8. Copiez le dossier contenant les films sur un lecteur flash pour analyse sur un ordinateur externe. Cette étape peut prendre plusieurs minutes et peut être effectuée parallèlement aux étapes 3.5.1 à 3.5.3.
  5. Nettoyage des cages d’enregistrement et transfert des souris expérimentales à leur lieu de logement
    1. Retirez le bluepad recouvrant les couvercles des cages. Transférer les animaux des cages d’enregistrement à leur cage de logement.
    2. Retirer les accessoires et les denrées alimentaires dans les chambres d’enregistrement (igloos en plastique, tubes en plastique, plat contenant des restes de chow et de gel d’eau et papier filtre) et les jeter dans les déchets biologiques dangereux.
    3. Nettoyez les cages à l’aide d’un aspirateur à main, en enlevant les granulés fécaux et fécaux présents au fond de la cage. Ensuite, vaporisez le sol et les parois internes de la cage avec de l’éthanol à 70% et nettoyez l’intérieur avec un morceau de chiffon doux. Laissez le couvercle des cages ouvert pour leur permettre de sécher à l’air.
    4. Placez la cage de logement avec les animaux dans un conteneur secondaire et transportez les animaux à leur lieu d’hébergement.

4. Génération de courbes d’étalonnage

REMARQUE: Une courbe d’étalonnage est nécessaire pour convertir les zones de taches vides en volumes d’urine. Si vous effectuez des expériences pendant les phases claires et sombres de la journée, deux courbes d’étalonnage doivent être générées, une pour chaque type de papier filtre utilisé (papiers filtres fins et épais). Les courbes d’étalonnage sont générées en double. Chaque réplique est exécutée sur un papier filtre placé dans une chambre d’enregistrement RT-VSA. Compte tenu de sa composition complexe et de son excitabilité aux UV, utilisez de l’urine de souris pour effectuer les courbes d’étalonnage.

  1. Collecte d’urine de souris
    1. Prenez un morceau de film transparent souple (10 cm x 15 cm) et placez-le sur un banc.
    2. Choisissez une souris par la queue et frottez-la. Massez doucement le bas-ventre pour induire la miction. Recueillir l’urine à la surface de la feuille de plastique à film transparent.
    3. Relâchez doucement l’animal à l’intérieur de sa cage. À l’aide d’une pipette, transférer l’urine de la surface du film transparent vers un tube microcentrifuge stérile de 1,5 mL. Répétez la procédure avec plusieurs souris jusqu’à ce que ~10 mL d’urine de souris soit recueillie, regroupez l’urine et stockez à -20 ° C.
      REMARQUE : Un total de ~10 mL d’urine de souris est nécessaire pour générer des courbes d’étalonnage en double pour les phases claire et foncée. Pour éviter de stresser les souris expérimentales, n’utilisez pas de souris qui seront soumises à des expériences RT-VSA pour le prélèvement d’urine.
  2. Enregistrements de courbes d’étalonnage
    1. Décongeler l’urine recueillie à l’étape 4.1 et la mélanger en tourbillonnant doucement pendant 10 à 15 s.
    2. Placez un morceau de papier filtre mince (24,3 cm x 36,3 cm) dans chacune des deux cages d’enregistrement RT-VSA.
    3. Pipeter les volumes d’urine suivants (en μL) sur chacun des papiers filtres : 2, 5, 10, 25, 50, 80, 100, 200, 300, 400, 500 et 750. Pour éviter le chevauchement des taches à la suite de la diffusion, répartissez-les à une distance suffisante les unes des autres.
    4. Fermez le couvercle des cages et couvrez-les avec des coussinets.
    5. Démarrez l’enregistrement en appuyant sur Commande et R, en appliquant les mêmes paramètres logiciels que ceux utilisés pour enregistrer les expériences (étape 3.3.).
    6. Enregistrer la courbe d’étalonnage pendant 1 h pour permettre une diffusion maximale des taches d’urine. Appuyez sur Commande et T pour arrêter l’enregistrement.
    7. Créez un nouveau dossier sur le bureau, placez-y les fichiers .m4v, puis transférez les données sur un lecteur flash pour une analyse ultérieure.
    8. Effectuez une procédure similaire pour générer des courbes dupliquées avec du papier filtre épais. Dans ce cas, ajoutez des couches supplémentaires de tampons pour assombrir l’intérieur et simuler des conditions de phase sombre.
  3. Analyse des enregistrements de la courbe d’étalonnage
    1. Ouvrez les fichiers .m4v dans un logiciel de lecteur de films, en agrandissant la fenêtre pour remplir l’écran. Pour analyser les courbes d’étalonnage effectuées sur papier filtre épais, utilisez les fichiers obtenus avec les caméras supérieures (Figure 3A). Pour analyser les courbes d’étalonnage effectuées sur papier filtre mince, utilisez les fichiers obtenus avec les caméras inférieures (Figure 3B).
    2. Lisez le fichier .m4v, en déplaçant le curseur temporel vers l’avant et vers l’arrière pour obtenir une vue d’ensemble du film complet de la courbe d’étalonnage de 1 h.
    3. Déterminez la plage de temps où les petites taches d’urine (<25 μL) ont la plus grande intensité et se sont propagées au maximum. Prenez une capture d’écran dans cette plage de temps. Nommez le fichier de capture d’écran et enregistrez-le en tant que fichier .png (Figure 3A, panneau supérieur).
      REMARQUE: Les captures d’écran sont prises en appuyant sur la touche F6. Pour configurer F6 pour l’acquisition de captures d’écran, sélectionnez: Préférences Système > Raccourcis clavier > et écrivez F6 dans la zone située à droite de l’option Enregistrer l’image de l’écran en tant que fichier .
    4. Identifiez la plage de temps où les taches d’urine moyennes et grandes (>50 μL) ont une surface maximale et prenez une capture d’écran. Il est possible que certaines des plus petites taches d’urine ne soient pas visibles au moment où les plus grandes taches d’urine présentent une diffusion maximale. Nommez le fichier et enregistrez la capture d’écran en tant que fichier .png (Figure 3A, panneau inférieur).
    5. Ouvrez le logiciel ImageJ (NIH), puis faites glisser et déposez l’icône du fichier .png obtenue à l’étape 4.3.3 pour ouvrir le fichier image (Figure 4A).
    6. Dans la barre d’outils, sélectionnez l’icône Sélections de polygones et délimitez la bordure du papier filtre.
    7. Ensuite, sélectionnez Analyser dans la barre de menus, choisissez Définir les mesures dans le menu développé et, dans la fenêtre qui apparaît, sélectionnez Zone. Cliquez sur OK. Cela permet d’obtenir des valeurs de surface lorsque l’étape 4.3.8 est effectuée.
    8. Ensuite, sélectionnez Analyser à nouveau dans la barre de menus et choisissez Mesure dans les options développées. Une fenêtre de résultats s’affiche contenant une zone de colonne qui affiche les valeurs de zone en pixel2 (Figure 4B-D).
    9. Sélectionnez l’icône Freehand Selections dans la barre d’outils et utilisez-la pour tracer une ligne autour du périmètre d’un point vide individuel. Mesurer la surface comme à l’étape 4.3.8. Le logiciel met à jour le tableau des résultats au fur et à mesure que de nouvelles mesures sont effectuées. Le nouvel ensemble de chiffres apparaît sous les précédents. Notez le nombre qui apparaît sous la zone de colonne de la fenêtre de résultats pour chaque point analysé (Figure 4E-G).
    10. Répétez les étapes 4.3.5 à 4.3.7 pour chacune des taches répliquées.
    11. Réglez la surface totale du papier filtre à 100% et calculez le pourcentage de surface (% surface) pour chaque tache d’urine. Cette normalisation corrigera les erreurs qui pourraient survenir en raison de différences de zoom ou de positionnement des caméras.
    12. Créez un nouveau tableau XY dans un programme graphique et insérez les valeurs du volume d’urine (en μL) dans la colonne X et les valeurs en double de % de surface dans la colonne Y.
    13. Ensuite, sélectionnez Analyse > Analyser > analyse XY > Régression non linéaire (ajustement de courbe). Dans la fenêtre des paramètres qui s’affiche, sélectionnez Modèle > Polynôme > Polynôme de second ordre (quadratique).
    14. Ensuite, dans l’onglet méthode, cliquez pour marquer les sélections suivantes : Régression des moindres carrés, Pas de pondération et Considérez chaque valeur Y répliquée comme un point individuel.
    15. Dans l’onglet Contrainte, sélectionnez B0, Type de contrainte > Constante égale à et tapez 0 dans la colonne Valeur. Cliquez sur OK.

5. Analyse des enregistrements expérimentaux de souris

  1. Ouvrez un fichier vidéo collecté pendant la phase claire (caméra inférieure) ou la phase sombre (caméra supérieure) pour analyse.
  2. Évaluez la qualité du fichier vidéo en déplaçant le défilement temporel vers l’avant et vers l’arrière, en confirmant que le papier filtre reste intact (sans déchirure ni mastication) pendant la fenêtre de temps de 6 heures à analyser. Si le papier est déchiré, n’effectuez aucune autre analyse, car la souris pourrait avoir uriné sur le plastique exposé qui ne peut pas être quantifié (Figure 5).
  3. Pour analyser les expériences collectées dans les phases claires ou sombres, utilisez la commande d’avance rapide ou le curseur de barre de temps pour accéder à la fenêtre temporelle souhaitée. L’activité de vidange pendant la phase lumineuse est enregistrée entre 11h00 et 17h00 (ZT = 4,0-10,0) et pendant la phase sombre entre minuit et 06h00 (ZT = 17,0-23,0).
  4. Lisez le film en mode avance rapide en cliquant sur l’icône >> (ou faites défiler manuellement le film), à la recherche de preuves que la souris est en train de s’épuiser. La façon la plus simple de savoir que cela se produit est de rechercher l’apparition soudaine de taches brillantes d’urine sur le papier filtre. Un autre indicateur consiste à rechercher des changements de comportement, y compris le mouvement vers les coins de la cage et une brève période d’inactivité lorsque la souris urine.
    REMARQUE: Au fur et à mesure que l’on détecte mieux les vides, on peut augmenter la vitesse de défilement ou d’avance rapide. Cependant, chez les souris atteintes de cystite bactérienne et chimique, qui ont un très grand nombre de petits vides 4,34, on peut manquer des événements de miction si l’on se déplace trop rapidement dans le film.
  5. Enregistrez l’heure à laquelle chaque vide se produit. Par convention, le temps du vide est enregistré au premier signe de détection d’urine (Figure 6A,B).
  6. Pour mesurer le vide, utilisez d’abord la barre de défilement pour avancer (ou reculer) dans le temps, en recherchant le moment où la diffusion maximale de la tache d’urine s’est produite. Mettez le film en pause à ce stade et prenez une capture d’écran comme décrit à l’étape 4.3.3. Placez la flèche de la souris de l’ordinateur à l’endroit analysé, de sorte que le point d’intérêt soit marqué dans la capture d’écran (Figure 6C, D).
  7. Nommez le fichier de capture d’écran en utilisant des numéros corrélatifs pour tenir compte de l’ordre d’apparition dans le film.
  8. Poursuivez l’analyse du fichier en répétant les étapes 5.5 et 5.7 pour chaque point vide du film. Une fois que toutes les taches de vide ont été analysées, mesurez la surface totale du papier filtre en prenant une capture d’écran et en suivant les étapes décrites en 4.3.6.
  9. Calculer le pourcentage de surface de chacune des taches d’urine comme décrit à l’étape 4.3.9. Transformez les valeurs de % de surface en volume d’urine (μL) pour chaque point vide à l’aide des courbes d’étalonnage générées à l’étape 4 et de la fonction d’interpolation du logiciel graphique.
    1. Dans le logiciel graphique, ouvrez la table XY contenant les données de la courbe d’étalonnage et insérez les valeurs de surface en % dans la colonne Y sous la dernière valeur de la courbe d’étalonnage (Figure 7A).
    2. Cliquez sur l’onglet Tableau des résultats , puis sous l’onglet modèle, sélectionnez Interpoler les inconnues à partir de la courbe standard et appuyez sur OK. Un onglet nommé valeurs moyennes X interpolées apparaît en regard de l’onglet Tableau des résultats. Cet onglet contient un tableau avec les valeurs interpolées qui correspondent au volume d’urine en μL pour chaque point vide. (Figure 7A,B).
  10. Répétez les étapes 5.1 à 5.9 pour analyser toutes les souris expérimentales.
  11. Créez un fichier de classeur contenant les données obtenues à partir des étapes 5.5 à 5.10, à l’aide d’une feuille de calcul par souris (Figure 7C). Créez un fichier pour les expériences en phase lumineuse et un autre pour celles en phase sombre. Ces fichiers maîtres contiennent toutes les données brutes et les calculs nécessaires utilisés dans les analyses ultérieures.

6. Analyse du schéma de miction de souris expérimentales

  1. Générer des profils de points de vide primaires et secondaires (Figure 8A, B et Figure 9).
    REMARQUE : Selon les études de distribution de fréquence 23, les taches de vide de ≥20 μL représentent généralement >95 % du volume total de vide et sont considérées comme des taches de vide primaires (PVS)8,23,35. Les taches vides de ≤20 μL sont considérées comme des taches de vide secondaires ou petites (SVS). La discrimination entre PVS et SVS s’est avérée être une approche utile pour caractériser les phénotypes de vidange. Un nombre élevé de SVS indique un dysfonctionnement de miction35.
    1. À partir du fichier maître contenant les données de points de vidange d’intérêt (phase claire ou phase sombre), classez les taches en fonction de leur volume en PVS lorsque leur volume est de ≥20 μL, ou SVS lorsque leur volume est de <20 μL.
    2. Comptez le nombre et calculez le volume moyen annulé et le volume total pour les PVS. Comptez le nombre et calculez le volume total pour les SVS.
    3. Générer une barre graphique qui compare le contrôle aux souris traitées pour chacun des paramètres calculés : nombre de PVS, volume annulé de PVS, volume total de PVS, nombre de SVS, volume total de PVS.
  2. Facultatif : générez un diagramme de volume vidé cumulé (fonction escalier) pour afficher le comportement de vidage au fil du temps (Figure 10 et Figure 11).
    1. Ouvrez le fichier maître du classeur et convertissez l’heure de miction, exprimée en heures, minutes et secondes, sous forme décimale. Calculer le volume urinaire cumulatif (en μL) pour chaque point temporel.
    2. Générez une table XY dans le logiciel graphique avec le temps sous forme décimale dans la colonne X et les volumes d’urine cumulés dans la colonne Y. Copiez les données de temps et de volume d’urine dans le tableau. Ajoutez (0; 0) et (6; valeur maximale) points de données. Ces points sont nécessaires pour compléter les lignes horizontales de la parcelle au début de l’expérience (temps: 0 h) lorsque le volume vidé est nul (0; 0), et à la fin de l’expérience (temps: 6 h) lorsque la valeur cumulée de l’urine vidée est égale à la valeur obtenue pour le dernier événement de miction (6; valeur maximale).
    3. Double-cliquez sur le graphique; La fenêtre Format Graph doit apparaître. Sélectionnez l’onglet Apparence , désélectionnez le bouton Afficher les symboles et sélectionnez Afficher la ligne/courbe de connexion. Cliquez sur l’option Style et sélectionnez Survie.

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Representative Results

Comportement mictionnel des souris urothéliales Piezo1/2 knockout

Pendant la phase de stockage du cycle miction, on suppose que l’urothélium détecte la tension exercée par l’urine accumulée dans la vessie et qu’il transduit ce stimulus mécanique en réponses cellulaires telles que la libération d’ATPsérosale 1,3. Nous avons précédemment montré que les canaux PIEZO1 et PIEZO2 activés mécaniquement sont exprimés dans l’urothélium 3,36 de souris. Pour déterminer si les canaux PIEZO urothéliaux sont importants pour le comportement normal de miction, nous avons effectué RT-VSA sur des souris Piezo1/2 double knockout (Pz1/2-KO) à condition urothéliale et des témoins appariés selon l’âge et le sexe (Pz1/2-C ; Graphique 9). Nous avons testé des souris femelles et mâles pendant 6 heures pendant les phases sombres et claires de la journée, et analysé les données comme décrit à l’étape 6.1. Lorsque nous avons comparé l’activité de miction entre les phases claires et sombres de la journée pour les groupes témoins, nous avons remarqué que les femelles et les mâles présentaient une augmentation du nombre et du volume total de PVS pendant leur période active. Cette observation indique que, même si les souris étaient dans un environnement étranger, la nature circadienne du comportement de miction des souris (le plus élevé pendant leur phase sombre active) a été préservée. Au cours de leur phase de lumière inactive, nous n’avons observé aucune différence significative dans aucun des paramètres analysés pour les souris femelles ou mâles Pz1/2-KO par rapport aux homologues témoins (Pz1/2-C). Cependant, lorsque nous avons testé les animaux pendant la phase sombre active, les souris Pz1/2-KO femelles et mâles présentaient un phénotype de miction altéré, caractérisé par une augmentation significative du nombre et du volume total de SVS (Figure 9). Il n’y avait pas de différences significatives dans le nombre de PVS, le volume moyen par PVS ou le volume PVS total chez les Pz1/2-KO femelles ou mâles par rapport à leurs témoins correspondants. Ces résultats indiquent que les canaux urothéliales PIEZO1/2 ne jouent pas un rôle significatif dans la fonction de vidange pendant la phase de lumière inactive de la souris, mais sont importants pour prévenir les taches fréquentes pendant leur phase sombre active.

Les résultats présentés à la figure 9 illustrent deux des avantages de l’utilisation du RT-VSA par rapport au critère d’évaluation VSA. Tout d’abord, si l’analyse n’avait été effectuée que pendant la phase de lumière, nous aurions conclu à tort que les canaux urothéliales PIEZO1/2 n’avaient aucun rôle dans la fonction de vidange. Deuxièmement, dans la plupart des études sur les VSA, les SVS ont été traités comme du bruit expérimental et, dans certains cas, exclus de l’analyse ultérieure23. Dans le RT-VSA, nous avons pu déterminer que les SVS étaient des événements individuels, non secondaires aux PVS (report ou fin de miction dribble) et étaient volontaires dans le sens où les animaux se déplaçaient vers la périphérie de la cage, vidaient, puis partaient. Cette observation nous a fourni des informations précieuses sur le phénotype des souris Pz1/2-KO qui, autrement, auraient été manquées.

Comportement mictionnel des souris femelles dans des conditions basales et après un traitement par cyclophosphamide

Dans cette expérience pilote, nous avons testé les effets du cyclophosphamide (CYP) sur le comportement de miction volontaire de la souris. Le cyclophosphamide, un médicament utilisé pour traiter certaines formes de cancer ou de troubles immunologiques, est connu pour causer une cystite chez les patients et les animaux de laboratoire, entraînant un phénotype de la vessie hyperactive caractérisé par de multiples petits événements de miction 26,37,38. Pour déterminer le comportement de vidange de base, nous avons placé une souris femelle non traitée dans le RT-VSA pendant la phase sombre. La même souris a reçu une injection intrapéritonéale avec une dose de CYP (150 mg / kg) 5 jours plus tard pour provoquer une cystite aiguë. Immédiatement après l’injection, la souris a été placée dans une cage RT-VSA pour l’enregistrement. Le comportement de miction est représenté dans un diagramme par étapes (Figure 11), avec les lignes verticales représentant le volume d’urine vidé et les lignes horizontales représentant le temps. Par rapport aux résultats obtenus dans des conditions basales, il est évident que la quantité d’urine libérée par vide est plus faible après le traitement par CYP, et que les événements de miction sont beaucoup plus fréquents. Cela peut être mieux apprécié dans l’encart du graphique, où les 30 premières minutes de la période analysée (correspondant à minuit à 00h30 [7,0 à 7,5 h après injection]) sont agrandies.

Figure 1
Figure 1 : La chambre d’enregistrement RT-VSA. (A) Le système d’enregistrement RT-VSA comprend une partie supérieure, qui comprend deux chambres en acrylique transparentes côte à côte et des caméras supérieures associées. La moitié inférieure de l’appareil est un support à unité unique qui contient les chambres supérieures de la souris et contient les caméras inférieures et les lumières UV. L’intérieur des murs du stand est constitué de panneaux de miroirs qui réfléchissent la lumière UV pour fournir un éclairage uniforme au fond des cages. Non représenté est un ordinateur qui reçoit un flux vidéo des caméras et enregistre les données. (B) Modèle de la chambre de la souris avec composants et dimensions. 1) charnière de décollage standard; 2) support de montage de la caméra; et 3) support d’angle de transition léger. Vues avant (C) et supérieure (D) du support UV avec composants et dimensions. Les lampes UV sont montées à l’intérieur des profilés avant et arrière avec des plaques plates droites. Un profil de 32 pouces fixé au cadre principal du support avec deux supports d’angle de transition légers est utilisé pour monter les caméras. Des plaques plates droites sont utilisées pour fixer les caméras au profil 32 pouces. Un panneau en miroir est monté à l’intérieur du support (non représenté). 1) plaque plate de départ à cinq trous; 2) plaque plate en T à cinq trous; et 3) des plaques plates en L à cinq trous. Toutes les valeurs présentées sont en pouces. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Chambre de souris RT-VSA. Avant les procédures expérimentales, chaque chambre de souris expérimentale est préparée en la tapissant d’un morceau de papier filtre (numéroté 1). Selon la période de la journée où l’expérience est réalisée, le papier filtre utilisé est soit épais (phase foncée), soit mince (phase légère). Un dôme en plastique est placé au centre de la chambre (numéroté 2), un plat en plastique avec de l’eau (sous forme de gel d’eau non mouillant) et du chow est placé d’un côté du dôme (numéroté 3) et un tube microcentrifuge en plastique de 1,5 mL, une forme d’enrichissement, est placé du côté opposé (numéroté 4). La disposition initiale des éléments à l’intérieur de la cage est maintenue cohérente dans toutes les expériences. Notez qu’un morceau de papier filtre est placé entre les deux cages voisines et est marqué dans la figure d’un astérisque. Il s’agit d’empêcher l’influence des indices visuels provenant de la souris voisine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Courbe d’étalonnage. Images représentatives de papiers filtrants épais (A, panneaux de gauche) et minces (B, panneau de gauche) tachetés avec des quantités connues d’urine de souris. Les images sont des captures d’écran d’enregistrements vidéo obtenus à l’aide des caméras supérieures (A, panneaux de gauche) ou inférieures (B, panneau de gauche). Les flèches rouges pointent vers les taches d’urine de 2 μL, et les chiffres sous les taches sont les valeurs de volume des taches en μL. Notez que les petites taches d’urine (<50 μL) dans l’image supérieure du panneau A qui sont visibles peu de temps après les taches d’urine (5 min) ne sont plus perceptibles après 30 minutes (panneau inférieur). Panneaux de droite: Tracé de la surface de la tache vide (exprimée en pourcentage de la surface totale du papier filtre) en fonction du volume d’urine. Comme d’autres l’ont noté, les données de la zone de la tache vide en fonction du volume d’urine ne suivent pas une relation linéaire30. Ainsi, nous ajustons les données à un polynôme du second ordre en utilisant la régression non linéaire. Les données étaient limitées de telle sorte que X = 0 à Y = 0. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Détermination des zones de papier filtre et de taches urinaires à l’aide d’ImageJ. (A) Une capture d’écran de la courbe d’étalonnage illustrée à la figure 3A ouverte dans ImageJ. La région encadrée en (A) est indiquée plus en détail en (B). (B) L’icône de sélection de polygones est sélectionnée (entourée en rouge) pour dessiner un polygone le long du périmètre du papier filtre (vue partielle ; ligne jaune avec flèches rouges pointant vers les nœuds générés par l’outil sélection). (C) La surface du polygone reflète la surface totale du papier filtre et est mesurée en sélectionnant Analyser > mesurer (cercle rouge). (D) La valeur de la zone (en pixels) apparaît dans une fenêtre de résultats (cercle rouge). (E) Pour mesurer l’aire d’une tache vide individuelle, l’outil de sélection à main levée est choisi (cercle rouge) et en (F) est utilisé pour tracer une ligne autour de la bordure du point (la flèche rouge pointe vers le spot). En utilisant la même commande qu’en (C), la surface du point vide est mesurée, le résultat apparaissant comme une nouvelle valeur dans la fenêtre de résultats, immédiatement en dessous de la dernière mesure effectuée (panneau G, cercle rouge). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Évaluation de l’état du papier filtre après la fin des expériences RT-VSA. Images représentatives de la chambre de la souris montrant différentes conditions du papier filtre pendant ou après une expérience RT-VSA. Le papier filtre qui est resté intact jusqu’à la fin de la période d’essai est indiqué en (A) et représente la situation la plus courante et la condition dans laquelle une expérience peut être analysée plus avant (coche verte). Des exemples de papier filtre endommagé sont présentés aux points (B) et (C) et sont représentatifs d’expériences qui ne doivent pas être analysées plus avant (X rouge). En (B), le papier filtre a été déchiqueté par la souris (flèche rouge) dans l’un des coins. La ligne jaune pointillée marque la bordure du plancher de la cage. La région encadrée est agrandie dans l’image de droite. En (C), l’intégrité de l’expérience a été compromise par le fait que le gel d’eau non mouillant (flèche rouge) a été déplacé par la souris dans le coin, laissant trois grandes taches d’eau (astérisques rouges). Ces mouvements ont été confirmés en regardant la vidéo. Les images sont des captures d’écran de fichiers vidéo obtenus pendant la phase sombre, à l’aide de la caméra supérieure et avec la cage tapissée de papier filtre épais. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Détermination de l’heure de vidage et acquisition de captures d’écran pour les mesures de surface de point vide. (A,B) Capture d’écran d’une souris dans un coin de sa chambre, avec une tache vide qui vient de devenir visible. L’heure de cette image est annotée comme l’heure de l’annulation. (C, D) Une fois que la tache de vide atteint la diffusion maximale, une capture d’écran est prise pour déterminer le volume du vide. Les images sont des captures d’écran de fichiers vidéo obtenus avec la caméra supérieure, en utilisant du papier filtre épais et pendant la phase sombre. La période d’analyse était de minuit à 06h00. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : Transformation de la zone de la tache vide en volume d’urine et génération d’un fichier de feuille de travail avec des données brutes expérimentales. (A) Capture d’écran de la fenêtre du logiciel graphique montrant les valeurs des taches vides exprimées en pourcentage de la surface totale du papier filtre (données indiquées en vert). La feuille de calcul (flèche verte) est enregistrée dans la section des tables de données. (B) Conversion du pourcentage de la surface totale en volume urinaire (données indiquées en rouge). Ces dernières valeurs sont indiquées dans la section des résultats (flèche rouge) et sont calculées à partir de la courbe d’étalonnage à l’aide d’interpolations d’inconnues de la fonction de courbe standard. (C) Capture d’écran d’une feuille de calcul avec des données brutes et calculées compilées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 8
Figure 8: Classification des taches de vide en PVS et SVS et leur analyse. Captures d’écran de feuilles de travail (générées comme illustré à la figure 7C) d’une souris dans des conditions basales (A) et 7 heures après avoir reçu une dose de cyclophosphamide (150 mg/kg) (B). Les taches vides sont classées comme taches de vide primaires (PVS) si le volume est de ≥20 μL, ou comme petites taches de vide (SVS) si le volume est de <20 μL. Notez que chez la souris non traitée (A), tous les événements de miction sont des PVS, tandis que chez l’animal traité au cyclophosphamide, la plupart des vides sont des SVS. Le tableau encerclé dans chaque panneau (contour rouge) comprend les statistiques récapitulatives suivantes : nombre de vides, volume moyen annulé et volume total annulé. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 9
Figure 9 : Comportement de miction de Piezo1/2 knockout et de souris témoins. Le comportement mictionnel des souris femelles (A) et mâles (B) Piezo1/2 knockout (Pz1/2-KO) et de leurs homologues témoins ( Pz1/2-C ) a été enregistré pendant une fenêtre temporelle de 6 heures pendant la phase sombre ou claire de la journée, et les résultats ont été analysés comme décrit à l’étape 6.1. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± d’erreur type de moyenne (S.E.M.). Les données ont été comparées à l’aide d’un test de Mann-Whitney. Abréviations : PVS = points de vide primaires; SVS = petites taches vides; NS = non significatif; * p < 0,05; ** p < 0,01. Ce chiffre a été modifié par rapport à3. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 10
Figure 10 : Feuilles de calcul et de représentation graphique du volume cumulé annulé en fonction du temps. (A) Capture d’écran de la feuille de travail générée à la figure 7C montrant les calculs nécessaires pour générer un diagramme de fonction d’escalier du volume cumulatif d’urine évacuée en fonction du temps. L’heure doit être saisie sous forme décimale (colonne G, carré rouge). Pour transformer l’heure au format décimal, trois colonnes (flèches rouges) ont été ajoutées à droite de la colonne de l’heure d’annulation pour annoter séparément les valeurs des heures (colonne D), des minutes (colonne E) et des secondes (colonne F), ainsi que le résultat final du temps au format décimal (colonne G). Pour transformer l’annulation temporelle au format décimal, utilisez la fonction suivante : (h) + (min/60) + (s/3 600). Une colonne a été ajoutée à droite de la colonne du volume d’urine, pour afficher le volume urinaire cumulatif (rectangle bleu), qui est calculé comme la somme de tous les volumes d’urine (colonne J) obtenus jusqu’au moment d’un nouvel événement de miction (y compris la nouvelle valeur d’événement). (B) Capture d’écran montrant les données copiées de la feuille de calcul dans le panneau A et collées dans la colonne X (temps en format décimal) et la colonne Y (volumes d’urine cumulés) dans un projet de logiciel graphique. Les premier et dernier points temporels du tracé sont définis sur 0 et 6 (valeur maximale) lignes comme indiqué par les flèches rouges. (C) Pour générer un diagramme d’étapes, le graphique est formaté en désélectionnant le champ Afficher les symboles, en activant l’option Afficher la ligne/courbe de connexion et en sélectionnant le style de survie, comme indiqué dans les champs entourés en rouge. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 11
Figure 11 : Résultats représentatifs du comportement de miction de la souris dans des conditions basales ou après l’administration de cyclophosphamide. Le comportement de miction volontaire d’une souris a été évalué par RT-VSA pendant la phase sombre avant (basal) et 7 h après l’administration de cyclophosphamide (CYP), comme décrit dans les résultats représentatifs. L’heure et le volume des événements de vidage sont représentés dans un diagramme d’étapes qui a été généré comme décrit à l’étape 6.2. L’encart du graphique représente l’aire du tracé marquée d’un rectangle vert et correspond aux 30 premières minutes de la période analysée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 12
Figure 12 : Identification des taches d’urine qui se chevauchent par RT-VSA. Captures d’écran d’images vidéo capturées avec la caméra supérieure dans la phase sombre d’une expérience RT-VSA (images 1 et 2). La zone encadrée de l’image 2 est agrandie dans l’image 3. La souris a vidé dans le même coin supérieur droit deux fois de plus au cours des heures suivantes (images 4 à 6). Malgré le chevauchement des taches vides, les événements de miction individuels ont été facilement détectés à l’aide de RT-VSA. Pour visualiser comment ces événements apparaîtraient comme un test de point final, nous avons exposé le coin du papier filtre à différentes conditions d’éclairage. Sous la lumière ambiante visible, une seule grande tache de vide a pu être identifiée (image 7). De même, si cette même région a été examinée sous la lumière UV, une seule tache sombre a été distinguée (image 8). Ainsi, plusieurs vides dans la même région sont facilement détectés par RT-VSA, mais une telle discrimination n’est pas possible si l’analyse est effectuée comme un test de point final. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

L’intégration de la vidéosurveillance est une modification rentable qui présente plusieurs avantages par rapport au VSA classique. Dans le VSA classique, qui est généralement utilisé comme test de point final, il est difficile de distinguer les points de vide qui se chevauchent. Ce n’est pas une préoccupation triviale, car les souris ont tendance à uriner plusieurs fois dans la même zone lorsque le test est prolongé pendant plusieurs heures, généralement dans les coins de leur cage. Ainsi, le premier avantage du RT-VSA est que l’investigateur peut facilement identifier les taches individuelles qui ont été déposées partiellement ou totalement les unes sur les autres. Ceci est bien illustré dans l’expérience illustrée à la figure 12. Dans ce cas, l’enregistrement vidéo confirme que la souris a vidé trois fois dans le même coin, déposant des taches de vide qui se chevauchent. Si le papier filtre n’était analysé qu’à la fin de l’expérience, de la manière typique d’un VSA, un seul point pourrait être distingué. Ainsi, bien que le VSA classique puisse être utile pour identifier de grandes différences dans le comportement de miction, il peut ne pas faire de distinction entre des phénotypes plus subtils. Avec les progrès actuels de la génétique et la génération d’animaux transgéniques, le développement de méthodes permettant d’évaluer avec précision le comportement de miction est essentiel.

Deuxièmement, RT-VSA fournit à l’investigateur des informations temporelles sur les événements de miction. Ainsi, on peut déterminer les vraies fréquences de miction, ainsi qu’établir des relations entre les événements de miction. Par exemple, dans une situation où un groupe de SVS est observé à côté d’un seul grand PVS, dans le VSA classique, on ne peut pas facilement distinguer si la souris a vidé plusieurs fois au cours de l’expérience (avec trois petits et un grand vide) ou si l’animal a déposé un grand volume d’urine, et les trois plus petites taches sont le résultat d’un dribble post-miction ou d’un transfert de fourrure. RT-VSA peut être utilisé pour répondre à ces questions.

Troisièmement, RT-VSA permet d’analyser le comportement d’une souris avant, pendant et après l’événement de vidage. L’enquêteur peut également surveiller le profil d’activité global de la souris en analysant les enregistrements RT-VSA avec un logiciel disponible gratuitement tel que Mouse Behavior Tracker39. En outre, on peut distinguer si un animal s’arrête pour uriner (comportement typique des femelles), si l’animal est en mouvement pendant la miction (ce qui, chez les mâles, peut entraîner la traînée de taches vides) ou s’il vide pendant sa phase de sommeil / repos. Nous avons observé ce dernier comportement, bien qu’il soit normalement rare. Ainsi, si elle est correctement validée et interprétée, l’observation du comportement mictionnel peut fournir à l’investigateur des informations précieuses sur le dysfonctionnement de la miction, y compris, par exemple, la nycturie ou l’incontinence. RT-VSA (et VSA) permet aux enquêteurs de déterminer la fraction des événements de vide qui se produisent dans la zone centrale d’une cage, par opposition aux coins. Normalement, la miction centrale est rare, et l’augmentation du nombre de tels événements est un signe de dysfonctionnement de la vessie 8,22. La seule exception concerne les mâles alpha dominants, qui urinent fréquemment et dans l’ensemble de leurs enclos20. Afin d’effectuer une analyse de la miction centrale à l’aide de RT-VSA, il faut envisager de déplacer le plat alimentaire sur une paroi latérale et de retirer le dôme (ou de le fixer à une région particulière de la cage), afin que les modèles spatiaux de miction puissent être plus facilement établis.

Quatrièmement, le RT-VSA permet de gérer plus efficacement les contraintes associées à l’échange de cage par rapport au VSA classique. Les souris sont nerveuses par nature et les manipuler ou les transférer dans un nouvel environnement provoque un stress, qui est connu pour avoir un impact sur le comportement de miction35. De par sa nature, il est difficile d’intégrer une période d’acclimatation dans le VSA standard. En revanche, dans RT-VSA, une période d’acclimatation peut être facilement incorporée dans chaque expérience, et tout événement de vidange pendant cette période n’est pas pris en compte lors de l’analyse. Un autre aspect anti-stress de la RT-VSA mis en œuvre dans ce protocole est la duplication des conditions dans lesquelles les souris sont normalement logées (c.-à-d. accès à de la nourriture et de l’eau ad libitum, un dôme et un jouet). C’est, à notre connaissance, l’un des environnements les plus riches décrits pour ce type d’expérience. Dans un critère d’évaluation typique VSA, les souris sont privées d’eau (et parfois aussi de nourriture)8,22, que nous fournissons ad libitum.

Cinquièmement, en plus de l’effet positif que cet environnement enrichi peut avoir sur les niveaux de stress des souris, il permet à l’investigateur d’effectuer RT-VSA pendant de longues périodes, généralement dans des fenêtres de temps de 6 heures; Cependant, plus récemment, nous avons effectué des expériences qui durent 24 heures (données non présentées). Ceci est idéal pour évaluer les effets de la rythmicité circadienne ou lors de l’étude de souris qui peuvent présenter un phénotype de vessie sous-actif, et donc uriner rarement.

Pour une surveillance vidéo 24 heures, nous vous recommandons d’utiliser du papier filtre mince et d’analyser les expériences à l’aide des caméras inférieures. Cette combinaison de type de papier et d’appareil photo est la meilleure option qui permet une sensibilité de détection dans les phases sombres et claires. Comme mentionné précédemment, les caméras inférieures ne peuvent pas facilement détecter les taches de vide sur le papier filtre épais et les caméras supérieures ne détectent pas de manière fiable les taches de vide pendant la phase de lumière. Si vous effectuez ces analyses étendues, nous suggérons de placer les animaux dans les cages d’enregistrement à 17h00, d’analyser à partir de 18h00 le jour 1 et de terminer l’expérience à 18h00 le lendemain.

Bien que RT-VSA présente de nombreux aspects positifs, certaines mises en garde méritent d’être notées. Bien que nous fassions tout notre possible pour limiter le stress lors de ces analyses, nous ne pouvons pas reproduire complètement l’habitat de la souris, car les animaux sont normalement hébergés en groupe. Ils boivent également de l’eau dans une bouteille au lieu d’obtenir de l’eau à partir de gel d’eau non mouillant. Cependant, notre observation que les souris ont moins de vides pendant leur phase lumineuse inactive par rapport à leur phase sombre active nous indique que les souris conservent leurs schémas normaux de comportement de miction circadienne40. Reflétant leur nature facilement stressée, nous avons constaté que les souris présentent un comportement de miction perturbé les jours de nettoyage de la cage. Ainsi, il faut limiter l’analyse aux périodes de temps où les animaux seront moins touchés par l’élevage de routine. Un facteur important à considérer est de savoir si la lumière UV a un impact sur la fonction de vidange. Parce que nos résultats montrent une différence circadienne distincte dans les paramètres VSA entre les phases claires et sombres, qui sont cohérentes avec d’autres techniques qui décrivent un phénomène similaire mais n’utilisent pas la lumière UV40, nous concluons que l’éclairage de la lumière UV n’a pas d’impact sur la fonction de miction. Notez que le papier filtre empêche la lumière de passer de la chambre inférieure à la chambre supérieure.

Une mise en garde supplémentaire est que plus on garde les souris longtemps dans la chambre, plus elles sont susceptibles de mâcher ou d’endommager le papier filtre (quelle que soit l’épaisseur du papier). Bien qu’aucun des animaux n’ait perturbé le papier pendant la phase de lumière, près de 30% des souris ont endommagé le papier pendant la phase active sombre. Dans l’analyse des expériences de 24 heures, nous avons observé qu’une proportion similaire (un tiers) des expériences ne pouvait pas être analysée en raison de dommages au papier, ce qui signifie que non seulement la quantité de temps, mais aussi la phase de la journée affecte le comportement de déchiquetage de l’animal. Malheureusement, d’après notre expérience, nous avons remarqué qu’un animal qui perturbe le papier de la cage continuera de le faire même après de nouveaux tests. Comme indiqué ci-dessus, les souris urinent parfois sur le sol en acrylique nu, et donc la perte du papier rend l’analyse incomplète et de valeur limitée.

De plus, l’analyse du comportement de miction des mâles peut être plus difficile car ils ont tendance à uriner plus fréquemment, ils peuvent dribbler après miction, et il existe une population de mâles (20%) avec un phénotype mâle alpha plus agressif caractérisé par un grand nombre de petits vides qui sont répartis dans la cage, comme discuté dans une publication antérieure3. Comme ce comportement alpha-mâle peut constituer un facteur de confusion pour établir des phénotypes de miction, nous excluons de l’analyse les animaux présentant des vides de ≥50 (expériences en phase légère) ou ≥100 (expériences en phase sombre).

Il existe des situations dans lesquelles la discrimination des vides en fonction de leur volume (c.-à-d. PVS vs SVS) n’est pas nécessairement justifiée. Par exemple, d’après notre expérience, les souris atteintes de cystite bactérienne ou chimique ont tendance à uriner des volumes plus petits que les témoins 4,34. Cependant, il existe de grandes différences dans le volume vide entre les souris individuelles; dans certains, la plupart des vides ont un volume ≤20 μL, tandis que dans d’autres, la majorité est de >20 μL. Par conséquent, la discrimination du volume annulé n’apporte aucun avantage pour la caractérisation de ces phénotypes.

En résumé, RT-VSA est un outil facile à mettre en œuvre pour analyser le comportement de vidage de la souris chez les souris librement mobiles. Contrairement à des outils tels que la cystométrie, il ne nécessite pas l’implantation chirurgicale d’un cathéter ou des taux non physiologiques de remplissage de la vessie. Il permet de déterminer le comportement de miction chez les deux sexes de souris, sur de longues périodes de temps et pendant les phases claires et sombres du cycle diurne. Il est également relativement abordable, surtout par rapport à des dispositifs plus spécialisés et coûteux tels que les cages métaboliques. Bien qu’il y ait des mises en garde associées à cet outil, elles sont généralement faciles à gérer. Enfin, cette technique pourrait être facilement adaptée à d’autres espèces animales, y compris d’autres rongeurs.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par une subvention des NIH R01DK119183 (à G.A. et M.D.C.), une bourse de projet pilote par P30DK079307 (à M.G.D.), une bourse de développement de carrière de l’American Urology Association et une subvention de la Fondation Winters (à N.M.), et par les noyaux d’imagerie rénale Cell Physiology and Model Organisms du Pittsburgh Center for Kidney Research (P30DK079307).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots –  cut to 10 inches 80/20 1010 Amount: 20
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots –  cut to 12 inches 80/20 1010 Amount: 6
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots –  cut to 40 inches 80/20 1010 Amount: 4
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots – cut to 14.75 inches 80/20 1010 Amount: 12
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots – cut to 32 inches 80/20 1010 Amount: 5
1/4-20 Double Slide-in Economy T-Nut 80/20 3280 Amount: 16
1/4-20 Triple Slide-in Economy T-Nut 80/20 3287 Amount: 18
10 & 25 Series 2 Hole - 18mm Slotted Inside Corner Bracket with Dual Support 80/20 14061 Amount: 6
10 Series 3 Hole - Straight Flat Plate 80/20 4118 Amount: 8
10 Series 5 Hole - "L" Flat Plate 80/20 4081 Amount: 8
10 Series 5 Hole - "T" Flat Plate 80/20 4080 Amount: 8
10 Series 5 Hole - Tee Flat Plate 80/20 4140 Amount: 2
10 Series Standard Lift-Off Hinge - Right Hand Assembly 80/20 2064 Amount: 2
10 to 15 Series 2 Hole - Lite Transition Inside Corner Bracket 80/20 4509 Amount: 6
24”-long UV tube lights ADJ Products LLC T8-F20BLB24 Amount: 2
20W bulb – 24” Wavelength: 365nm
Acrylic Mirror Sheet Profesional Plastics Amount: 1
82.5 cm x 26.5 cm
Acrylic Mirror Sheet Profesional Plastics Amount: 2
26.5 cm X 30.5 cm
Acrylic Mirror Sheet Profesional Plastics Amount: 2
82.5 cm x 30.5 cm
AR polycarbonate (UV resistance) 80/20 65-2641 Amount: 2
4.5mm Thick, Clear, 38.5 cm x 26.5 cm
AR polycarbonate (UV resistance) 80/20 65-2641 Amount: 4
4.5mm Thick, Clear, 38.5 cm x 21.5 cm
AR polycarbonate (UV resistance) 80/20 65-2641 Amount: 4
4.5mm Thick, Clear, 26.5 cm x 21.5 cm
AR polycarbonate (UV resistance) 80/20 65-2641 Amount: 4
4.5mm Thick, Clear 37.5 cm x 23.9 cm
AR polycarbonate (UV resistance) 80/20 65-2641 Amount: 4
4.5mm Thick, Clear , 24.4 cm x 23.9 cm
Chromatography paper (thin paper)  Thermo Fisher Scientific 57144
Cosmos blotting paper (thick paper) Blick Art Materials 10422-1005
Excel Microsoft Corporation
GraphPad Prism GraphPad Software Version 9.4.0 graphing and statistics software
ImageJ FIJI NIH
Parafilm Merck transparent film
Quick Time Player 10.5 software  Apple multimedia player
Security spy Ben software video surveillance software system
Standard End Fastener, 1/4-20 80/20 3381 Amount: 80
UV transmitting acrylic Spartech Polycast Solacryl SUVT Amount: 2
38.5 cm x 26.5 cm 
Water gel: HydroGel ClearH2O   70-01-5022 (https://www.clearh2o.com/product/hydrogel/)
Webcam Logitech C930e Amount: 4

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References

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