Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

Analyse af tomrum i realtid

Published: February 10, 2023 doi: 10.3791/64621
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1,2
1Renal-Electrolyte Division, Department of Medicine, University of Pittsburgh, 2Department of Cell Biology, University of Pittsburgh

Summary

Denne artikel beskriver en ny metode til at studere musetømningsadfærd ved at inkorporere videoovervågning i det konventionelle tomrumspunktassay. Denne fremgangsmåde giver tidsmæssig, rumlig og volumetrisk information om ugyldiggørelseshændelser og detaljer om museadfærd i dagens lyse og mørke faser.

Abstract

Normal tømningsadfærd er resultatet af den koordinerede funktion af blæren, urinrøret og urinrørets lukkemuskler under korrekt kontrol af nervesystemet. For at studere frivillig tømningsadfærd i musemodeller har forskere udviklet void spot assay (VSA), en metode, der måler antallet og arealet af urinpletter deponeret på et filterpapir, der beklæder gulvet i et dyrs bur. Selvom det er teknisk enkelt og billigt, har dette assay begrænsninger, når det bruges som et endepunktsassay, herunder mangel på tidsmæssig opløsning af ugyldiggørelseshændelser og vanskeligheder med at kvantificere overlappende urinpletter. For at overvinde disse begrænsninger udviklede vi en videoovervåget VSA, som vi kalder realtids VSA (RT-VSA), og som giver os mulighed for at bestemme ugyldiggørelsesfrekvens, vurdere ugyldige volumen- og ugyldiggørelsesmønstre og foretage målinger over 6 timers tidsvinduer i både dagens mørke og lyse faser. Metoden beskrevet i denne rapport kan anvendes på en lang række musebaserede undersøgelser, der udforsker de fysiologiske og neuroadfærdsmæssige aspekter af frivillig mikturering i sundheds- og sygdomstilstande.

Introduction

Urinopbevaring og mikturering koordineres af et centralt kredsløb (centralnervesystemet), der modtager information om blærens påfyldningsstatus gennem bækkenet og hypogastriske nerver. Urothelium, epitelet, der linjer urinvejen fra nyrebækkenet til det proksimale urinrør, danner en tæt barriere for de metaboliske affaldsprodukter og patogener, der er til stede i urinen. Det er en integreret del af et sensorisk net, som registrerer og kommunikerer blærens påfyldningstilstand til underliggende væv og afferente nerver 1,2. Forstyrrelse af urothelial barrieren, eller ændringer i urothelial mekanotransduktion veje, kan føre til ugyldiggørelse dysfunktion sammen med nedre urinveje symptomer såsom hyppighed, haster, nocturia, og inkontinens 3,4,5,6,7. Ligeledes er aldring, diabetes, nedre urinvejsinfektioner, interstitiel blærebetændelse og andre sygdomsprocesser, der påvirker urinblæren eller det tilhørende kredsløb, der styrer dens funktion, kendt for at forårsage blæredysfunktion 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17, 18,19. En bedre forståelse af normal og unormal tømningsadfærd afhænger af udviklingen af metoder, der pålideligt kan skelne mellem forskellige vandladningsmønstre.

Traditionelt er musens frivillige tømningsadfærd blevet undersøgt ved hjælp af void spot assay (VSA), udviklet af Desjardins og kolleger20, og bredt vedtaget på grund af sin enkelhed, lave omkostninger og ikke-invasive tilgang 8,21,22,23,24. Dette assay udføres typisk som et endepunktsassay, hvor en mus tilbringer en defineret mængde tid i et bur foret med et filterpapir, som efterfølgende analyseres ved at tælle antallet og vurdere størrelsen af urinpletter, når filterpapiret placeres under ultraviolet (UV) lys (urinpletterne fluorescerer under disse forhold)20. På trods af disse mange fordele har den traditionelle VSA nogle store begrænsninger. Fordi mus ofte urinerer i de samme områder, er efterforskerne nødt til at begrænse varigheden af analysen til en relativt kort periode (≤4 timer)25. Selv når VSA udføres over kortere tidsperioder, er det næsten umuligt at løse små tomrumspletter (SVS'er), der falder over store hulrumspletter, eller at skelne SVS'er fra overførsel af urin, der klæber til haler eller poter. Det er også meget vanskeligt at skelne mellem, om SVS'er er en konsekvens af hyppige, men individuelle tømningshændelser (en fænotype, der ofte observeres som reaktion på blærebetændelse 4,26) eller på grund af dribling efter mikturering (en fænotype forbundet med blæreudløbsobstruktion 27). Desuden begrænser ønsket om at gennemføre analysen i arbejdstiden kombineret med vanskeligheder med at få adgang til boligfaciliteter, når lyset er slukket, ofte disse analyser til lysperioden i døgnrytmen på 24 timer. Således forhindrer disse tidsbegrænsninger evalueringen af musetømningsadfærd under deres aktive natfase, hvilket mindsker evnen til at analysere specifikke gener eller behandlinger, der styres af cirkadiske rytmer.

For at overvinde nogle af disse begrænsninger har forskere udviklet alternative metoder til at vurdere ugyldiggørelsesadfærd i realtid 26,28,29,30,31,32. Nogle af disse tilgange involverer brug af dyrt udstyr såsom metaboliske bure26,28,29 eller brug af termiske kameraer30; Disse har dog også begrænsninger. For eksempel har urin i metaboliske bur tendens til at klæbe til ledningerne på maskegulvet og til tragtens vægge, hvilket reducerer mængden af urin, der opsamles og måles. Det kan således være svært præcist at indsamle data om små hulrum. Desuden giver metaboliske bure ikke information om den rumlige fordeling af ugyldiggørelseshændelserne (dvs. vandladning i hjørnerne vs. midten af kammeret). Da infrarød stråling med lang bølgelængde, der anvendes af de termografiske kameraer, ikke trænger ind i faste stoffer, skal ugyldiggørelsesaktivitet vurderet ved videotermografi udføres i et åbent system, hvilket kan være udfordrende med aktive mus, da de kan hoppe flere centimeter i luften. Et andet system er den automatiske voided stain on paper (aVSOP) approach33, som består af valset filterpapir, der ender med en konstant hastighed under trådnetgulvet i et musebur. Denne tilgang forhindrer papirskader og overlapning af urinpletter, der forekommer i den klassiske VSA, og dens implementering gør det muligt for efterforskeren at udføre eksperimenter over flere dage. Det giver imidlertid ikke efterforskeren præcis timing af ugyldiggørelseshændelserne, og der er ingen evne til at undersøge adfærd, og hvordan det korrelerer med spotting. For at få disse oplysninger har forskere indarbejdet videoovervågning til ugyldiggørelsesassays, en tilgang, der muliggør samtidig vurdering af museaktivitet og vandladningshændelser31,32. En fremgangsmåde består i at placere en diode (LED) med blåt lys og et videokamera med et grønt fluorescensproteinfilter indstillet under forsøgsburet for at visualisere tømningshændelserne og en infrarød LED og et videokamera over buret for at fange museposition32. Denne opsætning er blevet brugt til at overvåge ugyldiggørelsesadfærd, mens du udfører fiberfotometri; Det stærkt oplyste miljø i dette system krævede imidlertid, at efterforskerne behandlede deres mus med et vanddrivende middel for at stimulere tømning. I et andet eksperimentelt design blev vidvinkelkameraer placeret over og under forsøgsburet for at visualisere henholdsvis musemotorisk aktivitet og vandladningshændelser. I dette tilfælde blev urinpletter deponeret på et filterpapir, der beklæder burets gulv, afsløret ved at belyse filterpapiret med UV-lys placeret under buret31. Denne opsætning blev brugt i korte assays, 4 min varighed, i dagens lysfase for at studere hjernestammeneuronerne involveret i frivillig tømningsadfærd31. Dette systems egnethed til dets anvendelse i den mørke fase eller i perioder >4 min blev ikke rapporteret.

I denne artikel beskrives en metode, der forbedrer den traditionelle VSA ved at muliggøre langsigtet videoovervågning af musetømningsadfærd. Denne omkostningseffektive tilgang giver tidsmæssige, rumlige og volumetriske oplysninger om ugyldiggørelseshændelser i længere perioder i løbet af dagens lyse og mørke faser sammen med detaljer relateret til museadfærd 3,4,34. Detaljeret information til konstruktion af ugyldiggørelseskamrene, implementering af en realtids VSA (RT-VSA) og analyse af dataene leveres. RT-VSA er værdifuld for forskere, der søger at forstå de fysiologiske mekanismer, der styrer urinsystemets funktion, at udvikle farmakologiske tilgange til at kontrollere mikturering og at definere det molekylære grundlag for sygdomsprocesser, der påvirker de nedre urinveje.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Urothelial Piezo1/2 dobbelt knockout mus (Pz1/2-KO, genotype: Piezo1 fl/fl; Piezo2 fl/fl; Upk2CRE+/-) og kontroller (Pz1/2-C, genotype: Piezo1 fl/fl; Piezo2 fl/fl; Upk2CRE-/-) blev genereret internt fra forældrestammer opnået fra Jax-laboratorierne (Piezo1 fl/fl-stamme # 029213; Piezo2fl / fl stamme # 027720; Upk2CRE+/- stamme # 029281). Både hunmus (1,5-3 måneder gamle og 17-20 g i vægt) og hanmus (2-4 måneder gamle og 23-29 g i vægt) blev brugt i forsøgene. Til cyclophosphamid-induceret blærebetændelse forsøg, vildtype C57Bl / 6J hunner (3 måneder gamle og ~ 20 g i vægt) blev anvendt (Jackson laboratorier, stamme # 000664). Dyrene blev opstaldet, og forsøgene blev udført på University of Pittsburgh Animal Care Facility under godkendelse af University of Pittsburgh Institutional Animal Care and Use Committee. Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med relevante retningslinjer og regler i Public Health Service Policy on Humane Care and Use of Laboratory Animals og Animal Welfare Act.

1. Samling af bure til realtids-spotanalyse (RT-VSA)

  1. RT-VSA-riggen består af et UV-stativ, der rummer to UV-pærer og to vidvinkelkameraer (bundkameraer), som bruges til at registrere tømningsaktivitet i dagens lysfase. Arranger to musekamre til at hvile på stativet. Fastgør vidvinkelkameraer (topkameraer) til låget på hvert musekammer, der bruges til at registrere ugyldiggørelsesaktivitet i den mørke fase af dagen (figur 1A).
  2. Konstruer rammen på UV-stativet og musekamrene fra 1 tommer x 1 i T-slidsede aluminiumsprofiler. Se tabel 1 for en liste over de komponenter, der bruges til at bygge to musekamre og UV-stativet, og figur 1B-D for de forskellige visninger af de samlede komponenter og dimensioner.
  3. Konstruer hvert musekammer med otte T-slidsede aluminiumsprofiler, der er skåret til 10 tommer og fire skåret til 14,75 tommer. Start med at samle bunden af musekammeret, og brug standardendefastgørelseselementer (tabel 1) til at samle de T-slidsede profiler i henhold til figur 1. Monter den 38,5 cm x 26,5 cm UV-transmitterende akryl i profilernes indre kanal for at bygge gulvet i musekamrene.
    BEMÆRK: For detaljerede oplysninger om, hvordan man samler T-slidsede profiler med standard endefastgørelseselementer, besøg virksomhedens hjemmeside.
  4. Byg væggene i musekammeret med resten af profilerne. Monter de 38,5 cm x 21,5 cm og 26,5 cm x 21,5 cm slidstærke (AR) polykarbonatpaneler i profilerne for at samle musekammerets ydervægge. Brug AR-polykarbonatpanelerne på 37,5 cm x 23,9 cm og 24,4 cm x 23,9 cm til at bygge det indre af musekammeret.
  5. Fastgør AR-polykarbonatpanelerne med standard endefastgørelse 1/4-20 slidbane. Se instruktioner om, hvordan du monterer panelerne i profilerne på websiden i BEMÆRKNINGEN til trin 1.3. Brug kommerciel silikone caulk til at forsegle krydsene mellem de indvendige paneler.
  6. Der anvendes to 12 tommer og to 14,75 i T-slidsede profiler til at samle burets låg som vist i figur 1B. Monter et 38,5 cm x 26,5 cm AR-polycarbonatpanel i profilernes indvendige kanal for at fuldføre låget.
  7. Monter 12 i kameraprofilstøtten vinkelret på de lange akser øverst i buret, og fastgør den med to lette overgangsbeslag i hjørnebeslagene (markeret med 3 i figur 1B). Brug en lige flad plade (markeret 2) som webkameramonteringsstøtte, og monter den som vist i figur 1B. Fastgør kameraet til understøtningen med kameraets monteringsskrue.
  8. Brug højrehåndssamlingen i 10-seriens standardløftehængsel til at fastgøre låget til musekammerets krop (markeret med 1 i figur 1B).
  9. Konstruer UV-stativet med fire T-slidsede profiler skåret til 40 tommer, fire T-slidsede profiler skåret til 32 tommer og fire T-slidsede profiler skåret til 10 tommer i henhold til figur 1C, D. Monter et 82,5 cm x 26,5 cm akrylspejlark i profilerne for at bygge bunden af UV-kammeret.
  10. Brug akrylspejlpladen 82,5 cm x 30,5 cm og 26,5 cm x 30,5 cm til at konstruere væggen i UV-stativet.
  11. Fastgør de 10-serie fem-hullers T-fladplader (markeret 2 i figur 1 C), de 10-serie fem-hullers L-fladplader (markeret 3 i figur 1 C) og 10-seriens fem-hullers tee-fladplader (markeret 1 i figur 1C) for at fastgøre UV-stativet.
  12. Monter de nederste kameraer i en T-slidset profil, der er skåret til 32 tommer, og fastgør dem til bunden af stativet med to lette overgangshjørnebeslag som vist i figur 1D. Brug lige flade plader til at fastgøre webkameraerne til profilen med T-slids.
  13. Monter UV-lamperne på indersiden, fronten og bagprofilerne, og fastgør dem til de lige flade plader som vist i figur 1D.
  14. Tilslut de fire webkameraer til USB-portene på en computer, der kører en videoovervågningssoftware.

2. Opstaldning af dyr forud for forsøg

  1. Husforsøgsmus, enten specialopdrættede eller opnået fra et eksternt sted, i grupper på fire. Når det er muligt, skal du bruge aldersmatchede hun- eller hanmus til disse eksperimenter. Hvis dyr opnås fra en ekstern kilde, lad dem akklimatisere sig i mindst 7 dage, før de udfører forsøgsprocedurer.
  2. I løbet af deres tid i dyreanlægget skal dyrene huses i standardbure, der indeholder strøelse og berigelse (f.eks. plastiglo, hjul, stykke papir til makulering) og holde dem under en 12 timers dag/nat-cyklus med adgang til vand og tør muse-chow ad libitum.

3. RT-VSA-optagelser i dagens lyse og mørke faser

BEMÆRK: Protokollen nedenfor beskriver brugen af RT-VSA til at vurdere musens tømningsadfærd i dagens lyse og mørke faser. Dyrene holdes på en 12 timers lys og 12 timers mørk cyklus med Zeitgeber-tid (ZT) = 0 kl. 07:00. Optagelserne starter mellem kl. 10.30 og 11.00 (ZT = 3.5–4.0) for lysfaseeksperimenterne og mellem kl. 18:00 og 18:30 (ZT = 11,0–11,5) for eksperimenterne med den mørke fase. Når dyr testes under begge betingelser, udføres forsøg typisk på to separate dage med mindst 5 på hinanden følgende dage mellem de lyse og mørke tests. Forsøg bør ikke udføres på dage, hvor dyrerummene rengøres eller burene skiftes, da disse kan resultere i belastninger, der påvirker tømningsadfærd. Alle trin skal udføres under forhold med minimal belastning for musene.

  1. Transporter forsøgsdyrene fra deres staldsted til det forsøgsrum, hvor RT-VSA-registreringskamrene er placeret.
  2. Forberedelse af RT-VSA-optagelseskammer
    1. Anbring et stykke filtrerpapir (24,3 cm x 36,3 cm) i bunden af hvert RT-VSA-optagebur. Afhængigt af tidspunktet på dagen skal du bruge tyndt (lysfaseforsøg) eller tykt (mørke faseforsøg) filterpapir.
      BEMÆRK: Tykt filterpapir bruges i den aktive mørke fase, da det er mere modstandsdygtigt over for makulering end tyndt filterpapir. Topkameraer bruges til at visualisere urinpletter deponeret på tykt filterpapir i den mørke fase. I modsætning hertil bruges de nederste kameraer i lysfasen, fordi det omgivende lys forhindrer de øverste kameraer i at registrere urinpletter, der er deponeret på filterpapiret. I dette tilfælde anvendes tyndt filterpapir. Vi fandt ud af, at de nederste kameraer er ineffektive til at detektere små ugyldiggørelseshændelser deponeret på tykt filterpapir.
    2. Oven på filterpapiret anbringes følgende genstande: en plastiglo (som giver soveplads), et sterilt 1,5 ml mikrocentrifugerør til berigelsesformål og en 60 mm x 15 mm plastskål indeholdende to eller tre stykker musetørchow og 14-16 g vand i form af en gelpakning (ikke-befugtende vandgel; Figur 2).
      BEMÆRK: Anvendelsen af 1,5 ml mikrocentrifugeglas til berigelsesformål var specifik for det kabinet, der blev anvendt i denne undersøgelse.
    3. Når optagekamrene er klar, placeres forsøgsmusene forsigtigt indeni ved at lægge dem blødt ned på filterpapiret. Sørg for, at overførslen af dyrene fra staldburet til registreringsburene sker med mindst mulig belastning.
    4. Når alle forsøgsdyrene er inde i deres optagebure med lukkede låg, dækkes toppen af lågene med en absorberende bænk bluepad for at minimere direkte refleksioner af omgivende lys på plexiglaslågets overflade.
    5. Tænd UV-lysene i det nederste kammer.
      BEMÆRK: Dyrene har ingen direkte kontakt med UV-lyset. Det anbefalede UV-lys er detaljeret i materialeafsnittet.
  3. RT-VSA-optagelser
    1. For at optage video fra det øverste og nederste kamera skal du bruge en videoovervågningsoptagelsessoftware, som kan konfigureres til at optage fra flere webkameraer eller netværkskameraer på én gang.
    2. Når du åbner programmet, skal du starte optagelsen ved at trykke på Kommando og R i programvinduet. Udfør videooptagelser med en hastighed på 1 billede pr. S.
    3. Umiddelbart efter påbegyndelse af optagelserne skal du forlade rummet og lukke døren forsigtigt. Sørg for, at rummet forbliver stille i hele eksperimentets varighed.
  4. Afslut RT-VSA-optagelser
    1. Gå tilbage til procedurerummet efter 7 timer (lysfaseforsøg) eller næste morgen (mørke faseforsøg).
    2. Stop optagelserne ved at trykke på Kommando og T. Sluk for UV-lysene.
    3. Efter at have stoppet optagelsen, genererer softwaren automatisk en filmfil (i .m4v format) for hvert kamera og gemmer den under kameraets navn i en tidligere valgt destinationsmappe. Kontroller, at eksperimenterne i hver kameramappe er organiseret i mapper efter dato.
    4. I hver dato-/eksperimentmappe skal du kontrollere, at der er én .m4v fil og alle de individuelle .jpeg filer, der svarer til hver af filmrammerne.
    5. BEMÆRK: De .jpeg filer kan bruges til at gendanne eksperimentet, hvis filmfiler bliver beskadiget.
    6. Opret en mappe på skrivebordet med eksperimentets navn og dato, og overfør alle .m4v-filer til denne mappe. Slet om nødvendigt de .jpeg filer, når filmfilerne er gemt og sikkerhedskopieret.
    7. BEMÆRK: For lysfaseeksperimenter genererer softwaren en film pr. Kamera, mens den for mørke faseeksperimenter genererer to film for hvert kamera. Dette skyldes, at der genereres en ny .m4v fil efter midnat, når datoen ændres.
    8. Kopier mappen, der indeholder filmene, til et flashdrev til analyse på en ekstern computer. Dette trin kan tage flere minutter og kan udføres parallelt med trin 3.5.1 til 3.5.3.
  5. Rengøring af registreringsbure og overførsel af forsøgsmus tilbage til deres staldsted
    1. Fjern bluepad, der dækker lågene på burene. Overfør dyrene fra registreringsburene til deres staldebur.
    2. Fjern tilbehør og fødevarer i registreringskamrene (dvs. plastigloer, plastrør, fad med rester af chow og vandgel og filterpapir), og bortskaf dem sammen med biofarligt affald.
    3. Rengør burene ved hjælp af en håndstøvsuger, fjern chow og fækale pellets, der findes på bunden af buret. Sprøjt derefter gulvet og indvendige vægge i buret med 70% ethanol og rengør interiøret med et stykke blød klud. Lad låget på burene stå åbent, så de kan lufttørre.
    4. Anbring staldburet med dyrene i en sekundær beholder, og transporter dyrene tilbage til deres staldsted.

4. Generering af kalibreringskurver

BEMÆRK: En kalibreringskurve er nødvendig for at konvertere tomme pletområder til urinvolumen. Hvis der udføres eksperimenter i dagens lyse og mørke faser, skal der genereres to kalibreringskurver, en for hver anvendt type filterpapir (tyndt og tykt filterpapir). Kalibreringskurver genereres i to eksemplarer. Hver replikat køres på et filterpapir, der er anbragt i et RT-VSA-optagekammer. På grund af dets komplekse sammensætning og UV-excitabilitet skal du bruge museurin til at lave kalibreringskurverne.

  1. Opsamling af mus urin
    1. Tag et stykke fleksibel gennemsigtig film (10 cm x 15 cm) og læg den på en bænk.
    2. Vælg en mus ved halen og skrubbe den. Massér blødt underlivet for at fremkalde vandladning. Saml urin på overfladen af det gennemsigtige filmplastark.
    3. Frigør dyret forsigtigt inde i buret. Brug en pipette til at overføre urinen fra overfladen af den gennemsigtige film til et sterilt 1,5 ml mikrocentrifugerør. Gentag proceduren med flere mus, indtil ~10 ml museurin er opsamlet, saml urinen og opbevar ved -20 °C.
      BEMÆRK: Der kræves i alt ~10 ml museurin for at generere duplikerede kalibreringskurver for de lyse og mørke faser. For at undgå at stresse eksperimentelle mus må du ikke bruge mus, der vil blive udsat for RT-VSA-eksperimenter til urinindsamling.
  2. Registreringer af kalibreringskurver
    1. Optø urinen opsamlet i trin 4.1 og bland den ved forsigtigt at hvirvle i 10-15 s.
    2. Anbring et stykke tyndt filtrerpapir (24,3 cm x 36,3 cm) i hvert af de to RT-VSA-optageholdere.
    3. Følgende urinvolumener (i μL) pipetteres på hvert af filtrerpapirerne: 2, 5, 10, 25, 50, 80, 100, 200, 300, 400, 500 og 750. For at forhindre pletoverlapning som følge af diffusion skal du tildele pletterne i tilstrækkelig afstand fra hinanden.
    4. Luk låget på burene og dæk dem med puder.
    5. Start optagelsen ved at trykke på Kommando og R, og anvend de samme softwareparametre, der bruges til at registrere eksperimenterne (trin 3.3.).
    6. Kalibreringskurven registreres i 1 time for at muliggøre maksimal diffusion af urinpletterne. Tryk på Kommando og T for at stoppe optagelsen.
    7. Opret en ny mappe på skrivebordet, placer de .m4v filer i den, og overfør derefter dataene til et flashdrev til efterfølgende analyse.
    8. Udfør en lignende procedure for at generere dublerede kurver med tykt filterpapir. I dette tilfælde skal du tilføje ekstra lag puder for at gøre interiøret mørkere og simulere mørke faseforhold.
  3. Analyse af kalibreringskurveregistreringerne
    1. Åbn de .m4v filer i en filmafspillersoftware, og maksimer vinduet for at fylde skærmen. For at analysere kalibreringskurverne udført på tykt filterpapir skal du bruge de filer, der er opnået med de øverste kameraer (figur 3A). For at analysere kalibreringskurverne udført på tyndt filterpapir skal du bruge de filer, der er opnået med de nederste kameraer (figur 3B).
    2. Afspil .m4v-filen, og flyt tidsskyderen frem og tilbage for at få et overblik over den komplette 1 times kalibreringskurvefilm.
    3. Identificer det tidsinterval, hvor de mindre urinpletter (<25 μL) har den største intensitet og har spredt sig maksimalt. Tag et skærmbillede inden for dette tidsinterval. Navngiv skærmbilledefilen, og gem den som en .png fil (figur 3A, øverste panel).
      BEMÆRK: Skærmbilleder tages ved at trykke på tasten F6. For at konfigurere F6 til erhvervelse af skærmbilleder skal du vælge: Systemindstillinger > tastatur > genveje og skrive F6 i feltet, der findes til højre for Gem billede af skærm som en fil mulighed.
    4. Identificer det tidsinterval, hvor de mellemstore og store urinpletter (>50 μL) har maksimalt areal, og tag et skærmbillede. Det er muligt, at nogle af de mindre urinpletter ikke vil være synlige, når de større urinpletter udviser maksimal diffusion. Navngiv filen, og gem skærmbilledet som en .png fil (figur 3A, nederste panel).
    5. Åbn ImageJ-softwaren (NIH), og træk og slip derefter det .png filikon, der blev opnået i trin 4.3.3, for at åbne billedfilen (figur 4A).
    6. Vælg ikonet Polygonvalg på værktøjslinjen, og afgræns kanten af filterpapiret.
    7. Vælg derefter Analysér på menulinjen, vælg Indstil mål i den udvidede menu, og vælg Område i det vindue, der vises. Klik på OK. Dette gør det muligt at opnå arealværdier, når trin 4.3.8 udføres.
    8. Vælg derefter Analysér igen fra menulinjen, og vælg Mål fra de udvidede indstillinger. Der vises et resultatvindue, der indeholder et kolonneområde, der viser områdeværdierne i pixel2 (figur 4B-D).
    9. Vælg ikonet Frihåndsvalg på værktøjslinjen, og brug det til at tegne en linje rundt om omkredsen af et enkelt tomt sted. Mål arealet som i trin 4.3.8. Softwaren opdaterer resultattabellen, når nye målinger udføres. Det nye sæt tal vises under de foregående. Registrer det tal, der vises under kolonneområdet i resultatvinduet for hvert analyseret sted (figur 4E-G).
    10. Gentag trin 4.3.5 til 4.3.7 for hvert af de replikerede punkter.
    11. Indstil det samlede areal af filterpapiret til 100%, og beregn procentdelen af areal (% areal) for hver urinplet. Denne normalisering vil rette fejl, der kan opstå som følge af forskelle i zoom eller placering af kameraerne.
    12. Opret en ny XY-tabel i et grafprogram, og indsæt værdierne for urinvolumen (i μL) i X-kolonnen og dubletværdierne for %-området i Y-kolonnen.
    13. Vælg derefter Analyse > Analysér > XY-analyse > Ikke-lineær regression (kurvetilpasning). I det parametervindue, der vises, skal du vælge Model > Polynomium > Anden ordens Polynomium (kvadratisk).
    14. Klik derefter på fanen Metode for at markere følgende valg: Mindste kvadraters regression, Ingen vægtning og Betragt hver replikat Y-værdi som et individuelt punkt.
    15. Fra fanen Begræns skal du vælge for B0, Begrænsningstype > Konstant lig med og skrive 0 under kolonnen Værdi. Klik på OK.

5. Analyse af de eksperimentelle museoptagelser

  1. Åbn en filmfil, der er indsamlet under den lyse fase (nederste kamera) eller den mørke fase (øverste kamera) til analyse.
  2. Vurder kvaliteten af filmfilen ved at flytte tidsscrolleren frem og tilbage, hvilket bekræfter, at filterpapiret forbliver intakt (uden rivning eller tygning) i løbet af det 6 timers tidsvindue, der skal analyseres. Hvis papiret er revet, skal du ikke foretage yderligere analyser, da musen kan have urineret på den eksponerede plast, som ikke kan kvantificeres (figur 5).
  3. Hvis du vil analysere eksperimenter, der er indsamlet i de lyse eller mørke faser, skal du bruge kommandoen Spol frem eller skyderen på tidslinjen til at flytte til det ønskede tidsvindue. Ugyldiggørelsesaktivitet i lysfasen registreres mellem kl. 11:00 og 17:00 (ZT = 4,0–10,0) og i den mørke fase mellem midnat og 06:00 (ZT = 17,0–23,0).
  4. Afspil filmen i hurtig fremadgående tilstand ved at klikke på ikonet >> (eller rul manuelt gennem filmen) og se efter tegn på, at musen annulleres. Den nemmeste måde at fortælle, at dette sker, er at kigge efter det pludselige udseende af lyse pletter af urin på filterpapiret. En anden indikator er at kigge efter adfærdsændringer, herunder bevægelse til hjørnerne af buret og en kort periode med inaktivitet, når musen annulleres.
    BEMÆRK: Når man bliver bedre til at opdage hulrum, kan man øge hastigheden på rulning eller hurtig fremspoling. Men hos mus med bakteriel og kemisk induceret blærebetændelse, som har et meget stort antal små hulrum 4,34, kan man gå glip af ugyldiggørelseshændelser, hvis man bevæger sig for hurtigt gennem filmen.
  5. Registrer det tidspunkt, hvor hvert tomrum opstår. Som en konvention registreres tomrummets tid ved det første tegn på, at urin detekteres (figur 6A, B).
  6. For at foretage målinger af tomrummet skal du først bruge rullepanelet til at bevæge dig fremad (eller bagud) i tiden og se efter det tidspunkt, hvor maksimal diffusion af urinpletten har fundet sted. Sæt filmen på pause på dette tidspunkt, og tag et skærmbillede som beskrevet i trin 4.3.3. Placer computerens musepil på stedet under analyse, så stedet af interesse er markeret på skærmbilledet (figur 6C, D).
  7. Navngiv skærmbilledefilen ved hjælp af korrelative tal for at tage højde for rækkefølgen af udseendet i filmen.
  8. Fortsæt med at analysere filen, gentag trin 5.5 og 5.7 for hvert tomt sted i filmen. Når alle hulrumspletterne er analyseret, måles filterpapirets samlede areal ved at tage et skærmbillede og anvende de trin, der er beskrevet i 4.3.6.
  9. Det procentvise areal af hver af urinpletterne beregnes som beskrevet i trin 4.3.9. Omdan værdierne for % areal til volumen urin (μL) for hvert tomrumspunkt ved hjælp af kalibreringskurverne genereret i trin 4 og interpolatfunktionen i grafsoftwaren.
    1. Åbn XY-tabellen med kalibreringskurvens data i grafsoftwaren, og indsæt værdierne for %-arealet i Y-kolonnen under kalibreringskurvens sidste værdi (figur 7A).
    2. Klik på fanen Resultattabel , og klik under fanen model for at vælge Interpoler ukendte fra standardkurven , og tryk på OK. Der vises en fane med navnet interpolerede X-middelværdier ud for fanen Resultattabel. Denne fane indeholder en tabel med de interpolerede værdier, der svarer til mængden af urin i μL for hvert tomrumspunkt. (Figur 7A, B).
  10. Gentag trin 5.1 til 5.9 for at analysere alle forsøgsmusene.
  11. Opret en projektmappefil, der indeholder de data, der er hentet fra trin 5.5 til 5.10, ved hjælp af ét regneark pr. mus (figur 7C). Opret en fil til eksperimenterne med lysfasen og en anden til eksperimenterne med den mørke fase. Disse masterfiler indeholder alle de rådata og nødvendige beregninger, der anvendes i yderligere analyser.

6. Analyse af vandladningsmønsteret hos forsøgsmus

  1. Generer primære og sekundære tomrumsspotprofiler (figur 8A, B og figur 9).
    BEMÆRK: Ifølge frekvensfordelingsundersøgelser 23 repræsenterer hulrumspletter, der er ≥20 μL, typisk >95% af det samlede ugyldige volumen og betragtes som primære tomrumspletter (PVS'er)8,23,35. Hulrumspletter, der er ≤20 μL, betragtes som sekundære eller små hulrumspletter (SVS'er). Diskrimination mellem PVS'er og SVS'er har vist sig at være en nyttig tilgang til at karakterisere ugyldiggørelsesfænotyper. Et forhøjet antal SVS'er indikerer ugyldiggørelsesdysfunktion35.
    1. Fra masterfilen, der indeholder ugyldige spotdata af interesse (lys fase eller mørk fase), klassificeres pletterne baseret på deres volumen som PVS'er, når deres volumen er ≥20 μL, eller SVS'er, når deres volumen er <20 μL.
    2. Tæl antallet og beregn den gennemsnitlige ugyldige volumen og den samlede volumen for PVS'erne. Tæl antallet og beregn den samlede volumen for SVS'erne.
    3. Generer en graflinje, der sammenligner kontrollen med de behandlede mus for hver af de beregnede parametre: antal PVS'er, ugyldigt volumen PVS'er, samlet volumen PVS'er, antal SVS'er, samlet volumen af SVS'er.
  2. Valgfrit: Generer et kumulativt ugyldigt volumenplot (trappefunktion) for at vise ugyldiggørelsesadfærd over tid (figur 10 og figur 11).
    1. Åbn projektmappemasterfilen, og konverter annulleringstidspunktet, som udtrykkes i timer, minutter og sekunder, til decimalform. Beregn det kumulative urinvolumen (i μL) for hvert tidspunkt.
    2. Generer en XY-tabel i grafsoftwaren med tid i decimalform i X-kolonnen og kumulative urinvolumener i Y-kolonnen. Kopier tids- og urinvolumendataene til tabellen. Tilføj (0, 0) og (6; maksimal værdi) datapunkter. Disse punkter er nødvendige for at fuldføre plottets vandrette linjer ved eksperimentets begyndelse (tid: 0 timer), når det ugyldige volumen er nul (0; 0), og ved eksperimentets afslutning (tid: 6 timer), når den kumulative værdi af den ugyldige urin er lig med den værdi, der er opnået for den sidste ugyldiggørelsesbegivenhed (6; maksimumsværdi).
    3. Dobbeltklik på grafen; Vinduet Formatgraf skal vises. Vælg fanen Udseende , klik for at fjerne markeringen af knappen for Vis symboler , og klik for at vælge Vis forbindelseslinje/kurve. Klik på indstillingen Stil , og vælg Overlevelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ugyldig opførsel af urothelial Piezo1/2 knockout mus

Under opbevaringsfasen af miktureringscyklussen antages urothelium at mærke spændingen, der udøves af urinen akkumuleret i blæren og at transducere denne mekaniske stimulus til cellulære reaktioner såsom serosal ATP-frigivelse 1,3. Vi har tidligere vist, at mekanisk aktiverede PIEZO1- og PIEZO2-kanaler udtrykkes i musens urothelium 3,36. For at afgøre, om urothelial PIEZO-kanaler er vigtige for normal tømningsadfærd, udførte vi RT-VSA på urothelial-betingede Piezo1/2 dobbelt knockout-mus (Pz1/2-KO) mus og alders- og kønsmatchede kontroller (Pz1/2-C; Figur 9). Vi testede både hun- og hanmus i 6 timer i dagens mørke og lyse faser og analyserede dataene som beskrevet i trin 6.1. Da vi sammenlignede ugyldiggørelsesaktiviteten mellem dagens lyse og mørke faser for kontrolgrupperne, blev det bemærket, at både kvinder og mænd udviste en stigning i antallet og den samlede mængde PVS'er i deres aktive periode. Denne observation indikerer, at selvom musene var i et fremmed miljø, blev den cirkadiske karakter af musetømningsadfærd (højest under deres aktive mørke fase) bevaret. Under deres inaktive lysfase observerede vi ingen signifikante forskelle i nogen af de parametre, der blev analyseret for kvindelige eller mandlige Pz1/2-KO-mus sammenlignet med kontrolmodellerne (Pz1/2-C). Men da vi testede dyrene i den aktive mørke fase, viste både hun- og hanmus Pz1/2-KO-mus en ændret tømningsfænotype, kendetegnet ved en signifikant stigning i antallet og i den samlede mængde SVS'er (figur 9). Der var ingen signifikante forskelle i PVS-antal, gennemsnitligt volumen pr. PVS eller total PVS-volumen hos hun- eller han-Pz1/2-KO sammenlignet med deres tilsvarende kontroller. Disse resultater indikerer, at urothelial PIEZO1/2-kanaler ikke spiller en væsentlig rolle i tømningsfunktionen under musens inaktive lysfase, men er vigtige for at forhindre hyppig pletblødning under deres aktive mørke fase.

Resultaterne vist i figur 9 illustrerer to af fordelene ved at anvende RT-VSA versus endepunktet VSA. For det første, hvis analysen kun blev udført i lysfasen, ville vi fejlagtigt have konkluderet, at urothelial PIEZO1/2-kanaler ikke havde nogen rolle i ugyldiggørelsesfunktionen. For det andet blev SVS'er i de fleste endepunkts-VSA-undersøgelser behandlet som eksperimentel støj og i nogle tilfælde udelukket fra efterfølgende analyse23. I RT-VSA kunne vi bestemme, at SVS'erne var individuelle begivenheder, ikke sekundære til PVS'er (overførsel eller afslutning af miktureringsdribling) og var frivillige i den forstand, at dyrene flyttede til burets periferi, annullerede og derefter forlod. Denne observation gav os værdifuld information om fænotypen hos Pz1/2-KO-mus, som ellers ville være blevet savnet.

Ugyldig adfærd hos hunmus under basale forhold og efter cyclophosphamid behandling

I dette piloteksperiment testede vi virkningerne af cyclophosphamid (CYP) på musens frivillige tømningsadfærd. Cyclophosphamid, et lægemiddel, der anvendes til behandling af visse former for kræft eller immunologiske lidelser, er kendt for at forårsage blærebetændelse hos patienter og forsøgsdyr, hvilket resulterer i en overaktiv blærefænotype karakteriseret ved flere, små ugyldiggørelseshændelser 26,37,38. For at bestemme baseline ugyldiggørelsesadfærden placerede vi en ubehandlet hunmus i RT-VSA i den mørke fase. Den samme mus blev injiceret intraperitonealt med en dosis CYP (150 mg/kg) 5 dage senere for at forårsage akut blærebetændelse. Umiddelbart efter injektion blev musen anbragt i et RT-VSA-bur til optagelse. Ugyldiggørelsesadfærden er repræsenteret i et trinplot (figur 11), hvor de lodrette linjer repræsenterer mængden af urin annulleret og de vandrette linjer repræsenterer tiden. Sammenlignet med resultaterne opnået under basale forhold er det tydeligt, at mængden af urin, der frigives pr. tomrum, er mindre efter CYP-behandling, og at miktureringshændelserne er meget hyppigere. Dette kan bedre værdsættes i grafens indsats, hvor de første 30 minutter af den analyserede periode (svarende til midnat til 00:30 [7,0 til 7,5 timer efter injektion]) forstørres.

Figure 1
Figur 1: RT-VSA-optagekammeret. (A) RT-VSA-optagelsessystemet omfatter en øvre del, som består af to klare akrylkamre side om side og tilhørende øvre kameraer. Den nederste halvdel af enheden er et enkelt enhedsstativ, der holder de øverste musekamre og indeholder de nederste kameraer og UV-lys. Det indre af stativets vægge er lavet af spejlpaneler, der reflekterer UV-lyset for at give jævn belysning til bunden af burene. Ikke afbildet er en computer, der modtager et videofeed fra kameraerne og optager dataene. (B) Model af musekammeret med komponenter og dimensioner. 1) standard løftehængsel; 2) kamera monteringsbeslag; og 3) lite overgang hjørnebeslag. Forfra (C) og øverst (D) af UV-stativet med komponenter og dimensioner. UV-lys er monteret i det indre af for- og bagprofilerne med lige flade plader. En 32 tommer profil fastgjort til stativets hovedramme med to lite overgangshjørnebeslag bruges til at montere kameraerne. Lige flade plader bruges til at fastgøre kameraerne til 32 i profil. Et spejlpanel er monteret i det indre af stativet (ikke vist). 1) fem-hullers tee flad plade; 2) fem-hullers T flad plade; og 3) fem-hullers L flade plader. Alle viste værdier er i tommer. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: RT-VSA musekammer. Før forsøgsprocedurer fremstilles hvert eksperimentelt musekammer ved at beklæde det med et stykke filterpapir (nummereret 1). Afhængigt af den periode på dagen, hvor forsøget udføres, er det anvendte filterpapir enten tykt (mørk fase) eller tyndt (lys fase). En plastkuppel placeres i midten af kammeret (nummereret 2), en plastskål med vand (i form af ikke-befugtende vandgel) og chow placeres på den ene side af kuplen (nummereret 3), og et plastisk 1,5 ml mikrocentrifugerør, en form for berigelse, placeres på den modsatte side (nummereret 4). Det oprindelige arrangement af elementer i buret holdes konsistent i alle forsøg. Bemærk, at et stykke filterpapir er placeret mellem de to tilstødende bure og er markeret i figuren med en stjerne. Dette er for at forhindre påvirkning af visuelle signaler, der stammer fra nabomusen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Kalibreringskurve. Repræsentative billeder af tykt (A, venstre panel) og tyndt (B, venstre panel) filterpapir spottet med kendte mængder museurin. Billeder er skærmbilleder fra videooptagelser, der er taget med det øverste (A, venstre panel) eller det nederste (B, venstre panel) kamera. Røde pile peger på de 2 μL urinpletter, og tallene under pletterne er spotvolumenværdierne i μL. Bemærk, at de små urinpletter (<50 μL) i det øverste billede af panel A, der er synlige kort efter urinspotting (5 min), ikke længere er synlige efter 30 min (nederste panel). Højre paneler: Afbildning af tomrumspletareal (udtrykt som procentdelen af det samlede filterpapirareal) som funktion af urinvolumenet. Som bemærket af andre følger dataene for tomrumspletareal som funktion af urinvolumenet ikke et lineært forhold30. Således tilpasser vi dataene til et andenordenspolynom ved hjælp af ikke-lineær regression. Data var begrænset således, at X = 0 til Y = 0. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Bestemmelse af filterpapir og urinpletområder ved hjælp af ImageJ. (A) Et skærmbillede af kalibreringskurven vist i figur 3A åbnet i billedeJ. Det indrammede område i (A) vises mere detaljeret i (B). (B) Ikonet for polygonvalg vælges (cirklet med rødt) for at tegne en polygon langs filterpapirets omkreds (delvis visning; gul linje med røde pile, der peger på de noder, der genereres af markeringsværktøjet). (C) Polygonens areal afspejler filterpapirets samlede areal og måles ved at vælge Analysér > mål (rød cirkel). (D) Værdien af området (i pixels) vises i et resultatvindue (rød cirkel). (E) For at måle arealet af en individuel tomrumsplet vælges frihåndsvalgværktøjet (rød cirkel), og i (F) bruges det til at tegne en linje rundt om kanten af pletten (den røde pil peger på pletten). Ved hjælp af samme kommando som i (C) måles arealet af tomrumspunktet, hvor resultatet vises som en ny værdi i resultatvinduet umiddelbart under den sidst udførte måling (panel G, rød cirkel). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Vurdering af filterpapirets status efter afslutning af RT-VSA-forsøg. Repræsentative billeder af musekammeret, der viser forskellige betingelser for filterpapiret under eller efter et RT-VSA-eksperiment. Filterpapir, der forblev intakt indtil slutningen af testperioden, er vist i (A) og repræsenterer den mest almindelige situation og den tilstand, hvorunder et eksperiment kan analyseres yderligere (grønt flueben). Eksempler på beskadiget filterpapir er vist i (B) og (C) og er repræsentative for eksperimenter, der ikke må analyseres yderligere (rødt X). I (B) blev filterpapiret makuleret af musen (rød pil) i et af hjørnerne. Den stiplede gule linje markerer kanten af burets gulv. Det indrammede område forstørres i billedet til højre. I (C) blev eksperimentets integritet kompromitteret som følge af, at ikke-befugtende vandgel (rød pil) blev flyttet af musen ind i hjørnet, hvilket efterlod tre store vandpletter (røde stjerner). Disse bevægelser blev bekræftet ved at se videoen. Billeder er skærmbilleder fra filmfiler opnået i den mørke fase ved hjælp af det øverste kamera og med buret foret med tykt filterpapir. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Bestemmelse af tidspunktet for ugyldiggørelse og erhvervelse af skærmbilleder til måling af tomt spotareal. (A,B) Skærmbillede af en mus i et hjørne af sit kammer med et tomrumssted, der lige er blevet synligt. Tidspunktet for denne ramme er kommenteret som tidspunktet for annullering. (C,D) Når tomrumsstedet når maksimal diffusion, tages et skærmbillede for at bestemme volumenet af tomrummet. Billeder er skærmbilleder fra filmfiler, der er opnået med det øverste kamera ved hjælp af tykt filterpapir og i den mørke fase. Analyseperioden var midnat til 06:00. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: Omdannelse af tomt pletområde til urinvolumen og generering af en regnearksfil med eksperimentelle rådata. (A) Skærmbillede af grafsoftwarevinduet, der viser værdier for tomme pletter udtrykt som procentdelen af det samlede filterpapirareal (data skitseret med grønt). Regnearket (grøn pil) gemmes under sektionen datatabeller. (B) Omregning af procentdelen af det samlede areal til urinvolumen (data skitseret med rødt). Sidstnævnte værdier vises i resultatafsnittet (rød pil) og beregnes ud fra kalibreringskurven ved hjælp af interpolerede ukendte fra standardkurvefunktionen. (C) Skærmbillede af et regneark med kompilerede rå og beregnede data. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 8
Figur 8: Klassificering af hulrum i PVS'er og SVS'er og deres analyse. Skærmbilleder af regneark (genereret som vist i figur 7C) fra en mus under basale forhold (A) og 7 timer efter modtagelse af en dosis cyclophosphamid (150 mg/kg) (B). Hulrumspletter klassificeres som primære hulrumspletter (PVS'er), hvis volumenet er ≥20 μL, eller som små hulrumspletter (SVS'er), hvis volumenet er <20 μL. Bemærk, at i den ubehandlede mus (A) er alle ugyldiggørelseshændelser PVS'er, mens de fleste hulrum i det cyclophosphamid behandlede dyr er SVS'er. Den cirklede tabel i hvert panel (rød kontur) indeholder følgende sammenfattende statistikker: antal hulrum, gennemsnitligt ugyldigt volumen og samlet ugyldigt volumen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 9
Figur 9: Ugyldiggørelsesadfærd hos Piezo1/2 knockout- og kontrolmus. Ugyldiggørelsesadfærden hos kvindelige (A) og mandlige (B) Piezo1/2 knockout (Pz1/2-KO) mus og kontrolmodstykker ( Pz1/2-C ) blev registreret i løbet af et 6 timers tidsvindue i den mørke eller lyse fase af dagen, og resultaterne blev analyseret som beskrevet i trin 6.1. Data vises som middelværdi ± standardfejl på gennemsnit (S.E.M.). Data blev sammenlignet ved hjælp af en Mann-Whitney-test. Forkortelser: PVS'er = primære tomrumspletter; SVS'er = små tomme pletter; NS = ikke signifikant; * p < 0,05; ** p < 0,01. Dette tal er ændret fra3. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 10
Figur 10: Arbejdsark til beregning og grafisk repræsentation af det kumulative ugyldige volumen som funktion af tiden. (A) Skærmbillede af det i figur 7C genererede regneark, der viser de beregninger, der er nødvendige for at generere et trappefunktionsplot af det kumulative volumen af urin, der annulleres som funktion af tiden. Tiden skal angives i decimalformat (kolonne G, rød firkant). For at transformere tiden til decimalformat blev der tilføjet tre kolonner (røde pile) til højre for kolonnen med annulleringstidspunkt for separat at anmærke værdierne for timer (kolonne D), minutter (kolonne E) og sekunder (kolonne F) og det endelige resultat af tid i decimalformat (kolonne G). Hvis du vil omdanne tidsugyldiggørelsen til et decimalformat, skal du bruge følgende funktion: (h) + (min/60) + (s/3.600). En kolonne blev tilføjet til højre for urinvolumenkolonnen for at vise det kumulative urinvolumen (blåt rektangel), der beregnes som summen af alle urinvolumener (kolonne J) opnået indtil tidspunktet for en ny ugyldiggørelseshændelse (inklusive den nye hændelsesværdi). (B) Skærmbillede, der viser data kopieret fra regnearket i panel A og indsat i kolonne X (tid i decimalformat) og kolonne Y (kumulative urinvolumener) i et grafsoftwareprojekt. De første og sidste tidspunkter i plottet er indstillet til 0 og 6 (maksimumværdi) rækker som angivet med de røde pile. (C) For at generere et trindiagram formateres grafen ved at fravælge feltet Vis symboler, aktivere indstillingen Vis forbindelseslinje/kurve og vælge overlevelsesstilen, som vist i felterne omgivet af rødt. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 11
Figur 11: Repræsentative resultater af musetømningsadfærd under basale forhold eller efter administration af cyclophosphamid Den frivillige tømningsadfærd hos en mus blev vurderet af RT-VSA i den mørke fase før (basal) og 7 timer efter administration af cyclophosphamid (CYP), som beskrevet i de repræsentative resultater. Tidspunktet og volumenet for ugyldiggørelseshændelserne repræsenteres i et trinplot, der blev genereret som beskrevet i trin 6.2. Grafens indsats repræsenterer området af plottet markeret med et grønt rektangel og svarer til de første 30 minutter af den analyserede periode. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 12
Figur 12: Identifikation af overlappende urinpletter ved RT-VSA. Skærmbilleder af videobilleder taget med det øverste kamera i den mørke fase af et RT-VSA-eksperiment (billede 1 og 2). Det indrammede område på billede 2 forstørres i billede 3. Musen blev annulleret i samme øverste højre hjørne yderligere to gange i løbet af de næste par timer (billede 4-6). På trods af overlapningen af ugyldige pletter blev de enkelte ugyldiggørelseshændelser let detekteret ved hjælp af RT-VSA. For at visualisere, hvordan disse hændelser ville se ud som et slutpunktsassay, udsatte vi filterpapirets hjørne for forskellige lysforhold. Under synligt, omgivende lys kunne kun identificeres et enkelt, stort tomrumspunkt (billede 7). Ligeledes, hvis det samme område blev undersøgt under UV-lys, kunne kun en enkelt mørk plet skelnes (billede 8). Således opdages flere hulrum i samme region let af RT-VSA, men en sådan diskrimination er ikke mulig, hvis analysen udføres som et endepunktsassay. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Inkorporeringen af videoovervågning er en omkostningseffektiv ændring, der giver flere fordele i forhold til den klassiske VSA. I den klassiske VSA, som typisk bruges som et endepunktsassay, er det vanskeligt at skelne overlappende tomrumspletter. Dette er ikke en triviel bekymring, da mus har tendens til at urinere flere gange i det samme område, når analysen forlænges i flere timer, typisk i hjørnerne af deres bur. Den første fordel ved RT-VSA er således, at efterforskeren let kan identificere individuelle pletter, der er blevet deponeret helt eller delvist oven på hinanden. Dette illustreres godt i eksperimentet vist i figur 12. I dette tilfælde bekræfter videooptagelse, at musen annulleres tre gange i samme hjørne og deponerer overlappende tomrumspletter. Hvis filterpapiret kun blev analyseret ved eksperimentets afslutning på den måde, der er typisk for en VSA, kunne der kun skelnes mellem et sted. Så mens den klassiske endepunkt VSA kan være nyttig til at identificere store forskelle i ugyldiggørelsesadfærd, kan den muligvis ikke skelne mellem mere subtile fænotyper. Med de nuværende fremskridt inden for genetik og generering af transgene dyr er udviklingen af metoder, der nøjagtigt kan vurdere ugyldiggørelsesadfærd, afgørende.

For det andet giver RT-VSA efterforskeren tidsmæssige oplysninger om ugyldiggørelseshændelserne. Således kan man bestemme sande miktureringsfrekvenser samt etablere forhold mellem ugyldiggørelseshændelser. For eksempel i en situation, hvor en klynge af SVS'er observeres ved siden af en enkelt stor PVS, i den klassiske VSA, kan man ikke let skelne, hvis musen annulleres flere gange under forsøget (med tre små og et stort hulrum), eller hvis dyret deponerede et stort urinvolumen, og de tre mindre pletter er et resultat af post-mikturering dribling eller overførsel fra pels. RT-VSA kan bruges til at løse disse spørgsmål.

For det tredje giver RT-VSA mulighed for at analysere musens opførsel før, under og efter ugyldiggørelseshændelsen. Efterforskeren kan også overvåge musens samlede aktivitetsprofil ved at analysere RT-VSA-optagelser med frit tilgængelig software såsom Mouse Behavior Tracker39. Derudover kan man skelne mellem, om et dyr holder op med at urinere (typisk opførsel hos hunner), om dyret er i bevægelse under tømning (hvilket hos mænd kan resultere i efterfølgende tomrumspletter), eller om det tømmes under sin søvn / hvilefase. Vi har observeret sidstnævnte adfærd, selvom det normalt er sjældent. Hvis korrekt valideret og fortolket, kan observation af ugyldiggørelsesadfærd således give efterforskeren værdifuld indsigt i ugyldiggørelsesdysfunktion, herunder for eksempel nocturia eller inkontinens. RT-VSA (og VSA) giver efterforskere mulighed for at bestemme brøkdelen af ugyldige hændelser, der forekommer i det centrale område af et bur, i modsætning til hjørnerne. Normalt er centertømning sjælden, og øget antal af sådanne hændelser er et tegn på blæredysfunktion 8,22. Den eneste undtagelse er dominerende alfahanner, som urinerer hyppigt og på tværs af hele deres anlæg20. For at udføre en analyse af central tømning ved hjælp af RT-VSA, bør man overveje at flytte madskålen til en sidevæg og fjerne kuplen (eller fastgøre den til et bestemt område af buret), så rumlige vandladningsmønstre lettere kan etableres.

For det fjerde giver RT-VSA mulighed for mere effektivt at håndtere de belastninger, der er forbundet med burudskiftning sammenlignet med klassisk VSA. Mus er skittish af natur, og håndtering af dem eller overførsel af dem til et nyt miljø forårsager stress, hvilket vides at påvirke ugyldiggørelsesadfærd35. Det er i sagens natur vanskeligt at indarbejde en periode med akklimatisering i standard VSA. I modsætning hertil kan en akklimatiseringsperiode i RT-VSA let inkorporeres i hvert eksperiment, og eventuelle ugyldiggørelseshændelser i denne periode ignoreres under analysen. Et yderligere stresslindrende aspekt af RT-VSA, der implementeres i denne protokol, er overlapningen af forhold, hvorunder mus normalt er anbragt (dvs. adgang til mad og vand ad libitum, en kuppel og et legetøj). Dette er, så vidt vi ved, et af de rigeste miljøer, der er beskrevet for denne type eksperiment. I et typisk endepunkt VSA fratages mus vand (og nogle gange også fra mad)8,22, som vi leverer ad libitum.

For det femte, ud over den positive effekt, som dette berigede miljø kan have på musens stressniveauer, giver det efterforskeren mulighed for at udføre RT-VSA i længere perioder, typisk i 6 timers tidsvinduer; Men for nylig har vi udført eksperimenter, der kører i 24 timer (data ikke vist). Dette er ideelt, når man vurderer virkningerne af cirkadisk rytmicitet eller når man studerer mus, der kan udvise en underaktiv blærefænotype og dermed urinere sjældent.

Til 24 timers videoovervågning anbefaler vi at bruge tyndt filterpapir og analysere eksperimenterne ved hjælp af de nederste kameraer. Denne kombination af papirtype og kamera er den bedste løsning, der giver mulighed for følsomhed ved detektion i mørke og lyse faser. Som tidligere nævnt kan bundkameraer ikke let registrere hulrum på det tykke filterpapir, og topkameraer registrerer ikke pålideligt hulrum i lysfasen. Hvis du udfører disse udvidede analyser, foreslår vi, at dyrene placeres i registreringsburene kl. 17:00, analyserer fra kl. 18:00 på dag 1 og afslutter forsøget kl. 18:00 den følgende dag.

Mens RT-VSA har mange positive aspekter, er der nogle forbehold, der er værd at bemærke. Selvom vi gør alt for at begrænse stress, når vi udfører disse analyser, kan vi ikke helt replikere musens levested, da dyrene normalt er gruppehusede. De drikker også vand fra en flaske i stedet for at få vand fra ikke-befugtende vandgel. Vores observation af, at mus har færre hulrum i deres inaktive lysfase versus deres aktive mørke fase, indikerer imidlertid for os, at musene bevarer deres normale mønstre for døgnrytmeadfærd40. Som en afspejling af deres let stressede natur fandt vi, at mus udviser forstyrret tømningsadfærd på dagene med burrensning. Man må således begrænse analysen til perioder, hvor dyrene vil blive mindre påvirket af rutinemæssig husdyrhold. En vigtig faktor at overveje er, om UV-lyset har nogen indflydelse på tømningsfunktionen. Fordi vores resultater viser en tydelig cirkadisk forskel i VSA-parametre mellem lyse og mørke faser, som er i overensstemmelse med andre teknikker, der beskriver et lignende fænomen, men ikke bruger UV-lys40, konkluderer vi, at UV-lysbelysning ikke påvirker tømningsfunktionen. Bemærk, at filterpapiret forhindrer lys i at passere fra det nederste kammer til det øverste kammer.

En yderligere advarsel er, at jo længere man holder musene i kammeret, jo mere sandsynligt er det, at de tygger eller beskadiger filterpapiret (uanset papirets tykkelse). Mens ingen af dyrene forstyrrede papiret i lysfasen, beskadigede næsten 30% af musene papiret i den mørke aktive fase. I analysen af 24 timers eksperimenterne observerede vi, at en lignende andel (en tredjedel) af eksperimenterne ikke kunne analyseres på grund af papirskader, hvilket betyder, at ikke kun mængden af tid, men også dagens fase påvirker dyrets makuleringsadfærd. Desværre har vi efter vores erfaring bemærket, at et dyr, der forstyrrer burets papir, vil fortsætte med at gøre det, selv efter gentestning. Som nævnt ovenfor urinerer mus undertiden på det bare akrylgulv, og dermed gør tab af papiret analysen ufuldstændig og af begrænset værdi.

Endvidere kan analysen af mandlig ugyldiggørelsesadfærd være vanskeligere, da de har tendens til at tømme oftere, de kan drible efter tømning, og der er en population af mænd (20%) med en mere aggressiv alfa-hanfænotype kendetegnet ved et stort antal små hulrum, der er fordelt over buret, som diskuteret i en tidligere publikation3. Da denne alfa-han-adfærd kan udgøre en forvirrende faktor for etablering af ugyldiggørelsesfænotyper, udelukker vi dyr med ≥50 (lysfaseforsøg) eller ≥100 (mørke faseforsøg) hulrum fra analyse.

Der er situationer, hvor forskelsbehandling af hulrum baseret på deres volumen (dvs. PVS vs SVS) ikke nødvendigvis er berettiget. For eksempel har mus med bakteriel eller kemisk blærebetændelse efter vores erfaring tendens til at tømme mindre mængder end kontroller 4,34. Der er dog store forskelle i det ugyldige volumen mellem individuelle mus; i nogle har de fleste hulrum et volumen ≤20 μL, mens i andre er flertallet >20 μL. Følgelig giver diskrimineringen af det ugyldige volumen ingen fordel for karakteriseringen af disse fænotyper.

Alt i alt er RT-VSA et let at implementere værktøj til analyse af musetømningsadfærd hos frit mobile mus. I modsætning til værktøjer som cystometri kræver det ikke kirurgisk implantation af et kateter eller ikke-fysiologiske satser for blærefyldning. Det giver mulighed for bestemmelse af ugyldiggørelsesadfærd hos begge køn af mus, over længere perioder og i de lyse og mørke faser af dagscyklussen. Det er også relativt overkommeligt, især sammenlignet med mere specialiserede og dyre enheder såsom metaboliske bure. Selvom der er advarsler forbundet med dette værktøj, er de generelt nemme at administrere. Endelig kan denne teknik let tilpasses andre dyrearter, herunder andre gnavere.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af et NIH-tilskud R01DK119183 (til G.A. og MDC), en pilotprojektpris gennem P30DK079307 (til M.G.D.), en American Urology Association Career Development-pris og et Winters Foundation-tilskud (til N.M.) og af Cell Physiology and Model Organisms Kidney Imaging Cores fra Pittsburgh Center for Kidney Research (P30DK079307).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots –  cut to 10 inches 80/20 1010 Amount: 20
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots –  cut to 12 inches 80/20 1010 Amount: 6
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots –  cut to 40 inches 80/20 1010 Amount: 4
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots – cut to 14.75 inches 80/20 1010 Amount: 12
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots – cut to 32 inches 80/20 1010 Amount: 5
1/4-20 Double Slide-in Economy T-Nut 80/20 3280 Amount: 16
1/4-20 Triple Slide-in Economy T-Nut 80/20 3287 Amount: 18
10 & 25 Series 2 Hole - 18mm Slotted Inside Corner Bracket with Dual Support 80/20 14061 Amount: 6
10 Series 3 Hole - Straight Flat Plate 80/20 4118 Amount: 8
10 Series 5 Hole - "L" Flat Plate 80/20 4081 Amount: 8
10 Series 5 Hole - "T" Flat Plate 80/20 4080 Amount: 8
10 Series 5 Hole - Tee Flat Plate 80/20 4140 Amount: 2
10 Series Standard Lift-Off Hinge - Right Hand Assembly 80/20 2064 Amount: 2
10 to 15 Series 2 Hole - Lite Transition Inside Corner Bracket 80/20 4509 Amount: 6
24”-long UV tube lights ADJ Products LLC T8-F20BLB24 Amount: 2
20W bulb – 24” Wavelength: 365nm
Acrylic Mirror Sheet Profesional Plastics Amount: 1
82.5 cm x 26.5 cm
Acrylic Mirror Sheet Profesional Plastics Amount: 2
26.5 cm X 30.5 cm
Acrylic Mirror Sheet Profesional Plastics Amount: 2
82.5 cm x 30.5 cm
AR polycarbonate (UV resistance) 80/20 65-2641 Amount: 2
4.5mm Thick, Clear, 38.5 cm x 26.5 cm
AR polycarbonate (UV resistance) 80/20 65-2641 Amount: 4
4.5mm Thick, Clear, 38.5 cm x 21.5 cm
AR polycarbonate (UV resistance) 80/20 65-2641 Amount: 4
4.5mm Thick, Clear, 26.5 cm x 21.5 cm
AR polycarbonate (UV resistance) 80/20 65-2641 Amount: 4
4.5mm Thick, Clear 37.5 cm x 23.9 cm
AR polycarbonate (UV resistance) 80/20 65-2641 Amount: 4
4.5mm Thick, Clear , 24.4 cm x 23.9 cm
Chromatography paper (thin paper)  Thermo Fisher Scientific 57144
Cosmos blotting paper (thick paper) Blick Art Materials 10422-1005
Excel Microsoft Corporation
GraphPad Prism GraphPad Software Version 9.4.0 graphing and statistics software
ImageJ FIJI NIH
Parafilm Merck transparent film
Quick Time Player 10.5 software  Apple multimedia player
Security spy Ben software video surveillance software system
Standard End Fastener, 1/4-20 80/20 3381 Amount: 80
UV transmitting acrylic Spartech Polycast Solacryl SUVT Amount: 2
38.5 cm x 26.5 cm 
Water gel: HydroGel ClearH2O   70-01-5022 (https://www.clearh2o.com/product/hydrogel/)
Webcam Logitech C930e Amount: 4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. The urothelium: life in a liquid environment. Physiological Reviews. 100 (4), 1621 (2020).
  2. de Groat, W. C., Griffiths, D., Yoshimura, N. Neural control of the lower urinary tract. Comprehensive Physiology. 5 (1), 327 (2015).
  3. Dalghi, M. G., et al. Functional roles for PIEZO1 and PIEZO2 in urothelial mechanotransduction and lower urinary tract interoception. JCI Insight. 6 (19), (2021).
  4. Montalbetti, N., et al. Bladder infection with uropathogenic Escherichia coli increases the excitability of afferent neurons. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 322 (1), 1 (2022).
  5. Montalbetti, N., et al. Increased urothelial paracellular transport promotes cystitis. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 309 (12), 1070 (2015).
  6. Montalbetti, N., et al. Urothelial tight junction barrier dysfunction sensitizes bladder afferents. eNeuro. 4 (3), (2017).
  7. Montalbetti, N., Stocker, S. D., Apodaca, G., Bastacky, S. I., Carattino, M. D. Urinary K+ promotes irritative voiding symptoms and pain in the face of urothelial barrier dysfunction. Scientific Reports. 9 (1), 5509 (2019).
  8. Kim, A. K., Hamadani, C., Zeidel, M. L., Hill, W. G. Urological complications of obesity and diabetes in males and females of three mouse models: temporal manifestations. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 318 (1), 160 (2020).
  9. Bartolone, S. N., et al. Micturition defects and altered bladder function in the klotho mutant mouse model of aging. American Journal of Clinical and Experimental Urology. 8 (3), (2020).
  10. de Rijk, M. M., et al. Aging-associated changes in oxidative stress negatively impacts the urinary bladder urothelium. International Neurourology Journal. 26 (2), 111 (2022).
  11. Coyne, K. S., et al. The prevalence of lower urinary tract symptoms (LUTS) and overactive bladder (OAB) by racial/ethnic group and age: results from OAB-POLL. Neurourology and Urodynamics. 32 (3), 230 (2013).
  12. Wittig, L., Carlson, K. V., Andrews, J. M., Crump, R. T., Baverstock, R. J. Diabetic bladder dysfunction: a review. Urology. 123, (2019).
  13. Irwin, D. E., et al. Population-based survey of urinary incontinence, overactive bladder, and other lower urinary tract symptoms in five countries: results of the EPIC study. European Urology. 50 (6), 1314 (2006).
  14. Bogart, L. M., Berry, S. H., Clemens, J. Q. Symptoms of interstitial cystitis, painful bladder syndrome and similar diseases in women: a systematic review. The Journal of Urology. 177 (2), 450 (2007).
  15. Foxman, B. Urinary tract infection syndromes: occurrence, recurrence, bacteriology, risk factors, and disease burden. Infectious Disease Clinics of North America. 28 (1), 1 (2014).
  16. Fall, M., Logadottir, Y., Peeker, R. Interstitial cystitis is bladder pain syndrome with Hunner's lesion. International Journal of Urology. 21, 79 (2014).
  17. Birder, L. A. Urinary bladder, cystitis and nerve/urothelial interactions. Autonomic Neuroscience: Basic & Clinical. 182, 89 (2014).
  18. Rosen, J. M., Klumpp, D. J. Mechanisms of pain from urinary tract infection. International Journal of Urology. 21 Suppl. 1, 26 (2014).
  19. Birder, L., et al. Neural control of the lower urinary tract: peripheral and spinal mechanisms. Neurourology and Urodynamics. 29 (1), 128 (2010).
  20. Desjardins, C., Maruniak, J. A., Bronson, F. H. Social rank in house mice: differentiation revealed by ultraviolet visualization of urinary marking patterns. Science. 182 (4115), 939 (1973).
  21. Sugino, Y., et al. Voided stain on paper method for analysis of mouse urination. Neurourology and Urodynamics. 27 (6), 548 (2008).
  22. Hill, W. G., Zeidel, M. L., Bjorling, D. E., Vezina, C. M. Void spot assay: recommendations on the use of a simple micturition assay for mice. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 315 (5), (2018).
  23. Rajandram, R., et al. Intact urothelial barrier function in a mouse model of ketamine-induced voiding dysfunction. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 310 (9), (2016).
  24. Ruetten, H., et al. A uropathogenic E. coli UTI89 model of prostatic inflammation and collagen accumulation for use in studying aberrant collagen production in the prostate. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 320 (1), 31 (2021).
  25. Wegner, K. A., et al. Void spot assay procedural optimization and software for rapid and objective quantification of rodent voiding function, including overlapping urine spots. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 315 (4), (2018).
  26. Wood, R., Eichel, L., Messing, E. M., Schwarz, E. Automated noninvasive measurement of cyclophosphamide-induced changes in murine voiding frequency and volume. The Journal of Urology. 165 (2), 653 (2001).
  27. Dmochowski, R. R. Bladder outlet obstruction: etiology and evaluation. Reviews in Urology. 7 (Suppl 6), S3–S13. , (2005).
  28. Aizawa, N., Homma, Y., Igawa, Y. Influence of high fat diet feeding for 20 weeks on lower urinary tract function in mice. Lower Urinary Tract Symptoms. 5 (2), 101 (2013).
  29. Wang, Z., et al. Void sorcerer: an open source, open access framework for mouse uroflowmetry. American Journal of Clinical and Experimental Urology. 7 (3), 170 (2019).
  30. Verstegen, A. M., Tish, M. M., Szczepanik, L. P., Zeidel, M. L., Geerling, J. C. Micturition video thermography in awake, behaving mice. Journal of Neuroscience Methods. 331, 108449 (2020).
  31. Keller, J. A., et al. Voluntary urination control by brainstem neurons that relax the urethral sphincter. Nature Neuroscience. 21 (9), (2018).
  32. Hou, X. H., et al. Central control circuit for context-dependent micturition. Cell. 167 (1), 73 (2016).
  33. Negoro, H., et al. Involvement of urinary bladder Connexin43 and the circadian clock in coordination of diurnal micturition rhythm. Nature Communication. 3, (2012).
  34. Montalbetti, N., Carattino, M. D. Acid-sensing ion channels modulate bladder nociception. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 321 (5), (2021).
  35. Chen, H., Zhang, L., Hill, W. G., Yu, W. Evaluating the voiding spot assay in mice: a simple method with complex environmental interactions. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 313 (6), (2017).
  36. Dalghi, M. G., et al. Expression and distribution of PIEZO1 in the mouse urinary tract. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 317 (2), 303 (2019).
  37. Birder, L., Andersson, K. E. Animal modelling of interstitial cystitis/bladder pain syndrome. International Neurourology Journal. 22, (2018).
  38. Okinami, T., et al. Altered detrusor gap junction communications induce storage symptoms in bladder inflammation: a mouse cyclophosphamide-induced model of cystitis. PLoS One. 9 (8), (2014).
  39. Tungtur, S. K., Nishimune, N., Radel, J., Nishimune, H. Mouse Behavior Tracker: An economical method for tracking behavior in home cages. Biotechniques. 63 (5), (2017).
  40. Negoro, H., Kanematsu, A., Yoshimura, K., Ogawa, O. Chronobiology of micturition: putative role of the circadian clock. The Journal of Urology. 190 (3), (2013).

Tags

Tilbagetrækning udgave 192 Ugyldig pletanalyse Urinblære tømningsfunktion mikturering cystometri
Analyse af tomrum i realtid
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dalghi, M. G., Montalbetti, N.,… More

Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Wheeler, T. B., Apodaca, G., Carattino, M. D. Real-Time Void Spot Assay. J. Vis. Exp. (192), e64621, doi:10.3791/64621 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter