Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

Gerçek Zamanlı Boşluk Noktası Testi

Published: February 10, 2023 doi: 10.3791/64621
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1,2
1Renal-Electrolyte Division, Department of Medicine, University of Pittsburgh, 2Department of Cell Biology, University of Pittsburgh

Summary

Bu makalede, geleneksel boşluk noktası testine video izlemeyi dahil ederek fare işeme davranışını incelemek için yeni bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yaklaşım, günün aydınlık ve karanlık evrelerinde işeme olayları ve fare davranışının ayrıntıları hakkında zamansal, uzamsal ve hacimsel bilgiler sağlar.

Abstract

Normal işeme davranışı, sinir sisteminin uygun kontrolü altında mesane, üretra ve üretral sfinkterlerin koordineli fonksiyonunun sonucudur. Fare modellerinde gönüllü işeme davranışını incelemek için araştırmacılar, bir hayvanın kafesinin zeminini kaplayan bir filtre kağıdı üzerinde biriken idrar lekelerinin sayısını ve alanını ölçen bir yöntem olan boşluk noktası testini (VSA) geliştirdiler. Teknik olarak basit ve ucuz olmasına rağmen, bu tahlil, işeme olaylarının zamansal çözünürlüğünün olmaması ve örtüşen idrar noktalarının ölçülmesinde zorluklar da dahil olmak üzere bir son nokta testi olarak kullanıldığında sınırlamalara sahiptir. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, gerçek zamanlı VSA (RT-VSA) olarak adlandırdığımız ve işeme frekansını belirlememize, işeme hacmini ve işeme modellerini değerlendirmemize ve günün hem karanlık hem de aydınlık fazlarında 6 saatlik zaman aralıklarında ölçümler yapmamıza olanak tanıyan video izlemeli bir VSA geliştirdik. Bu raporda açıklanan yöntem, sağlık ve hastalık durumlarında gönüllü işitmenin fizyolojik ve nörodavranışsal yönlerini araştıran çok çeşitli fare tabanlı çalışmalara uygulanabilir.

Introduction

İdrar depolanması ve işlenmesi, pelvik ve hipogastrik sinirler aracılığıyla mesane dolum durumu hakkında bilgi alan merkezi bir devre (merkezi sinir sistemi) tarafından koordine edilir. Ürotel, idrar yolunu renal pelvisten proksimal üretraya kadar kaplayan epitel, idrarda bulunan metabolik atık ürünlere ve patojenlere sıkı bir bariyer oluşturur. Mesanenin doldurma durumunu algılayan ve altta yatan dokulara ve afferent sinirlere ileten duyusal bir ağın ayrılmaz bir bileşenidir 1,2. Ürotelyal bariyerin bozulması veya ürotelyal mekanotransdüksiyon yollarındaki değişiklikler, frekans, aciliyet, noktüri ve inkontinans gibi alt üriner sistem semptomları ile birlikte işeme disfonksiyonuna yol açabilir 3,4,5,6,7. Aynı şekilde, yaşlanma, diyabet, alt idrar yolu enfeksiyonları, interstisyel sistit ve idrar kesesini etkileyen diğer hastalık süreçlerinin veya işlevini kontrol eden ilişkili devrelerin mesane disfonksiyonuna neden olduğu bilinmektedir 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17, 18,19. Normal ve anormal işeme davranışının daha iyi anlaşılması, farklı idrara çıkma modelleri arasında güvenilir bir şekilde ayrım yapabilen yöntemlerin geliştirilmesine bağlıdır.

Geleneksel olarak, farelerin gönüllü işeme davranışı, Desjardins ve meslektaşları20 tarafından geliştirilen ve basitliği, düşük maliyeti ve invaziv olmayan yaklaşımı nedeniyle geniş çapta benimsenen boşluk noktası testi (VSA) kullanılarak incelenmiştir 8,21,22,23,24. Bu tahlil tipik olarak, bir farenin bir filtre kağıdı ile kaplı bir kafeste belirli bir süre harcadığı, daha sonra filtre kağıdı ultraviyole (UV) ışığı altında yerleştirildiğinde (bu koşullar altında idrar lekeleri floresan) sayıyı sayarak ve idrar lekelerinin boyutunu değerlendirerek analiz edilen bir son nokta testi olarak gerçekleştirilir20. Bu birçok avantaja rağmen, geleneksel VSA bazı önemli sınırlamalar sunmaktadır. Fareler genellikle aynı bölgelerde idrara çıktıklarından, araştırmacılar tahlilin süresini nispeten kısa bir süre (≤4 saat)25 ile sınırlamak zorundadır. VSA daha kısa zaman dilimlerinde gerçekleştirilse bile, büyük boşluk noktalarının üzerine düşen küçük boşluk noktalarını (SVS'ler) çözmek veya SVS'leri kuyruklara veya pençelere yapışmış idrarın taşınmasından ayırt etmek neredeyse imkansızdır. SVS'lerin sık fakat bireysel işeme olaylarının (sistit 4,26'ya yanıt olarak sıklıkla gözlenen bir fenotip) veya miktürasyon sonrası damlama (mesane çıkış tıkanıklığı 27 ile ilişkili bir fenotip) nedeniyle olup olmadığını ayırt etmek de çok zordur. Ayrıca, çalışma saatleri içinde tahlili tamamlama arzusu, ışıklar kapatıldığında konut tesislerine erişimdeki zorluklarla birleştiğinde, bu tahlilleri genellikle 24 saatlik sirkadiyen döngünün ışık periyoduyla sınırlar. Bu nedenle, bu zaman kısıtlamaları, aktif gece evrelerinde fare işeme davranışının değerlendirilmesini önler ve sirkadiyen ritimler tarafından yönetilen belirli genleri veya tedavileri analiz etme yeteneğini azaltır.

Bu sınırlamaların bazılarının üstesinden gelmek için, araştırmacılar işeme davranışını gerçek zamanlı olarak değerlendirmek için alternatif yöntemler geliştirdiler 26,28,29,30,31,32. Bu yaklaşımlardan bazıları, metabolik kafesler26,28,29 veya termal kameraların kullanımı30 gibi pahalı ekipmanların kullanımını içerir; ancak, bunların da sınırlamaları vardır. Örneğin, metabolik kafeslerde, idrar ağ tabanının tellerine ve huninin duvarlarına yapışma eğilimindedir, bu da toplanan ve ölçülen idrar miktarını azaltır. Bu nedenle, küçük boşluklar hakkında doğru bir şekilde veri toplamak zor olabilir. Dahası, metabolik kafesler işeme olaylarının mekansal dağılımı hakkında bilgi vermez (yani, köşelerde idrara çıkma ve odanın merkezi). Termografik kameralar tarafından kullanılan uzun dalga boylu kızılötesi radyasyonun katılara nüfuz etmediği göz önüne alındığında, video termografisi ile değerlendirilen işeme aktivitesi, havada birkaç inç zıplayabilecekleri için aktif farelerle zor olabilecek açık bir sistemde gerçekleştirilmelidir. Diğer bir sistem ise, bir fare kafesinin tel örgü tabanının altında sabit bir hızda sarılan haddelenmiş filtre kağıdından oluşan otomatik boşluklu kağıt lekesi (aVSOP) yaklaşım33'tür. Bu yaklaşım, kağıt hasarını ve klasik VSA'da meydana gelen idrar lekelerinin üst üste binmesini önler ve uygulanması, araştırmacının birkaç gün boyunca deneyler yapmasına izin verir. Bununla birlikte, araştırmacıya işeme olaylarının kesin zamanlamasını sağlamaz ve davranışı ve lekelenme ile nasıl ilişkili olduğunu inceleme yeteneği yoktur. Bu bilgiyi elde etmek için araştırmacılar, fare aktivitesinin ve idrara çıkma olaylarının eşzamanlı olarak değerlendirilmesine izin veren bir yaklaşım olan işeme tahlillerine video izlemeyi dahil etmişlerdir31,32. Bir yaklaşım, işeme olaylarını görselleştirmek için deneysel kafesin altına mavi ışık yayan bir diyot (LED) ve yeşil floresan protein filtreli bir video kamera ve fare pozisyonu32'yi yakalamak için kafesin üzerine bir kızılötesi LED ve bir video kamera yerleştirmekten oluşur. Bu kurulum, fiber fotometri yaparken işeme davranışını izlemek için kullanılmıştır; Bununla birlikte, bu sistemin parlak aydınlatılmış ortamı, araştırmacıların işemeyi uyarmak için farelerini bir diüretik ajanla tedavi etmelerini gerektirdi. Başka bir deneysel tasarımda, sırasıyla fare motor aktivitesini ve idrara çıkma olaylarını görselleştirmek için deney kafesinin üstüne ve altına geniş açılı kameralar yerleştirildi. Bu durumda, kafesin zeminini kaplayan bir filtre kağıdı üzerinde biriken idrar lekeleri, filtre kağıdının kafes31'in altına yerleştirilen UV ışıkları ile aydınlatılmasıyla ortaya çıkarılmıştır. Bu kurulum, gönüllü işeme davranışında yer alan beyin sapı nöronlarını incelemek için günün ışık fazı sırasında, 4 dakikalık kısa tahlillerde kullanıldı31. Bu sistemin karanlık fazda veya >4 dakikalık sürelerde kullanımına uygunluğu bildirilmemiştir.

Bu makalede, fare işeme davranışının uzun süreli video izlemesine izin vererek geleneksel VSA'yı geliştiren bir yöntem açıklanmaktadır. Bu uygun maliyetli yaklaşım, fare davranışıyla ilgili ayrıntıların yanı sıra günün aydınlık ve karanlık evrelerinde uzun süreler boyunca işeme olayları hakkında zamansal, uzamsal ve hacimsel bilgiler sağlar 3,4,34. İşeme odalarının yapımı, gerçek zamanlı bir VSA (RT-VSA) uygulaması ve verilerin analizi için ayrıntılı bilgi verilmektedir. RT-VSA, üriner sistemin işlevini kontrol eden fizyolojik mekanizmaları anlamak, işitmeyi kontrol etmek için farmakolojik yaklaşımlar geliştirmek ve alt üriner sistemi etkileyen hastalık süreçlerinin moleküler temelini tanımlamak isteyen araştırmacılar için değerlidir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Urothelial Piezo1/2 çift nakavt fareleri (Pz1/2-KO , genotip: Piezo1 fl/fl; Piezo2fl / fl; Upk2CRE+/-) ve kontrolleri (Pz1/2-C, genotip: Piezo1 fl/fl; Piezo2fl / fl; Upk2CRE-/-), Jax laboratuvarlarından elde edilen ebeveyn suşlarından (Piezo1 fl/ fl suşu # 029213; Piezo2fl / fl suşu # 027720; Upk2CRE+/- suş # 029281). Deneylerde hem dişi (1.5-3 aylık ve 17-20 g ağırlığında) hem de erkek (2-4 aylık ve 23-29 g ağırlığında) fareler kullanıldı. Siklofosfit kaynaklı sistit deneyleri için, vahşi tip C57Bl / 6J dişiler (3 aylık ve ~ 20 g ağırlığında) kullanılmıştır (Jackson laboratuvarları, suş # 000664). Hayvanlar barındırıldı ve deneyler, Pittsburgh Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'nin onayı altında Pittsburgh Üniversitesi Hayvan Bakım Tesisi'nde gerçekleştirildi. Tüm hayvan deneyleri, Laboratuvar Hayvanlarının İnsancıl Bakımı ve Kullanımına İlişkin Halk Sağlığı Hizmeti Politikası ve Hayvan Refahı Yasası'nın ilgili kılavuz ilkelerine ve düzenlemelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. Gerçek zamanlı boşluk noktası analizi için kafeslerin montajı (RT-VSA)

  1. RT-VSA sondaj makinesi, günün ışık fazında işeme aktivitesini kaydetmek için kullanılan iki UV ampul ve iki geniş açılı kamera (alt kameralar) tutan bir UV standından oluşur. Standın üzerinde duracak iki fare odası düzenleyin. Her fare odasının kapağına, günün karanlık evresinde işeme aktivitesini kaydetmek için kullanılan geniş açılı kameralar (üst kameralar) takın (Şekil 1A).
  2. UV standının ve fare odalarının çerçevesini T oluklu alüminyum profillerde 1 inç x 1'den oluşturun. İki fare haznesi ve UV standı oluşturmak için kullanılan bileşenlerin listesi için Tablo 1'e ve monte edilmiş bileşenlerin ve boyutların farklı görünümleri için Şekil 1B-D'ye bakın.
  3. Her fare haznesini, 10 inç'e kadar kesilmiş sekiz T oluklu alüminyum profille ve dördü 14,75 inç'e kadar kesilmiş olacak şekilde oluşturun. Fare haznesinin tabanını monte ederek başlayın ve Şekil 1'e göre T-oluklu profilleri monte etmek için standart uç bağlantı elemanlarını (Tablo 1) kullanın. Fare odalarının zeminini oluşturmak için profillerin iç kanalına 38,5 cm x 26,5 cm UV ileten akriliği monte edin.
    NOT: T-oluklu profillerin standart uç bağlantı elemanları ile nasıl monte edileceği hakkında ayrıntılı bilgi için, şirketin web sayfasını ziyaret edin.
  4. Fare odasının duvarlarını profillerin geri kalanıyla birlikte inşa edin. 38,5 cm x 21,5 cm ve 26,5 cm x 21,5 cm aşınmaya dayanıklı (AR) polikarbonat panelleri fare haznesinin dış duvarlarını monte etmek için profillere monte edin. Fare haznesinin içini oluşturmak için 37,5 cm x 23,9 cm ve 24,4 cm x 23,9 cm AR polikarbonat panelleri kullanın.
  5. AR polikarbonat panelleri standart uç bağlantı elemanı 1/4-20 sırt ile sabitleyin. Panellerin web sayfasındaki profillere nasıl monte edileceğine ilişkin talimatlara adım 1.3'ün NOTU'nda bakın. İç paneller arasındaki bağlantıları kapatmak için ticari silikon kazan kullanın.
  6. Kafesin kapağını Şekil 1B'de gösterildiği gibi monte etmek için T-oluklu profillerde iki adet 12 inç ve iki adet 14,75 kullanın. Kapağı tamamlamak için profillerin iç kanalına 38,5 cm x 26,5 cm AR polikarbonat panel monte edin.
  7. 12 kamera profili desteğini kafesin üst kısmındaki uzun eksenlere dik olarak monte edin ve köşe braketlerinin içinde iki hafif geçişle sabitleyin (Şekil 1B'de 3 olarak işaretlenmiştir). Web kamerası montaj desteği olarak düz düz bir plaka (2 işaretli) kullanın ve Şekil 1B'de gösterildiği gibi monte edin. Fotoğraf makinesini kamera montaj vidasıyla desteğe takın.
  8. Kapağı fare haznesinin gövdesine takmak için 10 serisi standart kaldırma menteşesi sağ tertibatını kullanın (Şekil1 B'de 1 olarak işaretlenmiştir).
  9. UV standını, Şekil 1C,D'ye göre, 40 inç'e kadar kesilmiş dört T-oluklu profil, 32 inç'e kesilmiş dört T-oluklu profil ve 10 inç'e kesilmiş dört T-oluklu profil ile inşa edin. UV haznesinin tabanını oluşturmak için profillere 82,5 cm x 26,5 cm akrilik ayna tabakası monte edin.
  10. UV standının duvarını oluşturmak için 82,5 cm x 30,5 cm ve 26,5 cm x 30,5 cm akrilik ayna tabakasını kullanın.
  11. UV standını sabitlemek için 10 serisi beş delikli T düz plakaları (Şekil 1 C'de 2 olarak işaretlenmiş), 10 serisi beş delikli L düz plakaları (Şekil 1 C'de 3 olarak işaretlenmiş) ve 10 serisi beş delikli tişört düz plakalarını (Şekil 1 C'de 1 olarak işaretlenmiş) takın.
  12. Alt kameraları 32 inçe kadar kesilmiş T oluklu bir profile monte edin ve Şekil 1D'de gösterildiği gibi iki hafif geçiş köşe braketi ile standın altına yapıştırın. Web kameralarını T oluklu profile bağlamak için düz düz plakalar kullanın.
  13. UV lambalarını iç, ön ve arka profillere monte edin ve Şekil 1D'de gösterildiği gibi düz düz plakalara takın.
  14. Dört web kamerasını bir video gözetim yazılımı çalıştıran bir bilgisayarın USB bağlantı noktalarına bağlayın.

2. Deneyden önce hayvan barınağı

  1. Amaca yönelik olarak yetiştirilen veya harici bir bölgeden elde edilen ev deney fareleri, dörderli gruplar halinde. Mümkün olduğunda, bu deneyler için yaşa uygun dişi veya erkek fareler kullanın. Hayvanlar harici bir kaynaktan elde edilirse, herhangi bir deneysel prosedür uygulamadan önce en az 7 gün boyunca iklimlendirmelerine izin verin.
  2. Hayvan tesisinde geçirdikleri süre boyunca, hayvanları yatak takımları ve zenginleştirme (örneğin, plastik iglo, tekerlek, parçalama için kağıt parçası) içeren standart kafeslerde barındırın ve suya ve kuru fare chow ad libitum'a erişimi olan 12 saatlik bir gündüz / gece döngüsü altında tutun.

3. Günün aydınlık ve karanlık aşamalarında RT-VSA kayıtları

NOT: Aşağıdaki protokolde, günün aydınlık ve karanlık aşamalarında fare işeme davranışını değerlendirmek için RT-VSA'nın kullanımı açıklanmaktadır. Hayvanlar, Zeitgeber zamanı (ZT) = 0 saat 07: 00'de 12 saat ışık ve 12 saat karanlık döngüde tutulur. Kayıtlar, ışık fazı deneyleri için 10:30 ile 11:00 (ZT = 3.5–4.0) arasında ve karanlık faz deneyleri için 18:00-18:30 (ZT = 11.0–11.5) arasında başlar. Hayvanlar her iki koşulda da test edildiğinde, deneyler tipik olarak açık ve koyu testler arasında en az 5 ardışık gün olmak üzere iki ayrı günde gerçekleştirilir. Deneyler, hayvan odalarının temizlendiği veya kafeslerin değiştirildiği günlerde yapılmamalıdır, çünkü bunlar işeme davranışını etkileyen streslere neden olabilir. Tüm adımlar, fareler için minimum stres koşulları altında gerçekleştirilmelidir.

  1. Deney hayvanlarını barındıkları yerden RT-VSA kayıt odalarının bulunduğu prosedür odasına taşıyın.
  2. RT-VSA kayıt odası hazırlama
    1. Her RT-VSA kayıt kafesinin altına bir parça filtre kağıdı (24,3 cm x 36,3 cm) yerleştirin. Günün saatine bağlı olarak, ince (ışık fazı deneyleri) veya kalın (karanlık faz deneyleri) filtre kağıdı kullanın.
      NOT: Kalın filtre kağıdı, ince filtre kağıdından daha parçalanmaya karşı daha dirençli olduğu için aktif karanlık fazda kullanılır. En iyi kameralar, karanlık fazda kalın filtre kağıdı üzerinde biriken idrar lekelerini görselleştirmek için kullanılır. Buna karşılık, ışık fazı sırasında, alt kameralar kullanılır, çünkü ortam ışığı, üst kameraların filtre kağıdında biriken idrar noktalarını algılamasını önler. Bu durumda, ince filtre kağıdı kullanılır. Alt kameraların, kalın filtre kağıdı üzerinde biriken küçük işeme olaylarını tespit etmede etkisiz olduğunu bulduk.
    2. Filtre kağıdının üzerine, aşağıdaki öğeleri yerleştirin: plastik bir iglo (uyku alanı sağlayan), zenginleştirme amaçlı steril bir 1,5 mL mikro santrifüj tüpü ve iki veya üç parça fare kuru çorbası ve jel paketi şeklinde 14-16 g su içeren 60 mm x 15 mm'lik plastik bir tabak (ıslanmayan su jeli; Şekil 2).
      NOT: Zenginleştirme amacıyla 1,5 mL mikro santrifüj tüplerinin kullanımı, bu çalışmada kullanılan muhafazaya özgüdür.
    3. Kayıt odaları hazır olduğunda, deney farelerini yavaşça filtre kağıdına yerleştirerek içine yerleştirin. Hayvanların barınak kafesinden kayıt kafeslerine transferinin minimum stresle gerçekleştiğinden emin olun.
    4. Tüm deney hayvanları, kapakları kapalıyken kayıt kafeslerine girdikten sonra, pleksiglas kapak yüzeyindeki doğrudan ortam ışığı yansımalarını en aza indirmek için kapakların üstünü emici bir tezgah bluepad ile örtün.
    5. Alt odadaki UV ışıklarını açın.
      NOT: Hayvanların UV ışığı ile doğrudan teması yoktur. Önerilen UV ışığı malzemeler bölümünde detaylandırılmıştır.
  3. RT-VSA kayıtları
    1. Üst ve alt kameralardan video kaydetmek için, aynı anda birden fazla web kamerasından veya ağa bağlı kameradan kayıt yapmak üzere yapılandırılabilen bir video gözetim kayıt yazılımı kullanın.
    2. Programı açtıktan sonra, program penceresinde Command ve R tuşlarına basarak kaydı başlatın. Video kayıtlarını s başına 1 kare hızında gerçekleştirin.
    3. Kayıtları başlattıktan hemen sonra, kapıyı yavaşça kapatarak odadan çıkın. Deneyin tüm süresi boyunca odanın sessiz kaldığından emin olun.
  4. RT-VSA kayıtlarını tamamlama
    1. 7 saat sonra (ışık fazı deneyleri) veya ertesi sabah (karanlık faz deneyleri) prosedür odasına dönün.
    2. Command ve T tuşlarına basarak kayıtları durdurun. UV ışıklarını kapatın.
    3. Kaydı durdurduktan sonra, yazılım her kamera için otomatik olarak bir film dosyası (.m4v formatında) oluşturur ve daha önce seçilen bir hedef klasörde kameranın adı altında kaydeder. Her kamera klasöründe, deneylerin tarihe göre klasörler halinde düzenlendiğini doğrulayın.
    4. Her tarih/deneme klasöründe, bir .m4v dosyası ve film karelerinin her birine karşılık gelen tüm ayrı ayrı .jpeg dosyaları olduğunu doğrulayın.
    5. NOT: .jpeg dosyaları, film dosyalarının bozulması durumunda denemeyi kurtarmak için kullanılabilir.
    6. Masaüstünde denemenin adını ve tarihini içeren bir klasör oluşturun ve .m4v tüm dosyaları bu klasöre aktarın. Gerekirse, film dosyaları kaydedilip yedeklendikten sonra .jpeg dosyaları silin.
    7. NOT: Işık fazı deneyleri için, yazılım kamera başına bir film üretirken, karanlık faz deneyleri için her kamera için iki film üretecektir. Bunun nedeni, tarih değiştiğinde gece yarısından sonra yeni bir .m4v dosyası oluşturulmasıdır.
    8. Filmleri içeren klasörü harici bir bilgisayarda analiz etmek üzere bir flash sürücüye kopyalayın. Bu adım birkaç dakika sürebilir ve 3.5.1 ile 3.5.3 arasındaki adımlara paralel olarak gerçekleştirilebilir.
  5. Kayıt kafeslerinin temizlenmesi ve deneysel farelerin barındıkları yere geri aktarılması
    1. Kafeslerin kapaklarını kaplayan mavi pedi çıkarın. Hayvanları kayıt kafeslerinden barınak kafeslerine aktarın.
    2. Kayıt odalarındaki aksesuarları ve gıda maddelerini (örneğin, plastik iglolar, plastik tüpler, chow ve su jeli dinlenmeli tabak ve filtre kağıdı) çıkarın ve bunları biyotehlikeli atıklara atın.
    3. Kafesleri bir el elektrikli süpürgesi kullanarak temizleyin, kafesin dibinde bulunan chow ve dışkı topaklarını çıkarın. Ardından, kafesin zeminine ve iç duvarlarına% 70 etanol püskürtün ve iç kısmı yumuşak bir bezle temizleyin. Hava kurumasını sağlamak için kafeslerin kapağını açık bırakın.
    4. Barınak kafesini hayvanlarla birlikte ikincil bir kaba yerleştirin ve hayvanları barınma yerlerine geri taşıyın.

4. Kalibrasyon eğrilerinin oluşturulması

NOT: Boşluk noktası alanlarını idrar hacimlerine dönüştürmek için bir kalibrasyon eğrisi gereklidir. Günün aydınlık ve karanlık evrelerinde deneyler yapılıyorsa, kullanılan her filtre kağıdı türü için bir tane olmak üzere iki kalibrasyon eğrisi oluşturulmalıdır (ince ve kalın filtre kağıtları). Kalibrasyon eğrileri çift olarak oluşturulur. Her çoğaltma, RT-VSA kayıt odasına yerleştirilmiş bir filtre kağıdı üzerinde çalıştırılır. Karmaşık bileşimi ve UV uyarılabilirliği göz önüne alındığında, kalibrasyon eğrilerini yapmak için fare idrarı kullanın.

  1. Fare idrarı toplama
    1. Bir parça esnek şeffaf film (10 cm x 15 cm) alın ve bir tezgahın üzerine yerleştirin.
    2. Kuyruğundan bir fare seçin ve fırçalayın. İdrar yapmayı tetiklemek için alt karın bölgesine yumuşak bir şekilde masaj yapın. Şeffaf film plastik tabakanın yüzeyinde idrar toplayın.
    3. Hayvanı yavaşça kafesinin içine bırakın. Bir pipet kullanarak, idrarı şeffaf filmin yüzeyinden steril bir 1,5 mL mikro santrifüj tüpüne aktarın. ~ 10 mL fare idrarı toplanana kadar prosedürü birden fazla fareyle tekrarlayın, idrarı bir araya getirin ve -20 ° C'de saklayın.
      NOT: Açık ve koyu fazlar için çift kalibrasyon eğrileri oluşturmak için toplam ~ 10 mL fare idrarı gerekir. Deneysel fareleri strese sokmaktan kaçınmak için, idrar toplama için RT-VSA deneylerine tabi tutulacak fareleri kullanmayın.
  2. Kalibrasyon eğrisi kayıtları
    1. Adım 4.1'de toplanan idrarı çözün ve 10-15 saniye boyunca hafifçe vorteks yaparak karıştırın.
    2. İki RT-VSA kayıt kafesinin her birine bir parça ince filtre kağıdı (24,3 cm x 36,3 cm) yerleştirin.
    3. Filtre kağıtlarının her birine aşağıdaki idrar hacimlerini (μL cinsinden) pipetleyin: 2, 5, 10, 25, 50, 80, 100, 200, 300, 400, 500 ve 750. Difüzyonun bir sonucu olarak nokta çakışmasını önlemek için, noktaları birbirinden yeterli bir mesafede tahsis edin.
    4. Kafeslerin kapağını kapatın ve pedlerle örtün.
    5. Command ve R tuşlarına basarak, denemeleri kaydetmek için kullanılan yazılım parametrelerinin aynısını uygulayarak kayda başlayın (adım 3.3.).
    6. İdrar noktalarının maksimum difüzyonuna izin vermek için kalibrasyon eğrisini 1 saat boyunca kaydedin. Kaydı durdurmak için Command ve T tuşlarına basın.
    7. Masaüstünde yeni bir klasör oluşturun, .m4v dosyalarını içine yerleştirin ve ardından daha sonra analiz etmek üzere verileri bir flash sürücüye aktarın.
    8. Kalın filtre kağıdıyla yinelenen eğriler oluşturmak için benzer bir prosedür uygulayın. Bu durumda, iç mekanı karartmak ve karanlık faz koşullarını simüle etmek için ekstra ped katmanları ekleyin.
  3. Kalibrasyon eğrisi kayıtlarının analizi
    1. .m4v dosyalarını bir film oynatıcı yazılımında açın ve pencereyi ekranı dolduracak şekilde ekranı kaplayın. Kalın filtre kağıdı üzerinde gerçekleştirilen kalibrasyon eğrilerini analiz etmek için, en iyi kameralarla elde edilen dosyaları kullanın (Şekil 3A). İnce filtre kağıdı üzerinde gerçekleştirilen kalibrasyon eğrilerini analiz etmek için, alt kameralar ile elde edilen dosyaları kullanın (Şekil 3B).
    2. 1 saatlik kalibrasyon eğrisi filminin tamamına genel bir bakış elde etmek için zaman kaydırıcısını ileri ve geri hareket ettirerek .m4v dosyasını oynatın.
    3. Daha küçük idrar lekelerinin (<25 μL) en yüksek yoğunluğa sahip olduğu ve maksimum yayıldığı zaman aralığını belirleyin. Bu zaman aralığında bir ekran görüntüsü alın. Ekran görüntüsü dosyasını adlandırın ve .png dosyası olarak kaydedin (Şekil 3A, üst panel).
      NOT: Ekran görüntüleri F6 tuşuna basılarak alınır. F6'yı ekran görüntüsü alma amacıyla ayarlamak için şunu seçin: Sistem Tercihleri > Klavye > Kısayollar'ı seçin ve Ekranın Resmini Dosya Olarak Kaydet seçeneğinin sağında bulunan kutuya F6 yazın.
    4. Orta ve büyük idrar lekelerinin (>50 μL) maksimum alana sahip olduğu zaman aralığını belirleyin ve ekran görüntüsü alın. Daha küçük idrar lekelerinin bazılarının, daha büyük idrar lekeleri maksimum difüzyon sergilediğinde görünmemesi mümkündür. Dosyayı adlandırın ve ekran görüntüsünü .png dosyası olarak kaydedin (Şekil 3A, alt panel).
    5. ImageJ yazılımını (NIH) açın ve ardından görüntü dosyasını açmak için adım 4.3.3'te elde edilen .png dosyası simgesini sürükleyip bırakın (Şekil 4A).
    6. Araç çubuğundan Çokgen Seçimleri simgesini seçin ve filtre kağıdının kenarlığını belirtin.
    7. Ardından, menü çubuğundan Analiz Et'i seçin, genişletilmiş menüden Ölçümleri Ayarla'yı seçin ve açılan pencereden Alan'ı seçin. Tamam'ı tıklatın. Bu, adım 4.3.8 gerçekleştirildiğinde alan değerlerinin elde edilmesini sağlar.
    8. Ardından, menü çubuğundan tekrar Analiz Et'i seçin ve genişletilmiş seçeneklerden Ölçüm'ü seçin. Alan değerlerini piksel2 olarak gösteren bir sütun alanı içeren bir sonuç penceresi açılır (Şekil 4B-D).
    9. Araç çubuğundan Serbest El Seçimleri simgesini seçin ve tek bir boşluk noktasının çevresine bir çizgi çizmek için kullanın. Alanı adım 4.3.8'deki gibi ölçün. Yazılım, yeni ölçümler yapıldıkça sonuç tablosunu günceller. Yeni sayı kümesi öncekilerin altında görünür. Analiz edilen her nokta için sonuçlar penceresinin sütun alanının altında görünen sayıyı kaydedin (Şekil 4E-G).
    10. Çoğaltılan noktaların her biri için 4.3.5 ile 4.3.7 arasındaki adımları yineleyin.
    11. Filtre kağıdının toplam alanını %100 olarak ayarlayın ve her idrar noktası için alan yüzdesini (% alan) hesaplayın. Bu normalleştirme, kameraların yakınlaştırma veya konumlandırılmasındaki farklılıkların bir sonucu olarak ortaya çıkabilecek hataları düzeltir.
    12. Bir grafik programında yeni bir XY tablosu oluşturun ve X sütununa idrar hacmi değerlerini (μL cinsinden) ve % alanının yinelenen değerlerini Y sütununa ekleyin.
    13. Ardından, Analiz > Doğrusal Olmayan Regresyon (eğri uyumu) > > XY analizini analiz et'i seçin. Görüntülenen parametreler penceresinden Model > Polinom > İkinci Dereceden Polinom (ikinci dereceden) seçeneğini belirleyin.
    14. Ardından, yöntem sekmesinden, aşağıdaki seçimleri işaretlemek için tıklatın: En Küçük Kareler Regresyonu, Ağırlıklandırma Yok ve Her Y Değerini Ayrı Bir Nokta Olarak Çoğaltın.
    15. Kısıtla sekmesinden B0, Kısıtlama Türü > Sabit eşittir'i seçin ve Değer sütununun altına 0 yazın. Tamam'ı tıklatın.

5. Deneysel fare kayıtlarının analizi

  1. Işık fazı (alt kamera) veya karanlık faz (üst kamera) sırasında toplanan bir film dosyasını analiz için açın.
  2. Zaman kaydırıcıyı ileri ve geri hareket ettirerek, analiz edilecek 6 saatlik zaman penceresi boyunca filtre kağıdının bozulmadan (yırtılma veya çiğneme olmadan) kaldığını doğrulayarak film dosyasının kalitesini değerlendirin. Kağıt yırtılmışsa, fare açıkta kalan plastiğin üzerine idrar yapmış olabileceğinden, nicelleştirilemeyen başka bir analiz yapmayın (Şekil 5).
  3. Açık veya koyu fazlarda toplanan denemeleri analiz etmek için, istenen zaman penceresine gitmek üzere ileri sarma komutunu veya zaman çubuğu kaydırıcısını kullanın. Işık fazı sırasında işeme aktivitesi 11:00 ile 17:00 arasında (ZT = 4.0–10.0) ve karanlık fazda gece yarısı ile 06:00 arasında (ZT = 17.0–23.0) kaydedilir.
  4. >> simgesine tıklayarak (veya filmde manuel olarak gezinerek) farenin işediğine dair kanıt arayarak filmi ileri sarma modunda oynatın. Bunun gerçekleştiğini söylemenin en kolay yolu, filtre kağıdında parlak idrar lekelerinin aniden ortaya çıkmasını sağlamaktır. Başka bir gösterge, kafesin köşelerine hareket ve fare işediğinde kısa bir hareketsizlik süresi de dahil olmak üzere davranış değişikliklerini aramaktır.
    NOT: Boşlukları algılamada daha iyi hale geldikçe, kaydırma veya hızlı ileri sarma hızını artırabilirsiniz. Bununla birlikte, çok sayıda küçük boşluk 4,34'e sahip olan bakteriyel ve kimyasal olarak indüklenen sistitli farelerde, film boyunca çok hızlı hareket ederse işeme olayları kaçırılabilir.
  5. Her boşluğun oluştuğu zamanı kaydedin. Bir kural olarak, boşluğun zamanı, idrarın tespit edildiğine dair ilk işarette kaydedilir (Şekil 6A,B).
  6. Boşluğun ölçümlerini yapmak için, önce idrar noktasının maksimum difüzyonunun meydana geldiği zaman noktasını arayarak zaman içinde ileri (veya geri) hareket etmek için kaydırma çubuğunu kullanın. Bu noktada filmi duraklatın ve adım 4.3.3'te açıklandığı gibi bir ekran görüntüsü alın. Bilgisayar fare okunu analiz altındaki noktaya yerleştirin, böylece ilgilenilen nokta ekran görüntüsünde işaretlenir (Şekil 6C, D).
  7. Filmdeki görünüm sırasını hesaba katmak için ekran görüntüsü dosyasını bağıntılı sayılar kullanarak adlandırın.
  8. Filmdeki her boşluk noktası için 5.5 ve 5.7 adımlarını tekrarlayarak dosyayı analiz etmeye devam edin. Tüm boşluk noktaları analiz edildikten sonra, bir ekran görüntüsü yakalayarak ve 4.3.6'da açıklanan adımları kullanarak filtre kağıdının toplam alanını ölçün.
  9. Adım 4.3.9'da açıklandığı gibi idrar lekelerinin her birinin % alanını hesaplayın. Adım 4'te oluşturulan kalibrasyon eğrilerini ve grafik yazılımındaki interpolat işlevini kullanarak her boşluk noktası için % alan değerlerini idrar hacmine (μL) dönüştürün.
    1. Grafik yazılımında, kalibrasyon eğrisinin verilerini içeren XY tablosunu açın ve kalibrasyon eğrisinin son değerinin altındaki Y sütununa % alan değerlerini ekleyin (Şekil 7A).
    2. Sonuç Tablosu sekmesine tıklayın ve model sekmesinin altında, Standart Eğri'den Bilinmeyenleri Enterpolat seçmek için tıklayın ve Tamam'a basın. Sonuç tablosu sekmesinin yanında enterpolasyonlu X ortalama değerleri adlı bir sekme görünür. Bu sekme, her boşluk noktası için μL cinsinden idrar hacmine karşılık gelen enterpolasyonlu değerleri içeren bir tablo içerir. (Şekil 7A,B).
  10. Tüm deneysel fareleri analiz etmek için 5.1 ile 5.9 arasındaki adımları tekrarlayın.
  11. Fare başına bir elektronik tablo kullanarak 5.5 ile 5.10 arasındaki adımlardan elde edilen verileri içeren bir çalışma kitabı dosyası oluşturun (Şekil 7C). Işık fazı deneyleri için bir dosya ve karanlık faz deneyleri için başka bir dosya oluşturun. Bu ana dosyalar, daha sonraki analizlerde kullanılan tüm ham verileri ve gerekli hesaplamaları içerir.

6. Deneysel farelerin idrara çıkma paterninin analizi

  1. Birincil ve ikincil boşluk nokta profilleri oluşturun (Şekil 8A,B ve Şekil 9).
    NOT: Frekans dağılımı çalışmaları 23'e göre, ≥20 μL olan boşluk noktaları tipik olarak toplam boşalan hacmin% >95'ini temsil eder ve birincil boşluk noktaları (PVS'ler) olarak kabul edilir8,23,35. ≤20 μL olan boşluk lekeleri ikincil veya küçük boşluk noktaları (SVS'ler) olarak kabul edilir. PVS'ler ve SVS'ler arasındaki ayrımın işeme fenotiplerini karakterize etmek için yararlı bir yaklaşım olduğu gösterilmiştir. Yüksek sayıda SVS, işeme disfonksiyonuna işareteder 35.
    1. İlgilenilen işeme noktası verilerini (açık faz veya karanlık faz) içeren ana dosyadan, noktaları hacimlerine göre hacimleri ≥20 μL olduğunda PVS'ler veya hacimleri <20 μL olduğunda SVS'ler olarak sınıflandırın.
    2. Sayıyı sayın ve PVS'ler için ortalama geçersiz hacmi ve toplam hacmi hesaplayın.
    3. Hesaplanan parametrelerin her biri için kontrolü işlenen farelerle karşılaştıran bir grafik çubuğu oluşturun: PVS sayısı, PVS'lerin boşalan hacmi, PVS'lerin toplam hacmi, SVS sayısı, SVS'lerin toplam hacmi.
  2. İsteğe bağlı: Zaman içinde işeme davranışını göstermek için kümülatif bir işeme hacmi grafiği (merdiven işlevi) oluşturun (Şekil 10 ve Şekil 11).
    1. Çalışma kitabı ana dosyasını açın ve saat, dakika ve saniye cinsinden ifade edilen işeme zamanını ondalık forma dönüştürün. Her zaman noktası için kümülatif idrar hacmini (μL cinsinden) hesaplayın.
    2. Grafik yazılımında, X sütununda ondalık biçimde zaman ve Y sütununda kümülatif idrar hacimleri olan bir XY tablosu oluşturun. Zaman ve idrar hacmi verilerini tabloya kopyalayın. (0; 0) ve (6; maksimum değer) veri noktaları ekleyin. Bu noktalar, boşa çıkarılan hacim sıfır (0; 0) olduğunda deneyin başlangıcında (zaman: 0 saat) ve deneyin sonunda (zaman: 6 saat) işemiş idrarın kümülatif değeri son işeme olayı için elde edilen değere eşit olduğunda (6; maksimum değer) grafiğin yatay çizgilerini tamamlamak için gereklidir.
    3. Grafiğe çift tıklayın; Grafiği Biçimlendir penceresi görünmelidir. Görünüm sekmesini seçin, Sembolleri Göster düğmesinin seçimini kaldırmak için tıklatın ve Bağlantı Çizgisini/Eğrisini Göster'i seçmek için tıklatın. Stil seçeneğine tıklayın ve Hayatta Kalma'yı seçin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ürotelyal Piezo1/2 nakavt farelerin işeme davranışı

Miktüritasyon döngüsünün depolama aşamasında, ürotelyumun mesanede biriken idrarın uyguladığı gerginliği algılamak ve bu mekanik uyaranı serozal ATP salınımı 1,3 gibi hücresel yanıtlara dönüştürmek için hipotez vardır. Daha önce mekanik olarak aktive edilen PIEZO1 ve PIEZO2 kanallarının fare urothelium 3,36'da ifade edildiğini göstermiştik. Ürotelyal PIEZO kanallarının normal işeme davranışı için önemli olup olmadığını belirlemek için, ürotelyal koşullu Piezo1/2 çift nakavt fareleri (Pz1/2-KO) fareler ve yaş ve cinsiyet uyumlu kontroller (Pz1/2-C; Şekil 9). Günün karanlık ve aydınlık aşamalarında hem dişi hem de erkek fareleri 6 saat boyunca test ettik ve verileri adım 6.1'de açıklandığı gibi analiz ettik. Kontrol grupları için günün aydınlık ve karanlık fazları arasındaki işeme aktivitesini karşılaştırdığımızda, hem kadınların hem de erkeklerin aktif dönemlerinde PVS'lerin sayısında ve toplam hacminde bir artış sergiledikleri fark edildi. Bu gözlem, farelerin yabancı bir ortamda olmasına rağmen, fare işeme davranışının sirkadiyen doğasının (aktif karanlık fazlarında en yüksek) korunduğunu göstermektedir. Aktif olmayan ışık fazları sırasında, dişi veya erkek Pz1/2-KO fareleri için analiz edilen parametrelerin hiçbirinde, kontrol muadillerine (Pz1/2-C) kıyasla anlamlı bir farklılık gözlemlemedik. Bununla birlikte, hayvanları aktif karanlık faz sırasında test ettiğimizde, hem dişi hem de erkek Pz1/2-KO fareleri, SVS'lerin sayısında ve toplam hacminde önemli bir artış ile karakterize edilen değişmiş bir işeme fenotipi göstermiştir (Şekil 9). PVS sayısında, PVS başına ortalama hacimde veya kadın veya erkek Pz1/2-KO'da toplam PVS hacminde karşılık gelen kontrollere kıyasla anlamlı bir fark yoktu. Bu sonuçlar, ürotelyal PIEZO1/2 kanallarının farenin aktif olmayan ışık fazı sırasında işeme fonksiyonunda önemli bir rol oynamadığını, ancak aktif karanlık fazlarında sık sık lekelenmeyi önlemede önemli olduğunu göstermektedir.

Şekil 9'da sunulan sonuçlar, RT-VSA'nın uç nokta VSA'ya kıyasla kullanılmasının iki avantajını göstermektedir. İlk olarak, analiz sadece ışık fazı sırasında yapılsaydı, ürotelyal PIEZO1/2 kanallarının işeme fonksiyonunda hiçbir rolü olmadığı sonucuna varırdık. İkincisi, son nokta VSA çalışmalarının çoğunda, SVS'ler deneysel gürültü olarak ele alınmış ve bazı durumlarda sonraki analizlerden hariç tutulmuştur23. RT-VSA'da, SVS'lerin PVS'lere ikincil değil (taşıma veya son micturition dribling) bireysel olaylar olduğunu ve hayvanların kafesin çevresine taşınması, boşaltılması ve sonra ayrılması anlamında gönüllü olduklarını belirleyebildik. Bu gözlem bize Pz1/2-KO farelerin fenotipi hakkında, aksi takdirde gözden kaçırılacak olan değerli bilgiler sağladı.

Dişi farelerin bazal koşullar altında ve siklofosfamid tedavisini takiben işeme davranışı

Bu pilot deneyde, siklofosfamidin (CYP) fare gönüllü işeme davranışı üzerindeki etkilerini test ettik. Bazı kanser türlerini veya immünolojik bozuklukları tedavi etmek için kullanılan bir ilaç olan siklofosfamidin, hastalarda ve deney hayvanlarında sistite neden olduğu bilinmektedir, bu da çoklu, küçük işeme olayları ile karakterize aşırı aktif bir mesane fenotipine neden olur 26,37,38. Temel işeme davranışını belirlemek için, karanlık fazda RT-VSA'ya tedavi edilmemiş bir dişi fare yerleştirdik. Aynı fareye akut sistiti neden olmak için 5 gün sonra bir doz CYP (150 mg / kg) ile intraperitoneal olarak enjekte edildi. Enjeksiyondan hemen sonra, fare kayıt için bir RT-VSA kafesine yerleştirildi. İşeme davranışı, boşalan idrar hacmini temsil eden dikey çizgiler ve zamanı temsil eden yatay çizgiler ile bir adım grafiğinde (Şekil 11) temsil edilir. Bazal koşullar altında elde edilen sonuçlarla karşılaştırıldığında, CYP tedavisinden sonra boşluk başına salınan idrar miktarının daha az olduğu ve miktürasyon olaylarının çok daha sık olduğu açıktır. Bu, analiz edilen dönemin ilk 30 dakikasının (gece yarısından 00:30'a [enjeksiyondan sonra 7,0 ila 7,5 saat sonrası]) büyütüldüğü grafiğin girişinde daha iyi anlaşılabilir.

Figure 1
Resim 1: RT-VSA kayıt odası. (A) RT-VSA kayıt sistemi, yan yana, şeffaf, akrilik iki bölmeden ve ilgili üst kameralardan oluşan bir üst kısım içerir. Cihazın alt yarısı, üst fare bölmelerini tutan ve alt kameraları ve UV ışıklarını içeren tek bir ünite standıdır. Standın duvarlarının içi, kafeslerin dibine eşit aydınlatma sağlamak için UV ışığını yansıtan ayna panellerinden yapılmıştır. Tasvir edilmeyen, kameralardan bir video beslemesi alan ve verileri kaydeden bir bilgisayardır. (B) Fare odasının bileşenleri ve boyutları ile modeli. 1) standart kaldırma menteşesi; 2) kamera montaj braketi; ve 3) lite geçiş köşe braketi. UV standının ön (C) ve üst (D) görünümleri, bileşenleri ve boyutları ile. UV ışıkları ön ve arka profillerin iç kısmına düz düz plakalarla monte edilir. Kameraları monte etmek için iki lite geçiş köşe braketi ile stand ana çerçevesine sabitlenmiş bir 32 inç profil kullanılır. Kameraları 32 in profiline bağlamak için düz düz plakalar kullanılır. Standın iç kısmına aynalı bir panel monte edilmiştir (gösterilmemiştir). 1) beş delikli tişört düz plaka; 2) beş delikli T düz plaka; ve 3) beş delikli L düz plakalar. Sunulan tüm değerler inç cinsindendir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Resim 2: RT-VSA fare bölmesi. Deneysel prosedürlerden önce, her deneysel fare odası bir parça filtre kağıdı (1 numaralı) ile kaplanarak hazırlanır. Deneyin yapıldığı günün periyoduna bağlı olarak, kullanılan filtre kağıdı kalın (koyu faz) veya ince (ışık fazı) olur. Odanın ortasına plastik bir kubbe (2 numaralı), su ile plastik bir tabak (ıslanmayan su jeli şeklinde) ve kubbenin bir tarafına (3 numaralı) chow yerleştirilir ve karşı tarafa (4 numaralı) bir zenginleştirme şekli olan plastik 1.5 mL mikro santrifüj tüpü yerleştirilir. Kafes içindeki elemanların ilk düzenlemesi tüm deneylerde tutarlı tutulur. İki komşu kafes arasına bir parça filtre kağıdı yerleştirildiğine ve şekilde yıldız işareti ile işaretlendiğine dikkat edin. Bu, komşu fareden kaynaklanan görsel ipuçlarının etkisini önlemek içindir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Kalibrasyon eğrisi. Bilinen miktarlarda fare idrarı ile lekelenmiş kalın (A, sol paneller) ve ince (B, sol panel) filtre kağıtlarının temsili görüntüleri. Görüntüler, üst (A, sol paneller) veya alt (B, sol panel) kameralar kullanılarak elde edilen video kayıtlarından elde edilen ekran görüntüleridir. Kırmızı oklar 2 μL idrar lekelerine işaret eder ve lekelerin altındaki sayılar μL cinsinden spot hacim değerleridir. İdrar lekelenmesinden kısa bir süre sonra (5 dakika) görülebilen A panelinin üst görüntüsündeki küçük idrar lekelerinin (<50 μL) 30 dakika sonra (alt panel) artık fark edilmediğine dikkat edin. Sağ paneller: İdrar hacminin bir fonksiyonu olarak boş nokta alanının grafiği (toplam filtre kağıdı alanının yüzdesi olarak ifade edilir). Diğerleri tarafından belirtildiği gibi, idrar hacminin bir fonksiyonu olarak boşluk nokta alanının verileri doğrusal bir ilişki izlemez30. Böylece, doğrusal olmayan regresyon kullanarak verileri ikinci dereceden bir polinoma sığdırıyoruz. Veriler, X = 0 ila Y = 0 olacak şekilde sınırlandırılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: ImageJ kullanılarak filtre kağıdı ve idrar lekesi alanlarının belirlenmesi. (A) Şekil 3A'da gösterilen kalibrasyon eğrisinin ekran görüntüsü ImageJ'de açıldı. (A)'daki kutulu bölge (B)'de daha ayrıntılı olarak gösterilir. (B) Çokgen seçimleri simgesi, filtre kağıdının çevresi boyunca bir çokgen çizmek için seçilir (kırmızı daire içine alınır) (kısmi görünüm; seçimler aracı tarafından oluşturulan düğümlere işaret eden kırmızı oklu sarı çizgi). (C) Poligonun alanı, filtre kağıdının toplam alanını yansıtır ve Analiz > Ölçü (kırmızı daire) seçilerek ölçülür. (D) Alanın değeri (piksel cinsinden) sonuçlar penceresinde (kırmızı daire) görünür. (E) Tek bir boşluk noktasının alanını ölçmek için, serbest el seçimleri aracı seçilir (kırmızı daire) ve (F) içinde noktanın sınırına bir çizgi çizmek için kullanılır (kırmızı ok noktaya işaret eder). (C)'deki komutun aynısı kullanılarak, boşluk noktasının alanı ölçülür ve sonuç, sonuçlar penceresinde, alınan son ölçümün hemen altında (panel G, kırmızı daire) yeni bir değer olarak görünür. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: RT-VSA deneylerini bitirdikten sonra filtre kağıdı durumunun değerlendirilmesi. RT-VSA deneyi sırasında veya sonrasında filtre kağıdının farklı koşullarını gösteren fare odasının temsili görüntüleri. Test süresinin sonuna kadar bozulmadan kalan filtre kağıdı (A) bendinde gösterilir ve en yaygın durumu ve bir deneyin daha fazla analiz edilebileceği durumu temsil eder (yeşil onay işareti). Hasarlı filtre kağıdı örnekleri (B) ve (C) bölümlerinde gösterilmiştir ve daha fazla analiz edilmemesi gereken deneyleri (kırmızı X) temsil etmektedir. (B)'de, filtre kağıdı köşelerden birinde fare (kırmızı ok) tarafından parçalanmıştır. Kesikli sarı çizgi, kafesin zemininin sınırını işaretler. Kutulu bölge sağdaki resimde büyütülmüştür. (C)'de, ıslanmayan su jelinin (kırmızı ok) fare tarafından köşeye taşınması ve üç büyük su lekesi (kırmızı yıldız işareti) bırakılması sonucu deneyin bütünlüğü tehlikeye girmiştir. Bu hareketler video izlenerek doğrulandı. Görüntüler, karanlık aşamada, üst kamera kullanılarak ve kafes kalın filtre kağıdıyla kaplı olarak elde edilen film dosyalarından alınan ekran görüntüleridir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6: İşeme zamanının belirlenmesi ve boşluk nokta alanı ölçümleri için ekran görüntülerinin alınması. (A,B) Odasının bir köşesinde, yeni görünür hale gelen boş bir noktaya sahip bir farenin ekran görüntüsü. Bu çerçevenin zamanı, işeme zamanı olarak açıklanır. (C,D) Boşluk noktası maksimum difüzyona ulaştığında, boşluğun hacmini belirlemek için bir ekran görüntüsü alınır. Görüntüler, üst kamerayla, kalın filtre kağıdı kullanılarak ve karanlık aşamada elde edilen film dosyalarından alınan ekran görüntüleridir. Analiz süresi gece yarısından sabah 06:00'ya kadardı. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 7
Şekil 7: Boş nokta alanının idrar hacmine dönüşümü ve deneysel ham verilerle bir çalışma sayfası dosyasının oluşturulması. (A) Toplam filtre kağıdı alanının yüzdesi olarak ifade edilen boşluk noktalarının değerlerini gösteren grafik yazılımı penceresinin ekran görüntüsü (yeşil renkle özetlenen veriler). Çalışma sayfası (yeşil ok) veri tabloları bölümünün altına kaydedilir. (B) Toplam alanın yüzdesinin idrar hacmine dönüştürülmesi (kırmızı ile özetlenen veriler). İkinci değerler sonuçlar bölümünde (kırmızı ok) gösterilir ve standart eğri fonksiyonundan interpolat bilinmeyenler kullanılarak kalibrasyon eğrisinden hesaplanır. (C) Derlenmiş ham ve hesaplanmış veriler içeren bir çalışma sayfasının ekran görüntüsü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 8
Şekil 8: Boşluk noktalarının PVS'ler ve SVS'ler halinde sınıflandırılması ve analizi. Bazal koşullar altında (A) bir fareden çalışma sayfalarının ekran görüntüleri (Şekil 7C'de gösterildiği gibi oluşturulmuştur) ve bir doz siklofosfamid (150 mg / kg) (B) aldıktan sonra 7 saat. Boşluk noktaları, hacim ≥20 μL ise birincil boşluk noktaları (PVS'ler) veya hacim <20 μL ise küçük boşluk noktaları (SVS'ler) olarak sınıflandırılır. tedavi edilmemiş farede (A), tüm işeme olaylarının PVS'ler olduğunu, siklofosfamid ile muamele edilen hayvanda ise çoğu boşluğun SVS'ler olduğunu unutmayın. Her paneldeki daire içine alınmış tablo (kırmızı anahat), aşağıdaki özet istatistikleri içerir: boşluk sayısı, ortalama geçersiz kılınan hacim ve toplam geçersiz kılınan hacim. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 9
Şekil 9: Piezo1/2 nakavt ve kontrol farelerinin işeme davranışı. Dişi (A) ve erkek (B) Piezo1/2 nakavt (Pz1/2-KO) farelerin ve kontrol meslektaşlarının (Pz1/2-C) işeme davranışı, günün karanlık veya aydınlık fazında 6 saatlik bir zaman penceresinde kaydedildi ve sonuçlar adım 6.1'de açıklandığı gibi analiz edildi. Veriler ortalamanın ± standart ortalama hatası (S.E.M.) olarak gösterilir. Veriler bir Mann-Whitney testi kullanılarak karşılaştırıldı. Kısaltmalar: PVS'ler = birincil boşluk noktaları; SVS'ler = küçük boşluk noktaları; NS = anlamlı değil; * p < 0.05; ** p < 0.01. Bu rakam3'ten değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 10
Şekil 10: Zamanın bir fonksiyonu olarak kümülatif geçersiz kılınan hacmin hesaplanması ve grafiksel gösterimi için çalışma sayfaları. (A) Şekil 7C'de oluşturulan çalışma sayfasının ekran görüntüsü, zamanın bir fonksiyonu olarak boşalan kümülatif idrar hacminin bir merdiven fonksiyonu grafiğini oluşturmak için gereken hesaplamaları gösterir. Zaman ondalık biçimde girilmelidir (G sütunu, kırmızı kare). Zamanı ondalık biçime dönüştürmek için, saat (D sütunu), dakika (E sütunu) ve saniye (F sütunu) değerlerine ve zamanın nihai sonucunu ondalık biçimde (G sütunu) ayrı ayrı açıklamak üzere işeme zamanı sütununun sağına üç sütun (kırmızı oklar) eklenmiştir. Zaman boşluğunu ondalık biçime dönüştürmek için şu işlevi kullanın: (h) + (min/60) + (s/3.600). İdrar hacmi sütununun sağına, yeni bir işeme olayına kadar elde edilen tüm idrar hacimlerinin (yeni olay değeri dahil) toplamı olarak hesaplanan kümülatif idrar hacmini (mavi dikdörtgen) görüntülemek için bir sütun eklenmiştir. (B) A panelindeki çalışma sayfasından kopyalanan ve bir grafik yazılımı projesinde X sütununa (ondalık biçimde zaman) ve Y sütununa (kümülatif idrar hacimleri) yapıştırılan verileri gösteren ekran görüntüsü. Grafiğin ilk ve son zaman noktaları, kırmızı oklarla gösterildiği gibi 0 ve 6 (maksimum değer) satırlarına ayarlanır. (C) Bir adım grafiği oluşturmak için grafik, sembolleri göster alanının seçimi kaldırılarak, bağlantı çizgisini/eğrisini göster seçeneği etkinleştirilerek ve kırmızıyla çevrili alanlarda gösterildiği gibi hayatta kalma stili seçilerek biçimlendirilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 11
Şekil 11: Bazal koşullar altında veya siklofosfamid uygulamasından sonra fare işeme davranışının temsili sonuçları. Bir farenin gönüllü işeme davranışı, Temsili Sonuçlarda açıklandığı gibi, siklofosfamid (CYP) uygulamasından önceki (bazal) ve 7 saat sonraki karanlık fazda RT-VSA tarafından değerlendirilmiştir. İşeme olaylarının zamanı ve hacmi, adım 6.2'de açıklandığı gibi oluşturulan bir adım grafiğinde temsil edilir. Grafiğin iç kısmı, yeşil bir dikdörtgenle işaretlenmiş grafiğin alanını temsil eder ve analiz edilen dönemin ilk 30 dakikasına karşılık gelir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 12
Şekil 12: RT-VSA ile örtüşen idrar lekelerinin tanımlanması. RT-VSA deneyinin karanlık aşamasında üst kamerayla çekilen video karelerinin ekran görüntüleri (resim 1 ve 2). Resim 2'deki kutulu bölge resim 3'te büyütülmüştür. Fare, sonraki birkaç saat içinde aynı sağ üst köşede iki kez daha boşaldı (resim 4-6). Boşluk noktalarının üst üste binmesine rağmen, bireysel işeme olayları RT-VSA kullanılarak kolayca tespit edildi. Bu olayların bir bitiş noktası testi olarak nasıl görüneceğini görselleştirmek için, filtre kağıdının köşesini farklı aydınlatma koşullarına maruz bıraktık. Görünür, ortam ışığı altında, yalnızca tek, büyük bir boşluk noktası tespit edilebildi (resim 7). Aynı şekilde, aynı bölge UV ışığı altında incelendiğinde, sadece tek bir karanlık nokta ayırt edilebilir (resim 8). Böylece, aynı bölgedeki birden fazla boşluk RT-VSA tarafından kolayca tespit edilir, ancak analiz bir son nokta testi olarak gerçekleştirilirse böyle bir ayrım mümkün değildir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Video izlemenin dahil edilmesi, klasik VSA'ya göre çeşitli avantajlar sunan uygun maliyetli bir değişikliktir. Tipik olarak bir son nokta testi olarak kullanılan klasik VSA'da, örtüşen boşluk noktalarını ayırt etmek zordur. Bu önemsiz bir endişe değildir, çünkü fareler, tahlil birkaç saat uzatıldığında, tipik olarak kafeslerinin köşelerinde, aynı bölgede birden çok kez idrara çıkma eğilimindedir. Bu nedenle, RT-VSA'nın ilk avantajı, araştırmacının kısmen veya tamamen birbirinin üzerine birikmiş bireysel noktaları kolayca tanımlayabilmesidir. Bu, Şekil 12'de gösterilen deneyde iyi bir şekilde gösterilmiştir. Bu durumda, video kaydı, farenin aynı köşede üç kez boşaldığını ve üst üste binen boşluk noktalarını biriktirdiğini doğrular. Filtre kağıdı yalnızca deneyin sonunda, tipik bir VSA'nın olduğu şekilde analiz edildiyse, yalnızca bir nokta ayırt edilebilir. Bu nedenle, klasik, uç nokta VSA, işeme davranışındaki büyük farklılıkları tanımlamada yararlı olabilirken, daha ince fenotipler arasında ayrım yapmakta başarısız olabilir. Genetikteki mevcut gelişmeler ve transgenik hayvanların oluşumu ile birlikte, işeme davranışını doğru bir şekilde değerlendirebilecek yöntemlerin geliştirilmesi esastır.

İkincisi, RT-VSA, araştırmacıya işeme olayları hakkında zamansal bilgi sağlar. Böylece, kişi gerçek işeme frekanslarını belirleyebilir ve işeme olayları arasında ilişkiler kurabilir. Örneğin, klasik VSA'da, tek bir büyük PVS'nin yanında bir SVS kümesinin gözlendiği bir durumda, farenin deney sırasında birkaç kez boşalıp işemediği (üç küçük ve bir büyük boşlukla) veya hayvanın bir büyük idrar hacmi biriktirip biriktirmediği ve üç küçük noktanın miktürasyon sonrası damlama veya kürkten taşınmasının bir sonucu olup olmadığı kolayca ayırt edilemez. RT-VSA bu soruları ele almak için kullanılabilir.

Üçüncüsü, RT-VSA, bir farenin işeme olayından önce, sırasında ve sonrasında davranışını analiz etmesine izin verir. Araştırmacı ayrıca, RT-VSA kayıtlarını Fare Davranış İzleyici39 gibi ücretsiz olarak kullanılabilen yazılımlarla analiz ederek farenin genel etkinlik profilini izleyebilir. Ek olarak, bir hayvanın idrara çıkmak için durup durmadığı (dişilerin tipik davranışı), hayvanın işeme sırasında hareket halinde olup olmadığı (erkeklerde boşluk noktalarının izlenmesine neden olabilir) veya uyku / dinlenme aşamasında boşalıp almadığı ayırt edilebilir. Normalde nadir olmasına rağmen, ikinci davranışı gözlemledik. Bu nedenle, uygun şekilde doğrulanır ve yorumlanırsa, işeme davranışını gözlemlemek, araştırmacıya, örneğin noktüri veya inkontinans da dahil olmak üzere işeme disfonksiyonu hakkında değerli bilgiler sağlayabilir. RT-VSA (ve VSA), araştırmacıların köşelerin aksine bir kafesin merkezi alanında meydana gelen boşluk olaylarının fraksiyonunu belirlemelerini sağlar. Normalde, merkez işeme nadirdir ve bu tür olayların sayısının artması mesane disfonksiyonunun bir işaretidir 8,22. Bunun tek istisnası, sık sık ve muhafazalarının tamamı boyunca idrara çıkan baskın alfa-erkeklerdir20. RT-VSA'yı kullanarak merkezi işeme analizi yapmak için, yiyecek kabını bir yan duvara taşımayı ve kubbeyi çıkarmayı (veya kafesin belirli bir bölgesine sabitlemeyi) düşünmelisiniz, böylece uzamsal idrara çıkma kalıpları daha kolay kurulabilir.

Dördüncüsü, RT-VSA, klasik VSA'ya kıyasla kafes değişimi ile ilişkili gerilimleri daha etkili bir şekilde yönetmeyi sağlar. Fareler doğası gereği ürkektir ve onları ele almak veya yeni bir ortama aktarmak, işeme davranışını etkilediği bilinen strese neden olur35. Doğası gereği, standart VSA'ya bir iklimlendirme dönemi dahil etmek zordur. Buna karşılık, RT-VSA'da, her deneye bir iklimlendirme periyodu kolayca dahil edilebilir ve bu süre zarfında herhangi bir işeme olayı analiz sırasında göz ardı edilir. Bu protokolde uygulanan RT-VSA'nın ek bir stres giderici yönü, farelerin normalde barındırıldığı koşulların çoğaltılmasıdır (yani, yiyecek ve suya ad libitum, bir kubbe ve bir oyuncağa erişim). Bu, bildiğimiz kadarıyla, bu tür deneyler için açıklanan en zengin ortamlardan biridir. Tipik bir VSA uç noktasında, fareler ad libitum sağladığımız sudan (ve bazen de yiyeceklerden)8,22 mahrum bırakılır.

Beşincisi, bu zenginleştirilmiş ortamın farelerin stres seviyeleri üzerindeki olumlu etkisine ek olarak, araştırmacının RT-VSA'yı uzun sürelerce, tipik olarak 6 saatlik zaman aralıklarında gerçekleştirmesine izin verir; Ancak, daha yakın zamanda 24 saat boyunca çalışan deneyler yapıyoruz (veriler gösterilmemiştir). Bu, sirkadiyen ritmisitenin etkilerini değerlendirirken veya az aktif bir mesane fenotipi sergileyebilecek ve bu nedenle nadiren idrara çıkabilecek fareleri incelerken idealdir.

24 saat video izleme için, ince filtre kağıdı kullanmanızı ve alt kameraları kullanarak deneyleri analiz etmenizi öneririz. Kağıt ve kamera türünün bu kombinasyonu, karanlık ve aydınlık fazlarda algılama hassasiyetine izin veren en iyi seçenektir. Daha önce de belirtildiği gibi, alt kameralar kalın filtre kağıdındaki boşluk noktalarını kolayca algılayamaz ve üst kameralar ışık fazı sırasında boşluk noktalarını güvenilir bir şekilde algılamaz. Bu genişletilmiş analizleri yapıyorsanız, hayvanları saat 17:00'de kayıt kafeslerine yerleştirmenizi, 1. gün saat 18:00'den itibaren analiz etmenizi ve ertesi gün saat 18:00'de deneyi tamamlamanızı öneririz.

RT-VSA'nın birçok olumlu yönü olsa da, dikkat edilmesi gereken bazı uyarılar var. Bu analizleri yaparken stresi sınırlamak için her türlü girişimi yapsak da, hayvanlar normalde grup halinde barındırıldığı için farenin yaşam alanını tamamen kopyalayamayız. Ayrıca ıslanmayan su jelinden su almak yerine bir şişeden su içerler. Bununla birlikte, farelerin aktif olmayan ışık fazları sırasında aktif karanlık fazlarına karşı daha az boşluğa sahip oldukları gözlemimiz, farelerin normal sirkadiyen işeme davranışı kalıplarını koruduğunu göstermektedir40. Kolayca strese giren doğalarını yansıtarak, farelerin kafes temizliği günlerinde bozulmuş işeme davranışı sergilediklerini bulduk. Bu nedenle, analiz, hayvanların rutin hayvancılıktan daha az etkileneceği zaman dilimleriyle sınırlandırılmalıdır. Dikkate alınması gereken önemli bir faktör, UV ışığının işeme fonksiyonu üzerinde herhangi bir etkisi olup olmadığıdır. Bulgularımız, benzer bir fenomeni ortadan kaldıran ancak UV ışığı40 kullanmayan diğer tekniklerle tutarlı olan açık ve karanlık fazlar arasındaki VSA parametrelerinde belirgin bir sirkadiyen fark gösterdiğinden, UV ışığı aydınlatmasının işeme fonksiyonunu etkilemediği sonucuna varıyoruz. Filtre kağıdının ışığın alt odadan üst bölmeye geçmesini engellediğine dikkat edin.

Ek bir uyarı, fareleri odada ne kadar uzun süre tutarsa, filtre kağıdını çiğneme veya zarar verme olasılıklarının o kadar yüksek olmasıdır (kağıdın kalınlığından bağımsız olarak). Hayvanların hiçbiri ışık fazı sırasında kağıdı bozmazken, farelerin neredeyse% 30'u karanlık aktif faz sırasında kağıda zarar verdi. 24 saatlik deneylerin analizinde, deneylerin benzer bir oranının (üçte birinin) kağıt hasarı nedeniyle analiz edilemediğini, yani sadece zaman miktarının değil, aynı zamanda günün fazının da hayvanın parçalama davranışını etkilediğini gözlemledik. Ne yazık ki, deneyimlerimize göre, kafesin kağıdını bozan bir hayvanın yeniden test edildiğinde bile bunu yapmaya devam edeceğini fark ettik. Yukarıda belirtildiği gibi, fareler bazen çıplak akrilik zemine idrar yaparlar ve bu nedenle kağıdın kaybı analizi eksik ve sınırlı bir değere sahip hale getirir.

Ayrıca, erkek işeme davranışının analizi, daha sık işeme eğiliminde olduklarından, işemeden sonra damlayabildikleri için daha zor olabilir ve daha önceki bir yayında tartışıldığı gibi, kafes boyunca dağılmış çok sayıda küçük boşluk ile karakterize edilen daha agresif bir alfa-erkek fenotipine sahip bir erkek popülasyonu (% 20) vardır3. Bu alfa-erkek davranışı, işeme fenotiplerinin oluşturulması için kafa karıştırıcı bir faktör oluşturabileceğinden, ≥50 (ışık fazı deneyleri) veya ≥100 (karanlık faz deneyleri) boşlukları olan hayvanları analizden hariç tutuyoruz.

Boşlukların hacimlerine göre ayırt edilmesinin (yani, PVS vs SVS) mutlaka garanti edilmediği durumlar vardır. Örneğin, deneyimlerimize göre, bakteriyel veya kimyasal sistitli fareler, kontrol 4,34'ten daha küçük hacimleri geçersiz kılma eğilimindedir. Bununla birlikte, bireysel fareler arasındaki boşluklu hacimde büyük farklılıklar vardır; bazılarında, çoğu boşluk ≤20 μL'lik bir hacme sahipken, diğerlerinde çoğunluk >20 μL'dir. Sonuç olarak, boşalan hacmin ayırt edilmesi, bu fenotiplerin karakterizasyonu için herhangi bir avantaj sağlamaz.

Özetle, RT-VSA, serbestçe taşınabilen farelerde fare işeme davranışını analiz etmek için uygulanması kolay bir araçtır. Sistometri gibi aletlerin aksine, bir kateterin cerrahi implantasyonunu veya mesane dolgusunun fizyolojik olmayan oranlarını gerektirmez. Her iki fare cinsiyetinde, uzun süreler boyunca ve gün döngüsünün aydınlık ve karanlık evrelerinde işeme davranışının belirlenmesine izin verir. Ayrıca, özellikle metabolik kafesler gibi daha özel ve pahalı cihazlarla karşılaştırıldığında nispeten uygun maliyetlidir. Bu araçla ilgili uyarılar olsa da, genellikle yönetilmesi kolaydır. Son olarak, bu teknik diğer kemirgenler de dahil olmak üzere diğer hayvan türlerine kolayca uyarlanabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Acknowledgments

Bu çalışma, bir NIH hibe R01DK119183 (G.A. ve MDC'ye), P30DK079307 aracılığıyla bir pilot proje ödülü (M.G.D.'ye), bir Amerikan Üroloji Derneği Kariyer Geliştirme ödülü ve bir Winters Vakfı hibesi (N.M.'ye) ve Pittsburgh Böbrek Araştırmaları Merkezi'nin (P30DK079307) Hücre Fizyolojisi ve Model Organizmalar Böbrek Görüntüleme Çekirdekleri tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots –  cut to 10 inches 80/20 1010 Amount: 20
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots –  cut to 12 inches 80/20 1010 Amount: 6
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots –  cut to 40 inches 80/20 1010 Amount: 4
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots – cut to 14.75 inches 80/20 1010 Amount: 12
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots – cut to 32 inches 80/20 1010 Amount: 5
1/4-20 Double Slide-in Economy T-Nut 80/20 3280 Amount: 16
1/4-20 Triple Slide-in Economy T-Nut 80/20 3287 Amount: 18
10 & 25 Series 2 Hole - 18mm Slotted Inside Corner Bracket with Dual Support 80/20 14061 Amount: 6
10 Series 3 Hole - Straight Flat Plate 80/20 4118 Amount: 8
10 Series 5 Hole - "L" Flat Plate 80/20 4081 Amount: 8
10 Series 5 Hole - "T" Flat Plate 80/20 4080 Amount: 8
10 Series 5 Hole - Tee Flat Plate 80/20 4140 Amount: 2
10 Series Standard Lift-Off Hinge - Right Hand Assembly 80/20 2064 Amount: 2
10 to 15 Series 2 Hole - Lite Transition Inside Corner Bracket 80/20 4509 Amount: 6
24”-long UV tube lights ADJ Products LLC T8-F20BLB24 Amount: 2
20W bulb – 24” Wavelength: 365nm
Acrylic Mirror Sheet Profesional Plastics Amount: 1
82.5 cm x 26.5 cm
Acrylic Mirror Sheet Profesional Plastics Amount: 2
26.5 cm X 30.5 cm
Acrylic Mirror Sheet Profesional Plastics Amount: 2
82.5 cm x 30.5 cm
AR polycarbonate (UV resistance) 80/20 65-2641 Amount: 2
4.5mm Thick, Clear, 38.5 cm x 26.5 cm
AR polycarbonate (UV resistance) 80/20 65-2641 Amount: 4
4.5mm Thick, Clear, 38.5 cm x 21.5 cm
AR polycarbonate (UV resistance) 80/20 65-2641 Amount: 4
4.5mm Thick, Clear, 26.5 cm x 21.5 cm
AR polycarbonate (UV resistance) 80/20 65-2641 Amount: 4
4.5mm Thick, Clear 37.5 cm x 23.9 cm
AR polycarbonate (UV resistance) 80/20 65-2641 Amount: 4
4.5mm Thick, Clear , 24.4 cm x 23.9 cm
Chromatography paper (thin paper)  Thermo Fisher Scientific 57144
Cosmos blotting paper (thick paper) Blick Art Materials 10422-1005
Excel Microsoft Corporation
GraphPad Prism GraphPad Software Version 9.4.0 graphing and statistics software
ImageJ FIJI NIH
Parafilm Merck transparent film
Quick Time Player 10.5 software  Apple multimedia player
Security spy Ben software video surveillance software system
Standard End Fastener, 1/4-20 80/20 3381 Amount: 80
UV transmitting acrylic Spartech Polycast Solacryl SUVT Amount: 2
38.5 cm x 26.5 cm 
Water gel: HydroGel ClearH2O   70-01-5022 (https://www.clearh2o.com/product/hydrogel/)
Webcam Logitech C930e Amount: 4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. The urothelium: life in a liquid environment. Physiological Reviews. 100 (4), 1621 (2020).
  2. de Groat, W. C., Griffiths, D., Yoshimura, N. Neural control of the lower urinary tract. Comprehensive Physiology. 5 (1), 327 (2015).
  3. Dalghi, M. G., et al. Functional roles for PIEZO1 and PIEZO2 in urothelial mechanotransduction and lower urinary tract interoception. JCI Insight. 6 (19), (2021).
  4. Montalbetti, N., et al. Bladder infection with uropathogenic Escherichia coli increases the excitability of afferent neurons. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 322 (1), 1 (2022).
  5. Montalbetti, N., et al. Increased urothelial paracellular transport promotes cystitis. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 309 (12), 1070 (2015).
  6. Montalbetti, N., et al. Urothelial tight junction barrier dysfunction sensitizes bladder afferents. eNeuro. 4 (3), (2017).
  7. Montalbetti, N., Stocker, S. D., Apodaca, G., Bastacky, S. I., Carattino, M. D. Urinary K+ promotes irritative voiding symptoms and pain in the face of urothelial barrier dysfunction. Scientific Reports. 9 (1), 5509 (2019).
  8. Kim, A. K., Hamadani, C., Zeidel, M. L., Hill, W. G. Urological complications of obesity and diabetes in males and females of three mouse models: temporal manifestations. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 318 (1), 160 (2020).
  9. Bartolone, S. N., et al. Micturition defects and altered bladder function in the klotho mutant mouse model of aging. American Journal of Clinical and Experimental Urology. 8 (3), (2020).
  10. de Rijk, M. M., et al. Aging-associated changes in oxidative stress negatively impacts the urinary bladder urothelium. International Neurourology Journal. 26 (2), 111 (2022).
  11. Coyne, K. S., et al. The prevalence of lower urinary tract symptoms (LUTS) and overactive bladder (OAB) by racial/ethnic group and age: results from OAB-POLL. Neurourology and Urodynamics. 32 (3), 230 (2013).
  12. Wittig, L., Carlson, K. V., Andrews, J. M., Crump, R. T., Baverstock, R. J. Diabetic bladder dysfunction: a review. Urology. 123, (2019).
  13. Irwin, D. E., et al. Population-based survey of urinary incontinence, overactive bladder, and other lower urinary tract symptoms in five countries: results of the EPIC study. European Urology. 50 (6), 1314 (2006).
  14. Bogart, L. M., Berry, S. H., Clemens, J. Q. Symptoms of interstitial cystitis, painful bladder syndrome and similar diseases in women: a systematic review. The Journal of Urology. 177 (2), 450 (2007).
  15. Foxman, B. Urinary tract infection syndromes: occurrence, recurrence, bacteriology, risk factors, and disease burden. Infectious Disease Clinics of North America. 28 (1), 1 (2014).
  16. Fall, M., Logadottir, Y., Peeker, R. Interstitial cystitis is bladder pain syndrome with Hunner's lesion. International Journal of Urology. 21, 79 (2014).
  17. Birder, L. A. Urinary bladder, cystitis and nerve/urothelial interactions. Autonomic Neuroscience: Basic & Clinical. 182, 89 (2014).
  18. Rosen, J. M., Klumpp, D. J. Mechanisms of pain from urinary tract infection. International Journal of Urology. 21 Suppl. 1, 26 (2014).
  19. Birder, L., et al. Neural control of the lower urinary tract: peripheral and spinal mechanisms. Neurourology and Urodynamics. 29 (1), 128 (2010).
  20. Desjardins, C., Maruniak, J. A., Bronson, F. H. Social rank in house mice: differentiation revealed by ultraviolet visualization of urinary marking patterns. Science. 182 (4115), 939 (1973).
  21. Sugino, Y., et al. Voided stain on paper method for analysis of mouse urination. Neurourology and Urodynamics. 27 (6), 548 (2008).
  22. Hill, W. G., Zeidel, M. L., Bjorling, D. E., Vezina, C. M. Void spot assay: recommendations on the use of a simple micturition assay for mice. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 315 (5), (2018).
  23. Rajandram, R., et al. Intact urothelial barrier function in a mouse model of ketamine-induced voiding dysfunction. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 310 (9), (2016).
  24. Ruetten, H., et al. A uropathogenic E. coli UTI89 model of prostatic inflammation and collagen accumulation for use in studying aberrant collagen production in the prostate. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 320 (1), 31 (2021).
  25. Wegner, K. A., et al. Void spot assay procedural optimization and software for rapid and objective quantification of rodent voiding function, including overlapping urine spots. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 315 (4), (2018).
  26. Wood, R., Eichel, L., Messing, E. M., Schwarz, E. Automated noninvasive measurement of cyclophosphamide-induced changes in murine voiding frequency and volume. The Journal of Urology. 165 (2), 653 (2001).
  27. Dmochowski, R. R. Bladder outlet obstruction: etiology and evaluation. Reviews in Urology. 7 (Suppl 6), S3–S13. , (2005).
  28. Aizawa, N., Homma, Y., Igawa, Y. Influence of high fat diet feeding for 20 weeks on lower urinary tract function in mice. Lower Urinary Tract Symptoms. 5 (2), 101 (2013).
  29. Wang, Z., et al. Void sorcerer: an open source, open access framework for mouse uroflowmetry. American Journal of Clinical and Experimental Urology. 7 (3), 170 (2019).
  30. Verstegen, A. M., Tish, M. M., Szczepanik, L. P., Zeidel, M. L., Geerling, J. C. Micturition video thermography in awake, behaving mice. Journal of Neuroscience Methods. 331, 108449 (2020).
  31. Keller, J. A., et al. Voluntary urination control by brainstem neurons that relax the urethral sphincter. Nature Neuroscience. 21 (9), (2018).
  32. Hou, X. H., et al. Central control circuit for context-dependent micturition. Cell. 167 (1), 73 (2016).
  33. Negoro, H., et al. Involvement of urinary bladder Connexin43 and the circadian clock in coordination of diurnal micturition rhythm. Nature Communication. 3, (2012).
  34. Montalbetti, N., Carattino, M. D. Acid-sensing ion channels modulate bladder nociception. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 321 (5), (2021).
  35. Chen, H., Zhang, L., Hill, W. G., Yu, W. Evaluating the voiding spot assay in mice: a simple method with complex environmental interactions. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 313 (6), (2017).
  36. Dalghi, M. G., et al. Expression and distribution of PIEZO1 in the mouse urinary tract. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 317 (2), 303 (2019).
  37. Birder, L., Andersson, K. E. Animal modelling of interstitial cystitis/bladder pain syndrome. International Neurourology Journal. 22, (2018).
  38. Okinami, T., et al. Altered detrusor gap junction communications induce storage symptoms in bladder inflammation: a mouse cyclophosphamide-induced model of cystitis. PLoS One. 9 (8), (2014).
  39. Tungtur, S. K., Nishimune, N., Radel, J., Nishimune, H. Mouse Behavior Tracker: An economical method for tracking behavior in home cages. Biotechniques. 63 (5), (2017).
  40. Negoro, H., Kanematsu, A., Yoshimura, K., Ogawa, O. Chronobiology of micturition: putative role of the circadian clock. The Journal of Urology. 190 (3), (2013).

Tags

Retraksiyon Sayı 192 Boşluk noktası tahlili İdrar kesesi işeme fonksiyonu miktüritasyon sistometri
Gerçek Zamanlı Boşluk Noktası Testi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dalghi, M. G., Montalbetti, N.,… More

Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Wheeler, T. B., Apodaca, G., Carattino, M. D. Real-Time Void Spot Assay. J. Vis. Exp. (192), e64621, doi:10.3791/64621 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter