Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

בדיקת ספוט ריק בזמן אמת

Published: February 10, 2023 doi: 10.3791/64621
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1,2
1Renal-Electrolyte Division, Department of Medicine, University of Pittsburgh, 2Department of Cell Biology, University of Pittsburgh

Summary

מאמר זה מתאר שיטה חדשה לחקר התנהגות התרוקנות עכבר על-ידי שילוב ניטור וידאו בבדיקת נקודות הריק הקונבנציונלית. גישה זו מספקת מידע זמני, מרחבי ונפחי על אירועי ההתרוקנות ופרטים על התנהגות עכברים במהלך שלבי האור והחושך של היום.

Abstract

התנהגות התרוקנות נורמלית היא תוצאה של תפקוד מתואם של שלפוחית השתן, השופכה וסוגרי השופכה תחת שליטה נכונה של מערכת העצבים. כדי לחקור התנהגות של התרוקנות מרצון במודלים של עכברים, חוקרים פיתחו את בדיקת נקודות הריק (VSA), שיטה המודדת את מספר ושטח כתמי השתן שהושקעו על נייר סינון המצפה את רצפת הכלוב של בעל חיים. למרות שמבחינה טכנית היא פשוטה וזולה, לבדיקה זו יש מגבלות כאשר משתמשים בה כבדיקת נקודת קצה, כולל חוסר רזולוציה זמנית של אירועי התרוקנות וקשיים בכימות כתמי שתן חופפים. כדי להתגבר על מגבלות אלה, פיתחנו VSA מנוטר וידאו, שאנו מכנים VSA בזמן אמת (RT-VSA), ואשר מאפשר לנו לקבוע את תדירות ההתרוקנות, להעריך את הנפח המבוטל ואת דפוסי ההתרוקנות, ולבצע מדידות על פני חלונות זמן של 6 שעות הן בשלב החשוך והן בשלב האור של היום. השיטה המתוארת בדו"ח זה יכולה להיות מיושמת במגוון רחב של מחקרים מבוססי עכברים הבוחנים את ההיבטים הפיזיולוגיים והנוירו-התנהגותיים של מיקוריטציה מרצון במצבי בריאות ומחלות.

Introduction

אחסון השתן והמיקטוריציה מתואמים על ידי מעגל מרכזי (מערכת העצבים המרכזית) המקבל מידע על מצב מילוי שלפוחית השתן דרך עצבי האגן וההיפוקיבה. האורותל, האפיתל המרפד את דרכי השתן מאגן הכליה ועד לשופכה הפרוקסימלית, יוצר מחסום הדוק בפני תוצרי הפסולת המטבולית והפתוגנים הנמצאים בשתן. זהו מרכיב אינטגרלי של רשת חושים, אשר חשה ומתקשרת את מצב המילוי של שלפוחית השתן לרקמות הבסיסיותולעצבים 1,2. הפרעה במחסום דרכי השתן, או שינויים במסלולי המכנוטרנסדוקציה של דרכי השתן, עלולה להוביל לתפקוד לקוי של התרוקנות יחד עם תסמינים בדרכי השתן התחתונות כגון תדירות, דחיפות, נוקטוריה ובריחת שתן 3,4,5,6,7. כמו כן, הזדקנות, סוכרת, דלקות בדרכי השתן התחתונות, דלקת שלפוחית השתן אינטרסטיציאלית ותהליכי מחלה אחרים המשפיעים על שלפוחית השתן, או על המעגלים החשמליים הקשורים השולטים בתפקודה, ידועים כגורמים לתפקוד לקוי של שלפוחית השתן 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17, 18,19. הבנה טובה יותר של התנהגות התרוקנות נורמלית וחריגה תלויה בפיתוח שיטות שיכולות להבחין באופן אמין בין דפוסי השתנה שונים.

באופן מסורתי, התנהגות ההתרוקנות מרצון של עכברים נחקרה באמצעות בדיקת נקודת הריק (VSA), שפותחה על ידי Desjardins ועמיתיו 20, ואומצה באופן נרחב בשל פשטותה, עלותה הנמוכה והגישה הלא פולשנית 8,21,22,23,24. בדיקה זו מבוצעת בדרך כלל כבדיקת נקודות קצה, שבה עכבר מבלה פרק זמן מוגדר בכלוב מרופד בנייר סינון, אשר מנותח לאחר מכן על ידי ספירת המספר והערכת גודל כתמי השתן כאשר נייר הסינון ממוקם תחת אור אולטרה סגול (UV) (כתמי השתן פלואורס בתנאים אלה)20. למרות יתרונות רבים אלה, VSA המסורתי מציג כמה מגבלות עיקריות. מכיוון שעכברים משתינים לעתים קרובות באותם אזורים, החוקרים צריכים להגביל את משך הבדיקה לפרק זמן קצר יחסית (≤4 שעות)25. אפילו כאשר ה-VSA מבוצע על פני פרקי זמן קצרים יותר, כמעט בלתי אפשרי לפתור כתמי ריק קטנים (SVS) הנופלים על כתמי ריק גדולים או, להבדיל בין SVS לבין נשיאת שתן המודבקת לזנבות או לכפות. כמו כן, קשה מאוד להבחין אם SVS הם תוצאה של אירועי התרוקנות תכופים אך אינדיבידואליים (פנוטיפ שנצפה לעתים קרובות בתגובה לדלקת שלפוחית השתן 4,26), או עקב כדרור לאחר מיקטוריציה (פנוטיפ הקשור לחסימת מוצא שלפוחית השתן 27). יתר על כן, הרצון להשלים את הבדיקה במהלך שעות העבודה, יחד עם קשיים בגישה למתקני דיור כאשר האורות כבויים, לעתים קרובות מגביל בדיקות אלה לתקופת האור של מחזור הצירקדי 24 שעות. לפיכך, אילוצי זמן אלה מונעים הערכה של התנהגות התרוקנות עכברים במהלך שלב הלילה הפעיל שלהם, ומפחיתים את היכולת לנתח גנים או טיפולים ספציפיים הנשלטים על ידי מקצבים צירקדיים.

כדי להתגבר על חלק מהמגבלות הללו, חוקרים פיתחו שיטות חלופיות להערכת התנהגות ההתרוקנות בזמן אמת 26,28,29,30,31,32. חלק מגישות אלה כוללות שימוש בציוד יקר כגון כלובים מטבוליים26,28,29, או שימוש במצלמות תרמיות30; עם זאת, גם לאלה יש מגבלות. לדוגמה, בכלובים מטבוליים, השתן נוטה להיצמד לחוטי רצפת הרשת ולקירות המשפך, ובכך להפחית את כמות השתן הנאסף ונמדד. לכן, זה יכול להיות קשה לאסוף במדויק נתונים על חללים קטנים. יתר על כן, כלובים מטבוליים אינם מספקים מידע על ההתפלגות המרחבית של אירועי ההתרוקנות (כלומר, השתנה בפינות לעומת מרכז החדר). בהתחשב בכך שקרינת אינפרא אדום באורך גל ארוך המשמשת את המצלמות התרמוגרפיות אינה חודרת למוצקים, פעילות ההתרוקנות המוערכת על ידי תרמוגרפיית וידאו חייבת להתבצע במערכת פתוחה, מה שיכול להיות מאתגר עם עכברים פעילים, מכיוון שהם יכולים לקפוץ כמה סנטימטרים באוויר. מערכת נוספת היא שיטת הכתם המבוטל האוטומטי על נייר (aVSOP) בגישה33, המורכבת מנייר סינון מגולגל המתפתל במהירות קבועה מתחת לרצפת רשת התיל של כלוב עכבר. גישה זו מונעת נזק לנייר וחפיפה של כתמי שתן המתרחשים ב- VSA הקלאסי, ויישומה מאפשר לחוקר לבצע ניסויים במשך מספר ימים. עם זאת, היא אינה מספקת לחוקר תזמון מדויק של אירועי ההתרוקנות, ואין יכולת לבחון התנהגות וכיצד היא קשורה לאיתור. כדי להשיג מידע זה, החוקרים שילבו ניטור וידאו לבדיקות ריקות, גישה המאפשרת הערכה בו זמנית של פעילות עכבר ואירועי השתנה31,32. גישה אחת כוללת הצבת דיודה פולטת אור כחול (LED) ומצלמת וידאו עם מסנן חלבון פלואורסצנטי ירוק המוצב מתחת לכלוב הניסוי כדי להמחיש את אירועי ההתרוקנות, ונורית אינפרא אדום ומצלמת וידאו מעל הכלוב כדי ללכוד את מיקום העכבר32. מערך זה שימש לניטור התנהגות התרוקנות בעת ביצוע פוטומטריית סיבים; עם זאת, הסביבה המוארת של מערכת זו דרשה מהחוקרים לטפל בעכברים שלהם עם חומר משתן כדי לעורר התרוקנות. בתכנון ניסיוני אחר, מצלמות רחבות זווית הוצבו מעל ומתחת לכלוב הניסוי כדי להמחיש פעילות מוטורית של עכבר ואירועי השתנה, בהתאמה. במקרה זה, כתמי שתן שהושקעו על נייר סינון המצפה את רצפת הכלוב נחשפו על ידי הארת נייר הסינון באורות UV שהונחו מתחת לכלוב31. מערך זה שימש בבדיקות קצרות, שנמשכו 4 דקות, במהלך שלב האור של היום כדי לחקור את נוירוני גזע המוח המעורבים בהתנהגות התרוקנות מרצון31. לא דווח על התאמת מערכת זו לשימוש בה בשלב החשוך או לפרקי זמן של >4 דקות.

במאמר זה מתוארת שיטה המשפרת את ה- VSA המסורתי בכך שהיא מאפשרת ניטור וידאו ארוך טווח של התנהגות ריקון עכבר. גישה חסכונית זו מספקת מידע זמני, מרחבי ונפחי על אירועי התרוקנות לפרקי זמן ממושכים במהלך שלבי האור והחושך של היום, יחד עם פרטים הקשורים להתנהגות עכבר 3,4,34. מידע מפורט לבניית תאי הריקות, יישום VSA בזמן אמת (RT-VSA) וניתוח הנתונים מסופק. RT-VSA הוא בעל ערך עבור חוקרים המבקשים להבין את המנגנונים הפיזיולוגיים השולטים בתפקוד מערכת השתן, לפתח גישות פרמקולוגיות לבקרת מיקטוריציה, ולהגדיר את הבסיס המולקולרי של תהליכי מחלה המשפיעים על דרכי השתן התחתונות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Urothelial Piezo1/2 עכברי נוקאאוט כפול (Pz1/2-KO , גנוטיפ: Piezo1 fl/fl; Piezo2 fl/fl; Upk2CRE+/-) ובקרות (Pz1/2-C, גנוטיפ: Piezo1 fl/fl; Piezo2 fl/fl; Upk2CRE-/-) נוצרו בתוך החברה מזני הורים שהתקבלו ממעבדות Jax (זן Piezo1 fl/fl # 029213; זן Piezo2 fl/fl # 027720; Upk2CRE+/- זן # 029281). בניסויים נעשה שימוש הן בעכברים נקבות (בנות 1.5-3 חודשים והן במשקל 17-20 גרם) וזכרים (בני 2-4 חודשים ו-23-29 גרם במשקל). עבור ניסויים cyclophosphamide-נגרמת דלקת שלפוחית השתן, נקבות בר C57Bl / 6J (3 חודשים ו ~ 20 גרם במשקל) שימשו (מעבדות ג'קסון, זן # 000664). בעלי חיים שוכנו והניסויים בוצעו במתקן לטיפול בבעלי חיים של אוניברסיטת פיטסבורג תחת אישור הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת פיטסבורג. כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות ולתקנות הרלוונטיות של מדיניות שירותי בריאות הציבור בנושא טיפול אנושי ושימוש בחיות מעבדה וחוק צער בעלי חיים.

1. הרכבת כלובים לבדיקת נקודת ריק בזמן אמת (RT-VSA)

  1. מתקן RT-VSA מורכב ממעמד UV המכיל שתי נורות UV ושתי מצלמות רחבות זווית (מצלמות תחתונות), המשמשות לתיעוד פעילות התרוקנות בשלב האור של היום. סדרו שני תאי עכבר כך שיונחו על המעמד. חברו מצלמות רחבות זווית (מצלמות עליונות) למכסה של כל תא עכבר, המשמשות לתיעוד פעילות התרוקנות במהלך השלב החשוך של היום (איור 1A).
  2. בנה את מסגרת מעמד ה- UV ותאי העכבר מ- 1 ב- x 1 בפרופילי אלומיניום עם חריצי T. ראו טבלה 1 לקבלת רשימה של הרכיבים המשמשים לבניית שני תאי עכבר ומעמד UV ואיור 1B–D עבור התצוגות השונות של הרכיבים והמידות שהורכבו.
  3. בנה כל תא עכבר עם שמונה פרופילי אלומיניום עם חריצי T שנחתכו ל-10 אינץ' וארבעה חתוכים ל-14.75 אינץ'. התחילו בהרכבת החלק התחתון של תא העכבר והשתמשו במחברי קצה סטנדרטיים (טבלה 1) כדי להרכיב את הפרופילים עם חריצי T לפי איור 1. הרכיבו את האקריליק משדר UV בגודל 38.5 ס"מ x 26.5 ס"מ בתעלה הפנימית של הפרופילים כדי לבנות את רצפת תאי העכבר.
    הערה: לקבלת מידע מפורט על אופן ההרכבה של פרופילי T-slotted עם מחברי קצה סטנדרטיים, בקר בדף האינטרנט של החברה.
  4. בנה את קירות תא העכבר עם שאר הפרופילים. הרכיבו את לוחות הפוליקרבונט (AR) בגודל 38.5 ס"מ x 21.5 ס"מ ו-26.5 ס"מ x 21.5 ס"מ העמידים בפני שחיקה (AR) בפרופילים כדי להרכיב את הדפנות החיצוניות של תא העכבר. השתמש בלוחות פוליקרבונט AR בגודל 37.5 ס"מ x 23.9 ס"מ ו- 24.4 ס"מ x 23.9 ס"מ AR כדי לבנות את פנים תא העכבר.
  5. אבטח את לוחות הפוליקרבונט AR עם מהדק קצה סטנדרטי 1/4-20 סוליה. ראה הוראות כיצד לטעון את החלוניות בפרופילים בדף האינטרנט בהערה של שלב 1.3. השתמשו בציפוי סיליקון מסחרי כדי לאטום את הצמתים בין הלוחות הפנימיים.
  6. השתמשו בשני פרופילים של 12 אינץ' ושני פרופילים של 14.75 אינץ' עם חריץ T כדי להרכיב את מכסה הכלוב כפי שמצוין באיור 1B. הרכיבו לוח פוליקרבונט AR בגודל 38.5 ס"מ x 26.5 ס"מ בתעלה הפנימית של הפרופילים כדי להשלים את המכסה.
  7. הרכיבו את 12 התמיכה בפרופיל המצלמה בניצב לצירים הארוכים של החלק העליון של הכלוב ומאובטחים באמצעות שני מעברי לייט בתוך סוגריים פינתיים (מסומנים 3 באיור 1B). השתמש בלוח שטוח ישר (מסומן 2) כתמיכה בהרכבה של מצלמת האינטרנט והרכיב אותו כפי שמוצג באיור 1B. חבר את המצלמה לתמיכה באמצעות בורג הרכבה של המצלמה.
  8. השתמש במכלול הימני הסטנדרטי של ציר הרמה מסדרה 10 כדי לחבר את המכסה לגוף תא העכבר (מסומן 1 באיור 1B).
  9. בנו את מעמד ה-UV עם ארבעה פרופילים עם חריצי T שנחתכו ל-40 אינץ', ארבעה פרופילים עם חריצי T שנחתכו ל-32 אינץ', וארבעה פרופילים עם חריצי T שנחתכו ל-10 אינץ', לפי איור 1C,D. הרכיבו יריעת מראה אקרילית בגודל 82.5 ס"מ x 26.5 ס"מ בפרופילים כדי לבנות את החלק התחתון של תא UV.
  10. השתמש ביריעות מראה אקריליות בגודל 82.5 ס"מ x 30.5 ס"מ ו- 26.5 ס"מ x 30.5 ס"מ כדי לבנות את קיר מעמד ה- UV.
  11. חברו את לוחות T שטוחים בעלי חמישה חורים מסדרה 10 (מסומנים 2 באיור 1 C), את לוחות L שטוחים בעלי חמישה חורים מסדרה 10 (מסומנים 3 באיור 1 C), ואת לוחות טי שטוחים בעלי חמישה חורים מסדרה 10 (מסומנים 1 באיור 1C) כדי לאבטח את מעמד ה-UV.
  12. הרכיבו את המצלמות התחתונות בפרופיל עם חריץ T שנחתך ל-32 אינץ' והתחברו לתחתית המעמד עם שני סוגריים פינתיים של מעבר לייט כפי שמוצג באיור 1D. השתמש בלוחות שטוחים ישרים כדי לחבר את מצלמות האינטרנט לפרופיל חריצי T.
  13. הרכיבו את מנורות ה-UV בפרופילים הפנימיים, הקדמיים והאחוריים, והתחברו ללוחות השטוחים הישרים כפי שמוצג באיור 1D.
  14. חבר את ארבע מצלמות האינטרנט ליציאות ה- USB של מחשב שבו פועלת תוכנת מעקב וידאו.

2. מגורי בעלי חיים לפני ניסויים

  1. עכברי ניסוי ביתיים, שגודלו במיוחד או הושגו מאתר חיצוני, בקבוצות של ארבעה. במידת האפשר, השתמשו בעכברים נקבות או זכרים תואמי גיל לניסויים אלה. אם בעלי חיים מתקבלים ממקור חיצוני, לאפשר להם להתאקלם לפחות 7 ימים לפני ביצוע הליכים ניסיוניים כלשהם.
  2. במהלך שהותם במתקן בעלי החיים, אכסנו את בעלי החיים בכלובים סטנדרטיים המכילים מצעים והעשרה (למשל, איגלו פלסטיק, גלגל, פיסת נייר לגריסה) והחזיקו אותם תחת מחזור יום / לילה של 12 שעות, עם גישה למים ולעכבר יבש צ'או אד ליביטום.

3. הקלטות RT-VSA במהלך שלבי האור והחושך של היום

הערה: הפרוטוקול שלהלן מתאר את השימוש ב-RT-VSA כדי להעריך את התנהגות ההתרוקנות של העכבר במהלך שלבי האור והחושך של היום. בעלי החיים מוחזקים במחזור אור של 12 שעות וחושך של 12 שעות עם זמן צייטגבר (ZT) = 0 בשעה 07:00 בבוקר. ההקלטות מתחילות בין 10:30 בבוקר ל-11:00 בבוקר (ZT = 3.5-4.0) עבור ניסויי הפאזה הקלה ובין השעות 18:00-18:30 (ZT = 11.0-11.5) עבור ניסויי הפאזה החשוכה. כאשר בעלי חיים נבדקים בשני התנאים, הניסויים מבוצעים בדרך כלל בשני ימים נפרדים, עם לפחות 5 ימים רצופים בין בדיקות האור והחושך. אין לבצע ניסויים בימים בהם מנקים את חדרי בעלי החיים או מחליפים את הכלובים, שכן אלה עלולים לגרום ללחצים המשפיעים על התנהגות ההתרוקנות. כל השלבים צריכים להתבצע בתנאים של לחץ מינימלי עבור העכברים.

  1. העבירו את חיות הניסוי ממקום מגוריהן לחדר הפרוצדורות שבו ממוקמים תאי ההקלטה RT-VSA.
  2. הכנת תא הקלטה RT-VSA
    1. הניחו פיסת נייר סינון (24.3 ס"מ x 36.3 ס"מ) בתחתית כל כלוב הקלטה RT-VSA. בהתאם לשעה ביום, השתמש בנייר סינון דק (ניסויי פאזה בהירה) או עבה (ניסויי פאזה כהה).
      הערה: נייר סינון עבה משמש בשלב הכהה הפעיל מכיוון שהוא עמיד יותר לגריסת נייר מסנן דק. מצלמות עליונות משמשות להמחשת כתמי שתן שהושקעו על נייר פילטר עבה במהלך השלב החשוך. לעומת זאת, בשלב התאורה נעשה שימוש במצלמות התחתונות מכיוון שתאורת הסביבה מונעת מהמצלמות העליונות לזהות כתמי שתן ששקעו על נייר הפילטר. במקרה זה, נעשה שימוש בנייר סינון דק. מצאנו כי המצלמות התחתונות אינן יעילות באיתור אירועי התרוקנות קטנים המושקעים על נייר פילטר עבה.
    2. מעל נייר הפילטר הניחו את הפריטים הבאים: איגלו פלסטיק (המאפשר מקום שינה), צינור מיקרו-צנטריפוגה סטרילי בנפח 1.5 מ"ל למטרות העשרה, וכלי פלסטיק בגודל 60X15 מ"מ המכיל שתיים או שלוש חתיכות של צ'או יבש עכבר ו-14-16 גרם מים בצורת חבילת ג'ל (ג'ל מים שאינו מרטיב; איור 2).
      הערה: השימוש בצינורות מיקרו-צנטריפוגות בנפח 1.5 מ"ל למטרות העשרה היה ספציפי למארז ששימש במחקר זה.
    3. ברגע שתאי ההקלטה מוכנים, הניחו בעדינות את עכברי הניסוי בפנים על ידי הנחתם ברכות על נייר הסינון. יש לוודא שהעברת בעלי החיים מכלוב הדיור לכלובי ההקלטה מתרחשת במינימום לחץ.
    4. ברגע שכל חיות הניסוי נמצאות בתוך כלובי ההקלטה שלהן, כשהעפעפיים סגורים, כסו את החלק העליון של העפעפיים במשטח כחול סופג כדי למזער השתקפויות אור סביבתיות ישירות על משטח מכסה הפרספקס.
    5. הפעל את אורות ה- UV בחדר התחתון.
      הערה: לבעלי החיים אין מגע ישיר עם אור UV. האור העל-סגול המומלץ מפורט בסעיף החומרים.
  3. הקלטות RT-VSA
    1. כדי להקליט וידאו מהמצלמה העליונה והתחתונה, השתמש בתוכנת הקלטת מעקב וידאו, שניתן להגדיר להקליט ממצלמות אינטרנט מרובות או מצלמות רשת בו זמנית.
    2. עם פתיחת התוכנית, התחל הקלטה על ידי לחיצה על Command ו - R בחלון התוכנית. בצע הקלטות וידאו בקצב של פריים אחד לשנייה.
    3. מיד לאחר תחילת ההקלטות, צא מהחדר וסגר את הדלת בעדינות. ודא שהחדר נשאר שקט למשך כל תקופת הניסוי.
  4. סיום הקלטות RT-VSA
    1. חזור לחדר הפרוצדורות לאחר 7 שעות (ניסויי פאזה בהירה) או למחרת בבוקר (ניסויי פאזה חשוכה).
    2. עצור את ההקלטות על-ידי הקשה על Command ו - T. כבה את אורות ה- UV.
    3. לאחר הפסקת ההקלטה, התוכנה יוצרת באופן אוטומטי קובץ סרט (בפורמט .m4v) עבור כל מצלמה ושומרת אותו תחת שם המצלמה בתיקיית יעד שנבחרה בעבר. ודא שבתוך כל תיקיית מצלמה, הניסויים מאורגנים בתיקיות לפי תאריך.
    4. בכל תיקיית תאריך/ניסוי, ודא שיש קובץ .m4v אחד ואת כל קובצי .jpeg הבודדים המתאימים לכל אחת ממסגרות הסרט.
    5. הערה: ניתן להשתמש בקובצי .jpeg כדי לשחזר את הניסוי במקרה שקובצי סרטים נפגמים.
    6. צור תיקיה בשולחן העבודה עם השם והתאריך של הניסוי והעבר את כל הקבצים .m4v לתיקיה זו. במידת הצורך, מחק את קובצי .jpeg לאחר שמירת קובצי הסרט וגיבוים.
    7. הערה: עבור ניסויים בפאזה בהירה, התוכנה תפיק סרט אחד לכל מצלמה, ואילו עבור ניסויים בפאזה אפלה, היא תפיק שני סרטים עבור כל מצלמה. הסיבה לכך היא שקובץ .m4v חדש נוצר לאחר חצות כאשר התאריך משתנה.
    8. העתק את התיקיה המכילה את הסרטים לכונן הבזק לצורך ניתוח במחשב חיצוני. שלב זה עשוי להימשך מספר דקות וניתן לבצעו במקביל לשלבים 3.5.1 עד 3.5.3.
  5. ניקוי כלובי הקלטה והעברת עכברי ניסוי חזרה למקום מגוריהם
    1. הסירו את הפד הכחול המכסה את מכסי הכלובים. העבירו את בעלי החיים מכלובי ההקלטה לכלוב הדיור שלהם.
    2. הסר את האביזרים ומוצרי המזון בתאי ההקלטה (כלומר, איגלו פלסטיק, צינורות פלסטיק, צלחת עם משענת של צ'או וג'ל מים, ונייר סינון) והשלך אותם לפסולת מסוכנת ביולוגית.
    3. נקו את הכלובים באמצעות שואב אבק ידני, תוך הסרת כדורי צ'או וצואה הנמצאים בתחתית הכלוב. לאחר מכן, לרסס את הרצפה ואת הקירות הפנימיים של הכלוב עם 70% אתנול ולנקות את הפנים עם חתיכת בד רך. השאירו את מכסה הכלובים פתוח כדי לאפשר להם להתייבש באוויר.
    4. הניחו את כלוב הדיור עם בעלי החיים במיכל משני והעבירו את בעלי החיים חזרה למקום מגוריהם.

4. יצירת עקומות כיול

הערה: יש צורך בעקומת כיול כדי להמיר אזורים ריקים לנפחי שתן. אם מבצעים ניסויים במהלך שלבי האור והחושך של היום, יש ליצור שתי עקומות כיול, אחת לכל סוג נייר סינון המשמש (ניירות סינון דקים ועבים). עקומות כיול נוצרות בכפילות. כל העתק מופעל על נייר סינון הממוקם בתא הקלטה RT-VSA. בהתחשב בהרכבו המורכב, וברגישות UV, השתמש בשתן עכבר כדי לבצע את עקומות הכיול.

  1. איסוף שתן עכבר
    1. קח חתיכת סרט שקוף גמיש (10 ס"מ x 15 ס"מ) והנח אותו על ספסל.
    2. בחר עכבר בזנבו וקשקש אותו. יש לעסות בעדינות את הבטן התחתונה כדי לגרום למתן שתן. יש לאסוף שתן על פני יריעת הפלסטיק השקופה של הסרט.
    3. שחררו את בעל החיים בעדינות לתוך הכלוב שלו. באמצעות פיפטה, להעביר את השתן מפני השטח של הסרט השקוף אל צינור סטרילי 1.5 מ"ל מיקרו צנטריפוגה. חזור על התהליך עם עכברים מרובים עד ~ 10 מ"ל של שתן עכבר נאסף, אגרו את השתן ואחסנו ב -20 מעלות צלזיוס.
      הערה: נדרש סך של ~10 מ"ל שתן עכבר כדי ליצור עקומות כיול כפולות עבור השלבים הבהירים והכהים. כדי להימנע מלחץ על עכברי ניסוי, אל תשתמש בעכברים שיהיו נתונים לניסויי RT-VSA לאיסוף שתן.
  2. הקלטות עקומת כיול
    1. הפשירו את השתן שנאסף בשלב 4.1 וערבבו אותו על ידי ערבול עדין במשך 10-15 שניות.
    2. הניחו פיסת נייר סינון דקה (24.3 ס"מ x 36.3 ס"מ) בכל אחד משני כלובי ההקלטה RT-VSA.
    3. פיפטה נפחי השתן הבאים (ב-μL) על כל אחד מניירות הסינון: 2, 5, 10, 25, 50, 80, 100, 200, 300, 400, 500 ו-750. כדי למנוע חפיפה נקודתית כתוצאה מדיפוזיה, הקצו את הכתמים במרחק מספיק זה מזה.
    4. סגרו את מכסה הכלובים וכסו אותם ברפידות.
    5. התחל להקליט על ידי לחיצה על Command ו - R, החלת אותם פרמטרי תוכנה המשמשים להקלטת הניסויים (שלב 3.3).
    6. רשום את עקומת הכיול למשך שעה אחת כדי לאפשר דיפוזיה מקסימלית של כתמי השתן. לחצו על Command ועל T כדי להפסיק את ההקלטה.
    7. צור תיקיה חדשה בשולחן העבודה, מקם בה את קבצי .m4v ולאחר מכן העבר את הנתונים לכונן הבזק לניתוח הבא.
    8. בצע הליך דומה ליצירת עקומות כפולות עם נייר סינון עבה. במקרה זה, הוסיפו שכבות נוספות של רפידות כדי להכהות את הפנים ולדמות תנאי פאזה חשוכים.
  3. ניתוח הקלטות עקומת הכיול
    1. פתח את קבצי .m4v בתוכנת נגן סרטים, והגדל את החלון כדי למלא את המסך. כדי לנתח את עקומות הכיול המבוצעות על נייר סינון עבה, השתמשו בקבצים שהתקבלו באמצעות המצלמות העליונות (איור 3A). כדי לנתח את עקומות הכיול המבוצעות על נייר סינון דק, השתמשו בקבצים שהתקבלו באמצעות המצלמות התחתונות (איור 3B).
    2. הפעל את קובץ .m4v, הזז את מחוון הזמן קדימה ואחורה כדי לקבל סקירה כללית של סרט עקומת הכיול המלא של שעה אחת.
    3. זהה את טווח הזמן שבו כתמי השתן הקטנים יותר (<25 μL) הם בעלי העוצמה הגדולה ביותר והתפשטו באופן מקסימלי. צלם צילום מסך בטווח זמן זה. תן שם לקובץ צילום המסך ושמור אותו כקובץ .png (איור 3A, לוח עליון).
      הערה: צילומי מסך מצולמים על-ידי הקשה על מקש F6. כדי להגדיר את F6 לרכישת צילום מסך, בחר: העדפות מערכת > קיצורי מקשים > וכתוב F6 בתיבה שנמצאת משמאל לאפשרות שמור תמונת מסך כקובץ .
    4. זהה את טווח הזמן שבו כתמי השתן הבינוניים והגדולים (>50 μL) יש שטח מקסימלי וצלם צילום מסך. ייתכן שחלק מכתמי השתן הקטנים יותר לא ייראו עד שכתמי השתן הגדולים יציגו דיפוזיה מקסימלית. תן שם לקובץ ושמור את צילום המסך כקובץ .png (איור 3A, לוח תחתון).
    5. פתח את תוכנת ImageJ (NIH) ולאחר מכן גרור ושחרר את סמל קובץ .png שהתקבל בשלב 4.3.3 כדי לפתוח את קובץ התמונה (איור 4A).
    6. בסרגל הכלים, בחר בסמל ' בחירות מצולע' ותחם את גבול נייר הסינון.
    7. לאחר מכן, בחרו ' נתח ' בשורת התפריטים, בחרו ' קבע מדידות ' מהתפריט המורחב, ומהחלון שמופיע בחרו ' אזור'. לחץ על אישור. זה מאפשר לקבל ערכים של שטח כאשר שלב 4.3.8 מבוצע.
    8. לאחר מכן, בחר נתח שוב משורת התפריטים ובחר מדידה מהאפשרויות המורחבות. חלון תוצאות מוקפץ ובו אזור עמודה המציג את ערכי האזור בפיקסל2 (איור 4, B–D).
    9. בחרו בסמל Freehand Selections מסרגל הכלים והשתמשו בו כדי לצייר קו מסביב להיקף של נקודת ריק בודדת. מדוד את האזור כמו בשלב 4.3.8. התוכנה מעדכנת את טבלת התוצאות כאשר מבוצעות מדידות חדשות. קבוצת המספרים החדשה מופיעה מתחת לקודמות. רשום את המספר שמופיע מתחת לאזור העמודות של חלון התוצאות עבור כל נקודה שנותחה (איור 4E-G).
    10. חזור על שלבים 4.3.5 עד 4.3.7 עבור כל אחד מהכתמים המשוכפלים.
    11. הגדר את השטח הכולל של נייר הסינון כ- 100% וחשב את אחוז השטח (% שטח) עבור כל נקודת שתן. נורמליזציה זו תתקן שגיאות שעלולות להתרחש כתוצאה מהבדלים בזום או במיקום המצלמות.
    12. צור טבלת XY חדשה בתוכנית גרפים והוסף את ערכי נפח השתן (ב- μL) בעמודה X ואת הערכים הכפולים של אזור % בעמודה Y.
    13. לאחר מכן, בחר ניתוח > ניתוח > ניתוח XY > רגרסיה לא ליניארית (התאמת עקומה). בחלון הפרמטרים שמופיע, בחר Model > Polynomial > Second Order Polynomial (quadratic).
    14. לאחר מכן, מהכרטיסייה method, לחץ כדי לסמן את הבחירות הבאות: לפחות ריבועים רגרסיה, ללא שקלול, ושקול כל ערך Y משוכפל כנקודה בודדת.
    15. בכרטיסיה אילוץ, בחר עבור B0, סוג אילוץ > קבוע שווה ל וסוג 0 תחת העמודה ערך . לחץ על אישור.

5. ניתוח הקלטות עכברי הניסוי

  1. פתח קובץ סרט שנאסף בשלב האור (המצלמה התחתונה) או בשלב הכהה (המצלמה העליונה) לצורך ניתוח.
  2. הערך את איכות קובץ הסרט על-ידי הזזת גלילת הזמן קדימה ואחורה, כדי לוודא שנייר הסינון נשאר שלם (ללא קריעה או לעיסה) במהלך חלון הזמן של 6 שעות לניתוח. אם הנייר קרוע, אל תבצעו ניתוח נוסף, מאחר שייתכן שהעכבר השתין על הפלסטיק החשוף שלא ניתן לכמת (איור 5).
  3. כדי לנתח ניסויים שנאספו בשלבים בהירים או חשוכים, השתמש בפקודה הרץ קדימה או במחוון סרגל הזמן כדי לעבור לחלון הזמן הרצוי. פעילות ההתרוקנות בשלב האור נרשמת בין השעות 11:00-17:00 (ZT = 4.0-10.0) ובמהלך השלב החשוך בין חצות ל-06:00 בבוקר (ZT = 17.0-23.0).
  4. הפעל את הסרט במצב הרצה קדימה על-ידי לחיצה על סמל >> (או גלול ידנית לאורך הסרט), בחיפוש אחר ראיות לכך שהעכבר מתבטל. הדרך הקלה ביותר לדעת שזה קורה היא לחפש את המראה הפתאומי של כתמים בהירים של שתן על נייר המסנן. אינדיקטור נוסף הוא לחפש שינויים התנהגותיים הכוללים תנועה לפינות הכלוב ופרק זמן קצר של חוסר פעילות כאשר העכבר מתרוקן.
    הערה: ככל שאדם משתפר בזיהוי חללים, הוא יכול להגביר את מהירות הגלילה או ההעברה המהירה. עם זאת, בעכברים עם דלקת חיידקית וכימית של שלפוחית השתן, שיש להם מספר גדול מאוד של חללים קטנים 4,34, אפשר לפספס אירועי התרוקנות אם מתקדמים מהר מדי לאורך הסרט.
  5. רשום את הזמן שבו מתרחש כל ריק. כמוסכמה, זמן הריק נרשם בסימן הראשון לזיהוי השתן (איור 6A,B).
  6. כדי לבצע מדידות של החלל, השתמש תחילה בפס הגלילה כדי לנוע קדימה (או אחורה) בזמן, וחפש את נקודת הזמן שבה התרחשה דיפוזיה מקסימלית של נקודת השתן. השהה את הסרט בשלב זה וצלם צילום מסך כמתואר בשלב 4.3.3. מקם את חץ עכבר המחשב בנקודה הנמצאת בניתוח, כך שנקודת העניין תסומן בצילום המסך (איור 6C,D).
  7. תן שם לקובץ צילום המסך באמצעות מספרים מתאמים כדי להסביר את סדר ההופעה בסרט.
  8. המשך לנתח את הקובץ, וחזור על שלבים 5.5 ו- 5.7 עבור כל נקודה ריקה בסרט. לאחר שכל כתמי הריק נותחו, מדוד את השטח הכולל של נייר הסינון על ידי לכידת צילום מסך ושימוש בשלבים המתוארים ב- 4.3.6.
  9. חשב את שטח ה- % של כל אחד מכתמי השתן כמתואר בשלב 4.3.9. המר את הערכים של שטח % לנפח שתן (μL) עבור כל נקודה ריקה באמצעות עקומות הכיול שנוצרו בשלב 4 ופונקציית האינטרפולציה בתוכנת הגרפים.
    1. בתוכנת הגרפים, פתח את טבלת XY המכילה את נתוני עקומת הכיול והוסף את ערכי השטח % בעמודה Y מתחת לערך האחרון של עקומת הכיול (איור 7A).
    2. לחץ על הכרטיסייה טבלת תוצאות , ותחת הכרטיסייה דגם, לחץ כדי לבחור אינטרפולציה של לא ידועים מהעקומה הרגילה ולחץ על אישור. טאב בשם ערכי ממוצע X אינטרפולציה מופיע ליד כרטיסיית טבלת התוצאות. כרטיסייה זו מכילה טבלה עם ערכי אינטרפולציה המתאימים לנפח השתן ב- μL עבור כל נקודה ריקה. (איור 7A,B).
  10. חזור על שלבים 5.1 עד 5.9 כדי לנתח את כל עכברי הניסוי.
  11. צור קובץ חוברת עבודה המכיל את הנתונים שהתקבלו משלבים 5.5 עד 5.10, באמצעות גיליון אלקטרוני אחד לכל עכבר (איור 7C). צור קובץ אחד עבור ניסויי הפאזה הבהירה וקובץ אחר עבור ניסויי הפאזה הכהה. קובצי אב אלה מכילים את כל הנתונים הגולמיים והחישובים הדרושים המשמשים בניתוחים נוספים.

6. ניתוח דפוס השתנה של עכברי ניסוי

  1. צור פרופילי נקודות ריק ראשוניות ומשניות (איור 8, A,B ואיור 9).
    הערה: על פי מחקרי התפלגות תדרים 23, כתמים ריקים שהם ≥20 μL מייצגים בדרך כלל >95% מכלל הנפח המבוטל ונחשבים לכתמי ריק ראשוניים (PVS)8,23,35. כתמי ריק בגודל ≤20 μL נחשבים לכתמי ריק משניים או קטנים (SVS). אפליה בין PVS ו- SVS הוכחה כגישה שימושית לאפיון פנוטיפים מתרוקנים. מספר גבוה של SVS מצביע על תפקוד לקוי של התרוקנות35.
    1. מקובץ האב הכולל נתוני ספוט מתרוקנים בעלי עניין (פאזה בהירה או פאזה כהה), סווגו את הכתמים לפי נפחם כ-PVS כאשר נפחם הוא ≥20 μL, או SVS כאשר נפחם הוא <20 μL.
    2. ספור את המספר וחשב את אמצעי האחסון הממוצע המבוטל ואת הנפח הכולל עבור PVS. ספור את המספר וחשב את אמצעי האחסון הכולל עבור SVS.
    3. צור סרגל גרף המשווה את הבקרה לעכברים המטופלים עבור כל אחד מהפרמטרים המחושבים: מספר PVSs, נפח מבוטל של PVSs, נפח כולל של PVSs, מספר SVSs, נפח כולל של SVSs.
  2. אופציונלי: צור תרשים נפח מבוטל מצטבר (פונקציית גרם מדרגות) כדי להציג התנהגות התרוקנות לאורך זמן (איור 10 ואיור 11).
    1. פתח את קובץ הבסיס של חוברת העבודה והמר את זמן הביטול, המתבטא בשעות, דקות ושניות, לצורה העשרונית. חשב את נפח השתן המצטבר (ב- μL) עבור כל נקודת זמן.
    2. צור טבלת XY בתוכנת הגרפים עם זמן בצורה עשרונית בעמודה X ונפחי שתן מצטברים בעמודה Y. העתק את נתוני השעה ונפח השתן לטבלה. הוסף נקודות נתונים (0; 0) ו- (6; ערך מרבי). נקודות אלה נחוצות להשלמת הקווים האופקיים של העלילה בתחילת הניסוי (זמן: 0 שעות) כאשר הנפח המבוטל הוא אפס (0; 0), ובסוף הניסוי (זמן: 6 שעות) כאשר הערך המצטבר של השתן המבוטל שווה לערך המתקבל עבור אירוע ההתרוקנות האחרון (6; ערך מקסימלי).
    3. לחץ פעמיים על הגרף; החלון 'עיצוב תרשים' אמור להופיע. בחרו בכרטיסייה ' מראה ', לחצו לביטול הבחירה בלחצן 'הצג סמלים' ולחצו לבחירת ' הצג קו מקשר/עקומה'. לחץ על האפשרות סגנון ובחר הישרדות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

התנהגות התרוקנות של עכברי נוקאאוט Piezo1/2 אורותל

במהלך שלב האחסון של מחזור המיקטוריציה, משערים כי האורותליום חש את המתח המופעל על ידי השתן המצטבר בשלפוחית השתן ולהמיר גירוי מכני זה לתגובות תאיות כגון שחרור ATPסרוסלי 1,3. הראינו בעבר שתעלות PIEZO1 ו-PIEZO2 המופעלות מכנית מבוטאות באורותל 3,36 של העכבר. כדי לקבוע אם תעלות PIEZO של דרכי השתן חשובות להתנהגות נורמלית של התרוקנות, ביצענו RT-VSA על עכברי Piezo1/2 בעלי נוקאאוט כפול מותנה בדרכי השתן (Pz1/2-KO) ועל קבוצת ביקורת תואמת גיל ומין (Pz1/2-C; איור 9). בדקנו עכברים נקבות וזכרים במשך 6 שעות במהלך השלבים החשוכים והבהירים של היום, וניתחנו את הנתונים כמתואר בשלב 6.1. כאשר השווינו את פעילות ההתרוקנות בין שלבי האור והחושך של היום עבור קבוצות הביקורת, הבחינו כי הן הנקבות והן הזכרים הציגו עלייה במספר ובנפח הכולל של PVS במהלך תקופת הפעילות שלהם. תצפית זו מצביעה על כך שלמרות שהעכברים שהו בסביבה זרה, נשמר האופי הצירקדי של התנהגות ההתרוקנות של עכברים (הגבוה ביותר בשלב החשוך הפעיל שלהם). במהלך שלב האור הלא פעיל שלהם, לא הבחנו בהבדלים משמעותיים באף אחד מהפרמטרים שנותחו עבור עכברי Pz1/2-KO נקבות או זכרים בהשוואה לעמיתי הביקורת (Pz1/2-C). אולם כאשר בחנו את החיות במהלך השלב האפל הפעיל, עכברי Pz1/2-KO נקבות וזכרים כאחד הראו פנוטיפ התרוקנות שונה, המאופיין בעלייה משמעותית במספר ובנפח הכולל של SVS (איור 9). לא היו הבדלים משמעותיים במספר ה-PVS, בנפח הממוצע ל-PVS או בנפח ה-PVS הכולל ב-Pz1/2-KO של נשים או גברים בהשוואה לבקרות המקבילות שלהם. תוצאות אלה מצביעות על כך שתעלות PIEZO1/2 של דרכי השתן אינן ממלאות תפקיד משמעותי בתפקוד ההתרוקנות בשלב האור הלא פעיל של העכבר, אך הן חשובות במניעת כתמים תכופים בשלב החשוך הפעיל שלהם.

התוצאות המוצגות באיור 9 ממחישות שניים מהיתרונות של שימוש ב-RT-VSA לעומת VSA של נקודת הקצה. ראשית, אם הניתוח היה מבוצע רק בשלב האור, היינו מסיקים בטעות כי לתעלות PIEZO1/2 של דרכי השתן אין תפקיד בתפקוד ההתרוקנות. שנית, ברוב מחקרי ה-VSA של נקודות הקצה, SVS טופלו כרעש ניסיוני, ובמקרים מסוימים לא נכללו בניתוח הבא23. ב-RT-VSA, יכולנו לקבוע שה-SVS היו אירועים בודדים, לא משניים ל-PVS (נשיאה או כדרור קצה) והיו מרצון במובן זה שהחיות עברו לשולי הכלוב, התרוקנו ואז עזבו. תצפית זו סיפקה לנו מידע רב ערך על הפנוטיפ של עכברי Pz1/2-KO שאחרת היה מתפספס.

התרוקנות התנהגות של נקבות עכברים בתנאי בסיס ולאחר טיפול בציקלופוספמיד

בניסוי פיילוט זה, בחנו את ההשפעות של ציקלופוספמיד (CYP) על התנהגות התרוקנות מרצון של עכברים. ציקלופוספמיד, תרופה המשמשת לטיפול בצורות מסוימות של סרטן או הפרעות אימונולוגיות, ידועה כגורמת לדלקת שלפוחית השתן בחולים ובחיות ניסוי, וכתוצאה מכך פנוטיפ שלפוחית השתן פעיל יתר על המידה המאופיין באירועי התרוקנות מרובים וקטנים 26,37,38. כדי לקבוע את התנהגות ההתרוקנות הבסיסית, מיקמנו עכברה נקבה לא מטופלת ב-RT-VSA במהלך השלב החשוך. אותו עכבר הוזרק תוך צפקית עם מינון של CYP (150 מ"ג / ק"ג) 5 ימים לאחר מכן כדי לגרום דלקת שלפוחית השתן חריפה. מיד לאחר ההזרקה, העכבר הוכנס לכלוב RT-VSA להקלטה. התנהגות ההתרוקנות מיוצגת בתרשים שלב (איור 11), כאשר הקווים האנכיים מייצגים את נפח השתן המבוטל והקווים האופקיים מייצגים את הזמן. בהשוואה לתוצאות המתקבלות בתנאי בסיס, ניכר כי כמות השתן המשתחררת לכל חלל קטנה יותר לאחר טיפול ב- CYP, וכי אירועי המיקטוריציה שכיחים הרבה יותר. ניתן להעריך זאת טוב יותר בכניסה של הגרף, שם 30 הדקות הראשונות של התקופה המנותחת (המקבילות לחצות עד 00:30 בבוקר [7.0 עד 7.5 שעות לאחר ההזרקה]) מוגדלות.

Figure 1
איור 1: תא ההקלטה RT-VSA. (A) מערכת ההקלטה RT-VSA כוללת חלק עליון, המורכב משני תאים אקריליים שקופים זה לצד זה ומצלמות עליונות נלוות. חציו התחתון של המכשיר הוא מעמד יחיד המחזיק את תאי העכבר העליונים ומכיל את המצלמות התחתונות ונורות UV. פנים קירות המעמד עשויים לוחות מראה המחזירים את אור ה- UV כדי לספק תאורה אחידה לתחתית הכלובים. לא מתואר מחשב שמקבל הזנת וידאו מהמצלמות ומקליט את הנתונים. (B) דגם של תא העכבר עם רכיבים ומידות. 1) ציר הרמה סטנדרטי; 2) תושבת הרכבה של מצלמה; ו-3) סוגר פינת מעבר לייט. מבט קדמי (C) ועליון (D) של מעמד UV עם רכיבים ומידות. נורות UV מותקנות בחלק הפנימי של הפרופילים הקדמיים והאחוריים עם לוחות שטוחים ישרים. פרופיל 32 אינץ' המאובטח למסגרת הראשית של המעמד עם שני סוגרי מעבר לייט משמש להרכבת המצלמות. לוחות שטוחים ישרים משמשים לחיבור המצלמות לפרופיל 32. לוח מראות מותקן בחלק הפנימי של המעמד (לא מוצג). 1) צלחת שטוחה עם חמישה חורים; 2) צלחת שטוחה T בעלת חמישה חורים; ו-3) לוחות שטוחים L בעלי חמישה חורים. כל הערכים המוצגים הם בסנטימטרים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: תא עכבר RT-VSA. לפני ההליכים הניסיוניים, כל תא עכבר ניסיוני מוכן על ידי ריפודו עם פיסת נייר סינון (ממוספר 1). בהתאם לתקופה ביום שבה הניסוי מבוצע, נייר הסינון המשמש הוא עבה (פאזה כהה) או דק (פאזה בהירה). כיפת פלסטיק ממוקמת במרכז התא (ממוספר 2), צלחת פלסטיק עם מים (בצורה של ג'ל מים שאינם מרטיבים) וצ'או ממוקם בצד אחד של הכיפה (ממוספר 3), וצינור מיקרו-צנטריפוגה מפלסטיק 1.5 מ"ל, סוג של העשרה, ממוקם בצד הנגדי (ממוספר 4). הסידור הראשוני של אלמנטים בתוך הכלוב נשמר עקבי בכל הניסויים. שימו לב שפיסת נייר סינון מונחת בין שני הכלובים השכנים ומסומנת באיור בכוכבית. זאת כדי למנוע את השפעת הרמזים החזותיים הנובעים מהעכבר השכן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: עקומת כיול. תמונות מייצגות של ניירות סינון עבים (A, פאנלים שמאליים) ודקים (B, פאנל שמאלי) עם כמויות ידועות של שתן עכבר. תמונות הן צילומי מסך מהקלטות וידאו שהתקבלו באמצעות המצלמה העליונה (A, פאנל שמאלי) או התחתונה (B, פאנל שמאלי). חיצים אדומים מצביעים על כתמי השתן של 2 μL, והמספרים מתחת לכתמים הם ערכי נפח הספוט ב- μL. שימו לב שכתמי השתן הקטנים (<50 μL) בתמונה העליונה של לוח A הנראים זמן קצר לאחר איתור השתן (5 דקות) אינם מורגשים עוד לאחר 30 דקות (פאנל תחתון). לוחות ימניים: תרשים של שטח ספוט ריק (מבוטא כאחוז משטח נייר הסינון הכולל) כפונקציה של נפח השתן. כפי שצוין על ידי אחרים, הנתונים של שטח נקודה ריק כפונקציה של נפח השתן אינו עוקב אחר קשר ליניארי30. לפיכך, אנו מתאימים את הנתונים לפולינום מסדר שני באמצעות רגרסיה לא ליניארית. הנתונים היו מוגבלים כך ש- X = 0 עד Y = 0. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: קביעת אזורי נייר סינון וכתמי שתן באמצעות ImageJ. (A) צילום מסך של עקומת הכיול המוצגת באיור 3A שנפתח ב-ImageJ. אזור התיבה ב- (A) מוצג בפירוט רב יותר ב- (B). (B) סמל בחירת המצולע נבחר (בעיגול אדום) כדי לצייר מצולע לאורך היקף נייר הסינון (תצוגה חלקית; קו צהוב עם חצים אדומים המצביעים על הצמתים שנוצרו על-ידי הכלי בחירות). (C) שטח המצולע משקף את השטח הכולל של נייר הסינון, והוא נמדד באמצעות בחירה באפשרות 'נתח > מידה ' (עיגול אדום). (D) ערך האזור (בפיקסלים) מופיע בחלון תוצאות (עיגול אדום). (E) למדידת שטחה של נקודת ריק בודדת, הכלי בחירות חופשיות נבחר (עיגול אדום) ו- (F) משמש לציור קו מסביב לגבול הנקודה (החץ האדום מצביע על הנקודה). באמצעות אותה פקודה כמו בפקודה (C), נמדד שטח נקודת הריק, והתוצאה תופיע כערך חדש בחלון התוצאות, מיד מתחת למדידה האחרונה שבוצעה (לוח G, עיגול אדום). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: הערכת מצב נייר סינון לאחר סיום ניסויי RT-VSA. תמונות מייצגות של תא העכבר המציגות תנאים שונים של נייר הסינון במהלך ניסוי RT-VSA או לאחריו. נייר סינון שנשאר שלם עד סוף תקופת הבדיקה מוצג ב-(A) ומייצג את המצב השכיח ביותר ואת המצב שבו ניתן להמשיך ולנתח ניסוי (סימן ביקורת ירוק). דוגמאות לנייר סינון פגום מוצגות ב-(B) וב-(C), והן מייצגות ניסויים שאין להמשיך לנתח (X אדום). ב-(B), נייר הסינון נגרס על-ידי העכבר (חץ אדום) באחת הפינות. הקו הצהוב המקווקו מסמן את גבול רצפת הכלוב. אזור הקופסה מוגדל בתמונה מימין. ב-(C), שלמות הניסוי נפגעה כתוצאה מכך שג'ל מים שאינו מרטיב (חץ אדום) הוזז על ידי העכבר לפינה, והותיר שלושה כתמי מים גדולים (כוכביות אדומות). תנועות אלה אושרו על ידי צפייה בסרטון. תמונות הן צילומי מסך מקבצי סרטים שהתקבלו בשלב החשוך, באמצעות המצלמה העליונה, ועם הכלוב מרופד בנייר פילטר עבה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: קביעת זמן ההתרוקנות ורכישת צילומי מסך למדידות שטח נקודה ריק. (א,ב) צילום מסך של עכבר בפינת החדר שלו, עם כתם ריק שזה עתה הפך גלוי. הזמן של מסגרת זו מבואר כזמן ההתרוקנות. (ג,ד) ברגע שנקודת הריק מגיעה לדיפוזיה מקסימלית, צילום מסך נלקח כדי לקבוע את עוצמת הקול של החלל. תמונות הן צילומי מסך מקבצי סרטים המתקבלים באמצעות המצלמה העליונה, באמצעות נייר סינון עבה, ובמהלך השלב החשוך. תקופת הניתוח הייתה חצות עד 06:00 בבוקר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 7
איור 7: טרנספורמציה של אזור נקודה ריקה לנפח שתן ויצירת קובץ גליון עבודה עם נתונים גולמיים ניסיוניים. (A) צילום מסך של חלון תוכנת הגרפים המציג ערכים עבור כתמים ריקים המבוטאים כאחוז משטח נייר הסינון הכולל (הנתונים מסומנים בירוק). גליון העבודה (חץ ירוק) נשמר תחת המקטע טבלאות נתונים. (B) המרה של אחוז השטח הכולל לנפח השתן (הנתונים מסומנים באדום). הערכים האחרונים מוצגים באזור התוצאות (חץ אדום) ומחושבים מעקומת הכיול באמצעות אינטרפולציה של לא ידועים מפונקציית עקומה סטנדרטית. (ג) צילום מסך של גליון עבודה עם נתונים גולמיים ומחושבים שעברו הידור. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 8
איור 8: סיווג כתמי ריק ל-PVS ו-SVS וניתוחם. צילומי מסך של גליונות עבודה (שנוצרו כפי שמוצג באיור 7C) מעכבר בתנאי בסיס (A) ו-7 שעות לאחר קבלת מנה של ציקלופוספמיד (150 מ"ג/ק"ג) (B). כתמי ריק מסווגים ככתמי ריק ראשוניים (PVS) אם הנפח הוא ≥20 μL, או ככתמי ריק קטנים (SVS) אם הנפח הוא <20 μL. שימו לב שבעכבר שלא טופל (A), כל אירועי ההתרוקנות הם PVS, בעוד שבחיה שטופלה בציקלופוספמיד, רוב החללים הם SVS. הטבלה המעוגלת בכל חלונית (קו מתאר אדום), כוללת את סטטיסטיקת הסיכום הבאה: מספר חללים, אמצעי אחסון ממוצע מבוטל ואמצעי אחסון כולל מבוטל. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 9
איור 9: התנהגות התרוקנות של עכברי נוקאאוט ובקרה Piezo1/2. התנהגות ההתרוקנות של עכברי נוקאאוט נקבות (A) וזכרים (B) Piezo1/2 (Pz1/2-KO) ועמיתי הבקרה (Pz1/2-C) תועדה בחלון זמן של 6 שעות במהלך השלב החשוך או הבהיר של היום, והתוצאות נותחו כמתואר בשלב 6.1. הנתונים מוצגים כממוצע ± שגיאת תקן של ממוצע (S.E.M). הנתונים הושוו באמצעות מבחן מאן-ויטני. קיצורים: PVS = נקודות ריק ראשיות; SVSs = כתמים ריקים קטנים; NS = לא משמעותי; * עמ' < 0.05; ** עמ' < 0.01. נתון זה שונהמ-3. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 10
איור 10: גליונות עבודה לחישוב ולייצוג גרפי של אמצעי האחסון המבוטל המצטבר כפונקציה של זמן. (A) צילום מסך של גליון העבודה שנוצר באיור 7C המציג את החישובים הדרושים ליצירת תרשים פונקציית גרם מדרגות של נפח השתן המצטבר שהתבטל כפונקציה של זמן. יש להזין שעה בתבנית עשרונית (עמודה G, ריבוע אדום). כדי להמיר את השעה לתבנית עשרונית, נוספו שלוש עמודות (חצים אדומים) מימין לזמן הביטול של עמודה כדי לבאר בנפרד את הערכים של שעות (עמודה D), דקות (עמודה E) ושניות (עמודה F), ואת התוצאה הסופית של הזמן בתבנית עשרונית (עמודה G). כדי להמיר את ריקות הזמן לתבנית עשרונית, השתמש בפונקציה הבאה: (h) + (min/60) + (s/3,600). עמודה אחת נוספה מימין לעמודת נפח השתן, כדי להציג את נפח השתן המצטבר (מלבן כחול), המחושב כסכום כל נפחי השתן (עמודה J) שהתקבלו עד לזמן של אירוע התרוקנות חדש (כולל ערך האירוע החדש). (B) צילום מסך המציג נתונים שהועתקו מגליון העבודה בלוח A והודבקו בעמודה X (שעה בתבנית עשרונית) ובעמודה Y (נפחי שתן מצטברים) בפרויקט תוכנה ליצירת גרפים. נקודות הזמן הראשונה והאחרונה של העלילה מוגדרות לשורות 0 ו- 6 (ערך מרבי) כפי שמצוין על-ידי החצים האדומים. (C) ליצירת תרשים צעדים, מעצבים את התרשים באמצעות ביטול הבחירה בשדה 'הצג סמלים', הפעלת האפשרות 'הצג קו מקשר/עקומה' ובחירת סגנון ההישרדות, כפי שמוצג בשדות המוקפים באדום. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 11
איור 11: תוצאות מייצגות של התנהגות התרוקנות עכבר בתנאי בסיס או לאחר מתן ציקלופוספמיד. התנהגות ההתרוקנות מרצון של עכבר הוערכה על ידי RT-VSA במהלך השלב החשוך לפני מתן ציקלופוספמיד (בסיסי) ו-7 שעות לאחר מתן ציקלופוספמיד (CYP), כמתואר בתוצאות המייצגות. הזמן והנפח של אירועי ההתרוקנות מיוצגים בתרשים שלב שנוצר כמתואר בשלב 6.2. הכניסה של הגרף מייצגת את שטח העלילה המסומן במלבן ירוק ומתאימה ל -30 הדקות הראשונות של התקופה המנותחת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 12
איור 12: זיהוי כתמי שתן חופפים על-ידי RT-VSA. צילומי מסך של מסגרות וידאו שצולמו באמצעות המצלמה העליונה בשלב החשוך של ניסוי RT-VSA (תמונות 1 ו-2). אזור הקופסה בתמונה 2 מוגדל בתמונה 3. העכבר התבטל באותה פינה ימנית עליונה פעמיים נוספות במהלך השעות הבאות (תמונות 4–6). למרות החפיפה בין כתמי הריק, אירועי ההתרוקנות הבודדים זוהו בקלות באמצעות RT-VSA. כדי להמחיש כיצד אירועים אלה ייראו כבדיקת נקודות קצה, חשפנו את פינת נייר הסינון לתנאי תאורה שונים. תחת אור סביבתי נראה, ניתן היה לזהות רק נקודת ריק אחת גדולה (תמונה 7). כמו כן, אם אותו אזור נבדק תחת אור UV, ניתן היה להבחין רק בכתם כהה אחד (תמונה 8). לפיכך, חללים מרובים באותו אזור מזוהים בקלות על ידי RT-VSA, אך אפליה כזו אינה אפשרית אם הניתוח מבוצע כבדיקת נקודת קצה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

שילוב של ניטור וידאו הוא שינוי חסכוני המציג מספר יתרונות על פני VSA קלאסי. ב- VSA הקלאסי, המשמש בדרך כלל כבדיקת נקודת קצה, קשה להבחין בין נקודות ריק חופפות. זה לא עניין של מה בכך, שכן עכברים נוטים להשתין מספר פעמים באותו אזור כאשר הבדיקה ממושכת למספר שעות, בדרך כלל בפינות הכלוב שלהם. לפיכך, היתרון הראשון של RT-VSA הוא שהחוקר יכול לזהות בקלות כתמים בודדים שהופקדו באופן חלקי או מלא זה על גבי זה. זה מודגם היטב בניסוי שמוצג באיור 12. במקרה זה, הקלטת וידאו מאשרת כי העכבר בוטל שלוש פעמים באותה פינה, הפקדת כתמים ריקים חופפים. אם נייר הסינון נותח רק בסוף הניסוי, באופן האופייני ל-VSA, ניתן היה להבחין רק בנקודה אחת. לכן, בעוד VSA הקלאסי, נקודת הקצה, יכול להיות שימושי בזיהוי הבדלים גדולים בהתנהגות ריקות, הוא עלול להיכשל להבחין בין פנוטיפים עדינים יותר. עם ההתקדמות הנוכחית בגנטיקה ויצירת בעלי חיים טרנסגניים, פיתוח שיטות שיכולות להעריך במדויק התנהגות ריקות הוא חיוני.

שנית, RT-VSA מספק לחוקר מידע זמני על אירועי ההתרוקנות. לפיכך, ניתן לקבוע תדרי מיקטוריציה אמיתיים, כמו גם ליצור קשרים בין אירועי ריקות. לדוגמה, במצב שבו מקבץ של SVS נצפה ליד PVS גדול יחיד, ב- VSA הקלאסי, לא ניתן להבחין בקלות אם העכבר התרוקן מספר פעמים במהלך הניסוי (עם שלושה קטנים וחלל אחד גדול) או אם בעל החיים הפקיד נפח שתן אחד גדול, ושלושת הכתמים הקטנים יותר הם תוצאה של טפטוף לאחר מיקטוריציה או נשיאה מפרווה. ניתן להשתמש ב- RT-VSA כדי לענות על שאלות אלה.

שלישית, RT-VSA מאפשר לנתח את ההתנהגות של עכבר לפני, במהלך ואחרי אירוע ההתרוקנות. החוקר יכול גם לעקוב אחר פרופיל הפעילות הכולל של העכבר על ידי ניתוח הקלטות RT-VSA עם תוכנה זמינה בחינם כגון Mouse Behavior Tracker39. בנוסף, ניתן להבחין אם בעל חיים מפסיק להשתין (התנהגות אופיינית של נקבות), אם בעל החיים נמצא בתנועה במהלך התרוקנות (מה שאצל זכרים יכול לגרום לנגרר אחר כתמי ריק), או אם הוא מתרוקן במהלך שלב השינה/מנוחה שלו. ראינו את ההתנהגות האחרונה, אם כי היא בדרך כלל נדירה. לכן, אם היא מאומתת ומתפרשת כראוי, התבוננות בהתנהגות של התרוקנות יכולה לספק לחוקר תובנות יקרות ערך לגבי תפקוד לקוי של התרוקנות, כולל, למשל, נוקטוריה או בריחת שתן. RT-VSA (ו-VSA) מאפשר לחוקרים לקבוע את שבריר אירועי הריק המתרחשים באזור המרכזי של הכלוב, בניגוד לפינות. בדרך כלל, התרוקנות מרכז היא נדירה, ומספר מוגבר של אירועים כאלה הוא סימן לתפקוד לקוי של שלפוחית השתן 8,22. יוצא הדופן היחיד הוא זכרי אלפא דומיננטיים, אשר משתינים לעתים קרובות ולאורך כל המתחמים שלהם20. על מנת לבצע ניתוח של התרוקנות מרכזית באמצעות RT-VSA, יש לשקול להזיז את צלחת המזון לדופן צדדית ולהסיר את הכיפה (או לקבע אותה לאזור מסוים בכלוב), כך שניתן יהיה לקבוע בקלות רבה יותר דפוסי השתנה מרחביים.

רביעית, RT-VSA מאפשר לנהל בצורה יעילה יותר את הלחצים הקשורים לחילופי כלובים בהשוואה ל- VSA קלאסי. עכברים הם ערמומיים מטבעם וטיפול בהם או העברתם לסביבה חדשה גורמים ללחץ, הידוע כמשפיע על התנהגות ההתרוקנות35 . מטבעו, קשה לשלב תקופת התאקלמות בתקן VSA. לעומת זאת, ב-RT-VSA, ניתן לשלב בקלות תקופת התאקלמות בכל ניסוי, וכל אירוע התרוקנות במהלך תקופה זו התעלם במהלך הניתוח. היבט נוסף להפגת מתחים של RT-VSA המיושם בפרוטוקול זה הוא שכפול התנאים שבהם עכברים שוכנים בדרך כלל (כלומר, גישה למזון ומים אד ליביטום, כיפה וצעצוע). זוהי, למיטב ידיעתנו, אחת הסביבות העשירות ביותר המתוארות לניסוי מסוג זה. בנקודת קצה טיפוסית VSA, עכברים נמנעים ממים (ולפעמים גם ממזון)8,22, אותם אנו מספקים אד ליביטום.

חמישית, בנוסף להשפעה החיובית שיש לסביבה מועשרת זו על רמות הלחץ של עכברים, היא מאפשרת לחוקר לבצע RT-VSA לפרקי זמן ממושכים, בדרך כלל בחלונות זמן של 6 שעות; עם זאת, לאחרונה אנו מבצעים ניסויים שנמשכים 24 שעות (הנתונים אינם מוצגים). זה אידיאלי כאשר מעריכים את ההשפעות של ריתמיות צירקדית או כאשר לומדים עכברים שעשויים להציג פנוטיפ שלפוחית השתן תת פעיל, ולכן להשתין לעתים רחוקות.

לניטור וידאו 24 שעות, אנו ממליצים להשתמש בנייר מסנן דק ולנתח את הניסויים באמצעות המצלמות התחתונות. שילוב זה של סוג נייר ומצלמה הוא האפשרות הטובה ביותר המאפשרת רגישות של זיהוי בשלב החשוך והבהיר. כפי שהוזכר קודם לכן, מצלמות תחתונות אינן יכולות לזהות בקלות כתמי ריק על נייר הסינון העבה ומצלמות עליונות אינן מזהות באופן אמין כתמים ריקים במהלך שלב האור. אם מבצעים את הניתוחים המורחבים הללו, אנו מציעים להכניס את בעלי החיים לכלובי ההקלטה בשעה 17:00, לנתח החל מהשעה 18:00 ביום הראשון ולהשלים את הניסוי בשעה 18:00 למחרת.

בעוד RT-VSA יש היבטים חיוביים רבים, יש כמה אזהרות ראוי לציין. בעוד שאנו עושים כל ניסיון להגביל את הלחץ בעת ביצוע ניתוחים אלה, איננו יכולים לשכפל לחלוטין את סביבת המחיה של העכבר, מכיוון שבעלי החיים בדרך כלל שוכנים בקבוצה. הם גם שותים מים מבקבוק במקום לקבל מים מג'ל מים שאינו מרטיב. עם זאת, התצפית שלנו שלעכברים יש פחות חללים במהלך שלב האור הלא פעיל שלהם לעומת השלב האפל הפעיל שלהם מצביעה על כך שהעכברים שומרים על הדפוסים הרגילים שלהם של התנהגות התרוקנות צירקדית40. בשיקוף טבעם הקל ללחץ, מצאנו כי עכברים מפגינים התנהגות משובשת של התרוקנות בימים של ניקוי כלובים. לפיכך, יש להגביל את הניתוח לפרקי זמן שבהם בעלי החיים יושפעו פחות מגידול שגרתי של בעלי חיים. גורם חשוב שיש לקחת בחשבון הוא האם לאור UV יש השפעה כלשהי על תפקוד ההתרוקנות. מכיוון שהממצאים שלנו מראים הבדל צירקדי מובהק בפרמטרים של VSA בין פאזות אור וחושך, אשר עולים בקנה אחד עם טכניקות אחרות המזהות תופעה דומה אך אינן משתמשות באור UV40, אנו מסיקים כי תאורת אור UV אינה משפיעה על תפקוד ההתרוקנות. שימו לב שנייר הסינון מונע מהאור לעבור מהתא התחתון לחדר העליון.

אזהרה נוספת היא שככל שמחזיקים את העכברים זמן רב יותר בתא, כך גדל הסיכוי שהם ילעסו או יפגעו בנייר הסינון (ללא קשר לעובי הנייר). בעוד שאף אחת מהחיות לא שיבשה את הנייר בשלב האור, כמעט 30% מהעכברים פגעו בנייר במהלך השלב הפעיל החשוך. בניתוח של 24 שעות הניסויים, ראינו כי שיעור דומה (שליש) מהניסויים לא ניתן לנתח בגלל נזק לנייר, כלומר לא רק כמות הזמן, אלא גם השלב של היום משפיע על התנהגות הגריסה של החיה. למרבה הצער, מניסיוננו, שמנו לב שבעל חיים שמשבש את עבודת הכלוב ימשיך לעשות זאת גם לאחר בדיקה חוזרת. כפי שצוין לעיל, עכברים לעיתים משתינים על רצפת האקריליק החשופה, ולכן אובדן הנייר הופך את הניתוח ללא שלם ובעל ערך מוגבל.

יתר על כן, ניתוח התנהגות ההתרוקנות הגברית יכול להיות קשה יותר מכיוון שהם נוטים להתרוקן בתדירות גבוהה יותר, הם יכולים לכדרר לאחר ההתרוקנות, ויש אוכלוסייה של זכרים (20%) עם פנוטיפ אלפא-זכר אגרסיבי יותר המאופיין במספר רב של חללים קטנים המפוזרים על פני הכלוב, כפי שנדון בפרסום קודם3. מכיוון שהתנהגות אלפא-זכרית זו יכולה להוות גורם מבלבל לביסוס פנוטיפים של ריקנות, אנו מוציאים מניתוח בעלי חיים עם חללים ≥50 (ניסויי פאזה בהירה) או ≥100 (ניסויי פאזה אפלה).

ישנם מצבים שבהם ההבחנה בין חללים על בסיס נפחם (כלומר, PVS לעומת SVS) אינה בהכרח מוצדקת. לדוגמה, מניסיוננו, עכברים עם דלקת חיידקית או כימית של שלפוחית השתן נוטים לרוקן נפחים קטנים יותר מאשר קבוצת ביקורת 4,34. עם זאת, ישנם הבדלים גדולים בנפח המבוטל בין עכברים בודדים; בחלקם, לרוב החללים יש נפח ≤20 μL, בעוד שבאחרים הרוב הוא >20 μL. כתוצאה מכך, ההבחנה של הנפח המבוטל אינה מספקת כל יתרון לאפיון של פנוטיפים אלה.

לסיכום, RT-VSA הוא כלי קל ליישום לניתוח התנהגות ריקון עכבר בעכברים ניידים באופן חופשי. בניגוד לכלים כגון ציסטומטריה, היא אינה דורשת השתלה כירורגית של קטטר או שיעורים לא פיזיולוגיים של מילוי שלפוחית השתן. היא מאפשרת לקבוע התנהגות של התרוקנות בשני המינים של עכברים, לאורך פרקי זמן ממושכים, ובמהלך שלבי האור והחושך של מחזור היום. זה גם זול יחסית, במיוחד בהשוואה למכשירים מיוחדים ויקרים יותר כגון כלובים מטבוליים. אמנם יש אזהרות הקשורות לכלי זה, הם בדרך כלל קלים לניהול. לבסוף, טכניקה זו יכולה להיות מותאמת בקלות למיני בעלי חיים אחרים, כולל מכרסמים אחרים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי R01DK119183 מענק NIH (ל- G.A. ו- MDC), פרס פרויקט פיילוט באמצעות P30DK079307 (ל- M.G.D.), פרס פיתוח קריירה של האגודה האמריקאית לאורולוגיה ומענק קרן וינטרס (ל- N.M.), ועל ידי ליבות הדמיית כליות של פיזיולוגיה של התא ואורגניזמים מודל של מרכז פיטסבורג לחקר הכליות (P30DK079307).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots –  cut to 10 inches 80/20 1010 Amount: 20
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots –  cut to 12 inches 80/20 1010 Amount: 6
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots –  cut to 40 inches 80/20 1010 Amount: 4
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots – cut to 14.75 inches 80/20 1010 Amount: 12
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots – cut to 32 inches 80/20 1010 Amount: 5
1/4-20 Double Slide-in Economy T-Nut 80/20 3280 Amount: 16
1/4-20 Triple Slide-in Economy T-Nut 80/20 3287 Amount: 18
10 & 25 Series 2 Hole - 18mm Slotted Inside Corner Bracket with Dual Support 80/20 14061 Amount: 6
10 Series 3 Hole - Straight Flat Plate 80/20 4118 Amount: 8
10 Series 5 Hole - "L" Flat Plate 80/20 4081 Amount: 8
10 Series 5 Hole - "T" Flat Plate 80/20 4080 Amount: 8
10 Series 5 Hole - Tee Flat Plate 80/20 4140 Amount: 2
10 Series Standard Lift-Off Hinge - Right Hand Assembly 80/20 2064 Amount: 2
10 to 15 Series 2 Hole - Lite Transition Inside Corner Bracket 80/20 4509 Amount: 6
24”-long UV tube lights ADJ Products LLC T8-F20BLB24 Amount: 2
20W bulb – 24” Wavelength: 365nm
Acrylic Mirror Sheet Profesional Plastics Amount: 1
82.5 cm x 26.5 cm
Acrylic Mirror Sheet Profesional Plastics Amount: 2
26.5 cm X 30.5 cm
Acrylic Mirror Sheet Profesional Plastics Amount: 2
82.5 cm x 30.5 cm
AR polycarbonate (UV resistance) 80/20 65-2641 Amount: 2
4.5mm Thick, Clear, 38.5 cm x 26.5 cm
AR polycarbonate (UV resistance) 80/20 65-2641 Amount: 4
4.5mm Thick, Clear, 38.5 cm x 21.5 cm
AR polycarbonate (UV resistance) 80/20 65-2641 Amount: 4
4.5mm Thick, Clear, 26.5 cm x 21.5 cm
AR polycarbonate (UV resistance) 80/20 65-2641 Amount: 4
4.5mm Thick, Clear 37.5 cm x 23.9 cm
AR polycarbonate (UV resistance) 80/20 65-2641 Amount: 4
4.5mm Thick, Clear , 24.4 cm x 23.9 cm
Chromatography paper (thin paper)  Thermo Fisher Scientific 57144
Cosmos blotting paper (thick paper) Blick Art Materials 10422-1005
Excel Microsoft Corporation
GraphPad Prism GraphPad Software Version 9.4.0 graphing and statistics software
ImageJ FIJI NIH
Parafilm Merck transparent film
Quick Time Player 10.5 software  Apple multimedia player
Security spy Ben software video surveillance software system
Standard End Fastener, 1/4-20 80/20 3381 Amount: 80
UV transmitting acrylic Spartech Polycast Solacryl SUVT Amount: 2
38.5 cm x 26.5 cm 
Water gel: HydroGel ClearH2O   70-01-5022 (https://www.clearh2o.com/product/hydrogel/)
Webcam Logitech C930e Amount: 4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. The urothelium: life in a liquid environment. Physiological Reviews. 100 (4), 1621 (2020).
  2. de Groat, W. C., Griffiths, D., Yoshimura, N. Neural control of the lower urinary tract. Comprehensive Physiology. 5 (1), 327 (2015).
  3. Dalghi, M. G., et al. Functional roles for PIEZO1 and PIEZO2 in urothelial mechanotransduction and lower urinary tract interoception. JCI Insight. 6 (19), (2021).
  4. Montalbetti, N., et al. Bladder infection with uropathogenic Escherichia coli increases the excitability of afferent neurons. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 322 (1), 1 (2022).
  5. Montalbetti, N., et al. Increased urothelial paracellular transport promotes cystitis. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 309 (12), 1070 (2015).
  6. Montalbetti, N., et al. Urothelial tight junction barrier dysfunction sensitizes bladder afferents. eNeuro. 4 (3), (2017).
  7. Montalbetti, N., Stocker, S. D., Apodaca, G., Bastacky, S. I., Carattino, M. D. Urinary K+ promotes irritative voiding symptoms and pain in the face of urothelial barrier dysfunction. Scientific Reports. 9 (1), 5509 (2019).
  8. Kim, A. K., Hamadani, C., Zeidel, M. L., Hill, W. G. Urological complications of obesity and diabetes in males and females of three mouse models: temporal manifestations. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 318 (1), 160 (2020).
  9. Bartolone, S. N., et al. Micturition defects and altered bladder function in the klotho mutant mouse model of aging. American Journal of Clinical and Experimental Urology. 8 (3), (2020).
  10. de Rijk, M. M., et al. Aging-associated changes in oxidative stress negatively impacts the urinary bladder urothelium. International Neurourology Journal. 26 (2), 111 (2022).
  11. Coyne, K. S., et al. The prevalence of lower urinary tract symptoms (LUTS) and overactive bladder (OAB) by racial/ethnic group and age: results from OAB-POLL. Neurourology and Urodynamics. 32 (3), 230 (2013).
  12. Wittig, L., Carlson, K. V., Andrews, J. M., Crump, R. T., Baverstock, R. J. Diabetic bladder dysfunction: a review. Urology. 123, (2019).
  13. Irwin, D. E., et al. Population-based survey of urinary incontinence, overactive bladder, and other lower urinary tract symptoms in five countries: results of the EPIC study. European Urology. 50 (6), 1314 (2006).
  14. Bogart, L. M., Berry, S. H., Clemens, J. Q. Symptoms of interstitial cystitis, painful bladder syndrome and similar diseases in women: a systematic review. The Journal of Urology. 177 (2), 450 (2007).
  15. Foxman, B. Urinary tract infection syndromes: occurrence, recurrence, bacteriology, risk factors, and disease burden. Infectious Disease Clinics of North America. 28 (1), 1 (2014).
  16. Fall, M., Logadottir, Y., Peeker, R. Interstitial cystitis is bladder pain syndrome with Hunner's lesion. International Journal of Urology. 21, 79 (2014).
  17. Birder, L. A. Urinary bladder, cystitis and nerve/urothelial interactions. Autonomic Neuroscience: Basic & Clinical. 182, 89 (2014).
  18. Rosen, J. M., Klumpp, D. J. Mechanisms of pain from urinary tract infection. International Journal of Urology. 21 Suppl. 1, 26 (2014).
  19. Birder, L., et al. Neural control of the lower urinary tract: peripheral and spinal mechanisms. Neurourology and Urodynamics. 29 (1), 128 (2010).
  20. Desjardins, C., Maruniak, J. A., Bronson, F. H. Social rank in house mice: differentiation revealed by ultraviolet visualization of urinary marking patterns. Science. 182 (4115), 939 (1973).
  21. Sugino, Y., et al. Voided stain on paper method for analysis of mouse urination. Neurourology and Urodynamics. 27 (6), 548 (2008).
  22. Hill, W. G., Zeidel, M. L., Bjorling, D. E., Vezina, C. M. Void spot assay: recommendations on the use of a simple micturition assay for mice. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 315 (5), (2018).
  23. Rajandram, R., et al. Intact urothelial barrier function in a mouse model of ketamine-induced voiding dysfunction. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 310 (9), (2016).
  24. Ruetten, H., et al. A uropathogenic E. coli UTI89 model of prostatic inflammation and collagen accumulation for use in studying aberrant collagen production in the prostate. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 320 (1), 31 (2021).
  25. Wegner, K. A., et al. Void spot assay procedural optimization and software for rapid and objective quantification of rodent voiding function, including overlapping urine spots. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 315 (4), (2018).
  26. Wood, R., Eichel, L., Messing, E. M., Schwarz, E. Automated noninvasive measurement of cyclophosphamide-induced changes in murine voiding frequency and volume. The Journal of Urology. 165 (2), 653 (2001).
  27. Dmochowski, R. R. Bladder outlet obstruction: etiology and evaluation. Reviews in Urology. 7 (Suppl 6), S3–S13. , (2005).
  28. Aizawa, N., Homma, Y., Igawa, Y. Influence of high fat diet feeding for 20 weeks on lower urinary tract function in mice. Lower Urinary Tract Symptoms. 5 (2), 101 (2013).
  29. Wang, Z., et al. Void sorcerer: an open source, open access framework for mouse uroflowmetry. American Journal of Clinical and Experimental Urology. 7 (3), 170 (2019).
  30. Verstegen, A. M., Tish, M. M., Szczepanik, L. P., Zeidel, M. L., Geerling, J. C. Micturition video thermography in awake, behaving mice. Journal of Neuroscience Methods. 331, 108449 (2020).
  31. Keller, J. A., et al. Voluntary urination control by brainstem neurons that relax the urethral sphincter. Nature Neuroscience. 21 (9), (2018).
  32. Hou, X. H., et al. Central control circuit for context-dependent micturition. Cell. 167 (1), 73 (2016).
  33. Negoro, H., et al. Involvement of urinary bladder Connexin43 and the circadian clock in coordination of diurnal micturition rhythm. Nature Communication. 3, (2012).
  34. Montalbetti, N., Carattino, M. D. Acid-sensing ion channels modulate bladder nociception. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 321 (5), (2021).
  35. Chen, H., Zhang, L., Hill, W. G., Yu, W. Evaluating the voiding spot assay in mice: a simple method with complex environmental interactions. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 313 (6), (2017).
  36. Dalghi, M. G., et al. Expression and distribution of PIEZO1 in the mouse urinary tract. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 317 (2), 303 (2019).
  37. Birder, L., Andersson, K. E. Animal modelling of interstitial cystitis/bladder pain syndrome. International Neurourology Journal. 22, (2018).
  38. Okinami, T., et al. Altered detrusor gap junction communications induce storage symptoms in bladder inflammation: a mouse cyclophosphamide-induced model of cystitis. PLoS One. 9 (8), (2014).
  39. Tungtur, S. K., Nishimune, N., Radel, J., Nishimune, H. Mouse Behavior Tracker: An economical method for tracking behavior in home cages. Biotechniques. 63 (5), (2017).
  40. Negoro, H., Kanematsu, A., Yoshimura, K., Ogawa, O. Chronobiology of micturition: putative role of the circadian clock. The Journal of Urology. 190 (3), (2013).

Tags

נסיגה גיליון 192 בדיקת נקודת ריק שלפוחית השתן תפקוד התרוקנות מיקטוריציה ציסטומטריה
בדיקת ספוט ריק בזמן אמת
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dalghi, M. G., Montalbetti, N.,… More

Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Wheeler, T. B., Apodaca, G., Carattino, M. D. Real-Time Void Spot Assay. J. Vis. Exp. (192), e64621, doi:10.3791/64621 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter