Summary
本文介绍了一种通过将视频监测纳入常规空隙点测定来研究小鼠排尿行为的新方法。这种方法提供有关排尿事件的时间、空间和体积信息，以及一天中明亮和黑暗阶段小鼠行为的细节。
Abstract
正常的排尿行为是膀胱、尿道和尿道括约肌在神经系统适当控制下协调功能的结果。为了研究小鼠模型中的自愿排尿行为，研究人员开发了空隙斑点测定法（VSA），这是一种测量沉积在动物笼子地板上的滤纸上的尿斑数量和面积的方法。虽然技术上简单且便宜，但该测定在用作终点测定时具有局限性，包括缺乏排尿事件的时间分辨率和难以量化重叠的尿点。为了克服这些限制，我们开发了一种视频监控的VSA，我们称之为实时VSA（RT-VSA），它使我们能够确定排尿频率，评估排尿量和排尿模式，并在一天的黑暗和光明阶段进行6小时时间窗口的测量。本报告中描述的方法可以应用于各种基于小鼠的研究，这些研究探索健康和疾病状态下自愿排尿的生理和神经行为方面。
Introduction
尿液储存和排尿由中枢回路（中枢神经系统）协调，该回路通过盆腔和下胃神经接收有关膀胱充盈状态的信息。尿路上皮是排列从肾盂到近端尿道的尿路上皮，对尿液中存在的代谢废物和病原体形成紧密的屏障。它是感觉网的一个组成部分，它感知膀胱的充盈状态并将其传达给下面的组织和传入神经1，2。尿路上皮屏障的破坏或尿路上皮机械转导通路的改变可导致排尿功能障碍以及下尿路症状，例如尿频、尿急、夜尿和尿失禁3，4，5，6，7。同样，衰老、糖尿病、下尿路感染、间质性膀胱炎和其他影响膀胱或控制其功能的相关回路的疾病过程已知会导致膀胱功能障碍8，9，10，11，12，13，14，15，16，17， 18，19.更好地了解正常和异常的排尿行为取决于能够可靠地区分不同排尿模式的方法的发展。
传统上，小鼠的自愿排尿行为已使用由Desjardins及其同事20开发的空隙点测定（VSA）进行了研究，并由于其简单，低成本和非侵入性方法而被广泛采用8，21，22，23，24。该测定通常作为终点测定进行，其中小鼠在衬有滤纸的笼子中花费规定的时间，随后通过计数数量并评估尿点的大小来分析当滤纸置于紫外线（UV）光下时（尿斑在这些条件下发出荧光）20.尽管有这么多优点，但传统的VSA存在一些主要限制。由于小鼠经常在同一区域排尿，研究人员必须将测定的持续时间限制在相对较短的时间内（≤4小时）25。即使在较短的时间内进行VSA，也几乎不可能分辨落在大空隙斑点上的小空隙斑点（SVS），或者将SVS与粘附在尾巴或爪子上的尿液残留区分开来。也很难区分 SVS 是频繁但个体的排尿事件（膀胱炎4，26 经常观察到的表型）的结果，还是排尿后滴漏（与膀胱出口梗阻相关的表型27）。此外，希望在工作时间内完成测定，加上在灯关闭时难以进入住房设施，通常将这些测定限制在24小时昼夜节律周期的光照期。因此，这些时间限制阻止了对小鼠在活跃夜间阶段的排尿行为的评估，从而降低了分析受昼夜节律控制的特定基因或治疗的能力。
为了克服其中一些限制，研究人员开发了实时评估排尿行为的替代方法26，28，29，30，31，32。其中一些方法涉及使用昂贵的设备，例如代谢笼26，28，29或使用热像仪30;但是，这些也有局限性。例如，在代谢笼中，尿液倾向于粘附在网状地板的电线和漏斗壁上，从而减少收集和测量的尿液量。因此，很难准确收集有关小空隙的数据。此外，代谢笼不能提供有关排尿事件的空间分布的信息（即，角落排尿与腔室中心排尿）。鉴于热像仪使用的长波长红外辐射不会穿透固体，因此通过视频热成像评估的空洞活动必须在开放系统中进行，这对于活跃的小鼠来说可能具有挑战性，因为它们可以在空中跳跃几英寸。另一个系统是自动空隙纸上污渍（aVSOP）方法33，它由卷制滤纸组成，以恒定速度卷绕在鼠笼的金属丝网地板下方。这种方法可以防止纸张损坏和经典VSA中发生的尿点重叠，并且其实施允许研究人员在几天内进行实验。然而，它不能为研究者提供排尿事件的精确时间，并且无法检查行为及其与斑点的相关性。为了获得这些信息，研究人员将视频监测纳入排尿测定，这种方法可以同时评估小鼠活动和排尿事件31，32。一种方法包括在实验笼下方放置一个蓝色发光二极管（LED）和一个带有绿色荧光蛋白滤光片的摄像机，以可视化排尿事件，并在笼子上方放置一个红外LED和一个摄像机以捕获小鼠位置32。此设置已用于在执行光纤光度测量时监测空洞行为;然而，该系统的明亮环境要求研究人员用利尿剂治疗小鼠以刺激排尿。在另一项实验设计中，将广角相机放置在实验笼的上方和下方，以分别可视化小鼠运动活动和排尿事件。在这种情况下，通过用放置在笼子31下方的紫外线灯照亮滤纸，可以发现沉积在笼子地板衬里的滤纸上的尿点。该装置在一天的光照阶段用于持续时间为4分钟的短测定，以研究参与自愿排尿行为的脑干神经元31。没有报告该系统在暗相或>4分钟时间段内的适用性。
本文介绍了一种通过允许对鼠标排尿行为进行长期视频监控来增强传统VSA的方法。这种经济高效的方法提供了关于一天中光明和黑暗阶段长时间排尿事件的时间、空间和体积信息，以及与小鼠行为相关的细节3，4，34。提供了有关空隙室的构造、实时 VSA （RT-VSA） 的实施以及数据分析的详细信息。RT-VSA对于寻求了解控制泌尿系统功能的生理机制，开发控制排尿的药理学方法以及定义影响下尿路的疾病过程的分子基础的研究人员很有价值。
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Protocol
尿路上皮压电1 /2双敲除小鼠（Pz1/2-KO，基因型： 压电1 fl/fl;压电2 fl/fl;Upk2CRE+/-）和对照（Pz1/2-C，基因型： Piezo1 fl/fl;压电2 fl/fl;Upk2CRE-/-）由从Jax实验室获得的亲本菌株（Piezo1 fl/fl 菌株#029213; 压电2 fl/fl 应变 # 027720; Upk2CRE+/- 应变 # 029281）。实验中使用雌性（1.5-3个月大，体重17-20g）和雄性（2-4个月大，体重23-29g）小鼠。对于环磷酰胺诱导的膀胱炎实验，使用野生型C57Bl / 6J雌性（3个月大，体重~20g）（杰克逊实验室，菌株#000664）。在匹兹堡大学机构动物护理和使用委员会的批准下，动物被饲养并在匹兹堡大学动物护理设施中进行实验。所有动物实验均按照《关于人道护理和使用实验动物的公共卫生服务政策》和《动物福利法》的相关准则和规定进行。
1. 实时空隙点测定（RT-VSA）保持架的组装
- RT-VSA钻机由一个装有两个紫外线灯泡的紫外线支架和两个广角摄像头（底部摄像头）组成，用于记录一天中光照阶段的排尿活动。安排两个鼠标室放在支架上。将广角相机（顶部相机）连接到每个小鼠室的盖子上，用于记录一天黑暗阶段的排尿活动（图1A）。
- 从 1 英寸 x 1 英寸 T 型槽铝型材构建 UV 支架和鼠标室的框架。有关用于构建两个鼠标室和UV支架的组件列表，请参见 表1 ，有关组装组件和尺寸的不同视图，请参见 表1B-D 。
- 用八个切割成 10 英寸的 T 型槽铝型材和四个切割到 14.75 英寸的 T 型槽铝型材构建每个鼠标室。首先组装鼠标室的底部，并使用标准端部紧固件（表1）根据 图1组装T型槽型材。将38.5厘米x 26.5厘米的紫外线透射亚克力安装在型材的内部通道中，以构建鼠标室的地板。
注意： 有关如何将 T 型槽型材与标准端部紧固件组装的详细信息，请访问公司网页。 - 用其余的轮廓建造鼠标室的墙壁。将 38.5 cm x 21.5 cm 和 26.5 cm x 21.5 cm 耐磨 （AR） 聚碳酸酯面板安装在型材中，以组装鼠标室的外壁。使用 37.5 cm x 23.9 cm 和 24.4 cm x 23.9 cm AR 聚碳酸酯面板构建鼠标室的内部。
- 用标准端部紧固件 1/4-20 胎面固定 AR 聚碳酸酯面板。请参阅步骤 1.3 注释中有关如何在网页上的配置文件中安装面板的说明。使用商用硅胶填缝剂密封内部面板之间的连接处。
- 使用两个 12 英寸和两个 14.75 英寸的 T 型槽型材组装笼盖，如图 1B 所示。在型材的内部通道中安装一块 38.5 cm x 26.5 cm 的 AR 聚碳酸酯面板以完成盖子。
- 垂直于保持架顶部长轴安装12英寸相机轮廓支架，并在角支架内用两个轻过渡固定（在图1B中标记为3）。使用直平板（标记为 2）作为网络摄像头安装支架，如图 1B 所示进行安装。使用相机安装螺钉将摄像机安装到支架上。
- 使用 10 系列标准提离铰链右手组件将盖子连接到鼠标室的主体上（图1 B 中标记为 1）。
- 根据 图 1C，D 构建 UV 支架，将四个 T 型槽型材切割到 40 英寸，将四个 T 型槽型材切割到 32 英寸，将四个 T 型槽型材切割到 10 英寸。在型材中安装82.5厘米x 26.5厘米的亚克力镜板，以构建UV室的底部。
- 使用82.5厘米x 30.5厘米和26.5厘米x 30.5厘米的亚克力镜板来构建UV支架的墙壁。
- 连接 10 系列五孔 T 平板（图 1 C 中标记为 2）、10 系列五孔 L 平板（图 1 C 中标记为 3）和 10 系列五孔 T 形平板（图1 C 中标记为 1）以固定 UV 支架。
- 将底部摄像头安装在切割成 32 英寸的 T 型槽型材中，并使用两个轻量级过渡角支架固定在支架底部，如图 1D 所示。使用直平板将网络摄像头连接到 T 型槽型材。
- 将紫外灯安装在内部、正面和背面轮廓上，并连接到直平板上，如图 1D 所示。
- 将四个网络摄像头连接到运行视频监控软件的计算机的 USB 端口。
2. 实验前的动物饲养
- 家养实验小鼠，无论是专门繁殖的还是从外部站点获得的，四人一组。如果可能，使用年龄匹配的雌性或雄性小鼠进行这些实验。如果动物是从外部来源获得的，在进行任何实验程序之前，让它们适应至少 7 天。
- 在动物设施的整个过程中，将动物安置在装有垫料和富集物（例如，塑料冰屋，轮子，用于切碎的纸）的标准笼子中，并将它们保持在12小时的昼夜循环下，随意获得水和干老鼠食物。
3. 一天中明暗阶段的 RT-VSA 录音
注意：以下协议描述了使用RT-VSA来评估小鼠在一天的光明和黑暗阶段的排尿行为。将动物保持在12小时的光照和12小时的黑暗循环中，Zeitgeber时间（ZT）= 0在上午07：00。光相实验的记录在上午 10：30 至上午 11：00 （ZT = 3.5–4.0） 之间开始，暗相实验的记录在下午 06：00 至晚上 06：30 （ZT = 11.0–11.5） 之间开始。当在两种条件下测试动物时，实验通常在两个不同的日期进行，在浅色和深色测试之间至少连续5天。不应在清洁动物房间或更换笼子的日子进行实验，因为这些会导致影响排尿行为的压力。所有步骤都应在小鼠压力最小的条件下进行。
- 将实验动物从其住房位置运送到RT-VSA记录室所在的手术室。
- RT-VSA记录室制备
- 将一张滤纸（24.3 cm x 36.3 cm）放在每个 RT-VSA 记录笼的底部。根据一天中的时间，使用薄（浅相实验）或厚（暗相实验）滤纸。
注意：在活跃的暗相期间使用厚滤纸，因为它比薄滤纸更耐碎。顶部相机用于可视化暗期沉积在厚滤纸上的尿点。相反，在光照阶段，使用底部相机，因为环境光阻止顶部相机检测沉积在滤纸上的尿点。在这种情况下，使用薄滤纸。我们发现底部相机在检测沉积在厚滤纸上的小空洞事件方面无效。 - 在滤纸上，放置以下物品：塑料冰屋（提供睡眠空间）、用于富集目的的无菌 1.5 mL 微量离心管和 60 mm x 15 mm 塑料培养皿，其中包含两片或三片小鼠干食物和 14-16 g 凝胶包形式的水（非润湿水凝胶;图2）。
注意：使用1.5 mL微量离心管进行富集是本研究中使用的外壳特有的。 - 一旦记录室准备好，轻轻地将实验小鼠放在滤纸上，将它们轻轻地放入其中。确保动物从笼子转移到记录笼子时应力最小。
- 一旦所有实验动物都进入他们的记录笼，盖上盖子，用吸收性工作台蓝垫盖住盖子的顶部，以尽量减少有机玻璃盖表面上的直接环境光反射。
- 打开下腔室的紫外线灯。
注意：动物不与紫外线直接接触。推荐的紫外线在材料部分有详细说明。
- 将一张滤纸（24.3 cm x 36.3 cm）放在每个 RT-VSA 记录笼的底部。根据一天中的时间，使用薄（浅相实验）或厚（暗相实验）滤纸。
- RT-VSA 录音
- 要录制来自顶部和底部摄像机的视频，请使用视频监控录制软件，该软件可以配置为一次从多个网络摄像头或网络摄像机录制。
- 打开程序后，按程序窗口中的 命令 和 R 开始录制。以每秒 1 帧的速率执行视频录制。
- 开始录音后，立即退出房间，轻轻关上门。确保房间在整个实验过程中保持安静。
- 完成 RT-VSA 录制
- 7小时（光相实验）或第二天早上（暗相实验）后返回手术室。
- 按 Command 和 T 停止录制。关闭紫外线灯。
- 停止录制后，软件会自动为每台摄像机生成一个动画文件（.m4v格式），并将其以相机名称保存在先前选择的目标文件夹中。验证在每个相机文件夹中，实验是否按日期组织到文件夹中。
- 在每个日期/实验文件夹中，验证是否存在一个.m4v文件以及与每个影片帧对应的所有单个.jpeg文件。
- 注意：.jpeg文件可用于恢复实验，以防电影文件损坏。
- 在桌面上创建一个包含实验名称和日期的文件夹，并将所有.m4v文件传输到此文件夹中。如果需要，请在保存并备份影片文件后删除.jpeg文件。
- 注意：对于浅相位实验，软件将为每个相机生成一个短片，而对于暗相实验，它将为每个相机生成两个短片。这是因为在日期更改的午夜之后会生成新的.m4v文件。
- 将包含电影的文件夹复制到闪存驱动器中，以便在外部计算机中进行分析。此步骤可能需要几分钟时间，并且可以与步骤 3.5.1 到 3.5.3 并行执行。
- 清洁记录笼并将实验小鼠转移回其住所
- 取下覆盖笼盖的蓝垫。将动物从记录笼转移到它们的笼子里。
- 取出记录室中的配件和食品（即塑料冰屋、塑料管、带有食物和水凝胶的盘子以及滤纸），并将其丢弃在生物危害废物中。
- 使用手持式真空吸尘器清洁笼子，清除笼子底部的食物和粪便颗粒。然后，用 70% 乙醇喷洒笼子的地板和内壁，并用一块软布清洁内部。打开笼子的盖子，让它们风干。
- 将装有动物的笼子放在第二个容器中，然后将动物运回其住房位置。
4. 生成校准曲线
注意：需要校准曲线将空隙斑点区域转换为尿量。如果在一天的明暗阶段进行实验，则应生成两条校准曲线，每种类型的滤纸（薄滤纸和厚滤纸）各一条。校准曲线一式两份生成。每次复制都在放置在RT-VSA记录室中的滤纸上运行。鉴于其复杂的成分和紫外线兴奋性，使用小鼠尿液进行校准曲线。
- 小鼠尿液收集
- 取一块柔性透明薄膜（10 cm x 15 cm），放在长凳上。
- 拴住一只老鼠的尾巴，揉捏它。轻轻按摩小腹以诱导排尿。在透明膜塑料片的表面上收集尿液。
- 将动物轻轻放入笼子内。使用移液器将尿液从透明薄膜表面转移到无菌的 1.5 mL 微量离心管中。对多只小鼠重复该过程，直到收集~10mL小鼠尿液，汇集尿液，并储存在-20°C。
注意：总共需要~10 mL小鼠尿液才能生成明相和暗相的重复校准曲线。为避免对实验小鼠造成压力，请勿使用将进行RT-VSA实验的小鼠进行尿液收集。
- 校准曲线记录
- 解冻在步骤4.1中收集的尿液，并通过轻轻涡旋10-15秒将其混合。
- 将一张薄滤纸（24.3 cm x 36.3 cm）放入两个 RT-VSA 记录笼中。
- 在每个滤纸上吸取以下尿量（μL）：2、5、10、25、50、80、100、200、300、400、500和750。为防止由于扩散而导致光斑重叠，请将光斑彼此分配在足够的距离处。
- 合上笼子的盖子并用垫子盖住它们。
- 按 Command 和 R 开始记录，应用用于记录实验的相同软件参数（步骤 3.3）。
- 记录校准曲线1小时，以允许尿斑的最大扩散。按 命令 和 T 停止录制。
- 在桌面上创建一个新文件夹，将.m4v文件放入其中，然后将数据传输到闪存驱动器以进行后续分析。
- 执行类似的过程以使用厚滤纸生成重复曲线。在这种情况下，添加额外的焊盘层以使内部变暗并模拟暗相条件。
- 分析校准曲线记录
- 在电影播放器软件中打开.m4v文件，最大化窗口以填充屏幕。要分析在厚滤纸上执行的校准曲线，请使用使用顶部相机获得的文件（图3A）。要分析在薄滤纸上执行的校准曲线，请使用底部相机获得的文件（图3B）。
- 播放.m4v文件，向前和向后移动时间滑块以获得完整的1 h校准曲线视频的概览。
- 确定较小尿点 （<25 μL） 强度最大且扩散最大的时间范围。在此时间范围内截取屏幕截图。命名屏幕截图文件并将其另存为.png文件（图3A，上图）。
注意：屏幕截图是通过按F6键拍摄的。要设置F6进行屏幕截图获取，请选择： 系统偏好设置>键盘>快捷键，然后在右侧的框中写入F6 将 屏幕图片另存为文件 选项。 - 确定中型和大型尿点（>50 μL）具有最大面积的时间范围并截取屏幕截图。当较大的尿斑表现出最大扩散时，一些较小的尿斑可能已经不可见。命名文件并将屏幕截图另存为.png文件（图 3A，下图）。
- 打开 ImageJ 软件 （NIH），然后拖放步骤 4.3.3 中获得的.png文件图标以打开图像文件（图 4A）。
- 从工具栏中，选择多边 形选择 图标，然后描绘滤纸的边框。
- 然后，从菜单栏中选择 分析 ，从展开的菜单中选择 设置测量 值，然后从弹出的窗口中选择 区域。单击“ 确定”。这允许在执行步骤4.3.8时获得面积值。
- 接下来，从菜单栏中再次选择“ 分析” ，然后从展开的选项中选择 “度量 ”。弹出一个结果窗口，其中包含一个列区域，该列区域以像素2 为单位显示区域值（图 4B–D）。
- 从工具栏中选择“ 手绘选择” 图标，并使用它来在单个空白点的周边绘制一条线。如步骤4.3.8所示测量面积。软件会在执行新测量时更新结果表。新数字集显示在以前的数字集下方。记录每个分析点的结果窗口列区域下显示的数字（图4E–G）。
- 对每个复制点重复步骤 4.3.5 到 4.3.7。
- 将滤纸的总面积设置为100%，并计算每个尿点的面积百分比（%面积）。此归一化将纠正由于摄像机的变焦或定位差异而可能发生的错误。
- 在图形程序中创建一个新的XY表，并在X列中插入尿量值（以μL为单位），在Y列中插入%面积的重复值。
- 然后，选择“分析”>“分析”>“XY 分析”>“非线性回归（曲线拟合）”。从出现的参数窗口中，选择模型>多项式>二阶多项式（二次）。
- 然后，从方法选项卡中，单击以标记以下选择：“ 最小二乘回归”、“ 无加权”，并将 每个重复 Y 值视为单个点。
- 从约束选项卡中，选择“ B0”、“约束类型”>“常量等于”，然后在 “值 ”列下键入 0。单击“ 确定”。
5.实验小鼠记录分析
- 打开在亮相（下部相机）或暗相（上部照相机）期间收集的影片文件进行分析。
- 通过向前和向后移动时间滚动器来评估电影文件的质量，确认滤纸在要分析的6小时时间窗口内保持完整（没有撕裂或咀嚼）。如果纸张撕裂，则不要执行进一步分析，因为鼠标可能在无法量化的暴露塑料上小便（图5）。
- 要分析在明相或暗阶段收集的实验，请使用快进命令或时间栏滑块移动到所需的时间窗口。在上午11：00至下午05：00之间记录轻度阶段的排尿活动（ZT = 4.0-10.0）和午夜至06：00之间的黑暗阶段（ZT = 17.0–23.0）。
- 通过单击 >> 图标（或手动滚动电影）以快进模式播放电影，寻找鼠标正在排空的证据。判断这种情况发生的最简单方法是寻找滤纸上突然出现的尿液亮点。另一个指标是寻找行为变化，包括向笼子角落移动和小鼠排尿时短暂的不活动。
注意：随着人们在检测空隙方面变得更好，可以提高滚动或快进的速度。然而，在患有细菌和化学诱导的膀胱炎的小鼠中，它们有大量的小空隙4，34，如果一个人在电影中移动得太快，可能会错过排尿事件。 - 记录每个空隙发生的时间。按照惯例，在检测到尿液的第一个迹象时记录排尿时间（图6A，B）。
- 要测量空隙，首先使用滚动条向前（或向后）移动，寻找尿点发生最大扩散的时间点。此时暂停影片，并按照步骤 4.3.3 中所述截取屏幕截图。将计算机鼠标箭头放在要分析的点上，以便在屏幕截图中标记感兴趣的点（图6C，D）。
- 使用相关编号命名屏幕截图文件，以说明影片中的出现顺序。
- 继续分析文件，对影片上的每个空白点重复步骤 5.5 和 5.7。分析完所有空隙点后，通过捕获屏幕截图并使用4.3.6中所述的步骤测量滤纸的总面积。
- 如步骤4.3.9所述计算每个尿点的面积百分比。使用步骤 4 中生成的校准曲线和绘图软件中的插值函数，将每个空隙点的 % 面积值转换为尿量 （μL）。
- 在绘图软件中，打开包含校准曲线数据的XY表，并在校准曲线最后一个值下方的Y列中插入%面积值（图7A）。
- 单击 结果表 选项卡，然后在模型选项卡下，单击以选择“ 从标准曲线插值未知数 ”，然后按 OK。名为内插 X 平均值的选项卡将显示在结果选项卡的旁边。此选项卡包含一个表格，其中包含与每个排尿点的尿液体积（以μL为单位）相对应的插值。（图7A，B）。
- 重复步骤5.1至5.9以分析所有实验小鼠。
- 创建一个工作簿文件，其中包含从步骤 5.5 到 5.10 获得的数据，每个鼠标使用一个电子表格（图 7C）。为浅相实验创建一个文件，为暗相实验创建另一个文件。这些主文件包含用于进一步分析的所有原始数据和必要的计算。
6.实验小鼠排尿模式分析
- 生成初级和次级空隙点轮廓（图 8A、B 和图 9）。
注意：根据频率分布研究23，≥20 μL 的空隙斑点通常占总空隙体积的 >95%，被认为是原发性空隙斑点 （PVS）8，23，35。≤20 μL 的空隙斑点被视为二级或小空隙斑点 （SVS）。PVS 和 SVS 之间的区分已被证明是表征排尿表型的有用方法。SVS 数量升高提示排尿功能障碍35。- 从包含感兴趣的空隙斑点数据（亮相或暗相）的主文件中，根据体积将斑点分类为 PVS 当体积为 ≥20 μL 时为 PVS，或当体积为 <20 μL 时，将斑点分类为 SVS。
- 计算数字并计算 PVS 的平均空隙体积和总体积。 计算数字并计算 SVS 的总体积。
- 生成一个图形条，将对照与每个计算参数的处理小鼠进行比较：PVS的数量，PVS的空隙体积，PVS的总体积，SVS的数量，SVS的总体积。
- 可选：生成累积排空体积图（阶梯函数）以显示随时间推移的排空行为（图 10 和 图 11）。
- 打开工作簿主文件，并将以小时、分钟和秒表示的无效时间转换为十进制形式。计算每个时间点的累积尿量（以μL为单位）。
- 在绘图软件中生成一个XY表，X列中以十进制形式显示时间，Y列中显示累积尿量。将时间和尿量数据复制到表中。添加 （0; 0） 和 （6; 最大值） 数据点。这些点对于在实验开始时（时间：0小时）当排尿量为零（0;0）时，以及在实验结束时（时间：6小时）当排尿的累积值等于最后一次排尿事件获得的值（6;最大值）时完成图的水平线是必要的。
- 双击图表;应出现“设置图形格式”窗口。选择 外观 选项卡，单击以取消选择 显示符号 按钮，然后单击以选择 显示连接线/曲线。单击 样式 选项并选择 生存。
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Representative Results
尿路上皮 压电1/2 基因敲除小鼠的排尿行为
在排尿周期的储存阶段，假设尿路上皮细胞感知膀胱中积聚的尿液所施加的张力，并将这种机械刺激转化为细胞反应，例如浆膜 ATP 释放1，3。我们之前已经证明，机械激活的PIEZO1和PIEZO2通道在小鼠尿路上皮3，36中表达。为了确定尿路上皮PIEZO通道对正常排尿行为是否重要，我们对尿路上皮条件Piezo1 / 2双敲除小鼠（Pz1 / 2-KO）小鼠和年龄和性别匹配的对照（ Pz1 / 2-C ; 图9）。我们在一天的黑暗和光明阶段测试雌性和雄性小鼠6小时，并分析步骤6.1中所述的数据。当我们比较对照组一天中明相和暗相之间的排尿活动时，注意到女性和男性在其活动期间PVS的数量和总量都有所增加。这一观察结果表明，即使小鼠处于异物环境中，小鼠排尿行为的昼夜节律性质（在其活跃的黑暗阶段最高）也得以保留。在它们的非活动光阶段，与对照组（Pz1 / 2-C）相比，我们没有观察到雌性或雄性Pz1 / 2-KO小鼠分析的任何参数有任何显着差异。然而，当我们在活跃的黑暗阶段测试动物时，雌性和雄性Pz1 / 2-KO小鼠都显示出改变的排尿表型，其特征在于SVS的数量和总体积显着增加（图9）。与相应的对照组相比，女性或男性Pz1/2-KO的PVS数量，每个PVS的平均体积或总PVS体积没有显着差异。这些结果表明，尿路上皮PIEZO1/2通道在小鼠非活动光期的排尿功能中起显着作用，但对于防止在其活动性黑暗阶段频繁点斑很重要。
图 9 中给出的结果说明了使用 RT-VSA 与端点 VSA 相比的两个优势。首先，如果仅在光照期进行分析，我们会错误地得出结论，尿路上皮PIEZO1/2通道在排尿功能中没有作用。其次，在大多数终点VSA研究中，SVS被视为实验噪声，在某些情况下被排除在后续分析之外23。在RT-VSA中，我们可以确定SVS是个体事件，而不是PVS（残留或末端排尿运球）的次要事件，并且是自愿的，因为动物移动到笼子的外围，排空，然后离开。这一观察结果为我们提供了有关Pz1 / 2-KO小鼠表型的宝贵信息，否则这些信息将被遗漏。
雌性小鼠在基础条件下和环磷酰胺治疗后的排尿行为
在这个试点实验中，我们测试了环磷酰胺（CYP）对小鼠自愿排尿行为的影响。环磷酰胺是一种用于治疗某些形式的癌症或免疫疾病的药物，已知会导致患者和实验动物的膀胱炎，导致膀胱过度活动表型，其特征是多次小排尿事件26，37，38。为了确定基线排尿行为，我们在黑暗阶段将一只未经治疗的雌性小鼠置于RT-VSA中。5天后腹膜内注射同一只小鼠的CYP（150mg / kg）以引起急性膀胱炎。注射后，立即将鼠标置于RT-VSA笼中进行记录。排尿行为用阶梯图表示（图11），垂直线表示排尿量，水平线表示时间。与在基础条件下获得的结果相比，很明显，在CYP治疗后，每次排尿释放的尿量较小，并且排尿事件更加频繁。这在图表的插图中可以更好地理解，其中分析期的前30分钟（对应于午夜至上午00：30[注射后7.0至7.5小时]）被放大。
图 1：RT-VSA 记录室。（A） RT-VSA记录系统包括上部，由两个并排的透明丙烯酸室和相关的上部摄像机组成。该设备的下半部分是一个单元支架，用于容纳鼠标上部室，并包含底部摄像头和紫外线灯。展台墙壁的内部由镜板制成，镜板反射紫外线，为笼子底部提供均匀的照明。未描绘的是一台从摄像机接收视频馈送并记录数据的计算机。（B）具有组件和尺寸的鼠标室模型。1）标准提离铰链;2）摄像机安装支架;3）精简过渡角支架。带有组件和尺寸的 UV 支架的前 （C） 和顶部 （D） 视图。紫外线灯通过直平板安装在前后型材的内部。一个 32 英寸的外形通过两个轻巧的过渡角支架固定在支架主框架上，用于安装摄像机。直平板用于将相机连接到 32 英寸型材上。镜面面板安装在支架内部（未显示）。 1）五孔三通平板;2）五孔T型平板;3）五孔L平板。显示的所有值均以英寸为单位。请点击此处查看此图的大图。
图 2：RT-VSA 鼠标室。 在实验程序之前，每个实验小鼠室都通过衬有一张滤纸（编号1）来制备。根据一天中进行实验的时间，使用的滤纸是厚（暗相）或薄（亮相）。将塑料圆顶放置在腔室的中心（编号为2），将装有水（以非润湿水凝胶的形式）和食物的塑料培养皿放置在圆顶的一侧（编号为3），并将塑料1.5mL微量离心管（一种富集形式）放置在另一侧（编号4）。在所有实验中，笼内元素的初始排列保持一致。请注意，在两个相邻的笼子之间放置了一张滤纸，并在图中用星号标记。这是为了防止相邻鼠标产生的视觉提示的影响。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：校准曲线。 用已知量的小鼠尿液发现厚（A，左图）和薄（B，左图）滤纸的代表性图像。图像是使用顶部（A，左侧面板）或底部（B，左侧面板）相机获得的视频记录的屏幕截图。红色箭头指向 2 μL 尿斑，斑点下方的数字是以 μL 为单位的斑点体积值。 请注意，在尿点（5 分钟）后不久可见的图上图上图（<50 μL）在 30 分钟后不再明显（下图）。右图：空隙斑点面积（表示为总滤纸面积的百分比）与尿量的函数关系图。正如其他人所指出的，作为尿量函数的空隙斑点面积数据不遵循线性关系30。因此，我们使用非线性回归将数据拟合到二阶多项式。数据受到约束，使得 X = 0 到 Y = 0。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：使用 ImageJ 测定滤纸和尿点区域。 （A） 在 ImageJ 中打开的 图 3A 所示校准曲线的屏幕截图。（A） 中的框区域在 （B） 中更详细地显示。（B） 选择多边形选择图标（以红色圆圈）以沿滤纸的周长绘制多边形（部分视图;黄色线，红色箭头指向选择工具生成的节点）。（C） 多边形的面积反映了滤纸的总面积，并通过选择 分析> 测量（红色圆圈）进行测量。（D） 区域的值（以像素为单位）显示在结果窗口（红色圆圈）中。（E） 要测量单个空隙点的面积，请选择手绘选择工具（红色圆圈），并在 （F） 中使用在点的边界周围绘制一条线（红色箭头指向该点）。使用与（C）中相同的命令，测量空隙点的面积，结果在结果窗口中显示为新值，紧邻上次测量的下方（图 G，红色圆圈）。 请点击此处查看此图的大图。
图5：完成RT-VSA实验后滤纸状态评估。 小鼠室的代表性图像显示了RT-VSA实验期间或之后滤纸的不同条件。在测试期结束之前保持完好无损的滤纸显示在（A）中，代表最常见的情况和可以进一步分析实验的条件（绿色复选标记）。损坏滤纸的例子如（B）和（C）所示，是不得进一步分析的实验的代表（红色X）。在（B）中，滤纸被鼠标（红色箭头）切碎其中一个角落。黄色虚线标记笼子地板的边界。框装区域在右侧的图像中被放大。在（C）中，由于鼠标将非润湿水凝胶（红色箭头）移动到角落，留下三个大水点（红色星号），实验的完整性受到损害。观看视频证实了这些动作。图像是在黑暗阶段获得的电影文件的屏幕截图，使用顶部相机，笼子内衬厚滤纸。 请点击此处查看此图的大图。
图 6：空隙时间的确定和空隙点区域测量的屏幕截图的采集。 （一，二）一张老鼠在房间角落里的截图，有一个刚刚变得可见的空白点。此帧的时间被注释为无效时间。（中，四）一旦空隙点达到最大扩散，就会截取屏幕截图以确定空隙的体积。图像是使用顶部相机、使用厚滤纸和黑暗阶段获得的电影文件的屏幕截图。分析时间为午夜至上午06：00， 请点击此处查看此图的大图。
图 7：将空隙点区域转换为尿量并生成包含实验原始数据的工作表文件。 （A） 绘图软件窗口的屏幕截图，显示空隙点的值，表示为总滤纸面积的百分比（数据以绿色勾勒）。工作表（绿色箭头）保存在数据表部分下。（B）总面积百分比与尿量换算（数据以红色概述）。后一个值显示在结果部分（红色箭头）中，并使用标准曲线函数的插值未知数根据校准曲线计算得出。（C） 包含已编译原始数据和计算数据的工作表的屏幕截图。 请点击此处查看此图的大图。
图 8：将空隙点分为 PVS 和 SVS 及其分析。 在基础条件（A）和接受一剂环磷酰胺（150mg / kg）（B）后7小时从小鼠发出的工作表（如图7C所示）的屏幕截图。如果体积为 ≥20 μL，则空隙斑点被归类为原发性空隙斑点 （PVS），如果体积为 <20 μL，则归类为小空隙点 （SVS）。 请注意，在未处理的小鼠（A）中，所有排尿事件都是PVS，而在环磷酰胺处理的动物中，大多数空隙是SVS。每个面板中的圆圈表（红色轮廓）包括以下汇总统计数据：空隙数、平均空隙体积和总空隙体积。请点击此处查看此图的大图。
图 9：Piezo1/2 敲除和对照小鼠的排尿行为。在一天的黑暗或光明阶段的6小时时间窗口内记录雌性（A）和雄性（B）压电1 / 2基因敲除（Pz1 / 2-KO）小鼠和对照对应物（Pz1 / 2-C）的排尿行为，并分析结果如步骤6.1中所述。数据显示为平均值±平均值的标准误差（S.E.M.）。使用曼-惠特尼检验比较数据。缩写：PVS = 初级空隙点;SVS = 小空隙斑点;NS = 不显著;* p < 0.05;** p < 0.01。这个数字是从3修改而来的。请点击此处查看此图的大图。
图 10：用于计算累积空隙体积和图形表示随时间变化的工作表。 （A） 图 7C 中生成的工作表的屏幕截图，显示了生成作为时间函数的排尿累积体积的阶梯函数图所需的计算。时间必须以十进制格式输入（G 列，红色方块）。为了将时间转换为十进制格式，在 void 时间列的右侧添加了三列（红色箭头），以分别注释小时（D 列）、分钟（E 列）和秒（F 列）的值，以及十进制格式的时间最终结果（G 列）。要将时间取消转换为十进制格式，请使用以下函数：（h） + （min/60） + （s/3，600）。在尿量列的右侧添加一列，以显示累积尿量（蓝色矩形），其计算为截至新排尿事件（包括新事件值）时获得的所有尿量（J列）的总和。（B） 显示从面板 A 中的工作表复制并粘贴到图形软件项目中的 X 列（十进制格式的时间）和 Y 列（累积尿量）中的数据的屏幕截图。图的第一个和最后一个时间点设置为 0 和 6（最大值）行，如红色箭头所示。（C） 要生成步长图，通过取消选择显示符号字段，启用显示连接线/曲线选项并选择生存样式来格式化图形， 如红色包围的字段所示。 请点击此处查看此图的大图。
图11：基础条件下或环磷酰胺给药后小鼠排尿行为的代表性结果。 如 代表性结果中所述，在给药前（基底）和环磷酰胺（CYP）给药后7小时的暗期用RT-VSA评估小鼠的自愿排尿行为。排尿事件的时间和体积在步骤6.2中生成的阶梯图中表示。图表的插图表示用绿色矩形标记的图面积，对应于分析周期的前 30 分钟。 请点击此处查看此图的大图。
图 12：通过 RT-VSA 识别重叠尿斑。 在 RT-VSA 实验的黑暗阶段使用顶部摄像头拍摄的视频帧的屏幕截图（图像 1 和 2）。图像 2 中的框框区域在图像 3 中放大。在接下来的几个小时内，鼠标在同一右上角又空了两次（图4-6）。尽管空位重叠，但使用RT-VSA很容易检测到单个排尿事件。为了可视化这些事件如何显示为终点测定，我们将滤纸的一角暴露在不同的照明条件下。在可见环境光下，只能识别出一个大的空隙斑点（影像 7）。同样，如果在紫外光下检查同一区域，只能区分一个黑点（图像8）。因此，RT-VSA很容易检测到同一区域中的多个空隙，但如果将分析作为终点测定进行，则无法进行这种区分。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
视频监控的结合是一种经济高效的修改，与传统的VSA相比具有几个优势。在通常用作终点测定的经典VSA中，很难区分重叠的空隙点。这不是一个微不足道的问题，因为当测定延长几个小时时，小鼠倾向于在同一区域多次排尿，通常是在笼子的角落。因此，RT-VSA的第一个优点是调查人员可以很容易地识别部分或全部沉积在一起的单个斑点。 图 12 所示的实验很好地说明了这一点。在这种情况下，视频记录确认鼠标在同一角落排空三次，沉积重叠的空白点。如果仅在实验结束时以VSA的典型方式分析滤纸，则只能区分一个点。因此，虽然经典的终点VSA可用于识别排尿行为的巨大差异，但它可能无法区分更微妙的表型。随着当前遗传学的进步和转基因动物的产生，开发能够准确评估排尿行为的方法至关重要。
其次，RT-VSA为研究者提供有关排尿事件的时间信息。因此，人们可以确定真正的排尿频率，以及建立排尿事件之间的关系。例如，在经典VSA中，在单个大型PVS旁边观察到一组SVS的情况下，人们无法轻易区分小鼠在实验过程中是否排尿多次（三个小空隙和一个大空隙），或者动物是否沉积了一个大尿量，并且三个较小的斑点是排尿后滴落或毛皮残留的结果。 RT-VSA可用于解决这些问题。
第三，RT-VSA允许人们分析小鼠在排尿事件之前，期间和之后的行为。调查人员还可以通过使用免费提供的软件（如鼠标行为跟踪器39）分析RT-VSA记录来监控鼠标的整体活动曲线。此外，人们可以区分动物是否停止排尿（雌性的典型行为），动物在排尿期间是否在运动（雄性可能导致排尿斑的尾随），或者它是否在睡眠/休息阶段排尿。我们已经观察到后一种行为，尽管通常很少见。因此，如果得到适当的验证和解释，观察排尿行为可以为研究者提供有关排尿功能障碍的宝贵见解，包括例如夜尿症或尿失禁。RT-VSA（和VSA）允许研究人员确定在笼子的中心区域而不是角落发生的空隙事件的比例。通常，中心排尿很少见，此类事件的数量增加是膀胱功能障碍的征兆8，22。唯一的例外是占主导地位的α-雄性，它们经常排尿，并在整个围栏内排尿20。为了使用RT-VSA对中央排尿进行分析，应考虑将食物盘移动到侧壁并移除圆顶（或将其固定在笼子的特定区域），以便更容易建立排尿的空间模式。
第四，与传统VSA相比，RT-VSA可以更有效地管理与保持架交换相关的应力。小鼠天生吝啬，处理它们或将它们转移到新环境会导致压力，已知这会影响排尿行为35。就其性质而言，很难将适应一段时间纳入标准VSA。相比之下，在RT-VSA中，可以很容易地将适应期纳入每个实验中，并且在分析过程中忽略了这段时间内的任何排尿事件。在该协议中实施的RT-VSA的另一个缓解压力的方面是复制通常饲养小鼠的条件（即随意获得食物和水，圆顶和玩具）。据我们所知，这是为此类实验描述的最丰富的环境之一。在典型的终点VSA中，小鼠被剥夺了水（有时也剥夺了食物）8，22，我们随意提供。
第五，除了这种富集的环境可能对小鼠的应激水平产生积极影响外，它还允许研究者长时间进行RT-VSA，通常在6小时时间窗口内;然而，最近我们一直在进行运行24小时的实验（数据未显示）。当评估昼夜节律性的影响或研究可能表现出膀胱表型不活跃的小鼠时，这是理想的选择，因此排尿不频繁。
对于24小时视频监控，我们建议使用薄滤纸并使用底部摄像机分析实验。纸张和相机的这种组合是允许在黑暗和明亮阶段进行检测灵敏度的最佳选择。如前所述，底部相机无法轻松检测到厚滤纸上的空隙点，而顶部相机在光照阶段无法可靠地检测到空隙点。如果进行这些扩展分析，我们建议在下午05：00将动物放入记录笼中，从第1天下午06：00开始分析，并在第二天下午06：00完成实验。
虽然RT-VSA有许多积极的方面，但也有一些注意事项值得注意。虽然我们在进行这些分析时尽一切努力限制压力，但我们无法完全复制小鼠的栖息地，因为这些动物通常是集体饲养的。他们还从瓶子里喝水，而不是从非湿润的水凝胶中取水。然而，我们观察到小鼠在非活跃的光期与活跃的暗相相比具有较少的空隙，这表明小鼠保留了正常的昼夜节律排尿行为模式40。反映它们容易受压的天性，我们发现小鼠在清洁笼子的日子里表现出破坏的排尿行为。因此，必须将分析限制在动物受常规畜牧业影响较小的时间段内。需要考虑的一个重要因素是紫外线是否对排尿功能有任何影响。因为我们的研究结果显示明相和暗相之间的VSA参数存在明显的昼夜节律差异，这与描述类似现象但没有使用紫外光40的其他技术一致，我们得出结论，紫外光照明不会影响排尿功能。请注意，滤纸可防止光线从下腔室传递到上腔室。
另一个警告是，将小鼠留在腔室中的时间越长，它们就越有可能咀嚼或损坏滤纸（无论纸的厚度如何）。虽然没有动物在光照阶段破坏纸张，但近30%的小鼠在黑暗活跃阶段损坏了纸张。在对24小时实验的分析中，我们观察到由于纸张损坏而无法分析相似比例（三分之一）的实验，这意味着不仅时间量，而且一天的阶段都会影响动物的切碎行为。不幸的是，根据我们的经验，我们注意到，即使重新测试，破坏笼子纸张的动物也会继续这样做。如上所述，小鼠有时会在裸露的丙烯酸地板上小便，因此纸张的损失使分析不完整且价值有限。
此外，对雄性排尿行为的分析可能更加困难，因为它们倾向于更频繁地排尿，它们可以在排尿后滴落，并且有一群雄性（20%）具有更具侵略性的α-雄性表型，其特征是分布在笼子上的大量小空隙，如早期出版物中所讨论的3.由于这种α-雄性行为可以构成建立排尿表型的混杂因素，因此我们将具有≥50（光相实验）或≥100（暗相实验）空隙的动物排除在分析之外。
在某些情况下，根据空隙的体积（即PVS与SVS）来区分空隙不一定是必要的。例如，根据我们的经验，患有细菌或化学膀胱炎的小鼠排尿量往往比对照组小4，34。然而，个体小鼠之间的空隙体积存在很大差异;在某些情况下，大多数空隙的体积为 ≤20 μL，而在其他情况下，大多数空隙的体积为 >20 μL。因此，对空隙体积的区分不能为这些表型的表征提供任何优势。
总之，RT-VSA是一种易于实现的工具，用于分析自由移动小鼠的小鼠排尿行为。与膀胱测量等工具不同，它不需要手术植入导管或非生理性膀胱充盈率。它允许确定两性小鼠的排尿行为，在较长时间内以及在日周期的光明和黑暗阶段。它也相对实惠，特别是与更专业和昂贵的设备（如代谢笼）相比。虽然此工具存在一些注意事项，但它们通常易于管理。最后，这种技术可以很容易地适应其他动物物种，包括其他啮齿动物。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了NIH资助R01DK119183（G.A.和MDC），通过P30DK079307（授予MGD）的试点项目奖，美国泌尿外科协会职业发展奖和温特斯基金会赠款（给NM），以及匹兹堡肾脏研究中心（P30DK079307）的细胞生理学和模式生物肾脏成像核心的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots – cut to 10 inches | 80/20 | 1010 | Amount: 20 |
| 1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots – cut to 12 inches | 80/20 | 1010 | Amount: 6 |
| 1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots – cut to 40 inches | 80/20 | 1010 | Amount: 4 |
| 1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots – cut to 14.75 inches | 80/20 | 1010 | Amount: 12 |
| 1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots – cut to 32 inches | 80/20 | 1010 | Amount: 5 |
| 1/4-20 Double Slide-in Economy T-Nut | 80/20 | 3280 | Amount: 16 |
| 1/4-20 Triple Slide-in Economy T-Nut | 80/20 | 3287 | Amount: 18 |
| 10 & 25 Series 2 Hole - 18mm Slotted Inside Corner Bracket with Dual Support | 80/20 | 14061 | Amount: 6 |
| 10 Series 3 Hole - Straight Flat Plate | 80/20 | 4118 | Amount: 8 |
| 10 Series 5 Hole - "L" Flat Plate | 80/20 | 4081 | Amount: 8 |
| 10 Series 5 Hole - "T" Flat Plate | 80/20 | 4080 | Amount: 8 |
| 10 Series 5 Hole - Tee Flat Plate | 80/20 | 4140 | Amount: 2 |
| 10 Series Standard Lift-Off Hinge - Right Hand Assembly | 80/20 | 2064 | Amount: 2 |
| 10 to 15 Series 2 Hole - Lite Transition Inside Corner Bracket | 80/20 | 4509 | Amount: 6 |
| 24”-long UV tube lights | ADJ Products LLC | T8-F20BLB24 | Amount: 2 20W bulb – 24” Wavelength: 365nm |
| Acrylic Mirror Sheet | Profesional Plastics | Amount: 1 82.5 cm x 26.5 cm |
|
| Acrylic Mirror Sheet | Profesional Plastics | Amount: 2 26.5 cm X 30.5 cm |
|
| Acrylic Mirror Sheet | Profesional Plastics | Amount: 2 82.5 cm x 30.5 cm |
|
| AR polycarbonate (UV resistance) | 80/20 | 65-2641 | Amount: 2 4.5mm Thick, Clear, 38.5 cm x 26.5 cm |
| AR polycarbonate (UV resistance) | 80/20 | 65-2641 | Amount: 4 4.5mm Thick, Clear, 38.5 cm x 21.5 cm |
| AR polycarbonate (UV resistance) | 80/20 | 65-2641 | Amount: 4 4.5mm Thick, Clear, 26.5 cm x 21.5 cm |
| AR polycarbonate (UV resistance) | 80/20 | 65-2641 | Amount: 4 4.5mm Thick, Clear 37.5 cm x 23.9 cm |
| AR polycarbonate (UV resistance) | 80/20 | 65-2641 | Amount: 4 4.5mm Thick, Clear , 24.4 cm x 23.9 cm |
| Chromatography paper (thin paper) | Thermo Fisher Scientific | 57144 | |
| Cosmos blotting paper (thick paper) | Blick Art Materials | 10422-1005 | |
| Excel | Microsoft Corporation | ||
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Version 9.4.0 | graphing and statistics software |
| ImageJ FIJI | NIH | ||
| Parafilm | Merck | transparent film | |
| Quick Time Player 10.5 software | Apple | multimedia player | |
| Security spy | Ben software | video surveillance software system | |
| Standard End Fastener, 1/4-20 | 80/20 | 3381 | Amount: 80 |
| UV transmitting acrylic | Spartech | Polycast Solacryl SUVT | Amount: 2 38.5 cm x 26.5 cm |
| Water gel: HydroGel | ClearH2O | 70-01-5022 | (https://www.clearh2o.com/product/hydrogel/) |
| Webcam | Logitech | C930e | Amount: 4 |
References
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