Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

Real-Time Void Spot Assay

Published: February 10, 2023 doi: 10.3791/64621
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1,2
1Renal-Electrolyte Division, Department of Medicine, University of Pittsburgh, 2Department of Cell Biology, University of Pittsburgh

Summary

Dit artikel beschrijft een nieuwe methode om het ledigingsgedrag van muizen te bestuderen door videobewaking op te nemen in de conventionele void spot-assay. Deze benadering biedt tijdelijke, ruimtelijke en volumetrische informatie over de ledigingsgebeurtenissen en details van muisgedrag tijdens de lichte en donkere fasen van de dag.

Abstract

Normaal ledigingsgedrag is het resultaat van de gecoördineerde functie van de blaas, de urethra en de urethrale sluitspieren onder de juiste controle van het zenuwstelsel. Om vrijwillig ledigingsgedrag in muismodellen te bestuderen, hebben onderzoekers de void spot assay (VSA) ontwikkeld, een methode die het aantal en de oppervlakte van urinevlekken meet die zijn afgezet op een filterpapier dat de vloer van de kooi van een dier bekleedt. Hoewel technisch eenvoudig en goedkoop, heeft deze test beperkingen wanneer deze wordt gebruikt als een eindpunttest, waaronder een gebrek aan tijdelijke oplossing van ledigingsgebeurtenissen en problemen met het kwantificeren van overlappende urinevlekken. Om deze beperkingen te overwinnen, hebben we een video-bewaakte VSA ontwikkeld, die we real-time VSA (RT-VSA) noemen, en waarmee we de ledigingsfrequentie kunnen bepalen, het lege volume en de ledigingspatronen kunnen beoordelen en metingen kunnen doen over 6 uur tijdvensters tijdens zowel de donkere als de lichte fase van de dag. De methode die in dit rapport wordt beschreven, kan worden toegepast op een breed scala aan op muizen gebaseerde studies die de fysiologische en neurobehaviorale aspecten van vrijwillige mictie in gezondheids- en ziektetoestanden onderzoeken.

Introduction

Urineopslag en mictie worden gecoördineerd door een centraal circuit (centraal zenuwstelsel) dat informatie ontvangt over de blaasvulstatus via de bekken- en hypogastrische zenuwen. Het urothelium, het epitheel dat de urinewegen van het nierbekken naar de proximale urethra bekleedt, vormt een strakke barrière voor de metabole afvalproducten en pathogenen die in de urine aanwezig zijn. Het is een integraal onderdeel van een sensorisch web, dat de vultoestand van de blaas detecteert en communiceert naar onderliggende weefsels en afferente zenuwen 1,2. Verstoring van de urotheliale barrière, of veranderingen in urotheliale mechanotransductieroutes, kan leiden tot ledigingsstoornissen samen met lagere urinewegsymptomen zoals frequentie, urgentie, nocturie en incontinentie 3,4,5,6,7. Evenzo is bekend dat veroudering, diabetes, lagere urineweginfecties, interstitiële cystitis en andere ziekteprocessen die de urineblaas beïnvloeden, of het bijbehorende circuit dat de functie ervan regelt, blaasdisfunctie veroorzaken 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17, 18,19. Een beter begrip van normaal en abnormaal ledigingsgedrag hangt af van de ontwikkeling van methoden die op betrouwbare wijze onderscheid kunnen maken tussen verschillende plaspatronen.

Traditioneel is het vrijwillige ledigingsgedrag van muizen bestudeerd met behulp van de void spot assay (VSA), ontwikkeld door Desjardins en collega's20, en breed aangenomen vanwege de eenvoud, lage kosten en niet-invasieve aanpak 8,21,22,23,24. Deze test wordt meestal uitgevoerd als een eindpunttest, waarbij een muis een bepaalde hoeveelheid tijd doorbrengt in een kooi bekleed met een filterpapier, dat vervolgens wordt geanalyseerd door het aantal te tellen en de grootte van urinevlekken te beoordelen wanneer het filterpapier onder ultraviolet (UV) licht wordt geplaatst (de urinevlekken fluoresceren onder deze omstandigheden)20. Ondanks deze vele voordelen heeft de traditionele VSA enkele grote beperkingen. Omdat muizen vaak in dezelfde gebieden plassen, moeten onderzoekers de duur van de test beperken tot een relatief korte periode (≤4 uur)25. Zelfs wanneer de VSA over kortere tijdsperioden wordt uitgevoerd, is het bijna onmogelijk om kleine lege plekken (SVS'en) op te lossen die over grote lege plekken vallen of om SVS'en te onderscheiden van de overdracht van urine die aan staarten of poten is gehecht. Het is ook erg moeilijk om te onderscheiden of SVS'en een gevolg zijn van frequente maar individuele ledigingsgebeurtenissen (een fenotype dat vaak wordt waargenomen als reactie op cystitis 4,26), of als gevolg van post-mictie dribbelen (een fenotype geassocieerd met obstructie van de blaasuitlaat 27). Bovendien beperkt de wens om de test tijdens werkuren te voltooien, in combinatie met moeilijkheden om toegang te krijgen tot huisvestingsfaciliteiten wanneer de lichten worden uitgeschakeld, deze tests vaak tot de lichtperiode van de circadiane cyclus van 24 uur. Deze tijdsbeperkingen voorkomen dus de evaluatie van het ledigingsgedrag van muizen tijdens hun actieve nachtfase, waardoor het vermogen om specifieke genen of behandelingen te analyseren die worden bepaald door circadiane ritmes, wordt verminderd.

Om een aantal van deze beperkingen te overwinnen, hebben onderzoekers alternatieve methoden ontwikkeld om het ledigingsgedrag in realtime te beoordelen 26,28,29,30,31,32. Sommige van deze benaderingen omvatten het gebruik van dure apparatuur zoals metabole kooien26,28,29, of het gebruik van thermische camera's 30; Ook deze hebben echter beperkingen. In metabole kooien heeft urine bijvoorbeeld de neiging zich te hechten aan de draden van de gaasvloer en aan de wanden van de trechter, waardoor de hoeveelheid urine die wordt verzameld en gemeten, wordt verminderd. Het kan dus moeilijk zijn om nauwkeurig gegevens over kleine holtes te verzamelen. Bovendien geven metabole kooien geen informatie over de ruimtelijke verdeling van de ledigingsgebeurtenissen (d.w.z. urineren in de hoeken versus het midden van de kamer). Aangezien infraroodstraling met een lange golflengte die door de thermografische camera's wordt gebruikt, niet doordringt in vaste stoffen, moet de ledigingsactiviteit die wordt beoordeeld door videothermografie worden uitgevoerd in een open systeem, wat een uitdaging kan zijn met actieve muizen, omdat ze enkele centimeters in de lucht kunnen springen. Een ander systeem is de geautomatiseerde voided beits on paper (aVSOP) approach33, die bestaat uit gewalst filterpapier dat met een constante snelheid onder de gaasvloer van een muizenkooi terechtkomt. Deze aanpak voorkomt papierschade en de overlap van urinevlekken die voorkomen in de klassieke VSA, en de implementatie ervan stelt de onderzoeker in staat om experimenten gedurende meerdere dagen uit te voeren. Het biedt de onderzoeker echter geen precieze timing van de voiding-gebeurtenissen en er is geen mogelijkheid om gedrag te onderzoeken en hoe het correleert met spotting. Om deze informatie te verkrijgen, hebben onderzoekers videomonitoring opgenomen in voiding-assays, een aanpak die de gelijktijdige beoordeling van muisactiviteit en urinegebeurtenissen mogelijk maakt31,32. Eén benadering bestaat uit het plaatsen van een blauw licht emitterende diode (LED) en een videocamera met een groen fluorescentie-eiwitfilter onder de experimentele kooi om de ledigingsgebeurtenissen te visualiseren, en een infrarood-LED en een videocamera boven de kooi om muispositie32 vast te leggen. Deze opstelling is gebruikt om het ledigingsgedrag te controleren tijdens het uitvoeren van vezelfotometrie; De fel verlichte omgeving van dit systeem vereiste echter dat de onderzoekers hun muizen behandelden met een diureticum om lediging te stimuleren. In een ander experimenteel ontwerp werden groothoekcamera's boven en onder de experimentele kooi geplaatst om respectievelijk de motorische activiteit van de muis en de plasgebeurtenissen te visualiseren. In dit geval werden urinevlekken afgezet op een filterpapier dat de vloer van de kooi bekleedde, onthuld door het filterpapier te verlichten met UV-lampen die onder de kooiwaren geplaatst 31. Deze opstelling werd gebruikt in korte assays, 4 minuten lang, tijdens de lichte fase van de dag om de hersenstamneuronen te bestuderen die betrokken zijn bij vrijwillig ledigingsgedrag31. De geschiktheid van dit systeem voor gebruik tijdens de donkere fase of voor perioden >4 minuten werd niet gemeld.

In dit artikel wordt een methode beschreven die de traditionele VSA verbetert door langdurige videomonitoring van muisledigingsgedrag mogelijk te maken. Deze kosteneffectieve aanpak biedt tijdelijke, ruimtelijke en volumetrische informatie over ledigingsgebeurtenissen gedurende langere tijd tijdens de lichte en donkere fasen van de dag, samen met details met betrekking tot muisgedrag 3,4,34. Gedetailleerde informatie voor de bouw van de ledigingskamers, de implementatie van een real-time VSA (RT-VSA) en de analyse van de gegevens wordt verstrekt. De RT-VSA is waardevol voor onderzoekers die de fysiologische mechanismen willen begrijpen die de functie van het urinewegstelsel regelen, farmacologische benaderingen willen ontwikkelen om mictie te beheersen en de moleculaire basis van ziekteprocessen willen definiëren die de lagere urinewegen beïnvloeden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Urotheliale piëzo1 /2 dubbele knock-out muizen (Pz1/2-KO, genotype: Piezo1 fl/fl; Piëzo2 fl/fl; Upk2CRE+/-) en controles (Pz1/2-C, genotype: Piezo1 fl/fl; Piëzo2 fl/fl; Upk2CRE-/-) werden intern gegenereerd uit ouderstammen verkregen uit de Jax-laboratoria (Piezo1 fl/fl stam # 029213; Piezo2 fl/fl soort # 027720; Upk2CRE+/- stam # 029281). Zowel vrouwelijke (1,5-3 maanden oud en 17-20 g in gewicht) als mannelijke (2-4 maanden oud en 23-29 g in gewicht) muizen werden gebruikt in de experimenten. Voor cyclofosfamide-geïnduceerde cystitis-experimenten werden wild-type C57Bl / 6J-vrouwtjes (3 maanden oud en ~ 20 g in gewicht) gebruikt (de Jackson-laboratoria, stam # 000664). Dieren werden gehuisvest en de experimenten werden uitgevoerd aan de University of Pittsburgh Animal Care Facility onder goedkeuring van de University of Pittsburgh Institutional Animal Care and Use Committee. Alle dierproeven zijn uitgevoerd in overeenstemming met relevante richtlijnen en voorschriften van het GGD-beleid humane zorg en gebruik van proefdieren en de Dierenwelzijnswet.

1. Assemblage van kooien voor real-time void spot assay (RT-VSA)

  1. De RT-VSA-rig bestaat uit een UV-standaard met twee UV-lampen en twee groothoekcamera's (onderste camera's), die worden gebruikt om ledigingsactiviteit tijdens de lichtfase van de dag te registreren. Schik twee muiskamers om op de standaard te rusten. Bevestig groothoekcamera's (bovenste camera's) aan het deksel van elke muiskamer, die worden gebruikt om ledigingsactiviteit tijdens de donkere fase van de dag vast te leggen (figuur 1A).
  2. Construeer het frame van de UV-standaard en muiskamers van 1 in x 1 in T-sleuf aluminium profielen. Zie tabel 1 voor een lijst van de componenten die zijn gebruikt om twee muiskamers en de UV-standaard te bouwen en figuur 1B-D voor de verschillende weergaven van de geassembleerde componenten en afmetingen.
  3. Bouw elke muiskamer met acht T-sleuf aluminium profielen gesneden tot 10 in en vier gesneden tot 14,75 inch. Begin met het monteren van de onderkant van de muiskamer en gebruik standaard eindbevestigingen (tabel 1) om de T-sleufprofielen te monteren volgens figuur 1. Monteer het 38,5 cm x 26,5 cm UV-doorlatende acrylaat in het interne kanaal van de profielen om de vloer van de muiskamers te bouwen.
    OPMERKING: Voor gedetailleerde informatie over het monteren van de T-sleufprofielen met standaard eindbevestigingen, gaat u naar de webpagina van het bedrijf.
  4. Bouw de wanden van de muiskamer met de rest van de profielen. Monteer de 38,5 cm x 21,5 cm en 26,5 cm x 21,5 cm slijtvaste (AR) polycarbonaatpanelen in de profielen om de buitenwanden van de muizenkamer te monteren. Gebruik de 37,5 cm x 23,9 cm en 24,4 cm x 23,9 cm AR polycarbonaat panelen om de binnenkant van de muiskamer te bouwen.
  5. Bevestig de AR polycarbonaat panelen met standaard eindbevestiging 1/4-20 loopvlak. Zie de instructies voor het monteren van de panelen in de profielen op de webpagina in de OPMERKING van stap 1.3. Gebruik commerciële siliconenkit om de verbindingen tussen de interne panelen af te dichten.
  6. Gebruik twee 12 inch en twee 14.75 in T-sleufprofielen om het deksel van de kooi te monteren zoals aangegeven in figuur 1B. Monteer een 38,5 cm x 26,5 cm AR polycarbonaat paneel in het interne kanaal van de profielen om het deksel te voltooien.
  7. Monteer de 12 in cameraprofielsteun loodrecht op de lange assen van de bovenkant van de kooi en bevestig met twee lite-overgang in hoekbeugels (gemarkeerd met 3 in figuur 1B). Gebruik een rechte vlakke plaat (gemarkeerd met 2) als ondersteuning voor webcammontage en monteer deze zoals weergegeven in figuur 1B. Bevestig de camera aan de steun met de bevestigingsschroef van de camera.
  8. Gebruik het standaard lift-off scharnier van de 10-serie rechts om het deksel aan het lichaam van de muiskamer te bevestigen (gemarkeerd met 1 in figuur 1B).
  9. Bouw de UV-standaard met vier T-sleufprofielen gesneden tot 40 inch, vier T-sleufprofielen gesneden tot 32 inch en vier T-sleufprofielen gesneden tot 10 inch, volgens figuur 1C, D. Monteer een acrylspiegelplaat van 82,5 cm x 26,5 cm in de profielen om de onderkant van de UV-kamer te bouwen.
  10. Gebruik de 82,5 cm x 30,5 cm en 26,5 cm x 30,5 cm acryl spiegelplaat om de wand van de UV-standaard te construeren.
  11. Bevestig de 10-serie vijfgats T-vlakke platen (gemarkeerd met 2 in figuur 1 C), de 10-serie vijfgats L-vlakke platen (gemarkeerd met 3 in figuur 1 C) en de 10-serie vijfgats T-platte platen (gemarkeerd met 1 in figuur 1C) om de UV-standaard vast te zetten.
  12. Monteer de onderste camera's in een T-sleufprofiel dat tot 32 inch is gesneden en bevestig aan de onderkant van de standaard met twee lite-overgangshoekbeugels zoals weergegeven in figuur 1D. Gebruik rechte platte platen om de webcams aan het T-sleufprofiel te bevestigen.
  13. Monteer de UV-lampen aan de binnenkant, de voor- en achterkant en bevestig ze aan de rechte vlakke platen zoals weergegeven in figuur 1D.
  14. Sluit de vier webcams aan op de USB-poorten van een computer met videobewakingssoftware.

2. Huisvesting van dieren voorafgaand aan experimenten

  1. Huisexperimentele muizen, speciaal gefokt of verkregen van een externe site, in groepen van vier. Gebruik indien mogelijk op leeftijd afgestemde vrouwelijke of mannelijke muizen voor deze experimenten. Als dieren worden verkregen uit een externe bron, laat ze dan minstens 7 dagen acclimatiseren voordat ze experimentele procedures uitvoeren.
  2. Plaats de dieren gedurende hun tijd in de dierenfaciliteit in standaardkooien met strooisel en verrijking (bijv. Plastic iglo, wiel, stuk papier om te versnipperen) en houd ze onder een dag/ nachtcyclus van 12 uur, met toegang tot water en droge muizenchow ad libitum.

3. RT-VSA opnames tijdens de lichte en donkere fasen van de dag

OPMERKING: Het onderstaande protocol beschrijft het gebruik van RT-VSA om het ledigingsgedrag van muizen tijdens de lichte en donkere fasen van de dag te beoordelen. De dieren worden gehouden op een 12 uur lichte en 12 uur donkere cyclus met Zeitgeber tijd (ZT) = 0 om 07:00 uur. De opnames starten tussen 10.30 en 11.00 uur (ZT = 3.5-4.0) voor de lichtfase-experimenten en tussen 18.00 en 18.30 uur (ZT = 11.0-11.5) voor de donkere fase-experimenten. Wanneer dieren onder beide omstandigheden worden getest, worden experimenten meestal op twee afzonderlijke dagen uitgevoerd, met ten minste 5 opeenvolgende dagen tussen de lichte en donkere tests. Experimenten mogen niet worden uitgevoerd op dagen dat de dierenkamers worden schoongemaakt of de kooien worden vervangen, omdat deze kunnen leiden tot spanningen die het ledigingsgedrag beïnvloeden. Alle stappen moeten worden uitgevoerd onder omstandigheden van minimale stress voor de muizen.

  1. Vervoer de proefdieren van hun huisvestingslocatie naar de procedureruimte waar de RT-VSA-opnamekamers zich bevinden.
  2. RT-VSA opnamekamer voorbereiding
    1. Plaats een stuk filterpapier (24,3 cm x 36,3 cm) in de bodem van elke RT-VSA-opnamekooi. Gebruik afhankelijk van het tijdstip van de dag dun (lichte fase experimenten) of dik (donkere fase experimenten) filterpapier.
      OPMERKING: Dik filterpapier wordt gebruikt tijdens de actieve donkere fase omdat het beter bestand is tegen versnippering dan dun filterpapier. Topcamera's worden gebruikt om urinevlekken te visualiseren die tijdens de donkere fase op dik filterpapier zijn afgezet. Tijdens de lichtfase worden daarentegen de onderste camera's gebruikt omdat het omgevingslicht voorkomt dat de bovenste camera's urinevlekken detecteren die op het filterpapier zijn afgezet. In dit geval wordt dun filterpapier gebruikt. We ontdekten dat de onderste camera's niet effectief zijn in het detecteren van kleine ledigingsgebeurtenissen die op dik filterpapier zijn afgezet.
    2. Plaats bovenop het filterpapier de volgende items: een plastic iglo (die een slaapruimte biedt), een steriele microcentrifugebuis van 1,5 ml voor verrijkingsdoeleinden en een plastic schaal van 60 mm x 15 mm met twee of drie stukjes muisdroog chow en 14-16 g water in de vorm van een gel-pack (niet-bevochtigende watergel; Figuur 2).
      OPMERKING: Het gebruik van 1,5 ml microcentrifugebuizen voor verrijkingsdoeleinden was specifiek voor de behuizing die in dit onderzoek werd gebruikt.
    3. Zodra de opnamekamers klaar zijn, plaatst u de experimentele muizen voorzichtig binnen door ze zachtjes op het filterpapier te leggen. Zorg ervoor dat de overdracht van de dieren van de huisvestingskooi naar de registratiekooien met minimale stress gebeurt.
    4. Zodra alle proefdieren zich in hun opnamekooien bevinden, met hun deksels gesloten, bedek je de bovenkant van de deksels met een absorberend blauw kussen om directe reflecties van omgevingslicht op het plexiglas dekseloppervlak te minimaliseren.
    5. Schakel de UV-lampen in de onderste kamer in.
      OPMERKING: De dieren hebben geen direct contact met het UV-licht. Het aanbevolen UV-licht wordt gedetailleerd beschreven in de sectie materialen.
  3. RT-VSA opnames
    1. Als u video van de bovenste en onderste camera's wilt opnemen, gebruikt u een videobewakingsopnamesoftware, die kan worden geconfigureerd om op te nemen van meerdere webcams of netwerkcamera's tegelijk.
    2. Start bij het openen van het programma de opname door op Command en R in het programmavenster te drukken. Voer video-opnamen uit met een snelheid van 1 frame per s.
    3. Onmiddellijk na het initiëren van de opnames, verlaat u de kamer en sluit u de deur voorzichtig. Zorg ervoor dat de ruimte stil blijft gedurende de gehele duur van het experiment.
  4. RT-VSA-opnames voltooien
    1. Keer terug naar de procedurekamer na 7 uur (lichtfase-experimenten) of de volgende ochtend (donkere fase-experimenten).
    2. Stop de opnames door op Command en T te drukken. Doe de UV-lampen uit.
    3. Na het stoppen van de opname genereert de software automatisch een filmbestand (in .m4v formaat) voor elke camera en slaat het op onder de naam van de camera in een eerder geselecteerde doelmap. Controleer of de experimenten in elke cameramap zijn geordend in mappen op datum.
    4. Controleer in elke datum-/experimentmap of er één .m4v bestand en alle afzonderlijke .jpeg bestanden zijn die overeenkomen met elk van de filmframes.
    5. OPMERKING: De .jpeg bestanden kunnen worden gebruikt om het experiment te herstellen voor het geval filmbestanden beschadigd raken.
    6. Maak een map op het bureaublad met de naam en datum van het experiment en breng alle .m4v bestanden over naar deze map. Verwijder indien nodig de .jpeg bestanden zodra de filmbestanden zijn opgeslagen en er een back-up van is gemaakt.
    7. OPMERKING: Voor lichtfase-experimenten genereert de software één film per camera, terwijl het voor donkerefase-experimenten twee films voor elke camera genereert. Dit komt omdat een nieuw .m4v bestand wordt gegenereerd na middernacht wanneer de datum verandert.
    8. Kopieer de map met de films naar een flashstation voor analyse op een externe computer. Deze stap kan enkele minuten duren en kan parallel aan de stappen 3.5.1 tot en met 3.5.3 worden uitgevoerd.
  5. Reiniging van opnamekooien en terugplaatsing van experimentele muizen naar hun huisvestingslocatie
    1. Verwijder het bluepad dat de deksels van de kooien bedekt. Breng de dieren over van de registratiekooien naar hun huisvestingskooi.
    2. Verwijder de accessoires en voedingsmiddelen in de opnamekamers (d.w.z. plastic iglo's, plastic buizen, schaal met resten van chow en watergel en filtreerpapier) en gooi ze weg bij biologisch gevaarlijk afval.
    3. Reinig de kooien met een handstofzuiger en verwijder chow en fecale pellets die op de bodem van de kooi aanwezig zijn. Spuit vervolgens de vloer en binnenwanden van de kooi met 70% ethanol en reinig het interieur met een stuk zachte doek. Laat het deksel van de kooien open om ze aan de lucht te laten drogen.
    4. Plaats de opvangkooi met de dieren in een secundaire container en vervoer de dieren terug naar hun huisvestingslocatie.

4. Genereren van kalibratiecurven

OPMERKING: Een kalibratiecurve is nodig om lege plekken om te zetten in urinevolumes. Als u experimenten uitvoert tijdens de lichte en donkere fasen van de dag, moeten twee kalibratiecurven worden gegenereerd, één voor elk type filterpapier dat wordt gebruikt (dun en dik filterpapier). Kalibratiecurven worden in tweevoud gegenereerd. Elke replicatie wordt uitgevoerd op een filterpapier dat in een RT-VSA-opnamekamer wordt geplaatst. Gezien de complexe samenstelling en UV-prikkelbaarheid, gebruikt u muizenurine om de kalibratiecurven te maken.

  1. Urineverzameling van muizen
    1. Neem een stuk flexibele transparante folie (10 cm x 15 cm) en leg deze op een bankje.
    2. Kies een muis bij zijn staart en krab hem. Masseer zachtjes de onderbuik om plassen op te wekken. Verzamel urine op het oppervlak van de transparante film plastic vel.
    3. Laat het dier voorzichtig los in zijn kooi. Breng met behulp van een pipet de urine over van het oppervlak van de transparante film naar een steriele microcentrifugebuis van 1,5 ml. Herhaal de procedure met meerdere muizen totdat ~ 10 ml muizenurine is verzameld, pool de urine en bewaar bij -20 ° C.
      OPMERKING: Een totaal van ~ 10 ml muizenurine is vereist om dubbele kalibratiecurven te genereren voor de lichte en donkere fasen. Om stress bij experimentele muizen te voorkomen, mag u geen muizen gebruiken die worden onderworpen aan RT-VSA-experimenten voor urineverzameling.
  2. Opnames van kalibratiecurves
    1. Ontdooi de urine verzameld in stap 4.1 en meng het door zachtjes te vortexen gedurende 10-15 s.
    2. Plaats een stuk dun filterpapier (24,3 cm x 36,3 cm) in elk van de twee RT-VSA-opnamekooien.
    3. Pipetteer de volgende urinevolumes (in μL) op elk van de filterpapieren: 2, 5, 10, 25, 50, 80, 100, 200, 300, 400, 500 en 750. Om overlapping van vlekken als gevolg van diffusie te voorkomen, wijst u de vlekken op voldoende afstand van elkaar toe.
    4. Sluit het deksel van de kooien en bedek ze met pads.
    5. Begin met opnemen door op Command en R te drukken en dezelfde softwareparameters toe te passen die worden gebruikt om de experimenten op te nemen (stap 3.3.).
    6. Registreer de kalibratiecurve gedurende 1 uur om maximale diffusie van de urinevlekken mogelijk te maken. Druk op Command en T om de opname te stoppen.
    7. Maak een nieuwe map op het bureaublad, plaats de .m4v bestanden erin en breng de gegevens vervolgens over naar een flashstation voor verdere analyse.
    8. Voer een vergelijkbare procedure uit om dubbele curven te genereren met dik filterpapier. Voeg in dit geval extra lagen pads toe om het interieur donkerder te maken en donkere faseomstandigheden te simuleren.
  3. Analyse van de kalibratiecurve-opnamen
    1. Open de .m4v bestanden in een filmspelersoftware en maximaliseer het venster om het scherm te vullen. Om de kalibratiecurven op dik filterpapier te analyseren, gebruikt u de bestanden die zijn verkregen met de bovenste camera's (figuur 3A). Om de kalibratiecurven op dun filterpapier te analyseren, gebruikt u de bestanden die zijn verkregen met de onderste camera's (figuur 3B).
    2. Speel het .m4v bestand af en beweeg de tijdschuifregelaar naar voren en naar achteren om een overzicht te krijgen van de volledige kalibratiecurvefilm van 1 uur.
    3. Identificeer het tijdsbereik waar de kleinere urinevlekken (<25 μL) de grootste intensiteit hebben en zich maximaal hebben verspreid. Maak een screenshot binnen dit tijdsbereik. Geef het screenshotbestand een naam en sla het op als een .png bestand (Figuur 3A, bovenpaneel).
      OPMERKING: Screenshots worden gemaakt door op de toets F6 te drukken. Als u F6 wilt instellen voor het verkrijgen van schermafbeeldingen, selecteert u: Systeemvoorkeuren > Toetsenbord > Sneltoetsen en schrijft u F6 in het vak rechts van de optie Afbeelding van scherm opslaan als bestand .
    4. Identificeer het tijdsbereik waar de middelgrote en grote urinevlekken (>50 μL) een maximaal oppervlak hebben en maak een screenshot. Het is mogelijk dat sommige van de kleinere urinevlekken niet zichtbaar zijn tegen de tijd dat de grotere urinevlekken maximale diffusie vertonen. Geef het bestand een naam en sla de schermafbeelding op als een .png bestand (Afbeelding 3A, onderste paneel).
    5. Open de ImageJ-software (NIH) en sleep vervolgens het pictogram van het .png-bestand dat is verkregen in stap 4.3.3 om het afbeeldingsbestand te openen (Figuur 4A).
    6. Selecteer op de werkbalk het pictogram Polygoonselecties en baken de rand van het filterpapier af.
    7. Selecteer vervolgens Analyseren in de menubalk, kies Metingen instellen in het uitgevouwen menu en selecteer Gebied in het venster dat verschijnt. Klik op OK. Dit maakt het mogelijk om waarden van het gebied te verkrijgen wanneer stap 4.3.8 wordt uitgevoerd.
    8. Selecteer vervolgens opnieuw Analyseren in de menubalk en kies Meten uit de uitgevouwen opties. Er verschijnt een resultatenvenster met een kolomgebied met de gebiedswaarden in pixel2 (figuur 4B-D).
    9. Selecteer het pictogram Selecties uit de vrije hand op de werkbalk en gebruik het om een lijn te tekenen rond de omtrek van een afzonderlijke leegteplek. Meet het gebied zoals in stap 4.3.8. De software werkt de resultatentabel bij wanneer nieuwe metingen worden uitgevoerd. De nieuwe reeks getallen wordt onder de vorige weergegeven. Noteer het nummer dat wordt weergegeven onder het kolomgebied van het resultatenvenster voor elke geanalyseerde plek (figuur 4E-G).
    10. Herhaal stap 4.3.5 tot en met 4.3.7 voor elk van de replicatievlekken.
    11. Stel de totale oppervlakte van het filterpapier in op 100% en bereken het percentage oppervlakte (% oppervlakte) voor elke urinevlek. Deze normalisatie corrigeert fouten die kunnen optreden als gevolg van verschillen in de zoom of positionering van de camera's.
    12. Maak een nieuwe XY-tabel in een grafisch programma en voeg de waarden van het urinevolume (in μL) in de X-kolom en de dubbele waarden van het % -gebied in de Y-kolom in.
    13. Selecteer vervolgens Analyse > Analyseer > XY-analyse > Niet-lineaire regressie (curve fit). Selecteer in het venster parameters dat verschijnt Model > Polynoom > Tweede-Orde Polynoom (kwadratisch).
    14. Klik vervolgens op het tabblad Methode om de volgende selecties te markeren: Regressie van de kleinste kwadraten, Geen weging en Beschouw elke replicerende Y-waarde als een afzonderlijk punt.
    15. Selecteer op het tabblad Beperkingen de optie voor B0, Type beperking > Constante gelijk aan en typ 0 onder de kolom Waarde. Klik op OK.

5. Analyse van de experimentele muizenopnamen

  1. Open een filmbestand dat is verzameld tijdens de lichte fase (onderste camera) of donkere fase (bovenste camera) voor analyse.
  2. Beoordeel de kwaliteit van het filmbestand door de tijdscroller naar voren en naar achteren te bewegen en te bevestigen dat het filterpapier intact blijft (zonder scheuren of kauwen) tijdens het te analyseren tijdvenster van 6 uur. Als het papier is gescheurd, voer dan geen verdere analyse uit, omdat de muis mogelijk op het blootgestelde plastic heeft geplast dat niet kan worden gekwantificeerd (figuur 5).
  3. Als u experimenten wilt analyseren die in de lichte of donkere fase zijn verzameld, gebruikt u de opdracht vooruitspoelen of de schuifregelaar voor de tijdbalk om naar het gewenste tijdvenster te gaan. De ledigingsactiviteit tijdens de lichtfase wordt geregistreerd tussen 11.00 en 17.00 uur (ZT = 4.0-10.0) en tijdens de donkere fase tussen middernacht en 06.00 uur (ZT = 17.0-23.0).
  4. Speel de film af in de vooruitspoelmodus door op het pictogram >> te klikken (of blader handmatig door de film), op zoek naar bewijs dat de muis leegloopt. De eenvoudigste manier om te zien dat dit gebeurt, is door te zoeken naar de plotselinge verschijning van heldere vlekken van urine op het filterpapier. Een andere indicator is om te zoeken naar gedragsveranderingen, waaronder beweging naar de hoeken van de kooi en een korte periode van inactiviteit wanneer de muis leegloopt.
    OPMERKING: Naarmate men beter wordt in het detecteren van leegtes, kan men de snelheid van scrollen of snel doorsturen verhogen. Bij muizen met bacteriële en chemisch geïnduceerde cystitis, die zeer grote aantallen kleine holteshebben 4,34, kan men echter ledigingsgebeurtenissen missen als men te snel door de film beweegt.
  5. Registreer het tijdstip waarop elke leegte optreedt. Volgens afspraak wordt de tijd van de leegte geregistreerd bij het eerste teken dat urine wordt gedetecteerd (figuur 6A,B).
  6. Om metingen van de leegte te doen, gebruikt u eerst de schuifbalk om vooruit (of achteruit) in de tijd te gaan, op zoek naar het moment waarop maximale diffusie van de urinevlek heeft plaatsgevonden. Pauzeer de film op dit punt en maak een screenshot zoals beschreven in stap 4.3.3. Plaats de pijl van de computermuis op de plek die wordt geanalyseerd, zodat de plek van belang wordt gemarkeerd in de schermafbeelding (figuur 6C, D).
  7. Geef het screenshotbestand een naam met behulp van correlatieve getallen om rekening te houden met de volgorde van verschijning in de film.
  8. Ga verder met het analyseren van het bestand en herhaal stap 5.5 en 5.7 voor elke lege plek in de film. Zodra alle lege plekken zijn geanalyseerd, meet u de totale oppervlakte van het filterpapier door een screenshot te maken en de stappen te gebruiken die worden beschreven in 4.3.6.
  9. Bereken het % gebied van elk van de urinevlekken zoals beschreven in stap 4.3.9. Zet de waarden van het % gebied om in het volume urine (μL) voor elke lege plek met behulp van de kalibratiecurven die in stap 4 zijn gegenereerd en de interpolatiefunctie in de grafische software.
    1. Open in de grafische software de XY-tabel met de gegevens van de kalibratiecurve en voeg de % oppervlaktewaarden in de Y-kolom in onder de laatste waarde van de kalibratiecurve (figuur 7A).
    2. Klik op het tabblad Tabel met resultaten en klik onder het tabblad Model om Onbekenden interpoleren in standaardcurve te selecteren en druk op OK. Er wordt een tabblad met de naam geïnterpoleerde X-gemiddelde waarden weergegeven naast het tabblad Resultatentabel. Dit tabblad bevat een tabel met de geïnterpoleerde waarden die overeenkomen met het volume urine in μL voor elke lege plek. (Figuur 7A,B).
  10. Herhaal stap 5.1 tot en met 5.9 om alle experimentele muizen te analyseren.
  11. Maak een werkmapbestand met de gegevens die zijn verkregen uit stap 5.5 tot en met 5.10, met één spreadsheet per muis (afbeelding 7C). Maak een bestand voor de lichtfase-experimenten en een ander voor de donkere fase-experimenten. Deze masterbestanden bevatten alle ruwe gegevens en noodzakelijke berekeningen die worden gebruikt in verdere analyses.

6. Analyse van het urinepatroon van experimentele muizen

  1. Genereer primaire en secundaire lege vlekprofielen (figuur 8A, B en figuur 9).
    OPMERKING: Volgens frequentieverdelingsstudies 23 vertegenwoordigen lege plekken met een ≥ 20 μL doorgaans >95% van het totale lege volume en worden ze beschouwd als primaire lege plekken (PVS's)8,23,35. Lege plekken die ≤ 20 μL zijn, worden beschouwd als secundaire of kleine lege plekken (SVS'en). Discriminatie tussen PVS'en en SVS'en is een nuttige benadering gebleken om voiding-fenotypen te karakteriseren. Een verhoogd aantal SVS'en duidt op voiding dysfunction35.
    1. Classificeer de vlekken uit het hoofdbestand met belanghebbende voiding-spotgegevens (lichte fase of donkere fase) op basis van hun volume als PVS'en wanneer hun volume ≥ 20 μL is, of SVS'en wanneer hun volume < 20 μL is.
    2. Tel het aantal en bereken het gemiddelde ongeldige volume en het totale volume voor de PVS'en. Tel het aantal en bereken het totale volume voor de SVS'en.
    3. Genereer een grafiekbalk die de controle vergelijkt met de behandelde muizen voor elk van de berekende parameters: aantal PVS'en, ongeldig gemaakt volume PVS'en, totaal volume PVS'en, aantal SVS'en, totaal volume SVS'en.
  2. Optioneel: Genereer een cumulatief leeggemaakt volumeplot (trapfunctie) om het ledigingsgedrag in de loop van de tijd weer te geven (figuur 10 en figuur 11).
    1. Open het hoofdbestand van de werkmap en converteer de tijd van ongeldigheid, die wordt uitgedrukt in uren, minuten en seconden, naar de decimale vorm. Bereken het cumulatieve urinevolume (in μL) voor elk tijdspunt.
    2. Genereer een XY-tabel in de grafische software met tijd in decimale vorm in de X-kolom en cumulatieve urinevolumes in de Y-kolom. Kopieer de tijd- en urinevolumegegevens naar de tabel. Voeg (0; 0) en (6; maximale waarde) gegevenspunten toe. Deze punten zijn nodig om de horizontale lijnen van het waarnemingspunt te voltooien aan het begin van het experiment (tijd: 0 uur) wanneer het lege volume nul is (0; 0), en aan het einde van het experiment (tijd: 6 uur) wanneer de cumulatieve waarde van de geleegde urine gelijk is aan de waarde die is verkregen voor de laatste ledigingsgebeurtenis (6; maximale waarde).
    3. Dubbelklik op de grafiek; Het venster Grafiek opmaken zou moeten verschijnen. Selecteer het tabblad Vormgeving , klik om de knop voor Symbolen weergeven op te heffen en klik om Verbindingslijn/curve weergeven te selecteren. Klik op de optie Stijl en selecteer Overleven.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ledigingsgedrag van urotheliale piëzo1/2 knock-out muizen

Tijdens de opslagfase van de mictiecyclus wordt verondersteld dat het urotheel de spanning waarneemt die wordt uitgeoefend door de urine die zich in de blaas heeft opgehoopt en om deze mechanische stimulus om te zetten in cellulaire reacties zoals serosale ATP-afgifte 1,3. We hebben eerder aangetoond dat mechanisch geactiveerde PIEZO1- en PIEZO2-kanalen tot expressie komen in het muisurothelium 3,36. Om te bepalen of urotheliale PIEZO-kanalen belangrijk zijn voor normaal ledigingsgedrag, hebben we RT-VSA uitgevoerd op urotheliale-voorwaardelijke Piezo1/2 dubbele knock-out muizen (Pz1/2-KO) muizen en leeftijds- en geslachtsgematchte controles (Pz1/2-C; Figuur 9). We testten zowel vrouwelijke als mannelijke muizen gedurende 6 uur tijdens de donkere en lichte fasen van de dag en analyseerden de gegevens zoals beschreven in stap 6.1. Toen we de ledigingsactiviteit tussen de lichte en donkere fasen van de dag voor de controlegroepen vergeleken, werd opgemerkt dat zowel vrouwen als mannen een toename vertoonden in het aantal en het totale volume van PVS'en tijdens hun actieve periode. Deze waarneming geeft aan dat, hoewel de muizen zich in een vreemde omgeving bevonden, de circadiane aard van het ledigingsgedrag van muizen (het hoogst tijdens hun actieve donkere fase) behouden bleef. Tijdens hun inactieve lichtfase zagen we geen significante verschillen in een van de geanalyseerde parameters voor vrouwelijke of mannelijke Pz1/2-KO-muizen in vergelijking met de controle-tegenhangers (Pz1/2-C). Toen we de dieren echter testten tijdens de actieve donkere fase, vertoonden zowel vrouwelijke als mannelijke Pz1/2-KO-muizen een veranderd voiding-fenotype, gekenmerkt door een significante toename van het aantal en van het totale volume SVS'en (figuur 9). Er waren geen significante verschillen in PVS-aantal, gemiddeld volume per PVS of totaal PVS-volume in vrouwelijke of mannelijke Pz1/2-KO in vergelijking met hun overeenkomstige controles. Deze resultaten geven aan dat urotheliale PIEZO1/2-kanalen geen significante rol spelen bij het legen van de functie tijdens de inactieve lichtfase van de muis, maar belangrijk zijn bij het voorkomen van frequente spotting tijdens hun actieve donkere fase.

De resultaten in figuur 9 illustreren twee van de voordelen van het gebruik van RT-VSA ten opzichte van het eindpunt VSA. Ten eerste, als de analyse alleen tijdens de lichtfase werd uitgevoerd, zouden we ten onrechte hebben geconcludeerd dat urotheliale PIEZO1/2-kanalen geen rol speelden bij de ledigingsfunctie. Ten tweede werden SVS'en in de meeste vsa-onderzoeken met eindpunten behandeld als experimentele ruis en in sommige gevallen uitgesloten van latere analyse23. In de RT-VSA konden we vaststellen dat de SVS'en individuele gebeurtenissen waren, niet secundair aan PVS'en (carryover of end mictie dribbelen) en vrijwillig waren in de zin dat de dieren naar de periferie van de kooi verhuisden, leeggemaakt en vervolgens vertrokken. Deze waarneming leverde ons waardevolle informatie op over het fenotype van Pz1/2-KO-muizen die anders gemist zouden zijn.

Ledigingsgedrag van vrouwelijke muizen onder basale omstandigheden en na behandeling met cyclofosfamide

In dit pilotexperiment testten we de effecten van cyclofosfamide (CYP) op vrijwillig ledigingsgedrag van muizen. Van cyclofosfamide, een geneesmiddel dat wordt gebruikt voor de behandeling van sommige vormen van kanker of immunologische aandoeningen, is bekend dat het cystitis veroorzaakt bij patiënten en proefdieren, wat resulteert in een overactief blaasfenotype dat wordt gekenmerkt door meerdere, kleine ledigingsgebeurtenissen 26,37,38. Om het baseline voiding gedrag te bepalen, plaatsten we een onbehandelde vrouwelijke muis in de RT-VSA tijdens de donkere fase. Dezelfde muis werd 5 dagen later intraperitoneaal geïnjecteerd met een dosis CYP (150 mg/kg) om acute cystitis te veroorzaken. Direct na injectie werd de muis in een RT-VSA-kooi geplaatst voor opname. Het ledigingsgedrag wordt weergegeven in een stappendiagram (figuur 11), waarbij de verticale lijnen het volume urine vertegenwoordigen dat is geleegd en de horizonale lijnen de tijd vertegenwoordigen. Vergeleken met de resultaten verkregen onder basale omstandigheden, is het duidelijk dat de hoeveelheid urine die vrijkomt per leegte kleiner is na CYP-behandeling en dat de mictiegebeurtenissen veel frequenter zijn. Dit kan beter worden gewaardeerd in de inzet van de grafiek, waar de eerste 30 minuten van de geanalyseerde periode (overeenkomend met middernacht tot 00:30 uur [7,0 tot 7,5 uur na injectie]) wordt vergroot.

Figure 1
Figuur 1: De RT-VSA opnamekamer. (A) Het RT-VSA-opnamesysteem omvat een bovenste gedeelte, dat bestaat uit twee naast elkaar liggende, heldere acrylkamers en bijbehorende bovenste camera's. De onderste helft van het apparaat is een enkele eenheidsstandaard die de bovenste muiskamers vasthoudt en de onderste camera's en UV-lampen bevat. De binnenkant van de wanden van de standaard zijn gemaakt van spiegelpanelen die het UV-licht reflecteren om een gelijkmatige verlichting van de bodem van de kooien te bieden. Niet afgebeeld is een computer die een videofeed van de camera's ontvangt en de gegevens opneemt. (B) Model van de muiskamer met componenten en afmetingen. 1) standaard lift-off scharnier; 2) camera montagebeugel; en 3) lite overgang hoekbeugel. Vooraanzicht (C) en bovenaanzicht (D) van de UV-standaard met componenten en afmetingen. UV-lampen worden in het interieur van de voor- en achterprofielen gemonteerd met rechte vlakke platen. Een 32 in profiel bevestigd aan de standaard hoofdframe met twee lite overgang hoekbeugels wordt gebruikt om de camera's te monteren. Rechte vlakke platen worden gebruikt om de camera's aan het 32 in profiel te bevestigen. Een gespiegeld paneel is gemonteerd in het interieur van de standaard (niet afgebeeld). 1) vijf-holes tee vlakke plaat; 2) T-vlakke plaat met vijf gaten; en 3) L-vlakke platen met vijf gaten. Alle gepresenteerde waarden zijn in inches. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: RT-VSA muiskamer. Voorafgaand aan experimentele procedures wordt elke experimentele muizenkamer bereid door deze te bekleden met een stuk filterpapier (genummerd 1). Afhankelijk van de periode van de dag waarin het experiment wordt uitgevoerd, is het gebruikte filterpapier dik (donkere fase) of dun (lichte fase). Een plastic koepel wordt in het midden van de kamer geplaatst (genummerd 2), een plastic schaal met water (in de vorm van niet-bevochtigende watergel) en chow wordt aan de ene kant van de koepel geplaatst (genummerd 3), en een plastic 1,5 ml microcentrifugebuis, een vorm van verrijking, wordt aan de andere kant geplaatst (genummerd 4). De initiële opstelling van elementen in de kooi wordt consistent gehouden in alle experimenten. Merk op dat een stuk filterpapier tussen de twee naburige kooien wordt geplaatst en in de figuur is gemarkeerd met een sterretje. Dit is om de invloed van visuele signalen van de naburige muis te voorkomen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Kalibratiecurve. Representatieve afbeeldingen van dikke (A, linkerpanelen) en dunne (B, linkerpaneel) filterpapieren gespot met bekende hoeveelheden muizenurine. Afbeeldingen zijn screenshots van video-opnamen die zijn verkregen met behulp van de bovenste (A, linkerdeelvensters) of onderste (B, linkerpaneel) camera's. Rode pijlen wijzen naar de 2 μL urinevlekken, en de getallen onder de vlekken zijn de spotvolumewaarden in μL. Merk op dat de kleine urinevlekken (<50 μL) in de bovenste afbeelding van paneel A die kort na urinespotting (5 min) zichtbaar zijn, na 30 min (onderste paneel) niet meer merkbaar zijn. Rechterpanelen: Plot van het lege plekgebied (uitgedrukt als het percentage van het totale filterpapieroppervlak) als functie van het urinevolume. Zoals door anderen opgemerkt, volgen de gegevens van het lege plekgebied als functie van het urinevolume geen lineaire relatie30. We passen de gegevens dus toe aan een polynoom van de tweede orde met behulp van niet-lineaire regressie. De gegevens werden zodanig beperkt dat X = 0 tot Y = 0. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Bepaling van filterpapier en urinevlekkengebieden met behulp van ImageJ. (A) Een screenshot van de kalibratiecurve in figuur 3A geopend in ImageJ. Het gebied in een doos in (A) wordt in meer detail weergegeven in (B). (B) Het pictogram voor polygoonselecties is geselecteerd (rood omcirkeld) om een veelhoek langs de omtrek van het filterpapier te tekenen (gedeeltelijke weergave; gele lijn met rode pijlen die wijzen naar de knooppunten die door het gereedschap selecties worden gegenereerd). (C) De oppervlakte van de veelhoek weerspiegelt de totale oppervlakte van het filterpapier en wordt gemeten door Analyseren > meten (rode cirkel) te selecteren. (D) De waarde van het gebied (in pixels) wordt weergegeven in een resultatenvenster (rode cirkel). (E) Om de oppervlakte van een individuele lege plek te meten, wordt het gereedschap selecties uit de vrije hand gekozen (rode cirkel) en in (F) wordt gebruikt om een lijn rond de rand van de vlek te tekenen (de rode pijl wijst naar de vlek). Met dezelfde opdracht als in (C) wordt de oppervlakte van de lege plek gemeten, waarbij het resultaat als een nieuwe waarde in het resultatenvenster verschijnt, direct onder de laatst uitgevoerde meting (paneel G, rode cirkel). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Beoordeling van de status van filterpapier na het voltooien van RT-VSA-experimenten. Representatieve beelden van de muiskamer met verschillende condities van het filterpapier tijdens of na een RT-VSA-experiment. Filterpapier dat tot het einde van de testperiode intact is gebleven, wordt weergegeven in (A) en geeft de meest voorkomende situatie weer en de voorwaarde waaronder een experiment verder kan worden geanalyseerd (groen vinkje). Voorbeelden van beschadigd filterpapier worden weergegeven onder (B) en (C) en zijn representatief voor experimenten die niet verder geanalyseerd mogen worden (rode X). In (B) werd het filterpapier door de muis (rode pijl) in een van de hoeken versnipperd. De onderbroken gele lijn markeert de rand van de vloer van de kooi. Het gebied met kaders wordt vergroot in de afbeelding aan de rechterkant. In (C) werd de integriteit van het experiment aangetast als gevolg van niet-bevochtigende watergel (rode pijl) die door de muis in de hoek werd verplaatst, waardoor drie grote watervlekken (rode sterretjes) overbleven. Deze bewegingen werden bevestigd door het bekijken van de video. Afbeeldingen zijn screenshots van filmbestanden die zijn verkregen tijdens de donkere fase, met behulp van de bovenste camera en met de kooi bekleed met dik filterpapier. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: Bepaling van het tijdstip van voiding en het verkrijgen van screenshots voor void spot area measurements. (A,B) Screenshot van een muis in een hoek van zijn kamer, met een lege plek die net zichtbaar is geworden. De tijd van dit frame wordt geannoteerd als de tijd van voiding. (C,D) Zodra de leegteplek de maximale diffusie bereikt, wordt een screenshot gemaakt om het volume van de leegte te bepalen. Afbeeldingen zijn screenshots van filmbestanden die zijn verkregen met de bovenste camera, met behulp van dik filterpapier en tijdens de donkere fase. De analyseperiode was middernacht tot 06:00 uur. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 7
Figuur 7: Transformatie van het lege plekgebied in urinevolume en het genereren van een werkbladbestand met experimentele ruwe gegevens. (A) Schermafbeelding van het grafieksoftwarevenster met waarden voor lege plekken uitgedrukt als het percentage van het totale filterpapieroppervlak (gegevens groen omlijnd). Het werkblad (groene pijl) wordt opgeslagen onder de sectie gegevenstabellen. (B) Conversie van het percentage van de totale oppervlakte naar urinevolume (gegevens in rood omlijnd). De laatste waarden worden weergegeven in de resultatensectie (rode pijl) en worden berekend op basis van de kalibratiecurve met behulp van interpolatie-onbekenden uit de standaardcurvefunctie. (C) Schermafbeelding van een werkblad met gecompileerde onbewerkte en berekende gegevens. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 8
Figuur 8: Classificatie van lege plekken in PVS'en en SVS'en en hun analyse. Schermafbeeldingen van werkbladen (gegenereerd zoals weergegeven in figuur 7C) van een muis onder basale omstandigheden (A) en 7 uur na ontvangst van een dosis cyclofosfamide (150 mg/kg) (B). Lege plekken worden geclassificeerd als primaire lege plekken (PVS's) als het volume ≥ 20 μL is, of als kleine lege plekken (SVS's) als het volume < 20 μL is. Merk op dat in de onbehandelde muis (A) alle ledigingsgebeurtenissen PVS'en zijn, terwijl bij het met cyclofosfamide behandelde dier de meeste holtes SVS'en zijn. De omcirkelde tabel in elk deelvenster (rode omtrek) bevat de volgende overzichtsstatistieken: aantal leegtes, gemiddeld ongeldig gemaakt volume en totaal ongeldig volume. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 9
Figuur 9: Leegloopgedrag van Piezo1/2 knock-out en controlemuizen. Het ledigingsgedrag van vrouwelijke (A) en mannelijke (B) Piezo1/2 knock-out (Pz1/2-KO) muizen en controle-tegenhangers ( Pz1/2-C ) werd geregistreerd tijdens een tijdvenster van 6 uur tijdens de donkere of lichte fase van de dag, en de resultaten werden geanalyseerd zoals beschreven in stap 6.1. De gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (S.E.M.). De gegevens werden vergeleken met behulp van een Mann-Whitney-test. Afkortingen: PVSs = primaire void spots; SVS'en = kleine lege plekken; NS = niet significant; * p < 0,05; ** p < 0,01. Dit cijfer is gewijzigd van3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 10
Figuur 10: Werkbladen voor de berekening en grafische weergave van het cumulatieve ongeldig geworden volume als functie van de tijd. (A) Schermafbeelding van het in figuur 7C gegenereerde werkblad met de berekeningen die nodig zijn om een trapfunctieplot te genereren van het cumulatieve volume urine dat als functie van de tijd is geleegd. De tijd moet worden ingevoerd in een decimale notatie (kolom G, rood vierkant). Om de tijd om te zetten in decimale notatie, werden drie kolommen (rode pijlen) toegevoegd aan de rechterkant van de tijd van het ongeldig maken van de kolom om de waarden van uren (kolom D), minuten (kolom E) en seconden (kolom F) en het uiteindelijke resultaat van tijd in een decimale notatie (kolom G) afzonderlijk te annoteren. Als u de tijdsbeëindiging wilt omzetten in een decimale notatie, gebruikt u de volgende functie: (h) + (min/60) + (s/3.600). Rechts van de kolom urinevolume werd één kolom toegevoegd om het cumulatieve urinevolume (blauwe rechthoek) weer te geven, dat wordt berekend als de som van alle urinevolumes (kolom J) die zijn verkregen tot het moment van een nieuwe ledigingsgebeurtenis (inclusief de nieuwe gebeurteniswaarde). (B) Schermafbeelding van gegevens die zijn gekopieerd van het werkblad in paneel A en geplakt in kolom X (tijd in decimale notatie) en kolom Y (cumulatieve urinevolumes) in een grafisch softwareproject. De eerste en laatste tijdpunten van de grafiek worden ingesteld op 0 en 6 rijen (maximale waarde) zoals aangegeven door de rode pijlen. (C) Om een stappendiagram te genereren, wordt de grafiek opgemaakt door het veld met de showsymbolen uit te schakelen, de optie de verbindingslijn/curve weer te geven en de overlevingsstijl te selecteren, zoals weergegeven in de rood omcirkelde velden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 11
Figuur 11: Representatieve resultaten van het ledigingsgedrag van muizen onder basale omstandigheden of na toediening van cyclofosfamide. Het vrijwillige ledigingsgedrag van een muis werd beoordeeld door RT-VSA tijdens de donkere fase vóór (basaal) en 7 uur na toediening van cyclofosfamide (CYP), zoals beschreven in de Representatieve Resultaten. De tijd en het volume van de voidinggebeurtenissen worden weergegeven in een stappendiagram dat is gegenereerd zoals beschreven in stap 6.2. De inzet van de grafiek vertegenwoordigt de oppervlakte van de grafiek gemarkeerd met een groene rechthoek en komt overeen met de eerste 30 minuten van de geanalyseerde periode. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 12
Figuur 12: Identificatie van overlappende urinevlekken door RT-VSA. Schermafbeeldingen van videoframes die zijn vastgelegd met de bovenste camera in de donkere fase van een RT-VSA-experiment (afbeeldingen 1 en 2). Het gekaderde gebied in afbeelding 2 is vergroot in afbeelding 3. De muis verdween in de loop van de volgende uren nog twee keer in dezelfde rechterbovenhoek (afbeeldingen 4-6). Ondanks de overlap van lege plekken, werden de individuele ledigingsgebeurtenissen gemakkelijk gedetecteerd met behulp van RT-VSA. Om te visualiseren hoe deze gebeurtenissen eruit zouden zien als een eindpunttest, hebben we de hoek van het filterpapier blootgesteld aan verschillende lichtomstandigheden. Onder zichtbaar omgevingslicht kon slechts één enkele, grote lege plek worden geïdentificeerd (afbeelding 7). Evenzo, als ditzelfde gebied onder UV-licht werd onderzocht, was slechts één donkere vlek te onderscheiden (afbeelding 8). Meerdere holtes in dezelfde regio worden dus gemakkelijk gedetecteerd door RT-VSA, maar een dergelijke discriminatie is niet mogelijk als de analyse wordt uitgevoerd als een eindpunttest. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De integratie van videobewaking is een kosteneffectieve wijziging die verschillende voordelen biedt ten opzichte van de klassieke VSA. In de klassieke VSA, die meestal wordt gebruikt als eindpunttest, is het moeilijk om overlappende leegteplekken te onderscheiden. Dit is geen triviale zorg, omdat muizen de neiging hebben om meerdere keren in hetzelfde gebied te plassen wanneer de test enkele uren wordt verlengd, meestal in de hoeken van hun kooi. Het eerste voordeel van RT-VSA is dus dat de onderzoeker gemakkelijk individuele vlekken kan identificeren die gedeeltelijk of volledig op elkaar zijn afgezet. Dit wordt goed geïllustreerd in het experiment in figuur 12. In dit geval bevestigt video-opname dat de muis drie keer in dezelfde hoek is leeggemaakt, waardoor overlappende lege plekken worden afgezet. Als het filterpapier pas aan het einde van het experiment werd geanalyseerd, op de manier die typisch is voor een VSA, kon slechts één plek worden onderscheiden. Dus, hoewel de klassieke, eindpunt VSA nuttig kan zijn bij het identificeren van grote verschillen in voiding-gedrag, kan het falen om onderscheid te maken tussen meer subtiele fenotypen. Met de huidige vooruitgang in de genetica en het genereren van transgene dieren, is de ontwikkeling van methoden die het ledigingsgedrag nauwkeurig kunnen beoordelen essentieel.

Ten tweede biedt RT-VSA de onderzoeker tijdelijke informatie over de voiding-gebeurtenissen. Zo kan men ware mictiefrequenties bepalen en relaties leggen tussen voiding-gebeurtenissen. Bijvoorbeeld, in een situatie waarin een cluster van SVS'en wordt waargenomen naast een enkele grote PVS, in de klassieke VSA, kan men niet gemakkelijk onderscheiden als de muis meerdere keren tijdens het experiment leeg is gegaan (met drie kleine en één grote leegte) of als het dier één groot urinevolume heeft afgezet, en de drie kleinere vlekken zijn het resultaat van post-mictie dribbelen of overdracht van vacht. RT-VSA kan worden gebruikt om deze vragen te beantwoorden.

Ten derde stelt RT-VSA het mogelijk om het gedrag van een muis voor, tijdens en na de voiding-gebeurtenis te analyseren. De onderzoeker kan ook het algemene activiteitenprofiel van de muis volgen door RT-VSA-opnames te analyseren met vrij beschikbare software zoals Mouse Behavior Tracker39. Daarnaast kan men onderscheiden of een dier stopt om te plassen (typisch gedrag van vrouwtjes), of het dier in beweging is tijdens het plassen (wat bij mannetjes kan resulteren in het volgen van lege plekken), of dat het leegloopt tijdens zijn slaap/ rustfase. We hebben dit laatste gedrag waargenomen, hoewel het normaal gesproken zeldzaam is. Dus, indien goed gevalideerd en geïnterpreteerd, kan het observeren van ledigingsgedrag de onderzoeker waardevolle inzichten bieden in ledigingsstoornissen, waaronder bijvoorbeeld nocturie of incontinentie. RT-VSA (en VSA) stelt onderzoekers in staat om de fractie van leegtegebeurtenissen te bepalen die zich voordoen in het centrale gebied van een kooi, in tegenstelling tot de hoeken. Normaal gesproken is het ledigen van het centrum zeldzaam en een verhoogd aantal van dergelijke gebeurtenissen is een teken van blaasdisfunctie 8,22. De enige uitzondering zijn dominante alfamannetjes, die vaak en over het geheel van hun behuizingen plassen20. Om een analyse van centrale lediging met RT-VSA uit te voeren, moet men overwegen de voedselschaal naar een zijwand te verplaatsen en de koepel te verwijderen (of aan een bepaald gebied van de kooi te bevestigen), zodat ruimtelijke patronen van urineren gemakkelijker kunnen worden vastgesteld.

Ten vierde stelt de RT-VSA het mogelijk om de spanningen die gepaard gaan met kooiuitwisseling effectiever te beheren in vergelijking met klassieke VSA. Muizen zijn van nature schichtig en het hanteren of overbrengen ervan naar een nieuwe omgeving veroorzaakt stress, waarvan bekend is dat het van invloed is op het ledigingsgedrag35. Door zijn aard is het moeilijk om een periode van acclimatisatie op te nemen in de standaard VSA. In RT-VSA daarentegen kan een periode van acclimatisatie gemakkelijk in elk experiment worden opgenomen en kunnen eventuele ledigingsgebeurtenissen tijdens deze periode tijdens de analyse buiten beschouwing worden gelaten. Een extra stressverlichtend aspect van RT-VSA geïmplementeerd in dit protocol is de duplicatie van omstandigheden waaronder muizen normaal worden gehuisvest (d.w.z. toegang tot voedsel en water ad libitum, een koepel en een speeltje). Dit is, voor zover we weten, een van de rijkste omgevingen die voor dit soort experimenten zijn beschreven. In een typisch eindpunt VSA worden muizen beroofd van water (en soms ook van voedsel)8,22, dat we ad libitum verstrekken.

Ten vijfde, naast het positieve effect dat deze verrijkte omgeving kan hebben op de stressniveaus van muizen, stelt het de onderzoeker in staat om RT-VSA gedurende langere tijd uit te voeren, meestal in tijdvensters van 6 uur; Meer recent hebben we echter experimenten uitgevoerd die 24 uur duren (gegevens niet getoond). Dit is ideaal bij het beoordelen van de effecten van circadiane ritmiek of bij het bestuderen van muizen die een onderactief blaasfenotype kunnen vertonen en dus niet vaak plassen.

Voor 24-uurs videobewaking raden we aan dun filterpapier te gebruiken en de experimenten te analyseren met behulp van de onderste camera's. Deze combinatie van papiersoort en camera is de beste optie die zorgt voor gevoeligheid van detectie in de donkere en lichte fasen. Zoals eerder vermeld, kunnen onderste camera's niet gemakkelijk lege plekken op het dikke filterpapier detecteren en bovenste camera's detecteren geen betrouwbare lege plekken tijdens de lichtfase. Als we deze uitgebreide analyses uitvoeren, raden we aan om de dieren om 17.00 uur in de opnamekooien te plaatsen, op dag 1 vanaf 18.00 uur te analyseren en het experiment de volgende dag om 18.00 uur af te ronden.

Hoewel RT-VSA veel positieve aspecten heeft, zijn er enkele kanttekeningen die het vermelden waard zijn. Hoewel we alles in het werk stellen om stress te beperken bij het uitvoeren van deze analyses, kunnen we de habitat van de muis niet volledig repliceren, omdat de dieren normaal gesproken in groepen worden gehuisvest. Ze drinken ook water uit een fles in plaats van water uit niet-bevochtigende watergel. Onze observatie dat muizen minder holtes hebben tijdens hun inactieve lichtfase versus hun actieve donkere fase, geeft ons echter aan dat de muizen hun normale patronen van circadiaans ledigingsgedrag behouden40. Als gevolg van hun gemakkelijk gestreste aard, ontdekten we dat muizen verstoord ledigingsgedrag vertonen op de dagen van kooireiniging. Men moet de analyse dus beperken tot perioden waarin de dieren minder worden beïnvloed door routinematige veehouderij. Een belangrijke factor om te overwegen is of het UV-licht invloed heeft op de ledigingsfunctie. Omdat onze bevindingen een duidelijk circadiaans verschil in VSA-parameters laten zien tussen lichte en donkere fasen, die consistent zijn met andere technieken die een vergelijkbaar fenomeen beschrijven, maar geen UV-licht40 gebruiken, concluderen we dat UV-lichtverlichting geen invloed heeft op de ledigingsfunctie. Merk op dat het filterpapier voorkomt dat licht van de onderste kamer naar de bovenste kamer gaat.

Een bijkomend voorbehoud is dat hoe langer men de muizen in de kamer houdt, hoe groter de kans dat ze het filterpapier kauwen of beschadigen (ongeacht de dikte van het papier). Hoewel geen van de dieren het papier verstoorde tijdens de lichte fase, beschadigde bijna 30% van de muizen het papier tijdens de donkere actieve fase. In de analyse van de 24-uursexperimenten zagen we dat een vergelijkbaar deel (een derde) van de experimenten niet kon worden geanalyseerd vanwege papierschade, wat betekent dat niet alleen de hoeveelheid tijd, maar ook de fase van de dag het versnipperingsgedrag van het dier beïnvloedt. Helaas hebben we in onze ervaring gemerkt dat een dier dat het papier van de kooi verstoort, dit ook bij hertesten zal blijven doen. Zoals hierboven vermeld, plassen muizen soms op de kale acrylvloer, en dus maakt verlies van het papier de analyse onvolledig en van beperkte waarde.

Verder kan de analyse van mannelijk ledigingsgedrag moeilijker zijn omdat ze de neiging hebben om vaker te plassen, ze kunnen dribbelen na het plassen en er is een populatie van mannetjes (20%) met een agressiever alfa-mannelijk fenotype dat wordt gekenmerkt door grote aantallen kleine holtes die over de kooi zijn verdeeld, zoals besproken in een eerdere publicatie3. Omdat dit alfa-mannelijke gedrag een verstorende factor kan vormen voor het vaststellen van voiding fenotypes, sluiten we dieren met ≥50 (lichtfase-experimenten) of ≥100 (donkere fase-experimenten) uit van analyse.

Er zijn situaties waarin de discriminatie van leegtes op basis van hun volume (d.w.z. PVS versus SVS) niet noodzakelijkerwijs gerechtvaardigd is. In onze ervaring hebben muizen met bacteriële of chemische cystitis bijvoorbeeld de neiging om kleinere volumes leeg te maken dan controles 4,34. Er zijn echter grote verschillen in het lege volume tussen individuele muizen; in sommige hebben de meeste holtes een volume ≤ 20 μL, terwijl in andere de meerderheid > 20 μL is. Bijgevolg biedt de discriminatie van het ongeldig gemaakte volume geen enkel voordeel voor de karakterisering van deze fenotypen.

Kortom, RT-VSA is een eenvoudig te implementeren hulpmiddel voor het analyseren van muisledigingsgedrag bij vrij mobiele muizen. In tegenstelling tot hulpmiddelen zoals cystometrie, vereist het geen chirurgische implantatie van een katheter of niet-fysiologische snelheden van blaasvulling. Het maakt het mogelijk om het ledigingsgedrag bij beide geslachten van muizen te bepalen, gedurende langere tijd en tijdens de lichte en donkere fasen van de dagcyclus. Het is ook relatief betaalbaar, vooral in vergelijking met meer gespecialiseerde en dure apparaten zoals metabole kooien. Hoewel er kanttekeningen zijn bij deze tool, zijn ze over het algemeen gemakkelijk te beheren. Ten slotte kan deze techniek gemakkelijk worden aangepast aan andere diersoorten, waaronder andere knaagdieren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door een NIH-subsidie R01DK119183 (aan G.A. en M.D.C.), een proefprojectprijs via P30DK079307 (aan M.G.D.), een American Urology Association Career Development award en een Winters Foundation-beurs (aan N.M.), en door de Cell Physiology and Model Organisms Kidney Imaging Cores van het Pittsburgh Center for Kidney Research (P30DK079307).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots –  cut to 10 inches 80/20 1010 Amount: 20
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots –  cut to 12 inches 80/20 1010 Amount: 6
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots –  cut to 40 inches 80/20 1010 Amount: 4
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots – cut to 14.75 inches 80/20 1010 Amount: 12
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots – cut to 32 inches 80/20 1010 Amount: 5
1/4-20 Double Slide-in Economy T-Nut 80/20 3280 Amount: 16
1/4-20 Triple Slide-in Economy T-Nut 80/20 3287 Amount: 18
10 & 25 Series 2 Hole - 18mm Slotted Inside Corner Bracket with Dual Support 80/20 14061 Amount: 6
10 Series 3 Hole - Straight Flat Plate 80/20 4118 Amount: 8
10 Series 5 Hole - "L" Flat Plate 80/20 4081 Amount: 8
10 Series 5 Hole - "T" Flat Plate 80/20 4080 Amount: 8
10 Series 5 Hole - Tee Flat Plate 80/20 4140 Amount: 2
10 Series Standard Lift-Off Hinge - Right Hand Assembly 80/20 2064 Amount: 2
10 to 15 Series 2 Hole - Lite Transition Inside Corner Bracket 80/20 4509 Amount: 6
24”-long UV tube lights ADJ Products LLC T8-F20BLB24 Amount: 2
20W bulb – 24” Wavelength: 365nm
Acrylic Mirror Sheet Profesional Plastics Amount: 1
82.5 cm x 26.5 cm
Acrylic Mirror Sheet Profesional Plastics Amount: 2
26.5 cm X 30.5 cm
Acrylic Mirror Sheet Profesional Plastics Amount: 2
82.5 cm x 30.5 cm
AR polycarbonate (UV resistance) 80/20 65-2641 Amount: 2
4.5mm Thick, Clear, 38.5 cm x 26.5 cm
AR polycarbonate (UV resistance) 80/20 65-2641 Amount: 4
4.5mm Thick, Clear, 38.5 cm x 21.5 cm
AR polycarbonate (UV resistance) 80/20 65-2641 Amount: 4
4.5mm Thick, Clear, 26.5 cm x 21.5 cm
AR polycarbonate (UV resistance) 80/20 65-2641 Amount: 4
4.5mm Thick, Clear 37.5 cm x 23.9 cm
AR polycarbonate (UV resistance) 80/20 65-2641 Amount: 4
4.5mm Thick, Clear , 24.4 cm x 23.9 cm
Chromatography paper (thin paper)  Thermo Fisher Scientific 57144
Cosmos blotting paper (thick paper) Blick Art Materials 10422-1005
Excel Microsoft Corporation
GraphPad Prism GraphPad Software Version 9.4.0 graphing and statistics software
ImageJ FIJI NIH
Parafilm Merck transparent film
Quick Time Player 10.5 software  Apple multimedia player
Security spy Ben software video surveillance software system
Standard End Fastener, 1/4-20 80/20 3381 Amount: 80
UV transmitting acrylic Spartech Polycast Solacryl SUVT Amount: 2
38.5 cm x 26.5 cm 
Water gel: HydroGel ClearH2O   70-01-5022 (https://www.clearh2o.com/product/hydrogel/)
Webcam Logitech C930e Amount: 4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. The urothelium: life in a liquid environment. Physiological Reviews. 100 (4), 1621 (2020).
  2. de Groat, W. C., Griffiths, D., Yoshimura, N. Neural control of the lower urinary tract. Comprehensive Physiology. 5 (1), 327 (2015).
  3. Dalghi, M. G., et al. Functional roles for PIEZO1 and PIEZO2 in urothelial mechanotransduction and lower urinary tract interoception. JCI Insight. 6 (19), (2021).
  4. Montalbetti, N., et al. Bladder infection with uropathogenic Escherichia coli increases the excitability of afferent neurons. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 322 (1), 1 (2022).
  5. Montalbetti, N., et al. Increased urothelial paracellular transport promotes cystitis. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 309 (12), 1070 (2015).
  6. Montalbetti, N., et al. Urothelial tight junction barrier dysfunction sensitizes bladder afferents. eNeuro. 4 (3), (2017).
  7. Montalbetti, N., Stocker, S. D., Apodaca, G., Bastacky, S. I., Carattino, M. D. Urinary K+ promotes irritative voiding symptoms and pain in the face of urothelial barrier dysfunction. Scientific Reports. 9 (1), 5509 (2019).
  8. Kim, A. K., Hamadani, C., Zeidel, M. L., Hill, W. G. Urological complications of obesity and diabetes in males and females of three mouse models: temporal manifestations. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 318 (1), 160 (2020).
  9. Bartolone, S. N., et al. Micturition defects and altered bladder function in the klotho mutant mouse model of aging. American Journal of Clinical and Experimental Urology. 8 (3), (2020).
  10. de Rijk, M. M., et al. Aging-associated changes in oxidative stress negatively impacts the urinary bladder urothelium. International Neurourology Journal. 26 (2), 111 (2022).
  11. Coyne, K. S., et al. The prevalence of lower urinary tract symptoms (LUTS) and overactive bladder (OAB) by racial/ethnic group and age: results from OAB-POLL. Neurourology and Urodynamics. 32 (3), 230 (2013).
  12. Wittig, L., Carlson, K. V., Andrews, J. M., Crump, R. T., Baverstock, R. J. Diabetic bladder dysfunction: a review. Urology. 123, (2019).
  13. Irwin, D. E., et al. Population-based survey of urinary incontinence, overactive bladder, and other lower urinary tract symptoms in five countries: results of the EPIC study. European Urology. 50 (6), 1314 (2006).
  14. Bogart, L. M., Berry, S. H., Clemens, J. Q. Symptoms of interstitial cystitis, painful bladder syndrome and similar diseases in women: a systematic review. The Journal of Urology. 177 (2), 450 (2007).
  15. Foxman, B. Urinary tract infection syndromes: occurrence, recurrence, bacteriology, risk factors, and disease burden. Infectious Disease Clinics of North America. 28 (1), 1 (2014).
  16. Fall, M., Logadottir, Y., Peeker, R. Interstitial cystitis is bladder pain syndrome with Hunner's lesion. International Journal of Urology. 21, 79 (2014).
  17. Birder, L. A. Urinary bladder, cystitis and nerve/urothelial interactions. Autonomic Neuroscience: Basic & Clinical. 182, 89 (2014).
  18. Rosen, J. M., Klumpp, D. J. Mechanisms of pain from urinary tract infection. International Journal of Urology. 21 Suppl. 1, 26 (2014).
  19. Birder, L., et al. Neural control of the lower urinary tract: peripheral and spinal mechanisms. Neurourology and Urodynamics. 29 (1), 128 (2010).
  20. Desjardins, C., Maruniak, J. A., Bronson, F. H. Social rank in house mice: differentiation revealed by ultraviolet visualization of urinary marking patterns. Science. 182 (4115), 939 (1973).
  21. Sugino, Y., et al. Voided stain on paper method for analysis of mouse urination. Neurourology and Urodynamics. 27 (6), 548 (2008).
  22. Hill, W. G., Zeidel, M. L., Bjorling, D. E., Vezina, C. M. Void spot assay: recommendations on the use of a simple micturition assay for mice. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 315 (5), (2018).
  23. Rajandram, R., et al. Intact urothelial barrier function in a mouse model of ketamine-induced voiding dysfunction. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 310 (9), (2016).
  24. Ruetten, H., et al. A uropathogenic E. coli UTI89 model of prostatic inflammation and collagen accumulation for use in studying aberrant collagen production in the prostate. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 320 (1), 31 (2021).
  25. Wegner, K. A., et al. Void spot assay procedural optimization and software for rapid and objective quantification of rodent voiding function, including overlapping urine spots. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 315 (4), (2018).
  26. Wood, R., Eichel, L., Messing, E. M., Schwarz, E. Automated noninvasive measurement of cyclophosphamide-induced changes in murine voiding frequency and volume. The Journal of Urology. 165 (2), 653 (2001).
  27. Dmochowski, R. R. Bladder outlet obstruction: etiology and evaluation. Reviews in Urology. 7 (Suppl 6), S3–S13. , (2005).
  28. Aizawa, N., Homma, Y., Igawa, Y. Influence of high fat diet feeding for 20 weeks on lower urinary tract function in mice. Lower Urinary Tract Symptoms. 5 (2), 101 (2013).
  29. Wang, Z., et al. Void sorcerer: an open source, open access framework for mouse uroflowmetry. American Journal of Clinical and Experimental Urology. 7 (3), 170 (2019).
  30. Verstegen, A. M., Tish, M. M., Szczepanik, L. P., Zeidel, M. L., Geerling, J. C. Micturition video thermography in awake, behaving mice. Journal of Neuroscience Methods. 331, 108449 (2020).
  31. Keller, J. A., et al. Voluntary urination control by brainstem neurons that relax the urethral sphincter. Nature Neuroscience. 21 (9), (2018).
  32. Hou, X. H., et al. Central control circuit for context-dependent micturition. Cell. 167 (1), 73 (2016).
  33. Negoro, H., et al. Involvement of urinary bladder Connexin43 and the circadian clock in coordination of diurnal micturition rhythm. Nature Communication. 3, (2012).
  34. Montalbetti, N., Carattino, M. D. Acid-sensing ion channels modulate bladder nociception. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 321 (5), (2021).
  35. Chen, H., Zhang, L., Hill, W. G., Yu, W. Evaluating the voiding spot assay in mice: a simple method with complex environmental interactions. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 313 (6), (2017).
  36. Dalghi, M. G., et al. Expression and distribution of PIEZO1 in the mouse urinary tract. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 317 (2), 303 (2019).
  37. Birder, L., Andersson, K. E. Animal modelling of interstitial cystitis/bladder pain syndrome. International Neurourology Journal. 22, (2018).
  38. Okinami, T., et al. Altered detrusor gap junction communications induce storage symptoms in bladder inflammation: a mouse cyclophosphamide-induced model of cystitis. PLoS One. 9 (8), (2014).
  39. Tungtur, S. K., Nishimune, N., Radel, J., Nishimune, H. Mouse Behavior Tracker: An economical method for tracking behavior in home cages. Biotechniques. 63 (5), (2017).
  40. Negoro, H., Kanematsu, A., Yoshimura, K., Ogawa, O. Chronobiology of micturition: putative role of the circadian clock. The Journal of Urology. 190 (3), (2013).

Tags

Retractie Void spot assay Urinaire blaas voiding functie mictie cystometrie
Real-Time Void Spot Assay
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dalghi, M. G., Montalbetti, N.,… More

Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Wheeler, T. B., Apodaca, G., Carattino, M. D. Real-Time Void Spot Assay. J. Vis. Exp. (192), e64621, doi:10.3791/64621 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter