Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

مقايسة بقعة الفراغ في الوقت الحقيقي

Published: February 10, 2023 doi: 10.3791/64621
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1,2
1Renal-Electrolyte Division, Department of Medicine, University of Pittsburgh, 2Department of Cell Biology, University of Pittsburgh

Summary

توضح هذه المقالة طريقة جديدة لدراسة سلوك إفراغ الماوس من خلال دمج مراقبة الفيديو في مقايسة بقعة الفراغ التقليدية. يوفر هذا النهج معلومات زمنية ومكانية وحجمية حول أحداث الإفراغ وتفاصيل سلوك الماوس خلال المراحل المضيئة والمظلمة من اليوم.

Abstract

سلوك الإفراغ الطبيعي هو نتيجة الوظيفة المنسقة للمثانة والإحليل والعضلة العاصرة للإحليل تحت السيطرة المناسبة للجهاز العصبي. لدراسة سلوك الإفراغ الطوعي في نماذج الفئران ، طور الباحثون مقايسة بقعة الفراغ (VSA) ، وهي طريقة تقيس عدد ومساحة بقع البول المودعة على ورقة ترشيح تبطن أرضية قفص الحيوان. على الرغم من أن هذا الفحص بسيط تقنيا وغير مكلف ، إلا أن له قيودا عند استخدامه كاختبار لنقطة النهاية ، بما في ذلك عدم وجود دقة زمنية لأحداث الإفراغ وصعوبات تحديد بقع البول المتداخلة. للتغلب على هذه القيود ، قمنا بتطوير VSA مراقب بالفيديو ، والذي نسميه VSA (RT-VSA) في الوقت الفعلي) ، والذي يسمح لنا بتحديد تردد الإفراغ ، وتقييم حجم الفراغ وأنماط الإفراغ ، وإجراء قياسات على مدى 6 ساعات من النوافذ الزمنية خلال كل من المرحلتين المظلمة والخفيفة من اليوم. يمكن تطبيق الطريقة الموضحة في هذا التقرير على مجموعة واسعة من الدراسات القائمة على الفئران التي تستكشف الجوانب الفسيولوجية والسلوكية العصبية للتبول الطوعي في حالات الصحة والمرض.

Introduction

يتم تنسيق تخزين البول والتبول بواسطة دائرة مركزية (الجهاز العصبي المركزي) تتلقى معلومات حول حالة ملء المثانة من خلال أعصاب الحوض وتحت المعدة. تشكل الظهارة البولية، وهي الظهارة التي تبطن المسالك البولية من الحوض الكلوي إلى مجرى البول القريب، حاجزا محكما أمام الفضلات الأيضية ومسببات الأمراض الموجودة في البول. إنه جزء لا يتجزأ من الشبكة الحسية ، التي تستشعر وتنقل حالة ملء المثانة إلى الأنسجة الكامنة والأعصاب الواردة 1,2. يمكن أن يؤدي اضطراب حاجز الظهارة البولية ، أو التغيرات في مسارات النقل الميكانيكي للظهارة البولية ، إلى خلل وظيفي في الإفراغ إلى جانب انخفاض أعراض المسالك البولية مثل التردد والإلحاح والتبول الليلي وسلس البول3،4،5،6،7. وبالمثل ، من المعروف أن الشيخوخة والسكري والتهابات المسالك البولية السفلية والتهاب المثانة الخلالي وعمليات المرض الأخرى التي تؤثر على المثانة البولية ، أو الدوائر المرتبطة بها التي تتحكم في وظيفتها ، تسبب اختلال وظيفي في المثانة8،9،10،11،12،13،14،15،16،17 ، 18,19. يعتمد الفهم الأفضل لسلوك الإفراغ الطبيعي وغير الطبيعي على تطوير طرق يمكنها التمييز بشكل موثوق بين أنماط التبول المختلفة.

تقليديا ، تمت دراسة سلوك الإفراغ الطوعي للفئران باستخدام مقايسة بقعة الفراغ (VSA) ، التي طورها Desjardins وزملاؤه20 ، وتم اعتمادها على نطاق واسع بسبب بساطتها وتكلفتها المنخفضة ونهجهاغير الجراحي 8،21،22،23،24. عادة ما يتم إجراء هذا الفحص كاختبار نقطة النهاية ، حيث يقضي الماوس قدرا محددا من الوقت في قفص مبطن بورق ترشيح ، والذي يتم تحليله لاحقا عن طريق حساب العدد وتقييم حجم بقع البول عند وضع ورق الترشيح تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية (تتألق بقع البول في ظل هذه الظروف)20. على الرغم من هذه المزايا العديدة ، فإن VSA التقليدي يقدم بعض القيود الرئيسية. نظرا لأن الفئران غالبا ما تتبول في نفس المناطق ، يتعين على الباحثين تقييد مدة الفحص لفترة زمنية قصيرة نسبيا (≤4 ساعات)25. حتى عندما يتم إجراء VSA على مدى فترات زمنية أقصر ، يكاد يكون من المستحيل حل البقع الفارغة الصغيرة (SVSs) التي تقع فوق بقع فراغ كبيرة أو التمييز بين SVSs وترحيل البول الملتصق بالذيول أو الكفوف. كما أنه من الصعب جدا التمييز بين ما إذا كانت SVSs نتيجة لأحداث إفراغ متكررة ولكن فردية (نمط ظاهري يتم ملاحظته غالبا استجابة لالتهاب المثانة4،26) ، أو بسبب التنقيط بعد التبول (النمط الظاهري المرتبط بانسداد مخرج المثانة27). علاوة على ذلك ، فإن الرغبة في إكمال الفحص خلال ساعات العمل ، إلى جانب صعوبات الوصول إلى مرافق الإسكان عند إطفاء الأنوار ، غالبا ما تحد من هذه المقايسات إلى فترة الإضاءة لدورة الساعة البيولوجية 24 ساعة. وبالتالي ، فإن هذه القيود الزمنية تمنع تقييم سلوك إفراغ الفئران خلال مرحلتها الليلية النشطة ، مما يقلل من القدرة على تحليل جينات أو علاجات معينة تحكمها إيقاعات الساعة البيولوجية.

للتغلب على بعض هذه القيود ، طور الباحثون طرقا بديلة لتقييم سلوك الإفراغ في الوقت الفعلي26،28،29،30،31،32. تتضمن بعض هذه الأساليب استخدام معدات باهظة الثمن مثل أقفاص التمثيل الغذائي26،28،29 ، أو استخدام الكاميرات الحرارية30 ؛ ومع ذلك ، هذه أيضا لها قيود. على سبيل المثال ، في الأقفاص الأيضية ، يميل البول إلى الالتصاق بأسلاك الأرضية الشبكية وجدران القمع ، مما يقلل من كمية البول التي يتم جمعها وقياسها. وبالتالي ، قد يكون من الصعب جمع البيانات بدقة حول الفراغات الصغيرة. علاوة على ذلك ، لا توفر الأقفاص الأيضية معلومات حول التوزيع المكاني لأحداث الإفراغ (أي التبول في الزوايا مقابل مركز الغرفة). بالنظر إلى أن الأشعة تحت الحمراء ذات الطول الموجي الطويل التي تستخدمها الكاميرات الحرارية لا تخترق المواد الصلبة ، يجب إجراء نشاط الإفراغ الذي يتم تقييمه بواسطة التصوير الحراري بالفيديو في نظام مفتوح ، والذي يمكن أن يكون صعبا مع الفئران النشطة ، حيث يمكنها القفز عدة بوصات في الهواء. نظام آخر هو نهج الصبغة المفرغة الآلية على الورق (aVSOP)33 ، والذي يتكون من ورق ترشيح ملفوف ينتهي بسرعة ثابتة أسفل أرضية الشبكة السلكية لقفص الفأر. يمنع هذا النهج تلف الورق وتداخل بقع البول التي تحدث في VSA الكلاسيكي ، ويسمح تنفيذه للمحقق بإجراء تجارب على مدار عدة أيام. ومع ذلك ، فإنه لا يوفر للمحقق توقيتا دقيقا لأحداث الإفراغ ، ولا توجد قدرة على فحص السلوك وكيفية ارتباطه بالإكتشاف. للحصول على هذه المعلومات ، قام الباحثون بدمج المراقبة بالفيديو لمقايسات الإفراغ ، وهو نهج يسمح بالتقييم المتزامن لنشاط الفئران وأحداث التبول31,32. يتمثل أحد الأساليب في وضع صمام ثنائي باعث للضوء الأزرق (LED) وكاميرا فيديو مزودة بمرشح بروتين مضان أخضر تحت القفص التجريبي لتصور أحداث الإفراغ ، ومصباح LED يعمل بالأشعة تحت الحمراء وكاميرا فيديو فوق القفص لالتقاط موضع الماوس32. تم استخدام هذا الإعداد لمراقبة سلوك الإفراغ أثناء إجراء القياس الضوئي للألياف. ومع ذلك ، فإن البيئة المضاءة بشكل مشرق لهذا النظام تتطلب من الباحثين علاج الفئران بعامل مدر للبول لتحفيز الإفراغ. في تصميم تجريبي آخر ، تم وضع كاميرات واسعة الزاوية أعلى وأسفل القفص التجريبي لتصور النشاط الحركي للفأر وأحداث التبول ، على التوالي. في هذه الحالة ، تم الكشف عن بقع البول المودعة على ورق ترشيح يبطن أرضية القفص عن طريق إضاءة ورق الترشيح بأضواء الأشعة فوق البنفسجية الموضوعة تحت القفص31. تم استخدام هذا الإعداد في فحوصات قصيرة ، مدتها 4 دقائق ، خلال مرحلة الضوء من اليوم لدراسة الخلايا العصبية في جذع الدماغ المشاركة في سلوك الإفراغ الطوعي31. لم يتم الإبلاغ عن مدى ملاءمة هذا النظام لاستخدامه خلال المرحلة المظلمة أو لفترات زمنية >4 دقيقة.

في هذه المقالة ، يتم وصف طريقة تعزز VSA التقليدي من خلال السماح بمراقبة الفيديو على المدى الطويل لسلوك إفراغ الماوس. يوفر هذا النهج الفعال من حيث التكلفة معلومات زمنية ومكانية وحجمية حول أحداث الإفراغ لفترات طويلة من الوقت خلال مراحل الضوء والظلام من اليوم ، إلى جانب التفاصيل المتعلقة بسلوك الماوس3،4،34. يتم توفير معلومات مفصلة لبناء غرف التفريغ ، وتنفيذ VSA (RT-VSA) في الوقت الفعلي ، وتحليل البيانات. يعد RT-VSA ذا قيمة للباحثين الذين يسعون إلى فهم الآليات الفسيولوجية التي تتحكم في وظيفة الجهاز البولي ، وتطوير الأساليب الدوائية للتحكم في التبول ، وتحديد الأساس الجزيئي لعمليات المرض التي تؤثر على المسالك البولية السفلية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Piezo1/2 الفئران بالضربة القاضية المزدوجة (Pz1 / 2-KO ، النمط الوراثي: Piezo1 fl/ fl; بيزو 2فلوريدا / فلوريدا ؛ Upk2CRE+/-) والضوابط (Pz1/2-C، النمط الجيني: Piezo1 fl/fl; بيزو 2فلوريدا / فلوريدا ؛ تم إنشاء Upk2CRE-/-) داخليا من سلالات الوالدين التي تم الحصول عليها من مختبرات Jax (سلالة Piezo1 fl/ fl # 029213; سلالة بيزو 2 فلوريدا/ فلوريدا # 027720 ؛ Upk2CRE +/- سلالة # 029281). تم استخدام كل من الفئران الإناث (1.5-3 أشهر ووزنها 17-20 جم) والذكور (2-4 أشهر ووزنها 23-29 جم) في التجارب. بالنسبة لتجارب التهاب المثانة الناجم عن سيكلوفوسفاميد ، تم استخدام الإناث من النوع البري C57Bl / 6J (3 أشهر من العمر و ~ 20 جم في الوزن) (مختبرات جاكسون ، سلالة # 000664). تم إيواء الحيوانات وأجريت التجارب في مرفق رعاية الحيوان بجامعة بيتسبرغ بموافقة لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية بجامعة بيتسبرغ. أجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح ذات الصلة لسياسة خدمة الصحة العامة بشأن الرعاية الإنسانية واستخدام المختبر وقانون رعاية الحيوان.

1. تجميع الأقفاص لمقايسة بقعة الفراغ في الوقت الفعلي (RT-VSA)

  1. يتكون جهاز RT-VSA من حامل للأشعة فوق البنفسجية يحمل مصباحين للأشعة فوق البنفسجية وكاميرتين واسعتي الزاوية (كاميرات سفلية) ، والتي تستخدم لتسجيل نشاط الإفراغ خلال مرحلة الضوء من اليوم. رتب غرفتي ماوس للراحة على الحامل. قم بتوصيل كاميرات بزاوية عريضة (كاميرات علوية) بغطاء كل غرفة ماوس ، تستخدم لتسجيل نشاط الإفراغ خلال المرحلة المظلمة من اليوم (الشكل 1أ).
  2. قم ببناء إطار حامل الأشعة فوق البنفسجية وغرف الماوس من 1 بوصة × 1 في مقاطع الألمنيوم المشقوقة على شكل حرف T. انظر الجدول 1 للحصول على قائمة بالمكونات المستخدمة لبناء غرفتي فأر وحامل الأشعة فوق البنفسجية والشكل 1ب - د للحصول على مناظر مختلفة للمكونات والأبعاد المجمعة.
  3. قم ببناء كل حجرة ماوس بثمانية مقاطع ألومنيوم مشقوقة على شكل حرف T مقطوعة إلى 10 بوصات وأربعة مقطوعة إلى 14.75 بوصة. ابدأ بتجميع الجزء السفلي من حجرة الماوس واستخدم مثبتات النهاية القياسية (الجدول 1) لتجميع الملامح المشقوقة على شكل حرف T وفقا للشكل 1. قم بتركيب الأكريليك الذي ينقل الأشعة فوق البنفسجية 38.5 سم × 26.5 سم في القناة الداخلية للملفات الشخصية لبناء أرضية غرف الماوس.
    ملاحظة: للحصول على معلومات مفصلة حول كيفية تجميع ملفات التعريف المشقوقة على شكل حرف T مع مثبتات النهاية القياسية ، قم بزيارة صفحة ويب الشركة.
  4. بناء جدران غرفة الماوس مع بقية الملامح. قم بتركيب ألواح البولي كربونات المقاومة للتآكل (AR) مقاس 38.5 سم × 21.5 سم و 26.5 سم × 21.5 سم في المقاطع لتجميع الجدران الخارجية لحجرة الماوس. استخدم ألواح البولي كربونات AR مقاس 37.5 سم × 23.9 سم و 24.4 سم × 23.9 سم لبناء الجزء الداخلي من غرفة الماوس.
  5. قم بتأمين ألواح البولي كربونات AR بقفل نهاية قياسي 1/4-20 مداس. راجع الإرشادات الخاصة بكيفية تركيب اللوحات في ملفات التعريف الموجودة على صفحة الويب في ملاحظة الخطوة 1.3. استخدم سد السيليكون التجاري لإغلاق التقاطعات بين الألواح الداخلية.
  6. استخدم اثنين من 12 بوصة واثنين 14.75 في ملفات تعريف مشقوقة على شكل حرف T لتجميع غطاء القفص كما هو موضح في الشكل 1ب. قم بتركيب لوحة AR من البولي كربونات مقاس 38.5 سم × 26.5 سم في القناة الداخلية للمقاطع لإكمال الغطاء.
  7. قم بتركيب دعم ملف تعريف الكاميرا مقاس 12 بوصة بشكل عمودي على المحاور الطويلة لأعلى القفص وقم بتثبيته بانتقالين خفيفين داخل أقواس الزاوية (تم وضع علامة 3 في الشكل 1ب). استخدم لوحة مسطحة مستقيمة (تحمل علامة 2) كدعم لتركيب كاميرا الويب وقم بتركيبها كما هو موضح في الشكل 1ب. قم بتوصيل الكاميرا بالدعم باستخدام برغي تثبيت الكاميرا.
  8. استخدم مجموعة اليد اليمنى لمفصلة الرفع القياسية من السلسلة 10 لتوصيل الغطاء بجسم حجرة الماوس (تم وضع علامة 1 في الشكل 1ب).
  9. قم ببناء حامل الأشعة فوق البنفسجية بأربعة مقاطع جانبية مشقوقة على شكل حرف T مقطوعة إلى 40 بوصة ، وأربعة مقاطع جانبية مشقوقة على شكل حرف T مقطوعة إلى 32 بوصة ، وأربعة مقاطع تعريف مشقوقة على شكل حرف T مقطوعة إلى 10 بوصات ، وفقا للشكل 1C ، D. قم بتركيب لوح مرآة أكريليك مقاس 82.5 سم × 26.5 سم في الملامح لبناء الجزء السفلي من غرفة الأشعة فوق البنفسجية.
  10. استخدم لوح مرآة الأكريليك 82.5 سم × 30.5 سم و 26.5 سم × 30.5 سم لبناء جدار حامل الأشعة فوق البنفسجية.
  11. قم بتوصيل الألواح المسطحة T ذات الخمسة ثقوب من السلسلة 10 (المميزة بعلامة 2 في الشكل 1 C) ، والألواح المسطحة L ذات الخمسة فتحات من السلسلة 10 (المميزة 3 في الشكل 1 C) ، والألواح المسطحة ذات الخمسة ثقوب من السلسلة 10 (المميزة 1 في الشكل 1C) لتأمين حامل الأشعة فوق البنفسجية.
  12. قم بتركيب الكاميرات السفلية في ملف تعريف مشقوق على شكل حرف T مقطوع إلى 32 بوصة وتثبيته في الجزء السفلي من الحامل مع قوسين زاوية انتقاليين خفيفين كما هو موضح في الشكل 1د. استخدم لوحات مسطحة مستقيمة لتوصيل كاميرات الويب بملف تعريف T المشقوق .
  13. قم بتركيب مصابيح الأشعة فوق البنفسجية في الداخل والأمام والخلف ، وقم بتوصيلها بالألواح المسطحة المستقيمة كما هو موضح في الشكل 1د.
  14. قم بتوصيل كاميرات الويب الأربعة بمنافذ USB لجهاز كمبيوتر يقوم بتشغيل برنامج مراقبة بالفيديو.

2. إسكان الحيوانات قبل التجريب

  1. فئران التجارب المنزلية ، إما تم تربيتها لهذا الغرض أو تم الحصول عليها من موقع خارجي ، في مجموعات من أربعة. عندما يكون ذلك ممكنا ، استخدم الفئران الإناث أو الذكور المتطابقة مع العمر لهذه التجارب. إذا تم الحصول على الحيوانات من مصدر خارجي ، اسمح لها بالتأقلم لمدة 7 أيام على الأقل قبل إجراء أي إجراءات تجريبية.
  2. طوال فترة وجودهم في منشأة الحيوانات ، قم بإيواء الحيوانات في أقفاص قياسية تحتوي على فراش وإثراء (على سبيل المثال ، كوخ الإسكيمو البلاستيكي ، والعجلة ، وقطعة من الورق للتمزيق) واحتفظ بها تحت دورة نهارية / ليلية مدتها 12 ساعة ، مع إمكانية الوصول إلى الماء والفأر الجاف chow ad libitum.

3. تسجيلات RT-VSA خلال مراحل الضوء والظلام من اليوم

ملاحظة: يصف البروتوكول أدناه استخدام RT-VSA لتقييم سلوك إفراغ الماوس خلال المراحل المضيئة والمظلمة من اليوم. يتم الاحتفاظ بالحيوانات في دورة مظلمة مدتها 12 ساعة و 12 ساعة مع توقيت Zeitgeber (ZT) = 0 في الساعة 07:00 صباحا. تبدأ التسجيلات بين الساعة 10:30 صباحا و 11:00 صباحا (ZT = 3.5-4.0) لتجارب المرحلة الضوئية وبين الساعة 06:00 مساء و 06:30 مساء (ZT = 11.0-11.5) لتجارب المرحلة المظلمة. عندما يتم اختبار الحيوانات في ظل كلتا الحالتين ، يتم إجراء التجارب عادة في يومين منفصلين ، مع 5 أيام متتالية على الأقل بين اختبارات الضوء والظلام. لا ينبغي إجراء التجارب في الأيام التي يتم فيها تنظيف غرف الحيوانات أو تغيير الأقفاص ، حيث يمكن أن يؤدي ذلك إلى ضغوط تؤثر على سلوك الإفراغ. يجب تنفيذ جميع الخطوات في ظل ظروف الحد الأدنى من الضغط على الفئران.

  1. نقل التجارب من موقع سكنها إلى غرفة الإجراءات حيث توجد غرف تسجيل RT-VSA.
  2. تحضير غرفة التسجيل RT-VSA
    1. ضع قطعة من ورق الترشيح (24,3 سم × 36,3 سم) في الجزء السفلي من كل قفص تسجيل RT-VSA. اعتمادا على الوقت من اليوم ، استخدم ورق ترشيح رقيق (تجارب المرحلة الخفيفة) أو سميك (تجارب المرحلة المظلمة).
      ملاحظة: يتم استخدام ورق الترشيح السميك أثناء المرحلة المظلمة النشطة لأنه أكثر مقاومة للتقطيع من ورق الترشيح الرقيق. تستخدم الكاميرات العلوية لتصور بقع البول المودعة على ورق ترشيح سميك أثناء المرحلة المظلمة. في المقابل ، أثناء مرحلة الضوء ، يتم استخدام الكاميرات السفلية لأن الضوء المحيط يمنع الكاميرات العلوية من اكتشاف بقع البول المودعة على ورق الترشيح. في هذه الحالة ، يتم استخدام ورق ترشيح رقيق. وجدنا أن الكاميرات السفلية غير فعالة في اكتشاف أحداث الإفراغ الصغيرة المودعة على ورق الترشيح السميك.
    2. في الجزء العلوي من ورق الترشيح ، ضع العناصر التالية: كوخ الإسكيمو البلاستيكي (الذي يوفر مساحة للنوم) ، وأنبوب طرد مركزي صغير معقم سعة 1.5 مل لأغراض التخصيب ، وطبق بلاستيكي 60 مم × 15 مم يحتوي على قطعتين أو ثلاث قطع من تشاو جاف للفأر و 14-16 جم من الماء على شكل عبوة هلامية (جل ماء غير مبلل ؛ الشكل 2).
      ملاحظة: كان استخدام أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل لأغراض التخصيب خاصا بالعلبة المستخدمة في هذه الدراسة.
    3. بمجرد أن تصبح غرف التسجيل جاهزة ، ضع الفئران التجريبية برفق بالداخل عن طريق وضعها برفق على ورق الترشيح. تأكد من أن نقل الحيوانات من قفص السكن إلى أقفاص التسجيل يحدث بأقل قدر من الإجهاد.
    4. بمجرد أن تكون جميع التجارب داخل أقفاص التسجيل الخاصة بها ، مع إغلاق أغطيتها ، قم بتغطية الجزء العلوي من الأغطية بلوحة زرقاء ماصة لتقليل انعكاسات الضوء المحيط المباشرة على سطح غطاء زجاج شبكي.
    5. قم بتشغيل مصابيح الأشعة فوق البنفسجية في الغرفة السفلية.
      ملاحظة: الحيوانات ليس لها اتصال مباشر مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية. ضوء الأشعة فوق البنفسجية الموصى به مفصل في قسم المواد.
  3. تسجيلات RT-VSA
    1. لتسجيل الفيديو من الكاميرات العلوية والسفلية ، استخدم برنامج تسجيل المراقبة بالفيديو ، والذي يمكن تهيئته للتسجيل من كاميرات ويب متعددة أو كاميرات متصلة بالشبكة في وقت واحد.
    2. عند فتح البرنامج ، ابدأ التسجيل بالضغط على Command و R في نافذة البرنامج. إجراء تسجيلات الفيديو بمعدل 1 إطار لكل ثانية.
    3. مباشرة بعد بدء التسجيلات ، اخرج من الغرفة ، وأغلق الباب برفق. تأكد من بقاء الغرفة هادئة طوال مدة التجربة.
  4. إنهاء تسجيلات RT-VSA
    1. العودة إلى غرفة الإجراءات بعد 7 ساعات (تجارب المرحلة الضوئية) أو في صباح اليوم التالي (تجارب المرحلة المظلمة).
    2. أوقف التسجيلات بالضغط على Command و T. أطفئ أضواء الأشعة فوق البنفسجية.
    3. بعد إيقاف التسجيل ، يقوم البرنامج تلقائيا بإنشاء ملف فيلم (بتنسيق .m4v) لكل كاميرا وحفظه تحت اسم الكاميرا في مجلد وجهة محدد مسبقا. تحقق من أنه داخل كل مجلد كاميرا، يتم تنظيم التجارب في مجلدات حسب التاريخ.
    4. في كل مجلد تاريخ/تجربة، تحقق من وجود ملف .m4v واحد وجميع ملفات .jpeg الفردية التي تتوافق مع كل إطار من إطارات الأفلام.
    5. ملاحظة: يمكن استخدام ملفات .jpeg لاسترداد التجربة في حالة تلف ملفات الأفلام.
    6. أنشئ مجلدا على سطح المكتب باسم التجربة وتاريخها وانقل جميع ملفات .m4v إلى هذا المجلد. إذا لزم الأمر ، احذف ملفات .jpeg بمجرد حفظ ملفات الأفلام ونسخها احتياطيا.
    7. ملاحظة: بالنسبة لتجارب المرحلة الضوئية ، سيقوم البرنامج بإنشاء فيلم واحد لكل كاميرا ، بينما بالنسبة لتجارب المرحلة المظلمة ، سيولد فيلمين لكل كاميرا. وذلك لأنه يتم إنشاء ملف .m4v جديد بعد منتصف الليل عندما يتغير التاريخ.
    8. انسخ المجلد الذي يحتوي على الأفلام إلى محرك أقراص محمول لتحليله في كمبيوتر خارجي. يمكن أن تستغرق هذه الخطوة عدة دقائق ويمكن تنفيذها بالتوازي مع الخطوات 3.5.1 إلى 3.5.3.
  5. تنظيف أقفاص التسجيل ونقل فئران التجارب إلى موقع سكنها
    1. قم بإزالة الوسادة الزرقاء التي تغطي أغطية الأقفاص. نقل الحيوانات من أقفاص التسجيل إلى قفص السكن الخاص بهم.
    2. قم بإزالة الملحقات والمواد الغذائية في غرف التسجيل (مثل الأكواخ البلاستيكية والأنابيب البلاستيكية والطبق مع مساند من الطعام وهلام الماء وورق الترشيح) وتخلص منها في النفايات الخطرة بيولوجيا.
    3. نظف الأقفاص باستخدام مكنسة كهربائية يدوية ، وقم بإزالة الكريات البرازية الموجودة في قاع القفص. ثم ، رش الأرضية والجدران الداخلية للقفص بنسبة 70 ٪ من الإيثانول وتنظيف الداخل بقطعة قماش ناعمة. اترك غطاء الأقفاص مفتوحا للسماح لها بالهواء الجاف.
    4. ضع قفص السكن مع الحيوانات في حاوية ثانوية وانقل الحيوانات إلى موقع سكنها.

4. توليد منحنيات المعايرة

ملاحظة: هناك حاجة إلى منحنى معايرة لتحويل مناطق بقعة الفراغ إلى أحجام البول. في حالة إجراء تجارب خلال مراحل الضوء والظلام من اليوم ، يجب إنشاء منحنيين للمعايرة ، واحد لكل نوع من ورق الترشيح المستخدم (أوراق الترشيح الرقيقة والسميكة). يتم إنشاء منحنيات المعايرة في نسختين. يتم تشغيل كل نسخة متماثلة على ورق ترشيح موضوع في غرفة تسجيل RT-VSA. نظرا لتكوينه المعقد ، واستثارة الأشعة فوق البنفسجية ، استخدم بول الفأر لعمل منحنيات المعايرة.

  1. جمع البول الفأر
    1. خذ قطعة من الفيلم الشفاف المرن (10 سم × 15 سم) وضعها على مقعد.
    2. اختر فأرا من ذيله وقفاه. تدليك بهدوء أسفل البطن للحث على التبول. جمع البول على سطح ورقة بلاستيكية فيلم شفاف.
    3. حرر الحيوان بلطف داخل قفصه. باستخدام ماصة ، انقل البول من سطح الفيلم الشفاف إلى أنبوب طرد مركزي صغير معقم سعة 1.5 مل. كرر الإجراء مع فئران متعددة حتى يتم جمع ~ 10 مل من بول الفأر ، وتجميع البول ، وتخزينه في -20 درجة مئوية.
      ملاحظة: مطلوب ما مجموعه ~ 10 مل من بول الفأر لإنشاء منحنيات معايرة مكررة لمراحل الضوء والظلام. لتجنب إجهاد فئران التجارب ، لا تستخدم الفئران التي ستخضع لتجارب RT-VSA لجمع البول.
  2. تسجيلات منحنى المعايرة
    1. قم بإذابة البول الذي تم جمعه في الخطوة 4.1 واخلطه عن طريق الدوامة بلطف لمدة 10-15 ثانية.
    2. ضع قطعة من ورق الترشيح الرفيع (24,3 سم × 36,3 سم) في كل من قفصي التسجيل RT-VSA.
    3. ماصة أحجام البول التالية (بالميكرولتر) على كل ورقة من أوراق الترشيح: 2 و 5 و 10 و 25 و 50 و 80 و 100 و 200 و 300 و 400 و 500 و 750. لمنع تداخل البقع نتيجة الانتشار ، قم بتخصيص البقع على مسافة كافية من بعضها البعض.
    4. أغلق غطاء الأقفاص وقم بتغطيتها بمنصات.
    5. ابدأ التسجيل بالضغط على Command و R ، مع تطبيق نفس معلمات البرنامج المستخدمة لتسجيل التجارب (الخطوة 3.3.).
    6. سجل منحنى المعايرة لمدة 1 ساعة للسماح بأقصى انتشار لبقع البول. اضغط على Command وT لإيقاف التسجيل.
    7. قم بإنشاء مجلد جديد في سطح المكتب ، ضع ملفات .m4v فيه ، ثم انقل البيانات إلى محرك أقراص محمول لتحليلها لاحقا.
    8. قم بإجراء مماثل لإنشاء منحنيات مكررة باستخدام ورق ترشيح سميك. في هذه الحالة ، أضف طبقات إضافية من الوسادات لتغميق المناطق الداخلية ومحاكاة ظروف المرحلة المظلمة.
  3. تحليل تسجيلات منحنى المعايرة
    1. افتح ملفات .m4v في برنامج مشغل الأفلام ، مع تكبير النافذة لملء الشاشة. لتحليل منحنيات المعايرة التي يتم إجراؤها على ورق ترشيح سميك ، استخدم الملفات التي تم الحصول عليها باستخدام الكاميرات العلوية (الشكل 3 أ). لتحليل منحنيات المعايرة التي يتم إجراؤها على ورق ترشيح رقيق ، استخدم الملفات التي تم الحصول عليها باستخدام الكاميرات السفلية (الشكل 3ب).
    2. قم بتشغيل ملف .m4v ، مع تحريك شريط تمرير الوقت للأمام والخلف للحصول على نظرة عامة على فيلم منحنى المعايرة الكامل لمدة 1 ساعة.
    3. حدد النطاق الزمني الذي تكون فيه بقع البول الأصغر (<25 ميكرولتر) ذات كثافة أكبر وتنتشر إلى أقصى حد. التقط لقطة شاشة ضمن هذا النطاق الزمني. قم بتسمية ملف لقطة الشاشة واحفظه كملف .png (الشكل 3أ ، اللوحة العلوية).
      ملاحظة: يتم التقاط لقطات الشاشة بالضغط على المفتاح F6. لإعداد F6 للحصول على لقطة شاشة ، حدد: تفضيلات النظام > اختصارات > لوحة المفاتيح، واكتب F6 في المربع الموجود على يمين خيار حفظ صورة الشاشة كملف .
    4. حدد النطاق الزمني الذي يكون فيه لبقع البول المتوسطة والكبيرة (>50 ميكرولتر) مساحة قصوى والتقط لقطة شاشة. من الممكن ألا تكون بعض بقع البول الأصغر مرئية بحلول الوقت الذي تظهر فيه بقع البول الأكبر أقصى انتشار. قم بتسمية الملف واحفظ لقطة الشاشة كملف .png (الشكل 3أ ، اللوحة السفلية).
    5. افتح برنامج ImageJ (NIH) ثم اسحب رمز ملف .png الذي تم الحصول عليه في الخطوة 4.3.3 لفتح ملف الصورة (الشكل 4أ).
    6. من شريط الأدوات، حدد أيقونة تحديدات المضلع ، وحدد حدود ورقة الترشيح.
    7. ثم حدد تحليل من شريط القائمة ، واختر تعيين القياسات من القائمة الموسعة ، ومن النافذة المنبثقة حدد المنطقة. انقر فوق موافق. يسمح هذا بالحصول على قيم المساحة عند تنفيذ الخطوة 4.3.8.
    8. بعد ذلك ، حدد تحليل مرة أخرى من شريط القائمة واختر قياس من الخيارات الموسعة. تنبثق نافذة نتائج تحتوي على منطقة عمود تعرض قيم المنطقة بالبكسل2 (الشكل 4ب - د).
    9. حدد أيقونة التحديدات اليدوية من شريط الأدوات واستخدمها لرسم خط حول محيط بقعة فراغ فردية. قم بقياس المنطقة كما في الخطوة 4.3.8. يقوم البرنامج بتحديث جدول النتائج عند إجراء قياسات جديدة. تظهر مجموعة الأرقام الجديدة أسفل الأرقام السابقة. سجل الرقم الذي يظهر أسفل منطقة العمود في نافذة النتائج لكل بقعة تم تحليلها (الشكل 4E-G).
    10. كرر الخطوات من 4.3.5 إلى 4.3.7 لكل نقطة من النقاط المتماثلة.
    11. اضبط المساحة الإجمالية لورق الترشيح على أنها 100٪ واحسب النسبة المئوية للمساحة (٪ المساحة) لكل بقعة بول. سيؤدي هذا التطبيع إلى تصحيح الأخطاء التي قد تحدث نتيجة للاختلافات في التكبير / التصغير أو تحديد موضع الكاميرات.
    12. قم بإنشاء جدول XY جديد في برنامج رسوم بيانية وأدخل قيم حجم البول (بالميكرولتر) في العمود X والقيم المكررة لمساحة ٪ في العمود Y.
    13. ثم حدد تحليل > تحليل > تحليل XY > الانحدار غير الخطي (ملاءمة المنحنى). من نافذة المعلمات التي تظهر، حدد نموذج > متعدد الحدود > متعدد الحدود من الدرجة الثانية (تربيعي).
    14. ثم، من علامة التبويب أسلوب، انقر لوضع علامة على التحديدات التالية: انحدار المربعات الصغرى، بدون ترجيح، واعتبر كل قيمة Y مكررة كنقطة فردية.
    15. من علامة التبويب تقييد، حدد B0 ونوع القيد > ثابت يساوي واكتب 0 ضمن عمود القيمة . انقر فوق موافق.

5. تحليل تسجيلات الفئران التجريبية

  1. افتح ملف فيلم تم جمعه أثناء مرحلة الضوء (الكاميرا السفلية) أو المرحلة المظلمة (الكاميرا العلوية) لتحليلها.
  2. قم بتقييم جودة ملف الفيلم عن طريق تحريك التمرير الزمني للأمام والخلف ، مع التأكد من أن ورق الترشيح يظل سليما (بدون تمزق أو مضغ) خلال النافذة الزمنية 6 ساعات المراد تحليلها. إذا تمزق الورق ، فلا تقم بإجراء مزيد من التحليل ، حيث قد يكون الفأر قد تبول على البلاستيك المكشوف الذي لا يمكن قياسه كميا (الشكل 5).
  3. لتحليل التجارب التي تم جمعها في المراحل الفاتحة أو المظلمة، استخدم أمر التقديم السريع أو شريط تمرير شريط الوقت للانتقال إلى النافذة الزمنية المطلوبة. يتم تسجيل نشاط الإفراغ خلال مرحلة الضوء بين الساعة 11:00 صباحا و 05:00 مساء (ZT = 4.0-10.0) وخلال المرحلة المظلمة بين منتصف الليل إلى 06:00 صباحا (ZT = 17.0-23.0).
  4. قم بتشغيل الفيلم في وضع التقديم السريع بالنقر فوق رمز >> (أو قم بالتمرير يدويا خلال الفيلم) ، بحثا عن دليل على أن الماوس يفرغ. أسهل طريقة لمعرفة حدوث ذلك هي البحث عن الظهور المفاجئ للبقع المضيئة من البول على ورق الترشيح. مؤشر آخر هو البحث عن التغييرات السلوكية بما في ذلك الحركة إلى زوايا القفص وفترة وجيزة من عدم النشاط عندما يكون الماوس فارغا.
    ملاحظة: عندما يصبح المرء أفضل في اكتشاف الفراغات ، يمكن للمرء زيادة سرعة التمرير أو التقديم السريع. ومع ذلك ، في الفئران المصابة بالتهاب المثانة البكتيري والكيميائي ، والتي تحتوي على أعداد كبيرة جدا من الفراغات الصغيرة 4,34 ، يمكن للمرء أن يفوت أحداث الإفراغ إذا تحرك المرء بسرعة كبيرة خلال الفيلم.
  5. سجل الوقت الذي يحدث فيه كل فراغ. كاتفاقية ، يتم تسجيل وقت الفراغ عند أول علامة على اكتشاف البول (الشكل 6أ ، ب).
  6. لإجراء قياسات للفراغ ، استخدم أولا شريط التمرير للتحرك للأمام (أو للخلف) في الوقت المناسب ، بحثا عن النقطة الزمنية التي حدث فيها أقصى انتشار لبقعة البول. أوقف الفيلم مؤقتا في هذه المرحلة ، والتقط لقطة شاشة كما هو موضح في الخطوة 4.3.3. ضع سهم فأرة الكمبيوتر في المكان قيد التحليل ، بحيث يتم تحديد نقطة الاهتمام في لقطة الشاشة (الشكل 6C ، D).
  7. قم بتسمية ملف لقطة الشاشة باستخدام الأرقام المرتبطة لحساب ترتيب الظهور في الفيلم.
  8. استمر في تحليل الملف ، وكرر الخطوتين 5.5 و 5.7 لكل بقعة فراغ في الفيلم. بمجرد تحليل جميع البقع الفارغة ، قم بقياس المساحة الإجمالية لورق الترشيح عن طريق التقاط لقطة شاشة واستخدام الخطوات الموضحة في 4.3.6.
  9. احسب النسبة المئوية لمساحة كل بقعة من بقع البول كما هو موضح في الخطوة 4.3.9. قم بتحويل قيم٪ مساحة إلى حجم البول (ميكرولتر) لكل بقعة فراغ باستخدام منحنيات المعايرة التي تم إنشاؤها في الخطوة 4 ووظيفة الاستيفاء في برنامج الرسوم البيانية.
    1. في برنامج الرسوم البيانية ، افتح جدول XY الذي يحتوي على بيانات منحنى المعايرة وأدخل قيم المساحة ٪ في العمود Y أسفل القيمة الأخيرة لمنحنى المعايرة (الشكل 7أ).
    2. انقر فوق علامة التبويب جدول النتائج ، وضمن علامة التبويب النموذج ، انقر لتحديد استيفاء المجهولين من المنحنى القياسي واضغط على موافق. تظهر علامة تبويب باسم قيم X المتوسطة المقحمة بجوار علامة تبويب جدول النتائج. تحتوي علامة التبويب هذه على جدول يحتوي على القيم المقحمة التي تتوافق مع حجم البول بالميكرولتر لكل بقعة فراغ. (الشكل 7أ ، ب).
  10. كرر الخطوات من 5.1 إلى 5.9 لتحليل جميع فئران التجارب.
  11. قم بإنشاء ملف مصنف يحتوي على البيانات التي تم الحصول عليها من الخطوات 5.5 إلى 5.10 ، باستخدام جدول بيانات واحد لكل ماوس (الشكل 7ج). قم بإنشاء ملف واحد لتجارب المرحلة الخفيفة وآخر لتجارب المرحلة المظلمة. تحتوي هذه الملفات الرئيسية على جميع البيانات الأولية والحسابات اللازمة المستخدمة في مزيد من التحليلات.

6. تحليل نمط التبول من الفئران التجريبية

  1. قم بإنشاء ملفات تعريف بقعة الفراغ الأولية والثانوية (الشكل 8أ ، ب والشكل 9).
    ملاحظة: وفقا لدراسات توزيع التردد 23 ، تمثل البقع الفارغة التي تبلغ ≥20 ميكرولتر عادة >95٪ من إجمالي الحجم المفرغ وتعتبر بقع فراغ أولية (PVSs)8،23،35. تعتبر البقع الفارغة التي تبلغ ≤20 ميكرولتر بقع فراغ ثانوية أو صغيرة (SVSs). وقد تبين أن التمييز بين PVSs و SVSs هو نهج مفيد لتوصيف الأنماط الظاهرية للإفراغ. يشير العدد المرتفع من SVSs إلى خلل وظيفي في الإفراغ35.
    1. من الملف الرئيسي الذي يحتوي على بيانات بقعة إفراغ ذات أهمية (مرحلة الضوء أو المرحلة المظلمة) ، صنف البقع بناء على حجمها على أنها PVSs عندما يكون حجمها ≥20 ميكرولتر ، أو SVSs عندما يكون حجمها <20 ميكرولتر.
    2. احسب الرقم واحسب متوسط الحجم الملغى والحجم الإجمالي ل PVSs. احسب الرقم واحسب الحجم الإجمالي ل SVSs.
    3. قم بإنشاء شريط رسم بياني يقارن عنصر التحكم بالفئران المعالجة لكل معلمة من المعلمات المحسوبة: عدد PVSs ، الحجم الملغى ل PVSs ، الحجم الإجمالي ل PVSs ، عدد SVSs ، الحجم الإجمالي ل SVSs.
  2. اختياري: قم بإنشاء مخطط حجم فراغ تراكمي (وظيفة الدرج) لإظهار سلوك الإفراغ بمرور الوقت (الشكل 10 والشكل 11).
    1. افتح الملف الرئيسي للمصنف وقم بتحويل وقت الإفراغ ، والذي يتم التعبير عنه بالساعات والدقائق والثواني ، إلى الصيغة العشرية. احسب حجم البول التراكمي (بالميكرولتر) لكل نقطة زمنية.
    2. قم بإنشاء جدول XY في برنامج الرسوم البيانية مع الوقت في شكل عشري في العمود X وأحجام البول التراكمية في العمود Y. انسخ بيانات الوقت وحجم البول في الجدول. أضف نقاط بيانات (0؛ 0) و(6؛ القيمة القصوى). هذه النقاط ضرورية لإكمال الخطوط الأفقية للمخطط في بداية التجربة (الوقت: 0 ساعة) عندما يكون الحجم المفرغ صفرا (0 ؛ 0) ، وفي نهاية التجربة (الوقت: 6 ساعات) عندما تكون القيمة التراكمية للبول المفرغ مساوية للقيمة التي تم الحصول عليها لحدث الإفراغ الأخير (6 ؛ القيمة القصوى).
    3. انقر نقرا مزدوجا على الرسم البياني ؛ يجب أن تظهر نافذة تنسيق الرسم البياني. حدد علامة التبويب المظهر ، وانقر لإلغاء تحديد الزر إظهار الرموز وانقر لتحديد إظهار الخط / المنحنى. انقر فوق خيار النمط وحدد البقاء على قيد الحياة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

سلوك إفراغ الفئران Piezo1/2 بالضربة القاضية Piezo 1/2

خلال مرحلة التخزين من دورة التبول ، يفترض أن تستشعر الظهارة البولية التوتر الذي يمارسه البول المتراكم في المثانة ولتحويل هذا التحفيز الميكانيكي إلى استجابات خلوية مثل إطلاق ATP المصلي 1,3. لقد أظهرنا سابقا أن قنوات PIEZO1 و PIEZO2 التي يتم تنشيطها ميكانيكيا يتم التعبير عنها في ظهارة البولللماوس 3,36. لتحديد ما إذا كانت قنوات PIEZO الظهارية البولية مهمة لسلوك الإفراغ الطبيعي ، أجرينا RT-VSA على الفئران Piezo1 / 2 المزدوجة بالضربة القاضية المشروطة بالظهارة البولية (Pz1 / 2-KO) وعناصر التحكم المتطابقة مع العمر والجنس (Pz1 / 2-C ؛ Pz1 / 2-C ؛ Pz1/2-C; الشكل 9). اختبرنا كلا من الفئران الإناث والذكور لمدة 6 ساعات خلال مراحل الظلام والضوء من اليوم ، وقمنا بتحليل البيانات كما هو موضح في الخطوة 6.1. عندما قارنا نشاط الإفراغ بين المرحلتين الفاتحة والمظلمة من اليوم للمجموعات الضابطة ، لوحظ أن كلا من الإناث والذكور أظهروا زيادة في عدد وحجم PVSs خلال فترة نشاطهم. تشير هذه الملاحظة إلى أنه على الرغم من أن الفئران كانت في بيئة غريبة ، فقد تم الحفاظ على الطبيعة اليومية لسلوك إفراغ الفئران (أعلى خلال مرحلتها المظلمة النشطة). خلال مرحلة الضوء غير النشطة ، لم نلاحظ أي اختلافات ذات دلالة إحصائية في أي من المعلمات التي تم تحليلها لإناث أو ذكور الفئران Pz1 / 2-KO عند مقارنتها بنظيراتها الضابطة (Pz1 / 2-C). ومع ذلك ، عندما اختبرنا الحيوانات خلال المرحلة المظلمة النشطة ، أظهرت كل من إناث وذكور الفئران Pz1 / 2-KO نمطا ظاهريا متغيرا للإفراغ ، يتميز بزيادة كبيرة في العدد والحجم الإجمالي ل SVSs (الشكل 9). لم تكن هناك فروق ذات دلالة إحصائية في عدد PVS ، أو متوسط الحجم لكل PVS ، أو إجمالي حجم PVS في الإناث أو الذكور Pz1 / 2-KO مقارنة مع الضوابط المقابلة لها. تشير هذه النتائج إلى أن قنوات PIEZO1 / 2 الظهارية البولية لا تلعب دورا مهما في وظيفة الإفراغ أثناء مرحلة الضوء غير النشط للفأر ولكنها مهمة في منع الإكتشاف المتكرر خلال مرحلتها المظلمة النشطة.

توضح النتائج المعروضة في الشكل 9 ميزتين من مزايا استخدام RT-VSA مقابل نقطة النهاية VSA. أولا ، إذا تم إجراء التحليل فقط أثناء مرحلة الضوء ، فسنكون قد أخطأنا في استنتاج أن قنوات PIEZO1 / 2 البولية ليس لها دور في وظيفة الإفراغ. ثانيا ، في معظم دراسات VSA لنقطة النهاية ، تم التعامل مع SVSs على أنها ضوضاء تجريبية ، وفي بعض الحالات تم استبعادها من التحليل اللاحق23. في RT-VSA ، يمكننا تحديد أن SVSs كانت أحداثا فردية ، وليست ثانوية ل PVSs (ترحيل أو مراوغة نهاية التبول) وكانت طوعية بمعنى أن الحيوانات انتقلت إلى محيط القفص ، وأفرغت ، ثم غادرت. زودتنا هذه الملاحظة بمعلومات قيمة حول النمط الظاهري للفئران Pz1 / 2-KO التي كان من الممكن تفويتها لولا ذلك.

سلوك إفراغ إناث الفئران تحت الظروف القاعدية وبعد علاج سيكلوفوسفاميد

في هذه التجربة التجريبية ، اختبرنا آثار سيكلوفوسفاميد (CYP) على سلوك إفراغ الفئران الطوعي. من المعروف أن سيكلوفوسفاميد ، وهو دواء يستخدم لعلاج بعض أشكال السرطان أو الاضطرابات المناعية ، يسبب التهاب المثانة لدى المرضى التجارب ، مما يؤدي إلى نمط ظاهري مفرط النشاط للمثانة يتميز بأحداث إفراغ متعددة وصغيرة26،37،38. لتحديد سلوك الإفراغ الأساسي ، وضعنا فأرة أنثى غير معالجة في RT-VSA أثناء المرحلة المظلمة. تم حقن نفس الفأر داخل الصفاق بجرعة من CYP (150 مجم / كجم) بعد 5 أيام ليسبب التهاب المثانة الحاد. مباشرة بعد الحقن ، تم وضع الماوس في قفص RT-VSA للتسجيل. يتم تمثيل سلوك الإفراغ في مخطط متدرج (الشكل 11) ، حيث تمثل الخطوط الرأسية حجم البول المفرغ والخطوط الأفقية التي تمثل الوقت. بالمقارنة مع النتائج التي تم الحصول عليها في ظل الظروف القاعدية ، من الواضح أن كمية البول المنبعثة لكل فراغ أصغر بعد علاج CYP ، وأن أحداث التبول أكثر تواترا. يمكن تقدير ذلك بشكل أفضل في الجزء الداخلي من الرسم البياني ، حيث يتم تكبير أول 30 دقيقة من الفترة التي تم تحليلها (المقابلة لمنتصف الليل إلى 00:30 صباحا [7.0 إلى 7.5 ساعة بعد الحقن]).

Figure 1
الشكل 1: غرفة تسجيل RT-VSA. (أ) يشتمل نظام التسجيل RT-VSA على جزء علوي يتكون من غرفتين من الأكريليك الشفاف جنبا إلى جنب والكاميرات العلوية المرتبطة بها. النصف السفلي من الجهاز عبارة عن حامل وحدة واحدة يحمل غرف الماوس العلوية ويحتوي على الكاميرات السفلية وأضواء الأشعة فوق البنفسجية. الجزء الداخلي من جدران الحامل مصنوع من ألواح مرآة تعكس ضوء الأشعة فوق البنفسجية لتوفير إضاءة متساوية أسفل الأقفاص. لم يصور هو جهاز كمبيوتر يتلقى تغذية فيديو من الكاميرات ويسجل البيانات. (ب) نموذج لحجرة الماوس مع المكونات والأبعاد. 1) مفصلة رفع قياسية. 2) قوس تصاعد الكاميرا. و 3) قوس زاوية الانتقال لايت. مناظر أمامية (C) وأعلى (D) لحامل الأشعة فوق البنفسجية مع المكونات والأبعاد. يتم تثبيت مصابيح الأشعة فوق البنفسجية في الجزء الداخلي من الملامح الأمامية والخلفية بألواح مسطحة مستقيمة. يتم استخدام ملف تعريف مقاس 32 بوصة مثبت بالإطار الرئيسي للحامل مع قوسين زاوية انتقاليين خفيفين لتركيب الكاميرات. تستخدم الألواح المسطحة المستقيمة لتوصيل الكاميرات بملف التعريف 32. يتم تثبيت لوحة عاكسة في الجزء الداخلي من الحامل (غير معروض). 1) خمس ثقوب نقطة الإنطلاق لوحة مسطحة. 2) خمسة ثقوب T لوحة مسطحة. و 3) لوحات مسطحة L بخمس فتحات. جميع القيم المقدمة بالبوصة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: غرفة الماوس RT-VSA. قبل الإجراءات التجريبية ، يتم تحضير كل غرفة فأر تجريبية عن طريق تبطينها بقطعة من ورق الترشيح (مرقمة 1). اعتمادا على فترة اليوم التي يتم فيها إجراء التجربة ، يكون ورق الترشيح المستخدم إما سميكا (المرحلة المظلمة) أو رقيقا (الطور الخفيف). يتم وضع قبة بلاستيكية في وسط الغرفة (مرقمة 2) ، وطبق بلاستيكي بالماء (على شكل هلام ماء غير مبلل) ويتم وضع تشاو على جانب واحد من القبة (مرقمة 3) ، ويتم وضع أنبوب طرد مركزي صغير بلاستيكي سعة 1.5 مل ، وهو شكل من أشكال التخصيب ، على الجانب الآخر (مرقمة 4). يتم الحفاظ على الترتيب الأولي للعناصر داخل القفص متسقا في جميع التجارب. لاحظ أن قطعة من ورق الترشيح توضع بين القفصين المتجاورين ويتم تمييزها في الشكل بعلامة النجمة. هذا لمنع تأثير الإشارات البصرية الناشئة عن الماوس المجاور. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: منحنى المعايرة. صور تمثيلية لأوراق ترشيح سميكة (A ، الألواح اليسرى) ورقيقة (B ، اللوحة اليسرى) مرقطة بكميات معروفة من بول الفأر. الصور عبارة عن لقطات شاشة من تسجيلات الفيديو التي تم الحصول عليها باستخدام الكاميرات العلوية (A ، اللوحات اليسرى) أو السفلية (B ، اللوحة اليسرى). تشير الأسهم الحمراء إلى بقع البول 2 ميكرولتر ، والأرقام الموجودة أسفل البقع هي قيم حجم البقعة بالميكرولتر. لاحظ أن بقع البول الصغيرة (<50 ميكرولتر) في الصورة العلوية للوحة A والتي تظهر بعد فترة وجيزة من اكتشاف البول (5 دقائق) لم تعد ملحوظة بعد 30 دقيقة (اللوحة السفلية). الألواح اليمنى: مخطط منطقة بقعة الفراغ (معبرا عنها كنسبة مئوية من إجمالي مساحة ورق الترشيح) كدالة لحجم البول. كما لاحظ آخرون ، فإن بيانات منطقة بقعة الفراغ كدالة لحجم البول لا تتبع علاقة خطية30. وبالتالي ، فإننا نلائم البيانات مع كثير حدود من الدرجة الثانية باستخدام الانحدار غير الخطي. كانت البيانات مقيدة بحيث X = 0 إلى Y = 0. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: تحديد ورق الترشيح ومناطق بقعة البول باستخدام ImageJ. (A) لقطة شاشة لمنحنى المعايرة الموضح في الشكل 3A مفتوحة في ImageJ. المنطقة المحاصرة في (أ) موضحة بمزيد من التفصيل في (ب). ( ب) يتم تحديد أيقونة تحديدات المضلع (محاطة بدائرة باللون الأحمر) لرسم مضلع على طول محيط ورقة الترشيح (عرض جزئي؛ خط أصفر مع أسهم حمراء تشير إلى العقد التي تم إنشاؤها بواسطة أداة التحديدات). (ج) تعكس مساحة المضلع المساحة الكلية لورقة الترشيح وتقاس باختيار تحليل > قياس (دائرة حمراء). (D) تظهر قيمة المساحة (بالبكسل) في نافذة النتائج (دائرة حمراء). (ه) لقياس مساحة بقعة فراغ فردية، يتم اختيار أداة التحديدات اليدوية (دائرة حمراء) وفي (F) تستخدم لرسم خط حول حدود البقعة (يشير السهم الأحمر إلى البقعة). باستخدام نفس الأمر كما في (C) ، يتم قياس مساحة بقعة الفراغ ، مع ظهور النتيجة كقيمة جديدة في نافذة النتائج ، مباشرة أسفل القياس الأخير الذي تم إجراؤه (اللوحة G ، الدائرة الحمراء). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: تقييم حالة ورق الترشيح بعد الانتهاء من تجارب RT-VSA. صور تمثيلية لحجرة الماوس توضح الظروف المختلفة لورق الترشيح أثناء تجربة RT-VSA أو بعدها. يظهر ورق الترشيح الذي ظل سليما حتى نهاية فترة الاختبار في (A) ويمثل الموقف الأكثر شيوعا والحالة التي يمكن بموجبها إجراء مزيد من التحليل للتجربة (علامة اختيار خضراء). يتم عرض أمثلة على ورق الترشيح التالف في (B) و (C) ، وهي تمثل التجارب التي يجب عدم تحليلها (علامة X حمراء). في (ب)، تم تمزيق ورقة الترشيح بواسطة الماوس (السهم الأحمر) في أحد الزوايا. يشير الخط الأصفر المتقطع إلى حدود أرضية القفص. يتم تكبير المنطقة المربعة في الصورة إلى اليمين. في (C) ، تعرضت سلامة التجربة للخطر نتيجة لتحريك هلام الماء غير المبلل (السهم الأحمر) بواسطة الماوس إلى الزاوية ، تاركا ثلاث بقع مائية كبيرة (علامات نجمية حمراء). تم تأكيد هذه التحركات من خلال مشاهدة الفيديو. الصور عبارة عن لقطات شاشة من ملفات الأفلام التي تم الحصول عليها أثناء المرحلة المظلمة ، باستخدام الكاميرا العلوية ، ومع القفص المبطن بورق ترشيح سميك. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: تحديد وقت الإفراغ والحصول على لقطات شاشة لقياسات مساحة بقعة الفراغ. (أ، ب) لقطة شاشة لماوس في زاوية من غرفته ، مع بقعة فارغة أصبحت مرئية للتو. يتم شرح وقت هذا الإطار على أنه وقت الإفراغ. (ج، د) بمجرد أن تصل بقعة الفراغ إلى أقصى انتشار ، يتم التقاط لقطة شاشة لتحديد حجم الفراغ. الصور عبارة عن لقطات شاشة من ملفات الأفلام التي تم الحصول عليها باستخدام الكاميرا العلوية ، باستخدام ورق ترشيح سميك ، وأثناء المرحلة المظلمة. كانت فترة التحليل من منتصف الليل إلى الساعة 06:00 صباحا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7: تحويل منطقة بقعة الفراغ إلى حجم البول وإنشاء ملف ورقة عمل ببيانات أولية تجريبية. ( A) لقطة شاشة لنافذة برنامج الرسوم البيانية تعرض قيم البقع الفارغة معبرا عنها كنسبة مئوية من إجمالي مساحة ورق الترشيح (البيانات موضحة باللون الأخضر). يتم حفظ ورقة العمل (السهم الأخضر) ضمن قسم جداول البيانات. ب: تحويل النسبة المئوية للمساحة الكلية إلى حجم البول (البيانات موضحة باللون الأحمر). يتم عرض القيم الأخيرة في قسم النتائج (السهم الأحمر) ويتم حسابها من منحنى المعايرة باستخدام المجهولات المقحمة من دالة المنحنى القياسية. (C) لقطة شاشة لورقة عمل تحتوي على بيانات أولية ومحسوبة مجمعة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 8
الشكل 8: تصنيف البقع الفارغة إلى PVSs و SVSs وتحليلها. لقطات شاشة لأوراق العمل (تم إنشاؤها كما هو موضح في الشكل 7C) من فأر تحت الظروف القاعدية (A) و 7 ساعات بعد تلقي جرعة من سيكلوفوسفاميد (150 مجم / كجم) (B). تصنف بقع الفراغ على أنها بقع فراغ أولية (PVSs) إذا كان الحجم ≥20 ميكرولتر ، أو بقع فراغ صغيرة (SVSs) إذا كان الحجم <20 ميكرولتر. لاحظ أنه في الفأر غير المعالج (A) ، تكون جميع أحداث الإفراغ عبارة عن PVSs ، بينما في الحيوان المعالج بالسيكلوفوسفاميد ، تكون معظم الفراغات عبارة عن SVSs. يتضمن الجدول المحاط بدائرة في كل لوحة (مخطط أحمر) إحصائيات الملخص التالية: عدد الفراغات ومتوسط الحجم الفارغ وإجمالي الحجم الفارغ. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 9
الشكل 9: سلوك إفراغ Piezo1/2 بالضربة القاضية والفئران الضابطة. تم تسجيل سلوك الإفراغ لإناث (A) والذكور (B) Piezo1 / 2 بالضربة القاضية (Pz1 / 2-KO) ونظرائهم الضابطين ( Pz1 / 2-C ) خلال نافذة زمنية مدتها 6 ساعات خلال المرحلة المظلمة أو الفاتحة من اليوم ، وتم تحليل النتائج كما هو موضح في الخطوة 6.1. يتم عرض البيانات كمتوسط ± خطأ معياري للمتوسط (S.E.M.). تمت مقارنة البيانات باستخدام اختبار مان ويتني. الاختصارات: PVSs = بقع الفراغ الأولية ؛ SVSs = بقع فراغ صغيرة ؛ NS = غير مهم ؛ * ص < 0.05 ؛ ** ص < 0.01. تم تعديل هذا الرقم من3. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 10
الشكل 10: أوراق عمل لحساب الحجم الفراغي التراكمي والتمثيل الرسومي له كدالة للوقت. (أ) لقطة شاشة لورقة العمل التي تم إنشاؤها في الشكل 7C تعرض الحسابات اللازمة لإنشاء مخطط دالة الدرج للحجم التراكمي للبول المفرغ كدالة للوقت. يجب إدخال الوقت بتنسيق عشري (العمود G ، المربع الأحمر). لتحويل الوقت إلى تنسيق عشري ، تمت إضافة ثلاثة أعمدة (أسهم حمراء) إلى يمين عمود وقت إفراغ لإضافة تعليق توضيحي منفصل إلى قيم الساعات (العمود D) والدقائق (العمود E) والثواني (العمود F) والنتيجة النهائية للوقت بتنسيق عشري (العمود G). لتحويل إفراغ الوقت إلى تنسيق عشري ، استخدم الوظيفة التالية: (h) + (min / 60) + (s / 3,600). تمت إضافة عمود واحد إلى يمين عمود حجم البول ، لعرض حجم البول التراكمي (المستطيل الأزرق) ، والذي يتم حسابه على أنه مجموع جميع أحجام البول (العمود J) التي تم الحصول عليها حتى وقت حدث إفراغ جديد (بما في ذلك قيمة الحدث الجديد). (B) لقطة شاشة تعرض البيانات المنسوخة من ورقة العمل في اللوحة A ولصقها في العمود X (الوقت بالتنسيق العشري) والعمود Y (أحجام البول التراكمية) في مشروع برنامج الرسوم البيانية. يتم تعيين النقطتين الأولى والأخيرة من المخطط على الصفوف 0 و 6 (القيمة القصوى) كما هو موضح بالأسهم الحمراء. (ج) لإنشاء مخطط خطوة ، يتم تنسيق الرسم البياني عن طريق إلغاء تحديد حقل إظهار الرموز ، وتمكين إظهار خيار الخط / المنحنى المتصل ، وتحديد نمط البقاء ، كما هو موضح في الحقول المحاطة باللون الأحمر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 11
الشكل 11: النتائج التمثيلية لسلوك إفراغ الفئران تحت الظروف القاعدية أو بعد إعطاء سيكلوفوسفاميد. تم تقييم سلوك الإفراغ الطوعي للفأر بواسطة RT-VSA خلال المرحلة المظلمة قبل إعطاء (القاعدية) و 7 ساعات بعد إعطاء سيكلوفوسفاميد (CYP) ، كما هو موضح في النتائج التمثيلية. يتم تمثيل وقت وحجم أحداث الإفراغ في مخطط خطوة تم إنشاؤه كما هو موضح في الخطوة 6.2. يمثل الجزء الداخلي من الرسم البياني مساحة قطعة الأرض المميزة بمستطيل أخضر ويتوافق مع أول 30 دقيقة من الفترة التي تم تحليلها. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 12
الشكل 12: تحديد بقع البول المتداخلة بواسطة RT-VSA. لقطات شاشة لإطارات الفيديو التي تم التقاطها بالكاميرا العلوية في المرحلة المظلمة من تجربة RT-VSA (الصورتان 1 و2). يتم تكبير المنطقة المربعة في الصورة 2 في الصورة 3. أفرغ الماوس في نفس الزاوية اليمنى العليا مرتين إضافيتين خلال الساعات القليلة التالية (الصور 4-6). على الرغم من تداخل البقع الفارغة، تم اكتشاف أحداث الإفراغ الفردية بسهولة باستخدام RT-VSA. لتصور كيفية ظهور هذه الأحداث كاختبار لنقطة النهاية ، قمنا بتعريض زاوية ورق الترشيح لظروف إضاءة مختلفة. تحت الضوء المحيط المرئي ، يمكن تحديد بقعة فراغ واحدة كبيرة فقط (الصورة 7). وبالمثل ، إذا تم فحص هذه المنطقة نفسها تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية ، فلا يمكن تمييز سوى بقعة مظلمة واحدة (الصورة 8). وبالتالي ، يتم اكتشاف فراغات متعددة في نفس المنطقة بسهولة بواسطة RT-VSA ، ولكن هذا التمييز غير ممكن إذا تم إجراء التحليل كاختبار نقطة نهاية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يعد دمج المراقبة بالفيديو تعديلا فعالا من حيث التكلفة يقدم العديد من المزايا على VSA الكلاسيكي. في VSA الكلاسيكي ، والذي يستخدم عادة كفحص لنقطة النهاية ، من الصعب التمييز بين البقع الفارغة المتداخلة. هذا ليس مصدر قلق تافه ، حيث تميل الفئران إلى التبول عدة مرات في نفس المنطقة عندما يطول الفحص لعدة ساعات ، عادة في زوايا قفصها. وبالتالي ، فإن الميزة الأولى ل RT-VSA هي أنه يمكن للمحقق بسهولة تحديد البقع الفردية التي تم ترسبها جزئيا أو كليا فوق بعضها البعض. وهذا موضح جيدا في التجربة الموضحة في الشكل 12. في هذه الحالة ، يؤكد تسجيل الفيديو أن الماوس أفرغ ثلاث مرات في نفس الزاوية ، مما أدى إلى إيداع بقع فارغة متداخلة. إذا تم تحليل ورقة الترشيح فقط في نهاية التجربة ، بالطريقة النموذجية ل VSA ، يمكن تمييز بقعة واحدة فقط. لذلك ، في حين أن نقطة النهاية الكلاسيكية VSA يمكن أن تكون مفيدة في تحديد الاختلافات الكبيرة في سلوك الإفراغ ، فقد تفشل في التمييز بين الأنماط الظاهرية الأكثر دقة. مع التقدم الحالي في علم الوراثة وتوليد الحيوانات المعدلة وراثيا ، يعد تطوير طرق يمكنها تقييم سلوك الإفراغ بدقة أمرا ضروريا.

ثانيا ، يزود RT-VSA المحقق بمعلومات زمنية حول أحداث الإبطال. وبالتالي ، يمكن للمرء تحديد ترددات التبول الحقيقية ، وكذلك إقامة علاقات بين أحداث الإفراغ. على سبيل المثال ، في الحالة التي يتم فيها ملاحظة مجموعة من SVSs بجوار PVS كبير واحد ، في VSA الكلاسيكي ، لا يمكن للمرء التمييز بسهولة إذا كان الفأر قد أفرغ عدة مرات أثناء التجربة (مع ثلاثة فراغات صغيرة وفراغ واحد كبير) أو إذا كان الحيوان قد أودع حجم بول كبير واحد ، وكانت البقع الثلاث الأصغر نتيجة للمراوغة بعد التبول أو الترحيل من الفراء. يمكن استخدام RT-VSA لمعالجة هذه الأسئلة.

ثالثا ، يسمح RT-VSA للشخص بتحليل سلوك الماوس قبل وأثناء وبعد حدث الإفراغ. يمكن للمحقق أيضا مراقبة ملف تعريف النشاط العام للماوس من خلال تحليل تسجيلات RT-VSA باستخدام البرامج المتاحة مجانا مثل Mouse BehaviorTracker 39. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن للمرء التمييز بين ما إذا كان الحيوان يتوقف عن التبول (السلوك النموذجي للإناث) ، أو ما إذا كان الحيوان يتحرك أثناء الإفراغ (والذي يمكن أن يؤدي عند الذكور إلى تتبع بقع الفراغ) ، أو ما إذا كان يفرغ أثناء مرحلة النوم / الراحة. لقد لاحظنا السلوك الأخير ، على الرغم من أنه نادر الحدوث عادة. وبالتالي ، إذا تم التحقق من صحتها وتفسيرها بشكل صحيح ، فإن مراقبة سلوك الإفراغ يمكن أن تزود الباحث برؤى قيمة حول خلل الإفراغ ، بما في ذلك ، على سبيل المثال ، التبول الليلي أو سلس البول. يسمح RT-VSA (و VSA) للمحققين بتحديد جزء من أحداث الفراغ التي تحدث في المنطقة المركزية للقفص ، بدلا من الزوايا. عادة ، يكون إفراغ المركز نادرا ، وزيادة أعداد مثل هذه الأحداث هي علامة على ضعف المثانة 8,22. الاستثناء الوحيد هو ذكور ألفا السائدة ، والتي تتبول بشكل متكرر وعبر كامل حاوياتها20. من أجل إجراء تحليل للإفراغ المركزي باستخدام RT-VSA ، ينبغي للمرء أن يفكر في نقل طبق الطعام إلى جدار جانبي وإزالة القبة (أو تثبيته في منطقة معينة من القفص) ، بحيث يمكن إنشاء أنماط التبول المكانية بسهولة أكبر.

رابعا ، يسمح RT-VSA للمرء بإدارة الضغوط المرتبطة بتبادل الأقفاص بشكل أكثر فعالية مقارنة ب VSA الكلاسيكي. الفئران متقلبة بطبيعتها والتعامل معها أو نقلها إلى بيئة جديدة يسبب الإجهاد ، والذي من المعروف أنه يؤثر على سلوك الإفراغ35. بحكم طبيعتها ، من الصعب دمج فترة التأقلم في VSA القياسي. في المقابل ، في RT-VSA ، يمكن دمج فترة التأقلم بسهولة في كل تجربة ، ويتم تجاهل أي أحداث إفراغ خلال هذه الفترة أثناء التحليل. ومن الجوانب الإضافية لتخفيف الإجهاد في RT-VSA المطبقة في هذا البروتوكول ازدواجية الظروف التي يتم فيها إيواء الفئران عادة (أي الحصول على الطعام والماء حسب الطلب ، وقبة ، ولعبة). هذه ، على حد علمنا ، واحدة من أغنى البيئات الموصوفة لهذا النوع من التجارب. في نقطة النهاية النموذجية VSA ، تحرم الفئران من الماء (وأحيانا أيضا من الطعام)8,22 ، والتي نقدمها مخصصة.

خامسا ، بالإضافة إلى التأثير الإيجابي الذي قد تحدثه هذه البيئة المخصبة على مستويات الإجهاد لدى الفئران ، فإنه يسمح للباحث بإجراء RT-VSA لفترات طويلة من الزمن ، عادة في نوافذ زمنية مدتها 6 ساعات. ومع ذلك ، في الآونة الأخيرة ، قمنا بإجراء تجارب تعمل لمدة 24 ساعة (البيانات غير معروضة). هذا مثالي عند تقييم آثار إيقاع الساعة البيولوجية أو عند دراسة الفئران التي قد تظهر النمط الظاهري للمثانة غير النشطة ، وبالتالي التبول بشكل غير منتظم.

لمراقبة الفيديو لمدة 24 ساعة ، نوصي باستخدام ورق ترشيح رقيق وتحليل التجارب باستخدام الكاميرات السفلية. هذا المزيج من نوع الورق والكاميرا هو الخيار الأفضل الذي يسمح بحساسية الكشف في مرحلتي الظلام والضوء. كما ذكرنا سابقا ، لا يمكن للكاميرات السفلية اكتشاف البقع الفارغة بسهولة على ورق الترشيح السميك ولا تكتشف الكاميرات العلوية البقع الفارغة بشكل موثوق أثناء مرحلة الضوء. في حالة إجراء هذه التحليلات الموسعة ، نقترح وضع الحيوانات في أقفاص التسجيل في الساعة 05:00 مساء ، والتحليل من الساعة 06:00 مساء في اليوم 1 وإكمال التجربة في الساعة 06:00 مساء في اليوم التالي.

في حين أن RT-VSA له العديد من الجوانب الإيجابية ، إلا أن هناك بعض المحاذير الجديرة بالملاحظة. بينما نبذل كل محاولة للحد من التوتر عند إجراء هذه التحليلات ، لا يمكننا تكرار موطن الفأر بالكامل ، حيث يتم إيواء الحيوانات عادة بشكل جماعي. كما أنهم يشربون الماء من زجاجة بدلا من الحصول على الماء من هلام الماء غير المبلل. ومع ذلك ، فإن ملاحظتنا أن الفئران لديها فراغات أقل خلال مرحلة الضوء غير النشطة مقابل طورها المظلم النشط تشير إلى أن الفئران تحتفظ بأنماطها الطبيعية لسلوك إفراغ الساعة البيولوجية40. مما يعكس طبيعتها المجهدة بسهولة ، وجدنا أن الفئران تظهر سلوك إفراغ معطل في أيام تنظيف القفص. وبالتالي ، يجب على المرء أن يقصر التحليل على الفترات الزمنية التي تكون فيها الحيوانات أقل تأثرا بتربية الحيوانات الروتينية. أحد العوامل المهمة التي يجب مراعاتها هو ما إذا كان ضوء الأشعة فوق البنفسجية له أي تأثير على وظيفة الإفراغ. نظرا لأن النتائج التي توصلنا إليها تظهر اختلافا يوميا واضحا في معلمات VSA بين مراحل الضوء والظلام ، والتي تتوافق مع التقنيات الأخرى التي تقلل من ظاهرة مماثلة ولكن لا تستخدم ضوء الأشعة فوق البنفسجية40 ، فإننا نستنتج أن إضاءة ضوء الأشعة فوق البنفسجية لا تؤثر على وظيفة الإفراغ. لاحظ أن ورق الترشيح يمنع الضوء من المرور من الحجرة السفلية إلى الحجرة العلوية.

تحذير إضافي هو أنه كلما طالت مدة بقاء الفئران في الغرفة ، زاد احتمال مضغها أو إتلافها لورق الترشيح (بغض النظر عن سمك الورق). في حين أن أيا من الحيوانات لم يعطل الورق خلال مرحلة الضوء ، فإن ما يقرب من 30٪ من الفئران ألحقت الضرر بالورق خلال المرحلة النشطة المظلمة. في تحليل تجارب 24 ساعة ، لاحظنا أنه لا يمكن تحليل نسبة مماثلة (ثلث) التجارب بسبب تلف الورق ، مما يعني أنه ليس فقط مقدار الوقت ، ولكن أيضا مرحلة اليوم تؤثر على سلوك تمزيق الحيوان. لسوء الحظ ، في تجربتنا ، لاحظنا أن الحيوان الذي يعطل ورقة القفص سيستمر في القيام بذلك حتى عند إعادة الاختبار. كما ذكر أعلاه ، تتبول الفئران أحيانا على أرضية الأكريليك العارية ، وبالتالي فإن فقدان الورق يجعل التحليل غير مكتمل وذو قيمة محدودة.

علاوة على ذلك ، يمكن أن يكون تحليل سلوك إفراغ الذكور أكثر صعوبة لأنهم يميلون إلى الإفراغ بشكل متكرر ، ويمكنهم المراوغة بعد الإفراغ ، وهناك مجموعة من الذكور (20٪) مع نمط ظاهري أكثر عدوانية من ذكور ألفا يتميز بأعداد كبيرة من الفراغات الصغيرة التي يتم توزيعها عبر القفص ، كما تمت مناقشته في منشور سابق3. نظرا لأن سلوك ألفا الذكوري هذا يمكن أن يشكل عاملا مربكا لإنشاء الأنماط الظاهرية للإفراغ ، فإننا نستبعد الحيوانات التي تحتوي على فراغات ≥50 (تجارب المرحلة الخفيفة) أو ≥100 (تجارب المرحلة المظلمة) من التحليل.

هناك حالات لا يكون فيها التمييز بين الفراغات على أساس حجمها (أي PVS مقابل SVS) مبررا بالضرورة. على سبيل المثال ، في تجربتنا ، تميل الفئران المصابة بالتهاب المثانة البكتيري أو الكيميائي إلى إفراغ أحجام أصغر من الضوابط 4,34. ومع ذلك ، هناك اختلافات كبيرة في الحجم المفرغ بين الفئران الفردية. في بعض الحالات ، يكون حجم معظم الفراغات ≤20 ميكرولتر ، بينما في حالات أخرى تكون الغالبية >20 ميكرولتر. وبالتالي ، فإن التمييز بين الحجم الملغى لا يوفر أي ميزة لتوصيف هذه الأنماط الظاهرية.

باختصار ، RT-VSA هي أداة سهلة التنفيذ لتحليل سلوك إفراغ الماوس في الفئران المتنقلة بحرية. على عكس أدوات مثل قياس المثانة ، فإنه لا يتطلب زرع جراحي للقسطرة أو معدلات غير فسيولوجية لملء المثانة. يسمح بتحديد سلوك الإفراغ في كلا الجنسين من الفئران ، على مدى فترات طويلة من الزمن ، وخلال مراحل الضوء والظلام من دورة اليوم. كما أنها ميسورة التكلفة نسبيا ، خاصة عند مقارنتها بأجهزة أكثر تخصصا وتكلفة مثل أقفاص التمثيل الغذائي. في حين أن هناك محاذير مرتبطة بهذه الأداة ، إلا أنها سهلة الإدارة بشكل عام. أخيرا ، يمكن تكييف هذه التقنية بسهولة مع الأنواع الحيوانية الأخرى ، بما في ذلك القوارض الأخرى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل من خلال منحة المعاهد الوطنية للصحة R01DK119183 (إلى GA و MDC) ، وجائزة مشروع تجريبي من خلال P30DK079307 (إلى M.G.D.) ، وجائزة التطوير الوظيفي لجمعية جراحة المسالك البولية الأمريكية ومنحة مؤسسة وينترز (إلى NM) ، ومن قبل فسيولوجيا الخلية والكائنات النموذجية لتصوير الكلى من مركز بيتسبرغ لأبحاث الكلى (P30DK079307).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots –  cut to 10 inches 80/20 1010 Amount: 20
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots –  cut to 12 inches 80/20 1010 Amount: 6
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots –  cut to 40 inches 80/20 1010 Amount: 4
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots – cut to 14.75 inches 80/20 1010 Amount: 12
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots – cut to 32 inches 80/20 1010 Amount: 5
1/4-20 Double Slide-in Economy T-Nut 80/20 3280 Amount: 16
1/4-20 Triple Slide-in Economy T-Nut 80/20 3287 Amount: 18
10 & 25 Series 2 Hole - 18mm Slotted Inside Corner Bracket with Dual Support 80/20 14061 Amount: 6
10 Series 3 Hole - Straight Flat Plate 80/20 4118 Amount: 8
10 Series 5 Hole - "L" Flat Plate 80/20 4081 Amount: 8
10 Series 5 Hole - "T" Flat Plate 80/20 4080 Amount: 8
10 Series 5 Hole - Tee Flat Plate 80/20 4140 Amount: 2
10 Series Standard Lift-Off Hinge - Right Hand Assembly 80/20 2064 Amount: 2
10 to 15 Series 2 Hole - Lite Transition Inside Corner Bracket 80/20 4509 Amount: 6
24”-long UV tube lights ADJ Products LLC T8-F20BLB24 Amount: 2
20W bulb – 24” Wavelength: 365nm
Acrylic Mirror Sheet Profesional Plastics Amount: 1
82.5 cm x 26.5 cm
Acrylic Mirror Sheet Profesional Plastics Amount: 2
26.5 cm X 30.5 cm
Acrylic Mirror Sheet Profesional Plastics Amount: 2
82.5 cm x 30.5 cm
AR polycarbonate (UV resistance) 80/20 65-2641 Amount: 2
4.5mm Thick, Clear, 38.5 cm x 26.5 cm
AR polycarbonate (UV resistance) 80/20 65-2641 Amount: 4
4.5mm Thick, Clear, 38.5 cm x 21.5 cm
AR polycarbonate (UV resistance) 80/20 65-2641 Amount: 4
4.5mm Thick, Clear, 26.5 cm x 21.5 cm
AR polycarbonate (UV resistance) 80/20 65-2641 Amount: 4
4.5mm Thick, Clear 37.5 cm x 23.9 cm
AR polycarbonate (UV resistance) 80/20 65-2641 Amount: 4
4.5mm Thick, Clear , 24.4 cm x 23.9 cm
Chromatography paper (thin paper)  Thermo Fisher Scientific 57144
Cosmos blotting paper (thick paper) Blick Art Materials 10422-1005
Excel Microsoft Corporation
GraphPad Prism GraphPad Software Version 9.4.0 graphing and statistics software
ImageJ FIJI NIH
Parafilm Merck transparent film
Quick Time Player 10.5 software  Apple multimedia player
Security spy Ben software video surveillance software system
Standard End Fastener, 1/4-20 80/20 3381 Amount: 80
UV transmitting acrylic Spartech Polycast Solacryl SUVT Amount: 2
38.5 cm x 26.5 cm 
Water gel: HydroGel ClearH2O   70-01-5022 (https://www.clearh2o.com/product/hydrogel/)
Webcam Logitech C930e Amount: 4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. The urothelium: life in a liquid environment. Physiological Reviews. 100 (4), 1621 (2020).
  2. de Groat, W. C., Griffiths, D., Yoshimura, N. Neural control of the lower urinary tract. Comprehensive Physiology. 5 (1), 327 (2015).
  3. Dalghi, M. G., et al. Functional roles for PIEZO1 and PIEZO2 in urothelial mechanotransduction and lower urinary tract interoception. JCI Insight. 6 (19), (2021).
  4. Montalbetti, N., et al. Bladder infection with uropathogenic Escherichia coli increases the excitability of afferent neurons. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 322 (1), 1 (2022).
  5. Montalbetti, N., et al. Increased urothelial paracellular transport promotes cystitis. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 309 (12), 1070 (2015).
  6. Montalbetti, N., et al. Urothelial tight junction barrier dysfunction sensitizes bladder afferents. eNeuro. 4 (3), (2017).
  7. Montalbetti, N., Stocker, S. D., Apodaca, G., Bastacky, S. I., Carattino, M. D. Urinary K+ promotes irritative voiding symptoms and pain in the face of urothelial barrier dysfunction. Scientific Reports. 9 (1), 5509 (2019).
  8. Kim, A. K., Hamadani, C., Zeidel, M. L., Hill, W. G. Urological complications of obesity and diabetes in males and females of three mouse models: temporal manifestations. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 318 (1), 160 (2020).
  9. Bartolone, S. N., et al. Micturition defects and altered bladder function in the klotho mutant mouse model of aging. American Journal of Clinical and Experimental Urology. 8 (3), (2020).
  10. de Rijk, M. M., et al. Aging-associated changes in oxidative stress negatively impacts the urinary bladder urothelium. International Neurourology Journal. 26 (2), 111 (2022).
  11. Coyne, K. S., et al. The prevalence of lower urinary tract symptoms (LUTS) and overactive bladder (OAB) by racial/ethnic group and age: results from OAB-POLL. Neurourology and Urodynamics. 32 (3), 230 (2013).
  12. Wittig, L., Carlson, K. V., Andrews, J. M., Crump, R. T., Baverstock, R. J. Diabetic bladder dysfunction: a review. Urology. 123, (2019).
  13. Irwin, D. E., et al. Population-based survey of urinary incontinence, overactive bladder, and other lower urinary tract symptoms in five countries: results of the EPIC study. European Urology. 50 (6), 1314 (2006).
  14. Bogart, L. M., Berry, S. H., Clemens, J. Q. Symptoms of interstitial cystitis, painful bladder syndrome and similar diseases in women: a systematic review. The Journal of Urology. 177 (2), 450 (2007).
  15. Foxman, B. Urinary tract infection syndromes: occurrence, recurrence, bacteriology, risk factors, and disease burden. Infectious Disease Clinics of North America. 28 (1), 1 (2014).
  16. Fall, M., Logadottir, Y., Peeker, R. Interstitial cystitis is bladder pain syndrome with Hunner's lesion. International Journal of Urology. 21, 79 (2014).
  17. Birder, L. A. Urinary bladder, cystitis and nerve/urothelial interactions. Autonomic Neuroscience: Basic & Clinical. 182, 89 (2014).
  18. Rosen, J. M., Klumpp, D. J. Mechanisms of pain from urinary tract infection. International Journal of Urology. 21 Suppl. 1, 26 (2014).
  19. Birder, L., et al. Neural control of the lower urinary tract: peripheral and spinal mechanisms. Neurourology and Urodynamics. 29 (1), 128 (2010).
  20. Desjardins, C., Maruniak, J. A., Bronson, F. H. Social rank in house mice: differentiation revealed by ultraviolet visualization of urinary marking patterns. Science. 182 (4115), 939 (1973).
  21. Sugino, Y., et al. Voided stain on paper method for analysis of mouse urination. Neurourology and Urodynamics. 27 (6), 548 (2008).
  22. Hill, W. G., Zeidel, M. L., Bjorling, D. E., Vezina, C. M. Void spot assay: recommendations on the use of a simple micturition assay for mice. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 315 (5), (2018).
  23. Rajandram, R., et al. Intact urothelial barrier function in a mouse model of ketamine-induced voiding dysfunction. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 310 (9), (2016).
  24. Ruetten, H., et al. A uropathogenic E. coli UTI89 model of prostatic inflammation and collagen accumulation for use in studying aberrant collagen production in the prostate. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 320 (1), 31 (2021).
  25. Wegner, K. A., et al. Void spot assay procedural optimization and software for rapid and objective quantification of rodent voiding function, including overlapping urine spots. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 315 (4), (2018).
  26. Wood, R., Eichel, L., Messing, E. M., Schwarz, E. Automated noninvasive measurement of cyclophosphamide-induced changes in murine voiding frequency and volume. The Journal of Urology. 165 (2), 653 (2001).
  27. Dmochowski, R. R. Bladder outlet obstruction: etiology and evaluation. Reviews in Urology. 7 (Suppl 6), S3–S13. , (2005).
  28. Aizawa, N., Homma, Y., Igawa, Y. Influence of high fat diet feeding for 20 weeks on lower urinary tract function in mice. Lower Urinary Tract Symptoms. 5 (2), 101 (2013).
  29. Wang, Z., et al. Void sorcerer: an open source, open access framework for mouse uroflowmetry. American Journal of Clinical and Experimental Urology. 7 (3), 170 (2019).
  30. Verstegen, A. M., Tish, M. M., Szczepanik, L. P., Zeidel, M. L., Geerling, J. C. Micturition video thermography in awake, behaving mice. Journal of Neuroscience Methods. 331, 108449 (2020).
  31. Keller, J. A., et al. Voluntary urination control by brainstem neurons that relax the urethral sphincter. Nature Neuroscience. 21 (9), (2018).
  32. Hou, X. H., et al. Central control circuit for context-dependent micturition. Cell. 167 (1), 73 (2016).
  33. Negoro, H., et al. Involvement of urinary bladder Connexin43 and the circadian clock in coordination of diurnal micturition rhythm. Nature Communication. 3, (2012).
  34. Montalbetti, N., Carattino, M. D. Acid-sensing ion channels modulate bladder nociception. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 321 (5), (2021).
  35. Chen, H., Zhang, L., Hill, W. G., Yu, W. Evaluating the voiding spot assay in mice: a simple method with complex environmental interactions. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 313 (6), (2017).
  36. Dalghi, M. G., et al. Expression and distribution of PIEZO1 in the mouse urinary tract. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 317 (2), 303 (2019).
  37. Birder, L., Andersson, K. E. Animal modelling of interstitial cystitis/bladder pain syndrome. International Neurourology Journal. 22, (2018).
  38. Okinami, T., et al. Altered detrusor gap junction communications induce storage symptoms in bladder inflammation: a mouse cyclophosphamide-induced model of cystitis. PLoS One. 9 (8), (2014).
  39. Tungtur, S. K., Nishimune, N., Radel, J., Nishimune, H. Mouse Behavior Tracker: An economical method for tracking behavior in home cages. Biotechniques. 63 (5), (2017).
  40. Negoro, H., Kanematsu, A., Yoshimura, K., Ogawa, O. Chronobiology of micturition: putative role of the circadian clock. The Journal of Urology. 190 (3), (2013).

Tags

التراجع ، العدد 192 ، مقايسة بقعة الفراغ ، المثانة البولية ، وظيفة الإفراغ ، التبول ، قياس المثانة
مقايسة بقعة الفراغ في الوقت الحقيقي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dalghi, M. G., Montalbetti, N.,… More

Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Wheeler, T. B., Apodaca, G., Carattino, M. D. Real-Time Void Spot Assay. J. Vis. Exp. (192), e64621, doi:10.3791/64621 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter