Summary
이 기사에서는 기존의 공극 스팟 분석에 비디오 모니터링을 통합하여 마우스 배뇨 거동을 연구하는 새로운 방법을 설명합니다. 이 접근 방식은 보이드 이벤트에 대한 시간적, 공간적, 체적 정보와 낮의 밝고 어두운 단계 동안 마우스 동작의 세부 정보를 제공합니다.
Abstract
정상적인 배뇨 행동은 신경계의 적절한 제어 하에 방광, 요도 및 요도 괄약근의 조정된 기능의 결과입니다. 마우스 모델에서 자발적인 배뇨 행동을 연구하기 위해 연구자들은 동물 케이지 바닥을 감싸는 여과지에 퇴적된 소변 반점의 수와 면적을 측정하는 방법인 공극 반점 분석(VSA)을 개발했습니다. 기술적으로 간단하고 저렴하지만 이 분석은 배뇨 사건의 시간적 분해능 부족과 겹치는 소변 반점을 정량화하는 데 어려움을 포함하여 종말점 분석으로 사용할 때 한계가 있습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 실시간 VSA(RT-VSA)라고 하는 비디오 모니터링 VSA를 개발했으며, 이를 통해 보이드 주파수를 결정하고, 보이드 볼륨 및 보이드 패턴을 평가하고, 낮의 어두운 단계와 밝은 단계 모두에서 6시간 동안 측정할 수 있습니다. 이 보고서에 설명된 방법은 건강 및 질병 상태에서 자발적인 배뇨의 생리학적 및 신경행동적 측면을 탐구하는 다양한 마우스 기반 연구에 적용할 수 있습니다.
Introduction
소변 저장과 배뇨는 골반 및 하복부 신경을 통해 방광 충전 상태에 대한 정보를 수신하는 중추 회로(중추 신경계)에 의해 조정됩니다. 신장 골반에서 근위 요도까지 요로를 둘러싸고 있는 상피인 요로상피는 소변에 존재하는 대사 노폐물과 병원체에 대한 단단한 장벽을 형성합니다. 이것은 방광의 충전 상태를 감지하고 기저 조직과 구심성 신경에 전달하는 감각 웹의 필수 구성 요소입니다 1,2. 요로상피막의 파괴 또는 요로상피기계 전달 경로의 변화는 빈뇨, 절박뇨, 야뇨증, 요실금과 같은 하부 요로 증상과 함께 배뇨 기능 장애를 유발할 수 있다 3,4,5,6,7. 마찬가지로, 노화, 당뇨병, 하부 요로 감염, 간질성 방광염, 및 방광 또는 그 기능을 조절하는 관련 회로에 영향을 미치는 다른 질병 과정은 방광 기능 장애를 유발하는 것으로 알려져 있다 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17, 18,19. 정상 및 비정상 배뇨 행동에 대한 더 나은 이해는 다양한 배뇨 패턴을 안정적으로 구별할 수 있는 방법의 개발에 달려 있습니다.
전통적으로, 마우스의 자발적인 배뇨 거동은 데자르뎅(Desjardins)과 동료들에 의해 개발된 공극 반점 분석(void spot assay, VSA)을 사용하여 연구되어 왔으며20, 그 단순성, 저비용, 비침습적 접근법으로 인해 널리 채택되었다 8,21,22,23,24. 이 분석은 일반적으로 종말점 분석으로 수행되며, 마우스는 여과지가 늘어선 케이지에서 정의된 시간을 보내고, 이후 여과지를 자외선(UV) 광선(이러한 조건에서 소변 반점이 형광을 발함) 아래에 놓았을 때 소변 반점의 수를 세고 크기를 평가하여 분석합니다.20. 이러한 많은 장점에도 불구하고 기존 VSA에는 몇 가지 주요 제한 사항이 있습니다. 생쥐는 종종 같은 부위에서 소변을 보기 때문에 연구자는 분석 기간을 비교적 짧은 시간(≤4시간)으로 제한해야 합니다25. VSA가 더 짧은 기간에 걸쳐 수행되더라도 큰 공극 반점 위로 떨어지는 작은 공극 반점(SVS)을 해결하거나 꼬리나 발에 부착된 소변의 이월과 SVS를 구별하는 것은 거의 불가능합니다. 또한 SVS가 빈번하지만 개별적인 배뇨 사건(방광염에 대한 반응으로 종종 관찰되는 표현형)의 결과인지 아니면 배뇨 후 드리블(방광출구 폐쇄와 관련된 표현형)의 결과인지 구별하는 것도 매우 어렵습니다27). 또한, 근무 시간 동안 분석을 완료하려는 욕구와 조명이 꺼졌을 때 주거 시설에 접근하는 데 어려움이 있기 때문에 이러한 분석은 종종 24시간 일주기 주기의 조명 기간으로 제한됩니다. 따라서 이러한 시간 제약은 활성 야간 단계에서 마우스 배뇨 행동의 평가를 방해하여 일주기 리듬에 의해 제어되는 특정 유전자 또는 치료법을 분석하는 능력을 감소시킵니다.
이러한 한계 중 일부를 극복하기 위해 연구자들은 실시간으로 배뇨 거동을 평가하는 대체 방법을 개발했습니다 26,28,29,30,31,32. 이러한 접근법 중 일부는 대사 케이지(26, 28, 29)와 같은 고가의 장비의 사용 또는 열화상 카메라(30)의 사용을 포함한다; 그러나 이것들 역시 한계가 있습니다. 예를 들어, 대사 케이지에서 소변은 메쉬 바닥의 와이어와 깔때기 벽에 달라붙는 경향이 있어 수집 및 측정되는 소변의 양을 줄입니다. 따라서 작은 공극에 대한 데이터를 정확하게 수집하기 어려울 수 있습니다. 또한, 대사 케이지는 배뇨 사건의 공간적 분포(즉, 모서리 대 챔버 중앙의 배뇨)에 대한 정보를 제공하지 않습니다. 열화상 카메라에서 사용하는 장파장 적외선이 고체를 투과하지 않는다는 점을 감안할 때, 비디오 열화상 촬영으로 평가한 공극 활동은 개방형 시스템에서 수행해야 하며, 이는 활성 마우스가 공중에서 몇 인치를 점프할 수 있기 때문에 어려울 수 있습니다. 또 다른 시스템은 aVSOP(Automated voided stain on paper) 접근법(33)이며, 이는 마우스 케이지의 철망 바닥 아래에서 일정한 속도로 감겨 있는 압연 여과지로 구성된다. 이 접근법은 종이 손상과 고전적인 VSA에서 발생하는 소변 반점의 겹침을 방지하며, 이를 구현하여 조사자가 며칠 동안 실험을 수행할 수 있도록 합니다. 그러나 조사관에게 배뇨 사건의 정확한 시기를 제공하지 않으며 행동 및 그것이 스포팅과 어떤 관련이 있는지 조사할 수 있는 능력이 없습니다. 이 정보를 얻기 위해, 연구자들은 마우스 활동과 배뇨 사건을 동시에 평가할 수 있는 접근법인 배뇨 분석에 비디오 모니터링을 통합했다31,32. 한 가지 접근법은 청색 발광 다이오드(LED) 및 녹색 형광 단백질 필터 세트를 갖는 비디오-카메라를 실험 케이지 아래에 배치하여 보이드 이벤트를 시각화하고, 적외선 LED 및 비디오-카메라를 케이지 위에 배치하여 마우스 위치(32)를 캡처하는 것으로 구성된다. 이 설정은 섬유 측광을 수행하는 동안 보이드 거동을 모니터링하는 데 사용되었습니다. 그러나 이 시스템의 밝은 조명 환경에서는 조사관이 배뇨를 자극하기 위해 이뇨제로 마우스를 치료해야 했습니다. 또 다른 실험 설계에서는 광각 카메라를 실험 케이지 위와 아래에 배치하여 마우스 운동 활동과 배뇨 이벤트를 각각 시각화했습니다. 이 경우, 케이지 바닥을 라이닝하는 여과지 상에 침착된 소변 반점은 케이지(31) 아래에 배치된 UV 광으로 여과지를 조명함으로써 드러났다. 이 설정은 자발적인 배뇨 행동31에 관여하는 뇌간 뉴런을 연구하기 위해 하루 중 가벼운 단계 동안 4분 동안 짧은 분석에 사용되었습니다. 암흑기 동안 또는 >4분 동안 사용하기 위한 이 시스템의 적합성은 보고되지 않았습니다.
이 기사에서는 마우스 보이드 동작에 대한 장기 비디오 모니터링을 허용하여 기존 VSA를 향상시키는 방법에 대해 설명합니다. 이러한 비용 효율적인 접근법은 마우스 행동(3,4,34)과 관련된 세부사항과 함께, 하루의 밝은 단계와 어두운 단계 동안 연장된 기간 동안 이벤트 무효화에 대한 시간적, 공간적, 체적 정보를 제공한다. 보이드 챔버의 구성, 실시간 VSA(RT-VSA)의 구현 및 데이터 분석에 대한 자세한 정보가 제공됩니다. RT-VSA는 비뇨기계의 기능을 제어하는 생리학적 메커니즘을 이해하고, 배뇨를 조절하기 위한 약리학적 접근법을 개발하고, 하부 요로에 영향을 미치는 질병 과정의 분자적 기초를 정의하려는 연구자에게 유용합니다.
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Protocol
Urothelial Piezo1/2 이중 녹아웃 마우스(Pz1/2-KO , 유전자형: Piezo1 fl/fl; 피에조2 fl/fl; Upk2CRE+/-) 및 대조군(Pz1/2-C, 유전자형: Piezo1 fl/fl; 피에조2 fl/fl; Upk2CRE-/-)는 Jax 실험실에서 얻은 부모 균주(Piezo1 fl/fl 균주 #029213; Piezo2 fl/fl 균주 # 027720; Upk2CRE+/- 균주 # 029281). 암컷 (1.5-3 개월, 체중 17-20g)과 수컷 (2-4 개월, 체중 23-29g) 마우스를 실험에 사용했다. 시클로포스파미드 유발 방광염 실험을 위해 야생형 C57Bl/6J 암컷(생후 3개월, 체중 ~20g)을 사용했습니다(Jackson laboratories, 균주 #000664). 동물을 수용하고 실험은 피츠버그 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인 하에 피츠버그 대학 동물 보호 시설에서 수행되었습니다. 모든 동물 실험은 실험실 동물의 인도적 관리 및 사용에 관한 공중 보건 서비스 정책 및 동물 복지법의 관련 지침 및 규정에 따라 수행되었습니다.
1. 실시간 보이드 스팟 분석(RT-VSA)을 위한 케이지 조립
- RT-VSA 장비는 2개의 UV 전구와 2개의 광각 카메라(하단 카메라)를 고정하는 UV 스탠드로 구성되며, 이 카메라는 하루 중 조명 단계에서 공극 활동을 기록하는 데 사용됩니다. 스탠드에 놓을 두 개의 마우스 챔버를 배치합니다. 광각 카메라(상단 카메라)를 각 마우스 챔버의 뚜껑에 부착하여 하루 중 어두운 단계에서 배뇨 활동을 기록하는 데 사용합니다(그림 1A).
- UV 스탠드 및 마우스 챔버의 프레임을 1 in x 1 in T-슬롯 알루미늄 프로파일로 구성합니다. 두 개의 마우스 챔버와 UV 스탠드를 구축하는 데 사용되는 구성 요소 목록은 표 1을 참조하고 조립된 구성 요소 및 치수의 다양한 보기는 그림 1B-D 를 참조하십시오.
- 10인치로 절단된 8개의 T-슬롯 알루미늄 프로파일과 14.75인치로 절단된 4개의 T-슬롯 알루미늄 프로파일로 각 마우스 챔버를 구성합니다. 마우스 챔버의 바닥을 조립하는 것으로 시작하고 표준 엔드 패스너(표 1)를 사용하여 T-슬롯 프로를 조립합니다.file그림 1에 따라. 38.5 cm x 26.5 cm UV 투과 아크릴을 프로파일의 내부 채널에 장착하여 마우스 챔버의 바닥을 구축한다.
알림: 표준 엔드 패스너가 있는 T-슬롯 프로파일을 조립하는 방법에 대한 자세한 내용은 회사 웹 페이지를 참조하십시오. - 나머지 프로파일로 마우스 챔버의 벽을 만듭니다. 38.5cm x 21.5cm 및 26.5cm x 21.5cm 내마모성(AR) 폴리카보네이트 패널을 프로파일에 장착하여 마우스 챔버의 외벽을 조립합니다. 37.5cm x 23.9cm 및 24.4cm x 23.9cm AR 폴리카보네이트 패널을 사용하여 마우스 챔버의 내부를 구성합니다.
- 표준 엔드 패스너 1/4-20 트레드로 AR 폴리카보네이트 패널을 고정합니다. 프로에 패널을 장착하는 방법에 대한 지침을 참조하십시오.file1.3단계의 참고에 있는 웹 페이지의 페이지에서. 상업용 실리콘 코크를 사용하여 내부 패널 사이의 접합부를 밀봉하십시오.
- 2개의 12인치 및 2개의 14.75인치 T-슬롯 프로files를 사용하여 그림 1B에 표시된 대로 케이지 뚜껑을 조립합니다. 38.5cm x 26.5cm AR 폴리카보네이트 패널을 프로파일의 내부 채널에 장착하여 덮개를 완성합니다.
- 카메라 프로에 12 장착 file 케이지 상단의 긴 축에 수직으로 지지대를 고정하고 모서리 브래킷 내부에 두 개의 라이트 트랜지션으로 고정합니다(그림 3B에서 1로 표시됨). 직선 평판(2로 표시)을 web캠 장착 지지대로 그림 1B와 같이 장착합니다. 카메라 장착 나사를 사용하여 카메라를 지지대에 부착합니다.
- 10 시리즈 표준 리프트오프 힌지 오른쪽 어셈블리를 사용하여 마우스 챔버 본체에 덮개를 부착합니다(그림 1B에서 1로 표시됨).
- 그림 1C,D에 따라 4개의 T-슬롯 프로파일이 40인치로 절단되고, 4개의 T-슬롯 프로파일이 32인치로 절단되고, 4개의 T-슬롯이 있는 프로파일이 10인치로 절단된 UV 스탠드를 구성합니다. 82.5cm x 26.5cm 아크릴 미러 시트를 프로파일에 장착하여 UV 챔버의 바닥을 만듭니다.
- 82.5cm x 30.5cm 및 26.5cm x 30.5cm 아크릴 미러 시트를 사용하여 UV 스탠드의 벽을 구성합니다.
- 10 시리즈 5홀 T 플랫 플레이트(그림 2 C에서 1로 표시), 10 시리즈 5홀 L 플랫 플레이트(그림 3 C에서 1로 표시) 및 10 시리즈 5홀 티 플랫 플레이트(그림1 C에서 1로 표시)를 부착하여 UV 스탠드를 고정합니다.
- 하단 카메라를 T-슬롯 프로에 장착file 32인치로 자르고 그림 1D와 같이 두 개의 라이트 전환 코너 브래킷으로 스탠드 바닥에 부착합니다. 직선 평판을 사용하여 웹캠을 T-슬롯 프로에 부착file.
- UV 램프 장착amps 내부, 전면 및 후면에 files를 선택하고 그림 1D와 같이 직선 평판에 부착합니다.
- 4개의 웹캠을 비디오 감시 소프트웨어를 실행하는 컴퓨터의 USB 포트에 연결합니다.
2. 실험 전 동물 사육
- 사육되거나 외부 사이트에서 얻은 실험용 마우스를 4 마리의 그룹으로 수용합니다. 가능하면 이러한 실험에 연령이 일치하는 암컷 또는 수컷 마우스를 사용하십시오. 동물을 외부 출처에서 얻은 경우 실험 절차를 수행하기 전에 최소 7 일 동안 순응하도록하십시오.
- 동물 시설에 있는 동안 침구와 농축물(예: 플라스틱 이글루, 바퀴, 파쇄용 종이)이 들어 있는 표준 케이지에 동물을 수용하고 물과 마른 쥐 차우를 자유롭게 이용할 수 있는 12시간 주야간 주기로 유지합니다.
3. 하루 중 밝고 어두운 단계 동안의 RT-VSA 기록
알림: 아래 프로토콜은 RT-VSA를 사용하여 하루 중 밝고 어두운 단계에서 마우스 배뇨 행동을 평가하는 방법을 설명합니다. 동물들은 오전 07:00에 Zeitgeber 시간(ZT) = 0인 12시간 조명 및 12시간 어두운 주기로 유지됩니다. 기록은 밝은 위상 실험의 경우 오전 10:30에서 오전 11:00(ZT = 3.5–4.0) 사이, 어두운 단계 실험의 경우 오후 06:00에서 오후 06:30(ZT = 11.0–11.5) 사이에 시작됩니다. 동물을 두 조건 모두에서 시험할 때 실험은 일반적으로 밝은 시험과 어두운 시험 사이에 최소 연속 5일과 함께 별도의 이틀에 걸쳐 수행됩니다. 동물실을 청소하거나 케이지를 교체하는 날에는 배뇨 행동에 영향을 미치는 스트레스가 발생할 수 있으므로 실험을 수행해서는 안 됩니다. 모든 단계는 마우스에 대한 최소한의 스트레스 조건 하에서 수행되어야합니다.
- 실험 동물을 사육장에서 RT-VSA 기록 챔버가 있는 시술실로 운반합니다.
- RT-VSA 레코딩 챔버 준비
- 각 RT-VSA 기록 케이지의 바닥에 여과지(24.3cm x 36.3cm)를 놓습니다. 하루 중 시간에 따라 얇은(밝은 단계 실험) 또는 두꺼운(어두운 단계 실험) 여과지를 사용합니다.
알림: 두꺼운 여과지는 얇은 여과지보다 파쇄에 더 강하기 때문에 활성 암흑기에 사용됩니다. 탑 카메라는 어두운 단계에서 두꺼운 여과지에 쌓인 소변 반점을 시각화하는 데 사용됩니다. 대조적으로, 조명 단계에서는 주변 조명이 상단 카메라가 여과지에 침착된 소변 반점을 감지하지 못하도록 하기 때문에 하단 카메라가 사용됩니다. 이 경우 얇은 여과지가 사용됩니다. 우리는 하단 카메라가 두꺼운 여과지에 침전된 작은 공극 이벤트를 감지하는 데 효과적이지 않다는 것을 발견했습니다. - 여과지 위에 다음 품목을 놓습니다 : 플라스틱 이글루 (수면 공간을 제공함), 농축 용 멸균 1.5mL 마이크로 원심 분리기 튜브, 2 개 또는 3 개의 마우스 건조 차우와 14-16g의 물이 들어있는 60mm x 15mm 플라스틱 접시 젤 팩 (비 습윤수 젤; 그림 2).
참고: 농축 목적으로 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브를 사용하는 것은 이 연구에 사용된 인클로저에 따라 다릅니다. - 기록 챔버가 준비되면 실험용 마우스를 여과지 위에 부드럽게 내려 놓아 부드럽게 안에 놓습니다. 하우징 케이지에서 기록 케이지로 동물을 옮길 때 최소한의 스트레스로 발생하는지 확인하십시오.
- 모든 실험 동물이 뚜껑을 닫은 상태에서 기록 케이지 안에 들어가면 플렉시 유리 뚜껑 표면의 직접적인 주변광 반사를 최소화하기 위해 흡수성 벤치 블루 패드로 뚜껑 상단을 덮습니다.
- 하부 챔버의 UV 조명을 켭니다.
참고: 동물은 자외선과 직접 접촉하지 않습니다. 권장 UV 광선은 재료 섹션에 자세히 설명되어 있습니다.
- 각 RT-VSA 기록 케이지의 바닥에 여과지(24.3cm x 36.3cm)를 놓습니다. 하루 중 시간에 따라 얇은(밝은 단계 실험) 또는 두꺼운(어두운 단계 실험) 여과지를 사용합니다.
- RT-VSA 레코딩
- 상단 및 하단 카메라에서 비디오를 녹화하려면 한 번에 여러 웹캠 또는 네트워크 카메라에서 녹화하도록 구성할 수 있는 비디오 감시 녹화 소프트웨어를 사용하십시오.
- 프로그램을 열면 프로그램 창에서 Command 와 R 을 눌러 녹음을 시작합니다. 초당 1프레임의 속도로 비디오 녹화를 수행합니다.
- 녹음을 시작한 직후 방을 나가 문을 부드럽게 닫습니다. 실험이 진행되는 동안 방이 조용하게 유지되는지 확인합니다.
- RT-VSA 레코딩 완료
- 7시간(밝은 단계 실험) 또는 다음날 아침(어두운 단계 실험) 후에 시술실로 돌아갑니다.
- Command와 T를 눌러 녹음을 중지합니다. 자외선을 끕니다.
- 녹화를 중지한 후 소프트웨어는 각 카메라에 대한 동영상 파일(.m4v 형식)을 자동으로 생성하고 이전에 선택한 대상 폴더에 카메라 이름으로 저장합니다. 각 카메라 폴더 내에서 실험이 날짜별로 폴더로 구성되어 있는지 확인합니다.
- 각 날짜/실험 폴더에 하나의 .m4v 파일과 각 동영상 프레임에 해당하는 모든 개별 .jpeg 파일이 있는지 확인합니다.
- 참고 : .jpeg 파일은 동영상 파일이 손상된 경우 실험을 복구하는 데 사용할 수 있습니다.
- 바탕 화면에 실험 이름과 날짜가 포함된 폴더를 만들고 모든 .m4v 파일을 이 폴더로 전송합니다. 필요한 경우 동영상 파일이 저장 및 백업된 후 .jpeg 파일을 삭제합니다.
- 참고: 밝은 단계 실험의 경우 소프트웨어는 카메라당 하나의 동영상을 생성하고 어두운 단계 실험의 경우 각 카메라에 대해 두 개의 동영상을 생성합니다. 이는 날짜가 변경되는 자정 이후에 새 .m4v 파일이 생성되기 때문입니다.
- 외부 컴퓨터에서 분석할 수 있도록 동영상이 포함된 폴더를 플래시 드라이브에 복사합니다. 이 단계는 몇 분 정도 걸릴 수 있으며 3.5.1-3.5.3단계와 병행하여 수행할 수 있습니다.
- 기록 케이지 청소 및 실험용 마우스를 주거 위치로 다시 이동
- 케이지 뚜껑을 덮고 있는 블루패드를 제거합니다. 기록 케이지에서 하우징 케이지로 동물을 옮깁니다.
- 녹음실에서 액세서리와 식품(예: 플라스틱 이글루, 플라스틱 튜브, 차우와 워터 젤이 담긴 접시, 여과지)을 제거하고 생물학적 유해 폐기물에 폐기하십시오.
- 핸드 진공 청소기를 사용하여 케이지를 청소하고 케이지 바닥에 있는 차우와 배설물 알갱이를 제거합니다. 그런 다음 케이지의 바닥과 내부 벽에 70% 에탄올을 뿌리고 부드러운 천으로 내부를 청소합니다. 케이지의 뚜껑을 열어 공기 건조를 허용하십시오.
- 동물과 함께 사육장을 보조 컨테이너에 넣고 동물을 사육 위치로 다시 운반합니다.
4. 검량선 생성
참고: 공극 부위를 소변량으로 전환하려면 보정 곡선이 필요합니다. 하루 중 밝은 단계와 어두운 단계에서 실험을 수행하는 경우 사용되는 각 유형의 여과지(얇고 두꺼운 여과지)에 대해 하나씩 두 개의 보정 곡선을 생성해야 합니다. 검량선은 이중으로 생성됩니다. 각 복제는 RT-VSA 기록 챔버에 배치된 여과지에서 실행됩니다. 복잡한 구성과 UV 흥분성을 감안할 때 마우스 소변을 사용하여 보정 곡선을 만드십시오.
- 쥐 소변 수집
- 유연한 투명 필름 (10cm x 15cm)을 가져 와서 벤치에 놓습니다.
- 꼬리로 마우스를 잡고 긁습니다. 배뇨를 유도하기 위해 하복부를 부드럽게 마사지하십시오. 투명 필름 플라스틱 시트의 표면에 소변을 수집합니다.
- 새장 안에서 동물을 부드럽게 풀어줍니다. 피펫을 사용하여 투명 필름 표면의 소변을 멸균된 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. ~10mL의 마우스 소변이 수집될 때까지 여러 마우스로 절차를 반복하고 소변을 모아 -20°C에서 보관합니다.
참고: 밝은 단계와 어두운 단계에 대한 중복 보정 곡선을 생성하려면 총 ~10mL의 마우스 소변이 필요합니다. 실험용 마우스에 스트레스를 주지 않으려면 소변 수집을 위해 RT-VSA 실험을 받을 마우스를 사용하지 마십시오.
- 검량선 기록
- 4.1단계에서 수집한 소변을 해동하고 10-15초 동안 부드럽게 볼텍싱하여 혼합합니다.
- 얇은 여과지(24.3cm x 36.3cm)를 두 개의 RT-VSA 기록 케이지 각각에 놓습니다.
- 각 여과지에 2, 5, 10, 25, 50, 80, 100, 200, 300, 400, 500 및 750의 소변량(μL)을 피펫팅합니다. 확산으로 인한 스폿 겹침을 방지하려면 스폿을 서로 충분한 거리에 할당하십시오.
- 케이지의 뚜껑을 닫고 패드로 덮으십시오.
- Command 및 R을 누르고 실험을 기록하는 데 사용된 것과 동일한 소프트웨어 매개변수를 적용하여 기록을 시작합니다(3.3단계).
- 소변 반점이 최대한 확산될 수 있도록 1시간 동안 보정 곡선을 등록합니다. Command 와 T 를 눌러 녹음을 중지합니다.
- 바탕 화면에 새 폴더를 만들고 .m4v 파일을 넣은 다음 후속 분석을 위해 데이터를 플래시 드라이브로 전송합니다.
- 유사한 절차를 수행하여 두꺼운 여과지로 중복 곡선을 생성합니다. 이 경우 패드를 추가하여 내부를 어둡게 하고 어두운 위상 조건을 시뮬레이션합니다.
- 검량선 기록 분석
- 동영상 플레이어 소프트웨어에서 .m4v 파일을 열고 창을 최대화하여 화면을 채웁니다. 두꺼운 여과지에서 수행된 검량선을 분석하려면 상단 카메라로 얻은 파일을 사용합니다(그림 3A). 얇은 여과지에서 수행된 검량선을 분석하려면 하단 카메라로 얻은 파일을 사용하십시오(그림 3B).
- .m4v 파일을 재생하고 시간 슬라이더를 앞뒤로 움직여 전체 1시간 검량선 동영상의 개요를 볼 수 있습니다.
- 더 작은 소변 반점(<25μL)의 강도가 가장 크고 최대로 퍼진 시간 범위를 식별합니다. 이 시간 범위 내에서 스크린샷을 찍습니다. 스크린샷 파일의 이름을 지정하고 .png 파일로 저장합니다(그림 3A, 위쪽 패널).
참고: 스크린샷은 F6 키를 눌러 촬영합니다. 스크린 샷 획득을 위해 F6을 설정하려면 시스템 환경 설정 > 키보드 > 단축키를 선택하고 화면 사진을 파일로 저장 옵션의 오른쪽에있는 상자에 F6을 씁니다. - 중간 및 큰 소변 반점(>50μL)의 최대 면적을 갖는 시간 범위를 식별하고 스크린샷을 찍습니다. 더 큰 소변 반점이 최대 확산을 나타낼 때까지 작은 소변 반점 중 일부가 보이지 않을 수 있습니다. 파일 이름을 지정하고 스크린샷을 .png 파일로 저장합니다(그림 3A, 아래쪽 패널).
- ImageJ 소프트웨어(NIH)를 연 다음 4.3.3단계에서 얻은 .png 파일 아이콘을 끌어다 놓아 이미지 파일을 엽니다(그림 4A).
- 도구 모음에서 Polygon Selections 아이콘을 선택하고 필터 용지의 테두리를 그립니다.
- 그런 다음 메뉴 모음에서 분석을 선택하고, 확장된 메뉴에서 측정값 설정을 선택하고, 팝업 창에서 영역을 선택합니다. 확인을 클릭합니다. 이를 통해 4.3.8 단계가 수행 될 때 영역 값을 얻을 수 있습니다.
- 그런 다음 메뉴 모음에서 분석을 다시 선택하고 확장된 옵션에서 측정을 선택합니다. 픽셀2 의 영역 값을 표시하는 열 영역이 포함된 결과 창이 나타납니다(그림 4B–D).
- 도구 모음에서 [자유형 선택] 아이콘을 선택하고 이 아이콘을 사용하여 개별 보이드 스폿의 둘레에 선을 그립니다. 4.3.8단계와 같이 면적을 측정합니다. 소프트웨어는 새로운 측정이 수행될 때 결과 테이블을 업데이트합니다. 새 숫자 집합이 이전 숫자 아래에 나타납니다. 분석된 각 스팟에 대해 결과 창의 열 영역 아래에 나타나는 숫자를 기록합니다(그림 4E–G).
- 각 복제 지점에 대해 4.3.5 - 4.3.7단계를 반복합니다.
- 여과지의 전체 면적을 100%로 설정하고 각 소변 반점의 면적(% 면적)을 계산합니다. 이 정규화는 카메라의 확대/축소 또는 위치 차이로 인해 발생할 수 있는 오류를 수정합니다.
- 그래프 프로그램에서 새 XY 테이블을 만들고 X 열에 소변량(μL) 값을 삽입하고 Y 열에 % 면적의 중복 값을 삽입합니다.
- 그런 다음 분석 > 분석 > XY 분석 > 비선형 회귀(곡선 적합)를 선택합니다. 표시되는 매개변수 창에서 Model > Polynomial(다항식) > Second Order Polynomial(2차)을 선택합니다.
- 그런 다음 방법(Method) 탭에서 최소 제곱 회귀 분석(Least Squares Regression), 가중치 적용(No Weighting) 및 각 반복실험 Y 값을 개별 점으로 고려(Consider each Replicate y value as an individual point) 선택 항목을 클릭하여 표시합니다.
- 구속(contrain) 탭에서 B0, 구속 유형(Constraint Type) > 상수 같음(Constant to equal)을 선택하고 값(Value ) 열 아래에 0을 입력합니다. 확인을 클릭합니다.
5. 실험용 마우스 기록 분석
- 밝은 단계(아래쪽 카메라) 또는 어두운 단계(위쪽 카메라) 동안 수집된 동영상 파일을 열어 분석합니다.
- 타임 스크롤러를 앞뒤로 움직여 동영상 파일의 품질을 평가하고, 분석할 6시간 동안 여과지가 손상되지 않는지(찢어지거나 씹히지 않음) 유지되는지 확인합니다. 종이가 찢어진 경우 마우스가 정량화할 수 없는 노출된 플라스틱에 소변을 보았을 수 있으므로 추가 분석을 수행하지 마십시오(그림 5).
- 밝은 단계 또는 어두운 단계에서 수집된 실험을 분석하려면 빨리 감기 명령 또는 시간 표시줄 슬라이더를 사용하여 원하는 시간 창으로 이동합니다. 밝은 단계 동안의 배뇨 활동은 오전 11:00에서 오후 05:00 사이(ZT = 4.0–10.0)와 자정에서 오전 06:00 사이(ZT = 17.0–23.0) 어두운 단계에서 기록됩니다.
- >> 아이콘을 클릭하거나 동영상을 수동으로 스크롤하여 빨리 감기 모드에서 동영상을 재생하고 마우스가 보이지 않는다는 증거를 찾습니다. 이것이 발생하고 있음을 알 수있는 가장 쉬운 방법은 여과지에 소변의 밝은 반점이 갑자기 나타나는 것을 찾는 것입니다. 또 다른 지표는 케이지 모서리로의 움직임과 마우스가 배뇨 중일 때 잠시 동안 활동하지 않는 것을 포함한 행동 변화를 찾는 것입니다.
알림: 보이드를 더 잘 감지할수록 스크롤 또는 빨리 감기 속도를 높일 수 있습니다. 그러나, 박테리아 및 화학적으로 유도된 방광염을 가진 마우스의 경우, 매우 많은 수의 작은 공극을 가지고 있다 4,34, 영화를 너무 빨리 움직이면 배뇨 사건을 놓칠 수 있다. - 각 보이드가 발생하는 시간을 등록합니다. 관례에 따라 배뇨 시간은 소변이 감지되는 첫 번째 징후에 기록됩니다(그림 6A, B).
- 공극을 측정하려면 먼저 스크롤 막대를 사용하여 시간을 앞(또는 뒤로)하여 소변 반점의 최대 확산이 발생한 시점을 찾습니다. 이 시점에서 동영상을 일시 중지하고 4.3.3 단계에서 설명한대로 스크린 샷을 찍습니다. 컴퓨터 마우스 화살표를 분석 중인 지점에 놓아 관심 지점이 스크린샷에 표시되도록 합니다(그림 6C,D).
- 동영상의 출현 순서를 설명하기 위해 상관 번호를 사용하여 스크린샷 파일의 이름을 지정합니다.
- 동영상의 각 빈 자리에 대해 5.5단계와 5.7단계를 반복하여 파일을 계속 분석합니다. 모든 보이드 스폿이 분석되면 스크린샷을 캡처하고 4.3.6에 설명된 단계를 사용하여 여과지의 전체 면적을 측정합니다.
- 4.3.9 단계에서 설명한대로 각 소변 반점의 % 면적을 계산하십시오. 4단계에서 생성된 보정 곡선과 그래프 소프트웨어의 보간 기능을 사용하여 각 공극 지점에 대해 % 면적 값을 소변 부피(μL)로 변환합니다.
- 그래프 작성 소프트웨어에서 검량선의 데이터가 포함된 XY 테이블을 열고 검량선의 마지막 값 아래 Y 열에 % 면적 값을 삽입합니다(그림 7A).
- 결과 테이블(Table of Results) 탭을 클릭하고 모델(model) 탭에서 표준 커브(Standard Curve)에서 알 수 없는 항목 보간(Interpolate Unknowns from Standard Curve)을 클릭하여 선택한 다음 확인(OK)을 누릅니다. 보간된 X 평균 값이라는 탭이 결과 테이블 탭 옆에 나타납니다. 이 탭에는 각 공극 지점에 대한 소변량(μL)에 해당하는 보간된 값이 있는 표가 포함되어 있습니다. (그림 7A, B).
- 5.1단계부터 5.9단계까지 반복하여 모든 실험용 마우스를 분석합니다.
- 마우스당 하나의 스프레드시트를 사용하여 5.5단계부터 5.10단계까지 가져온 데이터가 포함된 통합 문서 파일을 만듭니다(그림 7C). 밝은 단계 실험에 대해 하나의 파일을 만들고 어두운 단계에 대해 다른 파일을 만듭니다. 이 마스터 파일에는 추가 분석에 사용되는 모든 원시 데이터와 필요한 계산이 포함되어 있습니다.
6. 실험용 마우스의 배뇨 패턴 분석
- 1차 및 2차 보이드 스폿 프로파일을 생성합니다(그림 8A, B 및 그림 9).
참고: 주파수 분포 연구 23에 따르면 ≥20μL인 공극 반점은 일반적으로 총 공극 부피의 >95%를 나타내며 1차 공극 반점(PVS)으로 간주됩니다8,23,35. ≤20μL인 공극 반점은 2차 또는 작은 공극 반점(SVS)으로 간주됩니다. PVS와 SVS 사이의 차별은 배뇨 표현형을 특성화하는 데 유용한 접근 방식인 것으로 나타났습니다. SVS의 수가 증가하면 배뇨 기능 장애를 나타냅니다35.- 관심 있는 보이드 스팟 데이터(밝은 위상 또는 어두운 위상)가 포함된 마스터 파일에서 부피를 기준으로 스폿을 ≥20μL인 PVS로, 부피가 <20μL인 SVS로 분류합니다.
- 숫자를 세고 PVS의 평균 보이드 볼륨과 총 볼륨을 계산합니다. 숫자를 세고 SVS의 총 볼륨을 계산합니다.
- 계산된 각 파라미터(PVS 수, PVS 공극 부피, PVS 총 부피, SVS 수, SVS 총 부피)에 대해 대조군을 처리된 마우스와 비교하는 그래프 막대를 생성합니다.
- 선택 사항: 시간 경과에 따른 보이드 동작을 표시하기 위해 누적 보이드 볼륨 플롯(계단 함수)을 생성합니다(그림 10 및 그림 11).
- 통합 문서 마스터 파일을 열고 시, 분, 초로 표시되는 무효화 시간을 10진수 형식으로 변환합니다. 각 시점에 대한 누적 소변량(μL)을 계산합니다.
- 그래프 작성 소프트웨어에서 X 열에 십진수 형식의 시간, Y 열에 누적 소변량이 있는 XY 테이블을 생성합니다. 시간 및 소변량 데이터를 표에 복사합니다. (0, 0) 및 (6, 최대값) 데이터 요소를 추가합니다. 이 점은 배뇨 부피가 0 (0; 0) 일 때 실험 시작 (시간 : 0 h)과 배뇨 된 소변의 누적 값이 마지막 배뇨 이벤트 (6, 최대 값)에 대해 얻은 값과 같을 때 실험 종료 (시간 : 6 h)에 플롯의 수평선을 완성하는 데 필요합니다.
- 그래프를 두 번 클릭하십시오. 그래프 서식 창이 나타납니다. 모양새(Appearance ) 탭을 선택하고 기호 보기(Show Symbols ) 버튼을 클릭하여 선택 취소한 다음 연결선/곡선 표시(Show Connecting Line/Curve)를 클릭하여 선택합니다. 스타일 옵션을 클릭하고 생존을 선택합니다.
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Representative Results
요로상피 Piezo1/2 녹아웃 마우스의 배뇨 행동
배뇨 주기의 저장 단계에서 요로상피는 방광에 축적된 소변에 의해 가해지는 긴장을 감지하고 이 기계적 자극을 장막 ATP 방출 1,3과 같은 세포 반응으로 변환한다는 가설이 있습니다. 우리는 이전에 기계적으로 활성화 된 PIEZO1 및 PIEZO2 채널이 마우스 요로 상피 3,36에서 발현된다는 것을 보여주었습니다. 요로상피 PIEZO 채널이 정상적인 배뇨 거동에 중요한지 확인하기 위해 요로상피 조건부 Piezo1/2 이중 녹아웃 마우스(Pz1/2-KO) 마우스와 연령 및 성별 일치 대조군(Pz1/2-C; 그림 9). 우리는 하루 중 어둡고 밝은 단계에서 6시간 동안 암컷과 수컷 마우스를 모두 테스트하고 6.1단계에 설명된 대로 데이터를 분석했습니다. 대조군에 대해 하루의 밝은 단계와 어두운 단계 사이의 배뇨 활동을 비교했을 때, 암컷과 수컷 모두 활동 기간 동안 PVS의 수와 총 부피가 증가한 것으로 나타났습니다. 이 관찰은 마우스가 외부 환경에 있었음에도 불구하고 마우스 배뇨 행동의 일주기 특성(활성 암흑기 동안 가장 높음)이 보존되었음을 나타냅니다. 비활성 광 단계 동안 대조군(Pz1/2-C)과 비교할 때 암컷 또는 수컷 Pz1/2-KO 마우스에 대해 분석된 매개변수에서 유의미한 차이가 관찰되지 않았습니다. 그러나 활성 암흑기 동안 동물을 테스트했을 때 암컷과 수컷 Pz1/2-KO 마우스 모두 SVS의 수와 총 부피가 크게 증가한 것을 특징으로 하는 변경된 배뇨 표현형을 보여주었습니다(그림 9). 해당 대조군과 비교하여 PVS 수, PVS당 평균 부피 또는 여성 또는 남성 Pz1/2-KO의 총 PVS 부피에는 유의미한 차이가 없었습니다. 이러한 결과는 요로상피 PIEZO1/2 채널이 마우스 비활성 광 단계 동안 배뇨 기능에 중요한 역할을 하지 않지만 활성 암기 동안 빈번한 반점을 방지하는 데 중요하다는 것을 나타냅니다.
그림 9에 제시된 결과는 RT-VSA와 엔드포인트 VSA를 사용할 때의 두 가지 이점을 보여줍니다. 첫째, 분석이 빛의 단계에서만 수행되었다면 요로상피 PIEZO1/2 채널이 배뇨 기능에 아무런 역할도 하지 않는다는 잘못된 결론을 내렸을 것입니다. 둘째, 대부분의 종말점 VSA 연구에서 SVS는 실험적 노이즈로 취급되었으며 경우에 따라 후속 분석에서 제외되었습니다23. RT-VSA에서 우리는 SVS가 PVS(이월 또는 배뇨 끝 드리블)에 이차적인 것이 아니라 개별 이벤트이며 동물이 케이지 주변으로 이동하고 배뇨된 다음 떠났다는 의미에서 자발적이라고 판단할 수 있었습니다. 이 관찰은 그렇지 않았다면 놓쳤을 Pz1/2-KO 마우스의 표현형에 대한 귀중한 정보를 제공했습니다.
기저 조건 하에서 그리고 cyclophosphamide 처리 후 암컷 마우스의 배뇨 행동
이 파일럿 실험에서 우리는 시클로포스파미드(CYP)가 쥐의 자발적인 배뇨 행동에 미치는 영향을 테스트했습니다. 일부 형태의 암 또는 면역 장애를 치료하는 데 사용되는 약물인 시클로포스파미드는 환자와 실험 동물에서 방광염을 유발하는 것으로 알려져 있으며, 그 결과 여러 개의 작은 배뇨 사건을 특징으로 하는 과민성 방광 표현형이 발생합니다 26,37,38. 기준선 배뇨 거동을 결정하기 위해 우리는 어두운 단계에서 RT-VSA에 치료되지 않은 암컷 마우스를 배치했습니다. 5일 후 동일한 마우스에 CYP(150mg/kg) 용량을 복강주사하여 급성 방광염을 유발했습니다. 주사 직후, 마우스를 기록을 위해 RT-VSA 케이지에 넣었다. 배뇨 거동은 스텝 플롯(그림 11)으로 표시되며, 수직선은 배뇨된 소변의 양을 나타내고 수평선은 시간을 나타냅니다. 기저 조건에서 얻은 결과와 비교할 때 CYP 치료 후 공극당 방출되는 소변의 양이 더 적고 배뇨 사건이 훨씬 더 빈번하다는 것이 분명합니다. 이것은 그래프의 삽입에서 더 잘 이해할 수 있으며, 분석 된 기간의 처음 30 분 (자정에서 오전 00시 30 분에 해당하고 주입 후 7.0에서 7.5 시간])이 확대됩니다.
그림 1: RT-VSA 레코딩 챔버. (A) RT-VSA 레코딩 시스템은 상부를 포함하며, 상부는 두 개의 나란히 있는 투명 아크릴 챔버 및 관련 상부 카메라로 구성됩니다. 장치의 아래쪽 절반은 상단 마우스 챔버를 고정하고 하단 카메라와 UV 조명을 포함하는 단일 장치 스탠드입니다. 스탠드 벽의 내부는 자외선을 반사하는 거울 패널로 만들어져 케이지 바닥에 균일한 조명을 제공합니다. 카메라로부터 비디오 피드를 수신하고 데이터를 기록하는 컴퓨터는 묘사되지 않습니다. (B) 구성 요소 및 치수가 있는 마우스 챔버의 모델. 1) 표준 리프트 오프 힌지; 2) 카메라 장착 브래킷; 3) 라이트 트랜지션 코너 브래킷. 전면(C) 및 상단(D) view 구성 요소 및 치수가 있는 UV 스탠드. UV 조명은 직선 평판으로 전면 및 후면 프로파일의 내부에 장착됩니다. 32인치 프로파일은 2개의 라이트 트랜지션 코너 브래킷으로 스탠드 메인 프레임에 고정되어 카메라를 장착하는 데 사용됩니다. 직선 평판은 카메라를 32인치 프로파일에 부착하는 데 사용됩니다. 미러 패널은 스탠드 내부에 장착됩니다(표시되지 않음). 1) 5홀 티 평판; 2) 5홀 T 평판; 3) 5홀 L 평판. 표시된 모든 값은 인치 단위입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: RT-VSA 마우스 챔버. 실험 절차에 앞서, 각 실험용 마우스 챔버는 여과지(번호 1)로 라이닝하여 준비합니다. 실험이 수행되는 날의 기간에 따라 사용되는 여과지는 두껍거나(어두운 단계) 얇은(밝은 단계) 중 하나입니다. 플라스틱 돔을 챔버 중앙에 배치하고(2번), 물이 담긴 플라스틱 접시(비습윤수 젤 형태)와 차우를 돔의 한쪽에 배치하고(3번), 농축 형태인 플라스틱 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브를 반대쪽(4번)에 배치합니다. 케이지 내 요소의 초기 배열은 모든 실험에서 일관되게 유지됩니다. 여과지 조각이 인접한 두 케이지 사이에 배치되고 그림에 별표로 표시되어 있습니다. 이는 인접한 마우스에서 발생하는 시각적 신호의 영향을 방지하기 위한 것입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 보정 곡선. 두꺼운(A, 왼쪽 패널) 및 얇은(B, 왼쪽 패널) 여과지의 대표 이미지는 알려진 양의 마우스 소변으로 발견되었습니다. 이미지는 상단(A, 왼쪽 패널) 또는 하단(B, 왼쪽 패널) 카메라를 사용하여 촬영한 비디오 녹화의 스크린샷입니다. 빨간색 화살표는 2μL의 소변 반점을 가리키고 반점 아래의 숫자는 μL 단위의 반점 부피 값입니다. 소변 반점(5분) 직후에 볼 수 있는 패널 A의 상단 이미지에서 작은 소변 반점(<50μL)이 30분(하단 패널) 후에 더 이상 눈에 띄지 않습니다. 오른쪽 패널: 소변량의 함수로 공극 반점 면적(백분율로 표시됨)의 표시(백분율로 표시tage 총 여과지 면적). 다른 사람들에 의해 언급 된 바와 같이, 소변량의 함수로서의 공극 스팟 면적의 데이터는 선형 관계(30)를 따르지 않는다. 따라서 비선형 회귀를 사용하여 데이터를 2차 다항식에 맞춥니다. 데이터는 X = 0에서 Y = 0이 되도록 제한되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: ImageJ를 사용한 여과지 및 소변 반점 영역 측정. (A) ImageJ에서 열린 그림 3A 에 표시된 보정 곡선의 스크린샷. (A)의 박스형 영역은 (B)에 보다 상세히 나타내어 있다. (B) 다각형 선택 아이콘(빨간색 원)을 선택하여 여과지의 둘레를 따라 다각형을 그립니다(부분 보기, 선택 도구에서 생성된 노드를 가리키는 빨간색 화살표가 있는 노란색 선). (C) 다각형의 면적은 여과지의 전체 면적을 반영하며 분석(Analyze) > 측정( 빨간색 원)을 선택하여 측정합니다. (D) 영역 값(픽셀 단위)이 결과 창(빨간색 원)에 나타납니다. (E) 개별 보이드 스폿의 면적을 측정하기 위해 자유형 선택 도구(빨간색 원)를 선택하고 (F)에서 스팟 테두리 주위에 선을 그리는 데 사용합니다(빨간색 화살표는 스폿을 가리킴). (C)에서와 동일한 명령을 사용하여 보이드 스폿의 면적을 측정하고 결과가 결과 창에 마지막으로 측정한 바로 아래에 새 값으로 나타납니다(패널 G, 빨간색 원). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: RT-VSA 실험을 마친 후 여과지 상태 평가. RT-VSA 실험 동안 또는 후에 여과지의 상이한 조건을 보여주는 마우스 챔버의 대표 이미지. 테스트 기간이 끝날 때까지 손상되지 않은 여과지는 (A)에 표시되며 가장 일반적인 상황과 실험을 추가로 분석할 수 있는 조건(녹색 체크 표시)을 나타냅니다. 손상된 여과지의 예는 (B)와 (C)에 나와 있으며 더 이상 분석해서는 안 되는 실험(빨간색 X)을 나타냅니다. (B)에서, 여과지는 모서리 중 하나에서 마우스(빨간색 화살표)에 의해 파쇄되었다. 노란색 점선은 케이지 바닥의 경계를 표시합니다. 오른쪽 이미지에서 박스형 영역이 확대되어 있습니다. (C)에서, 실험의 무결성은 마우스에 의해 모서리로 이동되어 3개의 큰 물 반점(빨간색 별표)을 남긴 결과로 비습윤성 물 겔(빨간색 화살표)이 손상되었습니다. 이러한 움직임은 비디오를 보면서 확인되었습니다. 이미지는 상단 카메라를 사용하여 어두운 단계에서 얻은 동영상 파일의 스크린 샷이며 케이지에 두꺼운 여과지가 늘어서 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 보이드 스폿 영역 측정을 위한 보이드 시간 결정 및 스크린샷 획득. (ᄀ,ᄂ) 방의 한 구석에 있는 쥐의 스크린샷으로, 방금 보이기 시작한 빈 자리가 있습니다. 이 프레임의 시간은 보이드 시간으로 주석이 달려 있습니다. (씨, 디) 보이드 스폿이 최대 확산에 도달하면 보이드의 부피를 결정하기 위해 스크린샷을 찍습니다. 이미지는 두꺼운 여과지를 사용하여 어두운 단계에서 상단 카메라로 얻은 동영상 파일의 스크린 샷입니다. 분석 기간은 자정부터 오전 06:00까지였습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 공극 반점 영역을 소변량으로 변환하고 실험적 원시 데이터가 포함된 워크시트 파일 생성. (A) 전체 여과지 면적의 백분율로 표현된 보이드 스폿 값을 보여주는 그래프 소프트웨어 창의 스크린샷(녹색으로 표시된 데이터). 워크시트(녹색 화살표)는 데이터 테이블 섹션 아래에 저장됩니다. (B) 전체 면적의 백분율을 소변량으로 변환(빨간색으로 표시된 데이터). 후자의 값은 결과 섹션(빨간색 화살표)에 표시되며 표준 곡선 함수에서 미지수를 보간하여 보정 곡선에서 계산됩니다. (C) 컴파일된 원시 및 계산된 데이터가 있는 워크시트의 스크린샷. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8: 공극 스폿을 PVS 및 SVS로 분류하고 분석합니다. 기저 조건(A) 및 시클로포스파미드(150mg/kg) 투여 후 7시간 후 마우스에서 추출한 워크시트(그림 7C와 같이 생성됨)의 스크린샷(B). 공극 반점은 부피가 ≥20μL인 경우 1차 공극 반점(PVS)으로 분류되고 부피가 <20μL인 경우 작은 공극 반점(SVS)으로 분류됩니다. 처리되지 않은 마우스(A)에서 모든 배뇨 사건은 PVS인 반면, 시클로포스파미드 처리된 동물에서는 대부분의 공극이 SVS입니다. 각 패널의 원으로 표시된 표(빨간색 윤곽선)에는 보이드 수, 평균 보이드 볼륨 및 총 보이드 볼륨과 같은 요약 통계가 포함됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 9: Piezo1/2 녹아웃 및 대조군 마우스의 배뇨 거동. 암컷 (A) 및 수컷 (B) Piezo1/2 녹아웃 (Pz1/2-KO) 마우스 및 대조군 상대 (Pz1/2-C)의 배뇨 거동은 낮의 어둡거나 밝은 단계 동안 6시간 동안 기록되었습니다., 6.1단계에 설명된 대로 분석된 결과. 데이터는 평균± 표준 평균 오차(S.E.M.)로 표시됩니다. 데이터는 Mann-Whitney 테스트를 사용하여 비교되었습니다. 약어: PVS = 기본 공극 지점; SVSs = 작은 공극 반점; NS = 유의하지 않음; * p < 0.05; ** p < 0.01. 이 그림은3에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 10: 시간의 함수로 누적 무효화된 부피의 계산 및 그래픽 표현을 위한 워크시트. (A) 시간의 함수로 배뇨된 누적 소변량의 계단 함수 플롯을 생성하는 데 필요한 계산을 표시하는 그림 7C 에서 생성된 워크시트의 스크린샷. 시간은 10진수 형식(G열, 빨간색 사각형)으로 입력해야 합니다. 시간을 10진수 형식으로 변환하기 위해 무효화 시간 열 오른쪽에 3개의 열(빨간색 화살표)을 추가하여 시간(D열), 분(E열) 및 초(F열) 값과 시간의 최종 결과를 10진수 형식(G열)으로 별도로 주석을 달았습니다. 시간 무효화를 10진수 형식으로 변환하려면 (h) + (min/60) + (s/3,600) 함수를 사용합니다. 소변량 컬럼의 오른쪽에 하나의 컬럼을 추가하여 누적 소변량(파란색 직사각형)을 표시했으며, 이는 새로운 배뇨 이벤트(새 이벤트 값 포함)의 시간까지 얻은 모든 소변량(열 J)의 합계로 계산됩니다. (B) 패널 A의 워크시트에서 복사하여 그래프 소프트웨어 프로젝트의 X열(10진수 형식의 시간) 및 Y열(누적 소변량)에 붙여넣은 데이터를 보여주는 스크린샷. 그림의 첫 번째 및 마지막 시점은 빨간색 화살표로 표시된 대로 0 및 6(최대값) 행으로 설정됩니다. (C) 스텝 플롯을 생성하기 위해 그래프는 기호 표시 필드를 선택 해제하고, 연결선/곡선 표시 옵션을 활성화하고, 빨간색으로 둘러싸인 필드에 표시된 대로 생존 스타일을 선택하여 서식을 지정합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 11: 기저 조건 하에서 또는 cyclophosphamide 투여 후 마우스 배뇨 행동의 대표적인 결과. 마우스의 자발적인 배뇨 거동은 대표 결과에 설명된 바와 같이 시클로포스파미드(CYP) 투여 전(기저) 및 7시간 후 암기 동안 RT-VSA에 의해 평가되었습니다. 보이드 이벤트의 시간 및 부피는 단계 6.2에서 설명된 대로 생성된 단계 플롯으로 표시됩니다. 그래프의 삽입은 녹색 직사각형으로 표시된 플롯의 영역을 나타내며 분석된 기간의 처음 30분에 해당합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 12 : RT-VSA에 의한 겹치는 소변 반점 식별. RT-VSA 실험의 어두운 단계에서 상단 카메라로 캡처한 비디오 프레임의 스크린샷(이미지 1 및 2). 이미지 2의 박스 영역은 이미지 3에서 확대됩니다. 마우스는 다음 몇 시간 동안 동일한 오른쪽 상단 모서리에서 두 번 더 비워졌습니다(이미지 4–6). 공극 반점의 겹침에도 불구하고, 개별적인 공극 현상은 RT-VSA를 사용하여 쉽게 감지되었다. 이러한 이벤트가 종말점 분석으로 어떻게 나타나는지 시각화하기 위해 여과지의 모서리를 다양한 조명 조건에 노출시켰습니다. 가시광선 주변광 아래에서는 하나의 큰 공극 지점만 식별할 수 있었습니다(이미지 7). 마찬가지로, 이 동일한 영역을 자외선 하에서 검사한 경우 하나의 어두운 점만 구별할 수 있었습니다(이미지 8). 따라서, 동일한 영역의 다중 보이드는 RT-VSA에 의해 쉽게 검출되지만, 분석이 종말점 분석으로서 수행되는 경우에는 이러한 차별이 불가능하다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
비디오 모니터링의 통합은 기존 VSA에 비해 몇 가지 이점을 제공하는 비용 효율적인 수정입니다. 일반적으로 종말점 분석으로 사용되는 기존 VSA에서는 겹치는 공극 지점을 구별하기가 어렵습니다. 마우스는 일반적으로 케이지 모서리에서 몇 시간 동안 분석이 연장될 때 같은 영역에서 여러 번 소변을 보는 경향이 있기 때문에 이것은 사소한 문제가 아닙니다. 따라서, RT-VSA의 첫 번째 이점은 조사자가 부분적으로 또는 전체적으로 서로의 위에 퇴적된 개별 스팟을 쉽게 식별할 수 있다는 것이다. 이는 도 12에 도시된 실험에 잘 예시되어 있다. 이 경우 비디오 녹화는 마우스가 동일한 모서리에서 세 번 배뇨되어 겹치는 공극 반점을 퇴적하는 것을 확인합니다. VSA의 일반적인 방식으로 실험이 끝날 때만 여과지를 분석하면 한 지점만 구별할 수 있습니다. 따라서 고전적인 엔드포인트 VSA는 보이드 동작의 큰 차이를 식별하는 데 유용할 수 있지만 더 미묘한 표현형을 구별하지 못할 수 있습니다. 현재 유전학의 발전과 형질전환 동물의 생성으로 배뇨 행동을 정확하게 평가할 수 있는 방법의 개발이 필수적입니다.
둘째, RT-VSA는 조사자에게 보이드 이벤트에 대한 시간적 정보를 제공합니다. 따라서 진정한 배뇨 빈도를 결정할 수 있을 뿐만 아니라 배뇨 사건 사이의 관계를 설정할 수 있습니다. 예를 들어, 하나의 큰 PVS 옆에서 SVS 클러스터가 관찰되는 상황에서, 고전적인 VSA에서는 마우스가 실험 중에 여러 번 배뇨 (3 개의 작은 배뇨와 1 개의 큰 배뇨)가 있는지 또는 동물이 하나의 큰 소변 부피를 축적했는지, 그리고 세 개의 작은 반점은 배뇨 후 드리블 또는 모피로부터의 이월의 결과입니다. RT-VSA를 사용하여 이러한 질문을 해결할 수 있습니다.
셋째, RT-VSA를 사용하면 보이드 이벤트 전, 도중 및 후에 마우스의 동작을 분석할 수 있습니다. 조사자는 또한 Mouse Behavior Tracker39와 같은 무료로 이용 가능한 소프트웨어로 RT-VSA 기록을 분석하여 마우스의 전체 활동 프로필을 모니터링할 수 있습니다. 또한 동물이 소변을 보기 위해 멈추는지(암컷의 전형적인 행동), 배뇨 중에 동물이 움직이는지(수컷의 경우 배뇨 반점이 뒤따를 수 있음) 또는 수면/휴식 단계에서 배뇨되는지 여부를 구별할 수 있습니다. 우리는 일반적으로 드물지만 후자의 행동을 관찰했습니다. 따라서 적절하게 검증되고 해석된다면 배뇨 행동을 관찰하면 연구자에게 예를 들어 야뇨증 또는 요실금을 포함한 배뇨 기능 장애에 대한 귀중한 통찰력을 제공할 수 있습니다. RT-VSA(및 VSA)를 통해 조사관은 모서리가 아닌 케이지의 중앙 영역에서 발생하는 공극 이벤트의 비율을 결정할 수 있습니다. 일반적으로, 중앙 배뇨는 드물며, 이러한 사건의 증가는 방광 기능 장애의 징후이다 8,22. 한 가지 예외는 우세한 알파 수컷으로, 소변을 자주 보며 인클로저 전체에 걸쳐 소변을 본다20. RT-VSA를 사용하여 중앙 보이드 분석을 수행하려면 음식 접시를 측벽으로 옮기고 돔을 제거(또는 케이지의 특정 영역에 고정)하여 배뇨의 공간적 패턴을 보다 쉽게 설정할 수 있도록 고려해야 합니다.
넷째, RT-VSA를 사용하면 기존 VSA에 비해 케이지 교환과 관련된 스트레스를보다 효과적으로 관리 할 수 있습니다. 생쥐는 천성적으로 촌스럽기 때문에 생쥐를 다루거나 새로운 환경으로 옮기는 것은 스트레스를 유발하며, 이는 배뇨 행동에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다35. 본질적으로 표준 VSA에 순응 기간을 통합하는 것은 어렵습니다. 대조적으로, RT-VSA에서, 순응 기간은 각 실험에 쉽게 통합될 수 있고, 이 기간 동안의 임의의 공극 이벤트는 분석 중에 무시될 수 있다. 이 프로토콜에 구현된 RT-VSA의 추가적인 스트레스 완화 측면은 마우스가 일반적으로 수용되는 조건(즉, 음식과 물에 대한 접근, 돔 및 장난감)의 복제입니다. 이것은 우리가 아는 한, 이러한 유형의 실험에 대해 설명 된 가장 풍부한 환경 중 하나입니다. 일반적인 종점 VSA에서 마우스는 물(때로는 음식)8,22을 박탈당하며, 이는 우리가 임의로 제공합니다.
다섯째, 이 풍부한 환경이 생쥐의 스트레스 수준에 미칠 수 있는 긍정적인 효과 외에도 조사자가 일반적으로 6시간 창에서 연장된 기간 동안 RT-VSA를 수행할 수 있도록 합니다. 그러나 최근에는 24시간 동안 실행되는 실험을 수행하고 있습니다(데이터는 표시되지 않음). 이것은 일주기 리듬의 효과를 평가할 때 또는 방광 표현형이 저활동적이어서 드물게 소변을 볼 수 있는 마우스를 연구할 때 이상적입니다.
24시간 비디오 모니터링의 경우 얇은 여과지를 사용하고 하단 카메라를 사용하여 실험을 분석하는 것이 좋습니다. 이러한 유형의 용지와 카메라의 조합은 어두운 단계와 밝은 단계에서 감지 감도를 허용하는 최상의 옵션입니다. 앞서 언급했듯이 하단 카메라는 두꺼운 여과지의 공극 지점을 쉽게 감지할 수 없으며 상단 카메라는 조명 단계에서 빈 공간을 안정적으로 감지하지 못합니다. 이러한 확장 분석을 수행하는 경우 05:00 pm에 동물을 기록 케이지에 넣고 1일차 06:00 pm부터 분석하고 다음 날 06:00 p.m.에 실험을 완료하는 것이 좋습니다.
RT-VSA에는 많은 긍정적인 측면이 있지만 주목할 가치가 있는 몇 가지 주의 사항이 있습니다. 우리는 이러한 분석을 수행 할 때 스트레스를 제한하기 위해 모든 노력을 기울이지 만, 동물들은 일반적으로 집단 수용되기 때문에 마우스의 서식지를 완전히 복제 할 수는 없습니다. 그들은 또한 젖지 않는 물 젤에서 물을 얻는 대신 병에서 물을 마신다. 그러나, 생쥐가 비활성 빛 단계에 비해 비활성 암흑기 동안 공극이 더 적다는 우리의 관찰은 생쥐가 일주기 배뇨 행동의 정상적인 패턴을 유지한다는 것을 나타냅니다40. 쉽게 스트레스를 받는 성격을 반영하여, 우리는 쥐가 케이지 청소를 하는 날에 방해가 되는 배뇨 행동을 보인다는 것을 발견했습니다. 따라서 동물이 일상적인 축산의 영향을 덜 받는 기간으로 분석을 제한해야 합니다. 고려해야 할 중요한 요소는 UV 광선이 보이드 기능에 영향을 미치는지 여부입니다. 우리의 연구 결과는 밝은 단계와 어두운 단계 사이의 VSA 매개변수에서 뚜렷한 일주기 차이를 보여주기 때문에 유사한 현상을 설명하지만 UV 광선40을 사용하지 않는 다른 기술과 일치하므로 UV 광선 조명이 공극 기능에 영향을 미치지 않는다는 결론을 내립니다. 여과지는 빛이 하부 챔버에서 상부 챔버로 통과하는 것을 방지합니다.
추가 주의 사항은 마우스를 챔버에 오래 보관할수록 여과지를 씹거나 손상시킬 가능성이 더 높다는 것입니다(종이의 두께에 관계없이). 어떤 동물도 밝은 단계에서 종이를 방해하지 않았지만, 거의 30%의 쥐가 어두운 활동 단계에서 종이를 손상시켰습니다. 24시간 실험의 분석에서 우리는 종이 손상으로 인해 실험의 비슷한 비율(1/3)을 분석할 수 없었으며, 이는 시간뿐만 아니라 하루의 위상도 동물의 파쇄 행동에 영향을 미친다는 것을 의미합니다. 불행하게도, 우리의 경험에 비추어 볼 때, 우리는 새장의 종이를 방해하는 동물이 다시 테스트하더라도 계속 그렇게 할 것이라는 것을 알아 차렸다. 위에서 언급했듯이 생쥐는 때때로 맨 아크릴 바닥에서 소변을 보기 때문에 종이가 손실되면 분석이 불완전하고 가치가 제한됩니다.
또한, 수컷 배뇨 행동의 분석은 더 자주 배뇨하는 경향이 있고, 배뇨 후 드리블을 할 수 있으며, 이전 간행물3에서 논의된 바와 같이 케이지 전체에 분포된 많은 수의 작은 공극을 특징으로 하는 보다 공격적인 알파-남성 표현형을 가진 수컷 집단(20%)이 있기 때문에 더 어려울 수 있습니다. 이 알파-수컷 행동은 배뇨 표현형을 확립하는 교란 요인이 될 수 있으므로 ≥50(밝은 단계 실험) 또는 ≥100(어두운 단계 실험)의 공극이 있는 동물은 분석에서 제외합니다.
부피에 따른 보이드 차별(즉, PVS 대 SVS)이 반드시 보장되는 것은 아닙니다. 예를 들어, 우리의 경험에 비추어 볼 때, 세균성 또는 화학적 방광염을 앓고 있는 쥐는 대조군보다 더 작은 부피를 배출하는 경향이 있다 4,34. 그러나 개별 마우스 간의 빈 부피에는 큰 차이가 있습니다. 일부에서는 대부분의 공극의 부피가 ≤20μL인 반면 다른 공극에서는 대부분이 >20μL입니다. 결과적으로, 배뇨 부피의 차별은 이러한 표현형의 특성화에 어떠한 이점도 제공하지 않습니다.
요컨대, RT-VSA는 자유롭게 움직이는 마우스에서 마우스 배뇨 거동을 분석하기 위한 구현하기 쉬운 도구입니다. 방광 측정법과 같은 도구와 달리 카테터의 외과적 이식이나 비생리학적 방광 충전 속도가 필요하지 않습니다. 그것은 생쥐의 암수 모두에서, 장기간에 걸쳐, 그리고 낮 주기의 밝고 어두운 단계 동안 배뇨 행동을 결정할 수 있게 해줍니다. 또한 특히 대사 케이지와 같은 보다 전문적이고 값비싼 장치와 비교할 때 상대적으로 저렴합니다. 이 도구와 관련된 주의 사항이 있지만 일반적으로 관리하기 쉽습니다. 마지막으로, 이 기술은 다른 설치류를 포함한 다른 동물 종에 쉽게 적용될 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 NIH 보조금 R01DK119183(GA 및 MDC), P30DK079307(MGD)를 통한 파일럿 프로젝트 상, 미국 비뇨기과 협회 경력 개발 상 및 Winters 재단 보조금(NM), 피츠버그 신장 연구 센터(P30DK079307)의 세포 생리학 및 모델 유기체 신장 이미징 코어.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots – cut to 10 inches | 80/20 | 1010 | Amount: 20 |
| 1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots – cut to 12 inches | 80/20 | 1010 | Amount: 6 |
| 1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots – cut to 40 inches | 80/20 | 1010 | Amount: 4 |
| 1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots – cut to 14.75 inches | 80/20 | 1010 | Amount: 12 |
| 1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots – cut to 32 inches | 80/20 | 1010 | Amount: 5 |
| 1/4-20 Double Slide-in Economy T-Nut | 80/20 | 3280 | Amount: 16 |
| 1/4-20 Triple Slide-in Economy T-Nut | 80/20 | 3287 | Amount: 18 |
| 10 & 25 Series 2 Hole - 18mm Slotted Inside Corner Bracket with Dual Support | 80/20 | 14061 | Amount: 6 |
| 10 Series 3 Hole - Straight Flat Plate | 80/20 | 4118 | Amount: 8 |
| 10 Series 5 Hole - "L" Flat Plate | 80/20 | 4081 | Amount: 8 |
| 10 Series 5 Hole - "T" Flat Plate | 80/20 | 4080 | Amount: 8 |
| 10 Series 5 Hole - Tee Flat Plate | 80/20 | 4140 | Amount: 2 |
| 10 Series Standard Lift-Off Hinge - Right Hand Assembly | 80/20 | 2064 | Amount: 2 |
| 10 to 15 Series 2 Hole - Lite Transition Inside Corner Bracket | 80/20 | 4509 | Amount: 6 |
| 24”-long UV tube lights | ADJ Products LLC | T8-F20BLB24 | Amount: 2 20W bulb – 24” Wavelength: 365nm |
| Acrylic Mirror Sheet | Profesional Plastics | Amount: 1 82.5 cm x 26.5 cm |
|
| Acrylic Mirror Sheet | Profesional Plastics | Amount: 2 26.5 cm X 30.5 cm |
|
| Acrylic Mirror Sheet | Profesional Plastics | Amount: 2 82.5 cm x 30.5 cm |
|
| AR polycarbonate (UV resistance) | 80/20 | 65-2641 | Amount: 2 4.5mm Thick, Clear, 38.5 cm x 26.5 cm |
| AR polycarbonate (UV resistance) | 80/20 | 65-2641 | Amount: 4 4.5mm Thick, Clear, 38.5 cm x 21.5 cm |
| AR polycarbonate (UV resistance) | 80/20 | 65-2641 | Amount: 4 4.5mm Thick, Clear, 26.5 cm x 21.5 cm |
| AR polycarbonate (UV resistance) | 80/20 | 65-2641 | Amount: 4 4.5mm Thick, Clear 37.5 cm x 23.9 cm |
| AR polycarbonate (UV resistance) | 80/20 | 65-2641 | Amount: 4 4.5mm Thick, Clear , 24.4 cm x 23.9 cm |
| Chromatography paper (thin paper) | Thermo Fisher Scientific | 57144 | |
| Cosmos blotting paper (thick paper) | Blick Art Materials | 10422-1005 | |
| Excel | Microsoft Corporation | ||
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Version 9.4.0 | graphing and statistics software |
| ImageJ FIJI | NIH | ||
| Parafilm | Merck | transparent film | |
| Quick Time Player 10.5 software | Apple | multimedia player | |
| Security spy | Ben software | video surveillance software system | |
| Standard End Fastener, 1/4-20 | 80/20 | 3381 | Amount: 80 |
| UV transmitting acrylic | Spartech | Polycast Solacryl SUVT | Amount: 2 38.5 cm x 26.5 cm |
| Water gel: HydroGel | ClearH2O | 70-01-5022 | (https://www.clearh2o.com/product/hydrogel/) |
| Webcam | Logitech | C930e | Amount: 4 |
References
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