Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

Анализ пустоты в реальном времени

Published: February 10, 2023 doi: 10.3791/64621
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1,2
1Renal-Electrolyte Division, Department of Medicine, University of Pittsburgh, 2Department of Cell Biology, University of Pittsburgh

Summary

В этой статье описывается новый метод изучения поведения мышей при мочеиспускании путем включения видеомониторинга в обычный анализ пятен пустоты. Этот подход предоставляет временную, пространственную и объемную информацию о событиях мочеиспускания и деталях поведения мышей во время светлых и темных фаз дня.

Abstract

Нормальное мочеиспускание является результатом скоординированной функции мочевого пузыря, уретры и сфинктеров уретры под надлежащим контролем нервной системы. Чтобы изучить поведение произвольного мочеиспускания на мышиных моделях, исследователи разработали анализ пятен пустот (VSA), метод, который измеряет количество и площадь пятен мочи, нанесенных на фильтровальную бумагу, выстилающую пол клетки животного. Несмотря на то, что технически этот анализ прост и недорог, он имеет ограничения при использовании в качестве конечного анализа, включая отсутствие временного разрешения событий мочеиспускания и трудности с количественной оценкой перекрывающихся пятен мочи. Чтобы преодолеть эти ограничения, мы разработали VSA с видеомониторингом, который мы называем VSA В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ (RT-VSA), и который позволяет нам определять частоту мочеиспускания, оценивать объем мочеиспускания и характер мочеиспускания, а также проводить измерения в течение 6-часовых временных окон как в темную, так и в светлую фазы дня. Метод, описанный в этом отчете, может быть применен к широкому спектру исследований на мышах, которые изучают физиологические и нейроповеденческие аспекты произвольного мочеиспускания при состояниях здоровья и болезнях.

Introduction

Хранение мочи и мочеиспускание координируются центральной схемой (центральной нервной системой), которая получает информацию о состоянии наполнения мочевого пузыря через тазовый и подчревный нервы. Уротелий, эпителий, который выстилает мочевыводящие пути от почечной лоханки до проксимального отдела уретры, образует плотный барьер для продуктов метаболизма и патогенов, присутствующих в моче. Это неотъемлемый компонент сенсорной сети, которая ощущает и сообщает о состоянии наполнения мочевого пузыря подлежащим тканям и афферентным нервам 1,2. Нарушение уротелиального барьера или изменения в путях механотрансдукции уротелия могут привести к дисфункции мочеиспускания наряду с симптомами нижних мочевыводящих путей, такими как частота, срочность, никтурия и недержание мочи 3,4,5,6,7. Точно так же известно, что старение, диабет, инфекции нижних мочевыводящих путей, интерстициальный цистит и другие болезненные процессы, которые влияют на мочевой пузырь или связанную с ним схему, контролирующую его функцию, вызывают дисфункцию мочевого пузыря 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17, 18,19. Лучшее понимание нормального и ненормального поведения при мочеиспускании зависит от разработки методов, которые могут надежно различать различные модели мочеиспускания.

Традиционно поведение мышей при произвольном мочеиспускании изучалось с использованием анализа пятен мочеиспускания (VSA), разработанного Дежарденом и его коллегами 20 и получившего широкое распространение благодаря своей простоте, низкой стоимости и неинвазивному подходу 8,21,22,23,24. Этот анализ обычно проводится в виде конечного анализа, при котором мышь проводит определенное количество времени в клетке, выстланной фильтровальной бумагой, которая впоследствии анализируется путем подсчета количества и оценки размера пятен мочи, когда фильтровальная бумага помещается под ультрафиолетовый (УФ) свет (пятна мочи флуоресцируют в этих условиях)20. Несмотря на эти многочисленные преимущества, традиционная VSA имеет некоторые серьезные ограничения. Поскольку мыши часто мочатся в одних и тех же областях, исследователи должны ограничить продолжительность анализа относительно коротким периодом времени (≤4 часа)25. Даже когда VSA выполняется в течение более коротких периодов времени, практически невозможно устранить небольшие пустотные пятна (SVS), которые падают на большие пустоты, или отличить SVS от переноса мочи, прилипшей к хвостам или лапам. Также очень трудно различить, являются ли SVS следствием частых, но индивидуальных событий мочеиспускания (фенотип, который часто наблюдается в ответ на цистит 4,26) или из-за постмиктуриции (фенотип, связанный с обструкцией выходного отверстия мочевого пузыря 27). Кроме того, желание завершить анализ в рабочее время в сочетании с трудностями доступа к жилым помещениям при выключенном свете часто ограничивает эти анализы световым периодом 24-часового циркадного цикла. Таким образом, эти временные ограничения препятствуют оценке поведения мышей во время их активной ночной фазы, уменьшая способность анализировать конкретные гены или методы лечения, которые регулируются циркадными ритмами.

Чтобы преодолеть некоторые из этих ограничений, исследователи разработали альтернативные методы оценки поведения мочеиспускания в режиме реального времени 26,28,29,30,31,32. Некоторые из этих подходов предполагают использование дорогостоящего оборудования, такого как метаболические клетки26,28,29, или использование тепловизионных камер30; Однако у них тоже есть ограничения. Например, в метаболических клетках моча имеет тенденцию прилипать к проводам сетчатого пола и к стенкам воронки, уменьшая количество собираемой и измеряемой мочи. Таким образом, может быть сложно точно собрать данные о небольших пустотах. Кроме того, метаболические клетки не предоставляют информацию о пространственном распределении событий мочеиспускания (т.е. мочеиспускания в углах по сравнению с центром камеры). Учитывая, что длинноволновое инфракрасное излучение, используемое термографическими камерами, не проникает в твердые тела, активность мочеиспускания, оцениваемая с помощью видеотермографии, должна выполняться в открытой системе, что может быть сложно с активными мышами, поскольку они могут подпрыгивать на несколько дюймов в воздухе. Другой системой является автоматизированный подход33 для удаления пятен на бумаге (aVSOP), который состоит из рулонной фильтровальной бумаги, которая с постоянной скоростью наматывается под полом клетки для мыши из проволочной сетки. Такой подход предотвращает повреждение бумаги и наложение пятен мочи, которые происходят при классическом VSA, и его реализация позволяет исследователю проводить эксперименты в течение нескольких дней. Тем не менее, он не дает исследователю точного времени событий мочеиспускания, и нет возможности изучить поведение и то, как оно коррелирует с кровянистыми выделениями. Чтобы получить эту информацию, исследователи включили видеомониторинг в анализы мочеиспускания, подход, который позволяет одновременно оценивать активность мыши и события мочеиспускания31,32. Один из подходов состоит в размещении синего светоизлучающего диода (LED) и видеокамеры с зеленым флуоресцентным белковым фильтром, установленным под экспериментальной клеткой для визуализации событий мочеиспускания, а также инфракрасного светодиода и видеокамеры над клеткой для захвата положениямыши 32. Эта установка использовалась для мониторинга поведения мочеиспускания при выполнении фотометрии волокна; Однако ярко освещенная среда этой системы требовала от исследователей лечения своих мышей мочегонным агентом для стимуляции мочеиспускания. В другом экспериментальном проекте широкоугольные камеры были размещены над и под экспериментальной клеткой для визуализации двигательной активности мыши и событий мочеиспускания соответственно. В этом случае пятна мочи, осевшие на фильтровальной бумаге, выстилающей пол клетки, были выявлены путем освещения фильтровальной бумаги ультрафиолетовыми лучами, помещенными под клетку31. Эта установка использовалась в коротких анализах, продолжительностью 4 минуты, во время световой фазы дня для изучения нейронов ствола мозга, участвующих в произвольном мочеиспускании31. О пригодности этой системы для ее использования во время темновой фазы или в течение периодов времени >4 мин не сообщалось.

В этой статье описан метод, который усиливает традиционный VSA, позволяя осуществлять долгосрочный видеомониторинг поведения мышей при мочеиспускании. Этот экономически эффективный подход предоставляет временную, пространственную и объемную информацию о событиях мочеиспускания в течение длительных периодов времени в течение светлых и темных фаз дня, а также подробности, связанные с поведением мышей 3,4,34. Предоставляется подробная информация о строительстве камер пустотирования, внедрении VSA В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ (RT-VSA) и анализе данных. RT-VSA ценен для исследователей, стремящихся понять физиологические механизмы, контролирующие функцию мочевыделительной системы, разработать фармакологические подходы к контролю мочеиспускания и определить молекулярную основу патологических процессов, влияющих на нижние мочевыводящие пути.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Уротелиальные пьезо1 /2 мыши с двойным нокаутом (Pz1/2-KO, генотип: Piezo1 fl/fl; Пьезо2 фл/фл; Upk2CRE+/-) и контроль (Pz1/2-C, генотип: Piezo1 fl/fl; Пьезо2 фл/фл; Upk2CRE-/-) были получены собственными силами из родительских штаммов, полученных в лабораториях Jax (штамм Piezo1 fl/fl # 029213; Пьезо2 fl/fl штамм # 027720; Штамм Upk2CRE+/- # 029281). В экспериментах использовались как самки (1,5–3 месяца и вес 17–20 г), так и самцы (2–4 месяца и вес 23–29 г) мышей. Для экспериментов по циститу, индуцированному циклофосфамидом, использовали самок C57Bl/6J дикого типа (3 месяца и вес ~20 г) (лаборатории Джексона, штамм #000664). Животные были размещены, а эксперименты проводились в учреждении по уходу за животными Университета Питтсбурга с одобрения Комитета по уходу за животными и их использованию Университета Питтсбурга. Все эксперименты на животных проводились в соответствии с соответствующими руководящими принципами и положениями Политики Службы общественного здравоохранения по гуманному уходу и использованию лабораторных животных и Закона о благополучии животных.

1. Сборка сепараторов для анализа пустотных пятен в реальном времени (RT-VSA)

  1. Установка RT-VSA состоит из УФ-стенда, который вмещает две УФ-лампочки и две широкоугольные камеры (нижние камеры), которые используются для записи активности мочеиспускания во время световой фазы дня. Расположите две камеры для мышей, чтобы они опирались на подставку. Прикрепите широкоугольные камеры (верхние камеры) к крышке каждой камеры мыши, используемые для записи активности мочеиспускания в темную фазу дня (рис. 1A).
  2. Сконструируйте раму УФ-подставки и камер для мыши из алюминиевых профилей с Т-образными пазами размером 1 x 1. В таблице 1 приведен список компонентов, используемых для создания двух камер мыши и УФ-подставки, а на рисунке 1B–D представлены различные виды собранных компонентов и размеров.
  3. Сконструируйте каждую камеру мыши из восьми алюминиевых профилей с Т-образными пазами, разрезанных до 10 дюймов, и четырех, разрезанных до 14,75 дюйма. Начните со сборки нижней части камеры мыши и используйте стандартные торцевые крепления (таблица 1) для сборки профилей с Т-образными пазами в соответствии с рисунком 1. Установите акрил, пропускающий ультрафиолетовое излучение, размером 38,5 см x 26,5 см, во внутреннем канале профилей, чтобы построить пол камер для мыши.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения подробной информации о том, как собрать профили с Т-образными пазами со стандартными торцевыми крепежными элементами, посетите веб-страницу компании.
  4. Соорудите стены мышиной камеры с остальными профилями. Установите панели из износостойкого поликарбоната (AR) размером 38,5 см x 21,5 см и 26,5 см x 21,5 см в профили, чтобы собрать внешние стенки камеры мыши. Используйте панели AR размером 37,5 см x 23,9 см и 24,4 см x 23,9 см для создания внутренней части камеры мыши.
  5. Закрепите панели из поликарбоната AR стандартным торцевым крепежом 1/4-20 протектора. Инструкции по монтажу панелей в профилях на веб-странице см. в ПРИМЕЧАНИИ к шагу 1.3. Используйте коммерческий силиконовый герметик для герметизации стыков между внутренними панелями.
  6. Используйте два профиля с Т-образными пазами 12 дюймов и два профиля с Т-образными пазами 14,75 дюйма, чтобы собрать крышку клетки, как показано на рисунке 1B. Установите панель из поликарбоната AR размером 38,5 см x 26,5 см во внутренний канал профилей, чтобы завершить крышку.
  7. Установите 12-дюймовую опору профиля камеры перпендикулярно длинным осям верхней части сепаратора и закрепите двумя облегченными переходами внутри угловых кронштейнов (отмечен цифрой 3 на рисунке 1B). Используйте прямую плоскую пластину (отмеченную 2) в качестве опоры для крепления веб-камеры и установите ее, как показано на рисунке 1B. Прикрепите камеру к опоре с помощью крепежного винта камеры.
  8. Используйте стандартный правый узел с подъемным шарниром серии 10, чтобы прикрепить крышку к корпусу камеры мыши (отмечен 1 на рисунке 1B).
  9. Сконструируйте УФ-подставку с четырьмя профилями с Т-образными пазами, нарезанными до 40 дюймов, четырьмя профилями с Т-образными пазами, нарезанными до 32 дюймов, и четырьмя профилями с Т-образными пазами, нарезанными до 10 дюймов, в соответствии с рисунком 1C, D. Установите акриловый зеркальный лист размером 82,5 см x 26,5 см в профили, чтобы построить дно УФ-камеры.
  10. Используйте акриловый зеркальный лист размером 82,5 см x 30,5 см и 26,5 см x 30,5 см для создания стены УФ-подставки.
  11. Прикрепите плоские пластины T серии 10 с пятью отверстиями (отмеченные 2 на рисунке 1 C), плоские пластины L серии 10 с пятью отверстиями (отмеченные 3 на рисунке 1 C) и плоские пластины тройника с пятью отверстиями серии 10 (отмеченные 1 на рисунке 1C), чтобы закрепить УФ-подставку.
  12. Установите нижние камеры в профиль с Т-образными пазами, обрезанный до 32 дюймов, и прикрепите их к нижней части подставки с помощью двух облегченных переходных угловых кронштейнов, как показано на рисунке 1D. Используйте прямые плоские пластины, чтобы прикрепить веб-камеры к профилю с Т-образным пазом.
  13. Установите УФ-лампы на внутреннем, переднем и заднем профилях и прикрепите к прямым плоским пластинам, как показано на рисунке 1D.
  14. Подключите четыре веб-камеры к USB-портам компьютера, на котором запущено программное обеспечение для видеонаблюдения.

2. Содержание животных перед экспериментом

  1. Размещайте экспериментальных мышей, специально выведенных или полученных с внешнего участка, группами по четыре человека. Когда это возможно, используйте для этих экспериментов мышей соответствующего возраста или самцов мышей. Если животные получены из внешнего источника, дайте им акклиматизироваться не менее 7 дней, прежде чем проводить какие-либо экспериментальные процедуры.
  2. На протяжении всего времени пребывания на животноводческом объекте размещайте животных в стандартных клетках, содержащих подстилку и обогащение (например, пластиковое иглу, колесо, лист бумаги для измельчения), и держите их в течение 12 часов дневно-ночной цикл с доступом к воде и сухому мышиному корму ad libitum.

3. Записи RT-VSA в светлую и темную фазы дня

ПРИМЕЧАНИЕ: Приведенный ниже протокол описывает использование RT-VSA для оценки поведения мышей при мочеиспускании в светлую и темную фазы дня. Животные содержатся в 12-часовом светлом и 12-часовом темном цикле с временем Цайтгебера (ZT) = 0 в 07:00 утра. Запись начинается с 10:30 до 11:00 (ZT = 3,5–4,0) для экспериментов со светлой фазой и с 18:00 до 18:30 (ZT = 11,0–11,5) для экспериментов в темной фазе. Когда животные тестируются в обоих условиях, эксперименты обычно проводятся в два отдельных дня, по крайней мере, 5 последовательных дней между светлыми и темными тестами. Эксперименты не следует проводить в дни, когда комнаты для животных убираются или клетки меняются, так как это может привести к стрессам, влияющим на поведение при мочеиспускании. Все действия должны выполняться в условиях минимального стресса для мышей.

  1. Транспортируйте подопытных животных из места их содержания в процедурный кабинет, где расположены регистрирующие камеры RT-VSA.
  2. Подготовка записывающей камеры RT-VSA
    1. Поместите лист фильтровальной бумаги (24,3 см x 36,3 см) в нижнюю часть каждой записывающей клетки RT-VSA. В зависимости от времени суток используйте тонкую (эксперименты со светлой фазой) или толстую (эксперименты с темной фазой) фильтровальную бумагу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Плотная фильтровальная бумага используется во время активной темновой фазы, так как она более устойчива к измельчению, чем тонкая фильтровальная бумага. Верхние камеры используются для визуализации пятен мочи, оседающих на плотной фильтровальной бумаге во время темной фазы. Напротив, во время фазы освещения используются нижние камеры, потому что окружающий свет не позволяет верхним камерам обнаруживать пятна мочи, осевшие на фильтровальной бумаге. В этом случае используется тонкая фильтровальная бумага. Мы обнаружили, что нижние камеры неэффективны при обнаружении небольших случаев мочеиспускания, нанесенных на плотную фильтровальную бумагу.
    2. Поверх фильтровальной бумаги поместите следующие предметы: пластиковое иглу (которое обеспечивает спальное место), стерильную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл для обогащения и пластиковую тарелку размером 60 мм x 15 мм, содержащую два или три кусочка мышиного сухого корма и 14–16 г воды в виде гель-пакета (несмачивающийся водный гель; Рисунок 2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Использование микроцентрифужных пробирок объемом 1,5 мл для обогащения было специфическим для корпуса, используемого в этом исследовании.
    3. Как только записывающие камеры будут готовы, аккуратно поместите экспериментальных мышей внутрь, мягко положив их на фильтровальную бумагу. Убедитесь, что перемещение животных из клетки для содержания в клетки для записи происходит с минимальным стрессом.
    4. Как только все подопытные животные окажутся внутри своих записывающих клеток с закрытыми крышками, накройте верхнюю часть крышек абсорбирующей синеспинкой, чтобы свести к минимуму прямые отражения окружающего света на поверхности крышки из плексигласа.
    5. Включите ультрафиолетовую подсветку в нижней камере.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Животные не имеют прямого контакта с ультрафиолетовым светом. Рекомендуемый ультрафиолетовый свет подробно описан в разделе материалов.
  3. Записи RT-VSA
    1. Для записи видео с верхней и нижней камер используйте программное обеспечение для записи видеонаблюдения, которое можно настроить на запись с нескольких веб-камер или сетевых камер одновременно.
    2. Открыв программу, инициируйте запись, нажав Command и R в окне программы. Выполняйте видеозаписи со скоростью 1 кадр в секунду.
    3. Сразу после начала записи выйдите из комнаты, осторожно закрыв дверь. Следите за тем, чтобы в комнате было тихо на протяжении всего эксперимента.
  4. Завершение записи RT-VSA
    1. Вернитесь в процедурный кабинет через 7 ч (эксперименты со светлой фазой) или на следующее утро (эксперименты с темной фазой).
    2. Остановите запись, нажав клавиши Command и T. Выключите ультрафиолетовое излучение.
    3. После остановки записи программа автоматически генерирует видеофайл (в формате .m4v) для каждой камеры и сохраняет его под именем камеры в ранее выбранной папке назначения. Убедитесь, что в каждой папке камеры эксперименты упорядочены по дате.
    4. Убедитесь, что в каждой папке даты или эксперимента есть один файл .m4v и все отдельные файлы .jpeg, соответствующие каждому кадру фильма.
    5. ПРИМЕЧАНИЕ: Файлы .jpeg могут быть использованы для восстановления эксперимента в случае повреждения файлов фильма.
    6. Создайте на рабочем столе папку с названием и датой эксперимента и перенесите в нее все .m4v файлы. При необходимости удалите файлы .jpeg после сохранения и резервного копирования файлов фильмов.
    7. ПРИМЕЧАНИЕ: Для экспериментов со светлой фазой программное обеспечение генерирует один видеоролик на камеру, а для экспериментов с темной фазой оно генерирует два видеоролика для каждой камеры. Это связано с тем, что новый файл .m4v создается после полуночи при изменении даты.
    8. Скопируйте папку, содержащую фильмы, на флэш-накопитель для анализа на внешнем компьютере. Этот шаг может занять несколько минут и может выполняться параллельно с шагами 3.5.1–3.5.3.
  5. Очистка клеток для регистрации и перевод подопытных мышей обратно в место их содержания
    1. Снимите синюю подушку, закрывающую крышки клеток. Переведите животных из клеток записи в клетку для их содержания.
    2. Извлеките аксессуары и пищевые продукты из записывающих камер (например, пластиковые иглу, пластиковые трубки, тарелку с остатками чау-чау и водяного геля, а также фильтровальную бумагу) и утилизируйте их вместе с биологически опасными отходами.
    3. Очистите клетки с помощью ручного пылесоса, удалив гранулы чау-чау и фекалий, присутствующие на дне клетки. Затем опрыскайте пол и внутренние стенки клетки 70% этанолом и очистите внутреннюю часть мягкой тканью. Оставьте крышку клеток открытой, чтобы они высохли на воздухе.
    4. Поместите клетку с животными во вторичный контейнер и перевезите животных обратно к месту их содержания.

4. Генерация калибровочных кривых

ПРИМЕЧАНИЕ: Калибровочная кривая необходима для преобразования областей пустотных пятен в объемы мочи. Если вы проводите эксперименты в светлую и темную фазы дня, то следует сгенерировать две калибровочные кривые, по одной для каждого типа используемой фильтровальной бумаги (тонкая и толстая фильтровальная бумага). Калибровочные кривые формируются в двух экземплярах. Каждая реплика запускается на фильтровальной бумаге, помещенной в записывающую камеру RT-VSA. Учитывая его сложный состав и возбудимость к ультрафиолетовому излучению, используйте мочу мыши для построения калибровочных кривых.

  1. Сбор мочи мышей
    1. Возьмите кусок гибкой прозрачной пленки (10 см х 15 см) и положите его на скамейку.
    2. Возьмите мышь за хвост и почистите ее. Мягко помассируйте нижнюю часть живота, чтобы вызвать мочеиспускание. Соберите мочу на поверхности прозрачной пленки пластикового листа.
    3. Осторожно отпустите животное в клетку. С помощью пипетки перенесите мочу с поверхности прозрачной пленки в стерильную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Повторяйте процедуру с несколькими мышами до тех пор, пока не соберется ~ 10 мл мочи мыши, соберите мочу и храните при -20 ° C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В общей сложности ~ 10 мл мочи мыши требуется для создания дубликатов калибровочных кривых для светлой и темной фаз. Чтобы избежать стресса у экспериментальных мышей, не используйте мышей, которые будут подвергаться экспериментам RT-VSA для сбора мочи.
  2. Запись калибровочной кривой
    1. Разморозьте мочу, собранную на шаге 4.1, и перемешайте ее, осторожно встряхивая в течение 10–15 с.
    2. Поместите кусок тонкой фильтровальной бумаги (24,3 см x 36,3 см) в каждую из двух записывающих клеток RT-VSA.
    3. Пипеткой нанесите следующие объемы мочи (в мкл) на каждую из фильтровальных бумаг: 2, 5, 10, 25, 50, 80, 100, 200, 300, 400, 500 и 750. Чтобы предотвратить перекрытие пятен в результате диффузии, выделяйте пятна на достаточном расстоянии друг от друга.
    4. Закройте клетки крышками и накройте их подушечками.
    5. Начните запись, нажав Command и R, применяя те же параметры программного обеспечения, которые использовались для записи экспериментов (шаг 3.3.).
    6. Зарегистрируйте калибровочную кривую в течение 1 часа, чтобы обеспечить максимальную диффузию пятен мочи. Нажмите Command и T , чтобы остановить запись.
    7. Создайте новую папку на рабочем столе, поместите в нее файлы .m4v, а затем перенесите данные на флешку для последующего анализа.
    8. Выполните аналогичную процедуру для создания повторяющихся кривых с помощью плотной фильтровальной бумаги. В этом случае добавьте дополнительные слои прокладок, чтобы затемнить внутреннюю часть и имитировать условия темной фазы.
  3. Анализ записей калибровочных кривых
    1. Откройте файлы .m4v в программном обеспечении проигрывателя фильмов, развернув окно, чтобы заполнить экран. Для анализа калибровочных кривых, выполненных на плотной фильтровальной бумаге, используйте файлы, полученные с помощью верхних камер (рис. 3A). Для анализа калибровочных кривых, выполненных на тонкой фильтровальной бумаге, используйте файлы, полученные с помощью нижних камер (рис. 3B).
    2. Воспроизведите файл .m4v, перемещая ползунок времени вперед и назад, чтобы просмотреть полный видеоролик калибровочной кривой за 1 час.
    3. Определите временной диапазон, в котором меньшие пятна мочи (<25 мкл) имеют наибольшую интенсивность и максимально распространяются. Сделайте снимок экрана в течение этого периода времени. Назовите файл скриншота и сохраните его как файл .png (рисунок 3A, верхняя панель).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Скриншоты делаются нажатием клавиши F6. Чтобы настроить F6 для получения снимков экрана, выберите: «Системные настройки» > «Сочетания клавиш >» и напишите F6 в поле справа от параметра «Сохранить изображение экрана как файл ».
    4. Определите временной диапазон, в котором средние и большие пятна мочи (>50 мкл) имеют максимальную площадь, и сделайте снимок экрана. Возможно, что некоторые из меньших пятен мочи не будут видны к тому времени, когда большие пятна мочи проявят максимальную диффузию. Назовите файл и сохраните снимок экрана как файл .png (рисунок 3A, нижняя панель).
    5. Откройте программное обеспечение ImageJ (NIH), а затем перетащите значок файла .png, полученный на шаге 4.3.3, чтобы открыть файл изображения (рис. 4A).
    6. На панели инструментов выберите значок «Многоугольные выделения » и очертите границу фильтровальной бумаги.
    7. Затем выберите «Анализировать» в строке меню, выберите «Установить измерения» в развернутом меню и во всплывающем окне выберите «Площадь». Нажмите кнопку ОК. Это позволяет получить значения площади при выполнении шага 4.3.8.
    8. Затем снова выберите « Анализировать » в строке меню и выберите «Измерить » из развернутых параметров. Появится окно результатов, содержащее область столбца, в которой показаны значения области в пикселе2 (рис. 4B–D).
    9. Выберите значок «Выделено от руки » на панели инструментов и используйте его, чтобы нарисовать линию по периметру отдельного пустотного пятна. Измерьте площадь, как показано на шаге 4.3.8. Программное обеспечение обновляет таблицу результатов по мере выполнения новых измерений. Новый набор чисел появится под предыдущими. Запишите число, которое появляется под областью столбца окна результатов для каждого проанализированного пятна (рис. 4E–G).
    10. Повторите шаги с 4.3.5 по 4.3.7 для каждого из реплицируемых точек.
    11. Установите общую площадь фильтровальной бумаги равной 100% и рассчитайте процент площади (% площади) для каждого пятна мочи. Эта нормализация исправит ошибки, которые могут возникнуть из-за различий в масштабировании или расположении камер.
    12. Создайте новую таблицу XY в графической программе и вставьте значения объема мочи (в мкл) в столбец X и повторяющиеся значения % площади в столбец Y.
    13. Затем выберите «Анализ» > « Анализ > анализ XY» > «Нелинейная регрессия (подгонка кривой)». В появившемся окне параметров выберите Модель > Полином > Полином второго порядка (квадратный).
    14. Затем на вкладке метода щелкните, чтобы отметить следующие варианты: « Регрессия наименьших квадратов», « Без взвешивания» и «Рассматривать каждое реплицируемое значение Y как отдельную точку».
    15. На вкладке "Ограничение" выберите " B0", "Тип ограничения" > "Константа, равная" и введите 0 в столбце "Значение ". Нажмите кнопку ОК.

5. Анализ записей экспериментальных мышей

  1. Откройте видеофайл, собранный во время светлой фазы (нижняя камера) или темной фазы (верхняя камера), для анализа.
  2. Оцените качество видеофайла, перемещая прокрутку времени вперед и назад, подтверждая, что фильтровальная бумага остается неповрежденной (без разрывов и пережевывания) в течение 6-часового временного окна, подлежащего анализу. Если бумага порвана, не проводите дальнейший анализ, так как мышь могла помочиться на открытый пластик, который не поддается количественной оценке (рис. 5).
  3. Чтобы проанализировать эксперименты, собранные в светлой или темной фазах, используйте команду перемотки вперед или ползунок временной шкалы, чтобы перейти к нужному временному окну. Активность мочеиспускания во время световой фазы регистрируется между 11:00 и 17:00 (ZT = 4,0–10,0) и во время темной фазы с полуночи до 06:00 утра (ZT = 17,0–23,0).
  4. Воспроизведите фильм в ускоренном режиме перемотки вперед, щелкнув значок >> (или вручную прокрутив фильм) в поисках доказательств того, что мышь опорожняется. Самый простой способ определить, что это происходит, — поискать внезапное появление ярких пятен мочи на фильтровальной бумаге. Другим индикатором является поиск поведенческих изменений, включая движение к углам клетки и короткий период бездействия, когда мышь опорожняется.
    ПРИМЕЧАНИЕ: По мере того, как человек становится лучше обнаруживать пустоты, он может увеличить скорость прокрутки или быстрой перемотки вперед. Однако у мышей с бактериальным и химически индуцированным циститом, которые имеют очень большое количество маленьких пустот 4,34, можно пропустить события мочеиспускания, если слишком быстро перемещаться по фильму.
  5. Зарегистрируйте время, в которое возникает каждая пустота. Как правило, время пустоты регистрируется при первых признаках обнаружения мочи (рис. 6A, B).
  6. Чтобы измерить пустоту, сначала используйте полосу прокрутки, чтобы переместиться вперед (или назад) во времени, ища момент времени, когда произошла максимальная диффузия пятна мочи. На этом этапе поставьте фильм на паузу и сделайте снимок экрана, как описано в шаге 4.3.3. Поместите стрелку компьютерной мыши в анализируемое место так, чтобы на снимке экрана было отмечено интересующее место (рис. 6C, D).
  7. Назовите файл снимка экрана, используя корреляционные числа, чтобы учесть порядок появления в фильме.
  8. Продолжайте анализировать файл, повторяя шаги 5.5 и 5.7 для каждого пустого места в фильме. После того, как все пустоты будут проанализированы, измерьте общую площадь фильтровальной бумаги, сделав снимок экрана и используя шаги, описанные в 4.3.6.
  9. Рассчитайте % площади каждого из пятен мочи, как описано в шаге 4.3.9. Преобразуйте значения % площади в объем мочи (мкл) для каждого пустотного пятна, используя калибровочные кривые, сгенерированные на шаге 4, и функцию интерполяции в графическом программном обеспечении.
    1. В программном обеспечении для построения графиков откройте таблицу XY, содержащую данные калибровочной кривой, и вставьте значения площади % в столбец Y под последним значением калибровочной кривой (рис. 7A).
    2. Перейдите на вкладку «Таблица результатов» и на вкладке «Модель» щелкните, чтобы выбрать «Интерполировать неизвестные» из стандартной кривой, и нажмите «ОК». Вкладка с именем Интерполированные средние значения X отображается рядом с вкладкой таблицы результатов. Эта вкладка содержит таблицу с интерполированными значениями, которые соответствуют объему мочи в мкл для каждого пустотного пятна. (рис. 7 А,Б).
  10. Повторите шаги с 5.1 по 5.9, чтобы проанализировать всех подопытных мышей.
  11. Создайте файл книги, содержащий данные, полученные на шагах с 5.5 по 5.10, используя по одной электронной таблице для каждой мыши (рис. 7C). Создайте один файл для экспериментов со светлой фазой, а другой — для экспериментов с темной фазой. Эти основные файлы содержат все необработанные данные и необходимые расчеты, используемые при дальнейшем анализе.

6. Анализ характера мочеиспускания подопытных мышей

  1. Сгенерируйте первичные и вторичные профили пустотных пятен (рис. 8, A, B и рис. 9).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Согласно исследованиям частотного распределения 23, пустотные пятна размером ≥20 мкл обычно составляют >95% от общего объема пустот и считаются первичными пустотными пятнами (PVS)8,23,35. Пустотные пятна размером ≤20 мкл считаются вторичными или небольшими пустотными пятнами (SVS). Было показано, что различение между PVS и SVS является полезным подходом для характеристики фенотипов мочеиспускания. Повышенное количество SVS указывает на дисфункцию мочеиспускания35.
    1. Из основного файла, содержащего интересующие данные о пятнах мочеиспускания (светлая фаза или темная фаза), классифицируйте пятна в зависимости от их объема как PVS, когда их объем составляет ≥20 мкл, или SVS, когда их объем составляет <20 мкл.
    2. Подсчитайте число и вычислите средний пустой объем и общий объем для PVS. Подсчитайте количество и рассчитайте общий объем для SVS.
    3. Сгенерируйте гистограмму, которая сравнивает контроль с обработанными мышами для каждого из вычисляемых параметров: количество PVS, пустой объем PVS, общий объем PVS, количество SVS, общий объем SVS.
  2. Необязательно: Сгенерируйте график кумулятивного пустотного объема (функция лестницы), чтобы показать поведение пустот с течением времени (рис. 10 и рис . 11).
    1. Откройте главный файл книги и преобразуйте время аннулирования, выраженное в часах, минутах и секундах, в десятичную форму. Рассчитайте кумулятивный объем мочи (в мкл) для каждого момента времени.
    2. Создайте таблицу XY в графическом программном обеспечении со временем в десятичной форме в столбце X и совокупными объемами мочи в столбце Y. Скопируйте данные о времени и объеме мочи в таблицу. Сложите точки данных (0; 0) и (6; максимальное значение). Эти точки необходимы для завершения горизонтальных линий графика в начале эксперимента (время: 0 ч), когда объем опорожнения равен нулю (0; 0), и в конце эксперимента (время: 6 ч), когда кумулятивное значение мочеиспускания равно значению, полученному для последнего события мочеиспускания (6; максимальное значение).
    3. Двойной щелчок по графику; Должно появиться окно Формат графика. Перейдите на вкладку « Внешний вид », щелкните, чтобы снять флажок « Показать символы », и щелкните, чтобы выбрать «Показать соединительную линию/кривую». Нажмите на опцию «Стиль » и выберите «Выживание».

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Мочеиспускание уротелиальных мышей с нокаутом Piezo1/2

Предполагается, что во время фазы накопления цикла мочеиспускания уротелий ощущает напряжение, оказываемое мочой, накопленной в мочевом пузыре, и преобразует этот механический стимул в клеточные реакции, такие как серозное высвобождениеАТФ 1,3. Ранее мы показали, что механически активированные каналы PIEZO1 и PIEZO2 экспрессируются в уротелиимыши 3,36. Чтобы определить, важны ли уротелиальные пьезоканалы для нормального поведения при мочеиспускании, мы провели RT-VSA на мышах с двойным нокаутом Piezo1/2 (Pz1/2-KO) и контрольной группе с одинаковым возрастом и полом (Pz1/2-C; Рисунок 9). Мы тестировали как самок, так и самцов мышей в течение 6 часов в темную и светлую фазы дня и проанализировали данные, как описано в шаге 6.1. Когда мы сравнили активность мочеиспускания между светлой и темной фазами дня для контрольных групп, было замечено, что как у женщин, так и у мужчин наблюдалось увеличение количества и общего объема PVS в течение их активного периода. Это наблюдение указывает на то, что, несмотря на то, что мыши находились в чужеродной среде, циркадный характер поведения мышей при мочеиспускании (самый высокий во время их активной темновой фазы) сохранялся. Во время их неактивной световой фазы мы не наблюдали каких-либо существенных различий ни в одном из параметров, проанализированных для самок или самцов мышей Pz1/2-KO, по сравнению с контрольными аналогами (Pz1/2-C). Однако, когда мы тестировали животных во время активной темновой фазы, как самки, так и самцы мышей Pz1/2-KO показали измененный фенотип мочеиспускания, характеризующийся значительным увеличением количества и общего объема SVS (рис. 9). Не было существенных различий в количестве PVS, среднем объеме на PVS или общем объеме PVS у женщин или мужчин Pz1/2-KO по сравнению с их соответствующими контрольными группами. Эти результаты показывают, что уротелиальные пьезоканалы PIEZO1/2 не играют существенной роли в функции мочеиспускания во время неактивной световой фазы мыши, но важны для предотвращения частых кровянистых выделений во время их активной темновой фазы.

Результаты, представленные на рисунке 9 , иллюстрируют два преимущества использования RT-VSA по сравнению с VSA конечной точки. Во-первых, если бы анализ проводился только во время световой фазы, мы бы неправильно пришли к выводу, что уротелиальные пьезоканалы/2 не играют никакой роли в функции мочеиспускания. Во-вторых, в большинстве исследований конечных точек VSA SVS рассматривались как экспериментальный шум, а в некоторых случаях исключались из последующего анализа23. В RT-VSA мы могли определить, что SVS были индивидуальными событиями, а не вторичными по отношению к PVS (перенос или концевое мочеиспускание) и были добровольными в том смысле, что животные перемещались на периферию клетки, опорожнялись, а затем уходили. Это наблюдение дало нам ценную информацию о фенотипе мышей Pz1/2-KO, которая в противном случае была бы упущена.

Мочеиспускание самок мышей в базальных условиях и после лечения циклофосфамидом

В этом пилотном эксперименте мы проверили влияние циклофосфамида (CYP) на поведение мышей при произвольном мочеиспускании. Известно, что циклофосфамид, препарат, используемый для лечения некоторых форм рака или иммунологических расстройств, вызывает цистит у пациентов и экспериментальных животных, что приводит к гиперактивному фенотипу мочевого пузыря, характеризующемуся множественными небольшими событиями мочеиспускания 26,37,38. Чтобы определить исходное поведение мочеиспускания, мы поместили необработанную самку мыши в RT-VSA во время темной фазы. Той же мыши внутрибрюшинно вводили дозу CYP (150 мг / кг) через 5 дней, чтобы вызвать острый цистит. Сразу после инъекции мышь помещали в клетку RT-VSA для записи. Поведение мочеиспускания представлено в виде ступенчатого графика (рис. 11), где вертикальные линии представляют объем мочеиспускания, а горизонтальные линии представляют время. По сравнению с результатами, полученными в базальных условиях, очевидно, что количество мочи, выделяемой на пустоту, меньше после лечения CYP, и что события мочеиспускания происходят гораздо чаще. Это можно лучше понять на врезке графика, где увеличиваются первые 30 минут анализируемого периода (соответствующие полуночи до 00:30 утра [от 7,0 до 7,5 ч после инъекции]).

Figure 1
Рисунок 1: Записывающая камера RT-VSA. (A) Регистрирующая система RT-VSA включает в себя верхнюю часть, состоящую из двух расположенных рядом прозрачных акриловых камер и связанных с ними верхних камер. Нижняя половина устройства представляет собой единую подставку, которая удерживает верхние камеры мыши и содержит нижние камеры и ультрафиолетовые лучи. Внутренняя часть стенок стенда выполнена из зеркальных панелей, которые отражают ультрафиолетовый свет, чтобы обеспечить равномерное освещение дна клеток. Не изображен компьютер, который получает видеопоток с камер и записывает данные. (B) Модель камеры мыши с компонентами и размерами. 1) стандартный подъемный шарнир; 2) кронштейн крепления камеры; и 3) облегченный переходный угловой кронштейн. Вид спереди (C) и сверху (D) УФ-стенда с компонентами и размерами. Ультрафиолетовые лампы монтируются в интерьере переднего и заднего профилей с прямыми плоскими пластинами. Для крепления камер используется профиль 32 дюйма, прикрепленный к основной раме стенда с помощью двух угловых кронштейнов с облегченным переходом. Прямые плоские пластины используются для крепления камер к 32-дюймовому профилю. Внутри стенда монтируется зеркальная панель (не показана). 1) плоская тройник с пятью отверстиями; 2) Т-образная плоская пластина с пятью отверстиями; и 3) плоские пластины L с пятью отверстиями. Все представленные значения указаны в дюймах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Камера мыши RT-VSA. Перед экспериментальными процедурами каждую экспериментальную камеру для мышей подготавливают, выкладывая ее куском фильтровальной бумаги (пронумерованный 1). В зависимости от периода дня, когда проводится эксперимент, используемая фильтровальная бумага бывает либо толстой (темная фаза), либо тонкой (светлая фаза). В центре камеры помещают пластиковый купол (пронумерованный 2), пластиковую тарелку с водой (в виде несмачивающегося водного геля) и чау-чау помещают с одной стороны купола (номер 3), а пластиковую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл, форму обогащения, помещают на противоположную сторону (пронумеровано 4). Первоначальное расположение элементов в клетке поддерживается неизменным во всех экспериментах. Обратите внимание, что лист фильтровальной бумаги помещен между двумя соседними клетками и отмечен на рисунке звездочкой. Это делается для того, чтобы предотвратить влияние визуальных подсказок, исходящих от соседней мыши. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Калибровочная кривая. Репрезентативные изображения толстой (A, левая панель) и тонкой (B, левая панель) фильтровальной бумаги с известным количеством мышиной мочи. Изображения представляют собой скриншоты видеозаписей, полученных с помощью верхней (А, левая панель) или нижней (Б, левая панель) камер. Красные стрелки указывают на пятна мочи объемом 2 мкл, а числа под пятнами - это значения объема пятна в мкл. Обратите внимание, что небольшие пятна мочи (<50 мкл) на верхнем изображении панели А, которые видны вскоре после пятен мочи (5 минут), больше не заметны через 30 минут (нижняя панель). Правые панели: График площади пустотного пятна (выраженный в процентах от общей площади фильтровальной бумаги) в зависимости от объема мочи. Как отмечают другие, данные о площади пустотного пятна в зависимости от объема мочи не следуют линейной зависимости30. Таким образом, мы подгоняем данные под полином второго порядка с помощью нелинейной регрессии. Данные были ограничены таким образом, что от X = 0 до Y = 0. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Определение участков фильтровальной бумаги и пятен мочи с помощью ImageJ. (A) Скриншот калибровочной кривой, показанной на рисунке 3A , открытый в ImageJ. Область в штучной упаковке в (А) более подробно показана в (В). (B) Выбран значок многоугольника (обведен красным), чтобы нарисовать многоугольник по периметру фильтровальной бумаги (частичный вид; желтая линия с красными стрелками, указывающими на узлы, созданные инструментом выделения). (C) Площадь многоугольника отражает общую площадь фильтровальной бумаги и измеряется путем выбора «Анализировать» > «Измерять » (красный кружок). (D) Значение области (в пикселях) отображается в окне результатов (красный кружок). (E) Чтобы измерить площадь отдельного пустотного пятна, выбирается инструмент выделения от руки (красный круг) и в (F) используется линия вокруг границы пятна (красная стрелка указывает на пятно). С помощью той же команды, что и в (C), измеряется площадь пустотного пятна, при этом результат появляется в виде нового значения в окне результатов, непосредственно под последним проведенным измерением (панель G, красный кружок). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Оценка состояния фильтровальной бумаги после завершения экспериментов RT-VSA. Репрезентативные изображения камеры мыши, показывающие различные условия фильтровальной бумаги во время или после эксперимента RT-VSA. Фильтровальная бумага, которая оставалась нетронутой до конца периода тестирования, показана в (A) и представляет собой наиболее распространенную ситуацию и условие, при котором эксперимент может быть дополнительно проанализирован (зеленая галочка). Примеры поврежденной фильтровальной бумаги показаны в (B) и (C) и являются репрезентативными для экспериментов, которые не должны подвергаться дальнейшему анализу (красный X). В (B) фильтровальная бумага была измельчена мышью (красная стрелка) в одном из углов. Пунктирной желтой линией обозначена граница пола клетки. Область в рамке увеличена на изображении справа. В (C) целостность эксперимента была нарушена в результате того, что не смачивающий водяной гель (красная стрелка) был перемещен мышью в угол, оставив три больших водяных пятна (красные звездочки). Эти перемещения были подтверждены просмотром видео. Изображения представляют собой скриншоты из видеофайлов, полученных во время темной фазы, с помощью верхней камеры и с клеткой, выстланной плотной фильтровальной бумагой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6: Определение времени пустоты и получение скриншотов для измерений площади пустотного пятна. (А,Б) Скриншот мыши в углу камеры, с пустым пятном, которое только что стало видимым. Время этого кадра аннотировано как время аннулирования. (С,Д) Как только пустота достигает максимальной диффузии, делается снимок экрана, чтобы определить объем пустоты. Изображения представляют собой скриншоты из видеофайлов, полученных с помощью верхней камеры, с использованием плотной фильтровальной бумаги и в темной фазе. Период анализа был с полуночи до 06:00 утра. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 7
Рисунок 7: Преобразование площади пустотного пятна в объем мочи и создание файла рабочего листа с экспериментальными исходными данными. (A) Скриншот окна программного обеспечения для построения графиков, показывающий значения пустот, выраженные в процентах от общей площади фильтровальной бумаги (данные выделены зеленым цветом). Лист (зеленая стрелка) сохраняется в разделе таблиц данных. (B) Пересчет процентной доли общей площади в объем мочи (данные выделены красным цветом). Последние значения показаны в разделе результатов (красная стрелка) и вычисляются на основе калибровочной кривой с использованием интерполяции неизвестных из стандартной функции кривой. (C) Снимок экрана рабочего листа со скомпилированными необработанными и вычисленными данными. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 8
Рисунок 8: Классификация пустотных пятен на ПВС и СВС и их анализ. Скриншоты рабочих листов (сгенерированных, как показано на рисунке 7C) у мыши в базальных условиях (A) и через 7 часов после получения дозы циклофосфамида (150 мг / кг) (B). Пустотные пятна классифицируются как первичные пустотные пятна (PVS), если объем составляет ≥20 мкл, или как небольшие пустотные пятна (SVS), если объем составляет <20 мкл. Обратите внимание, что у необработанной мыши (A) все события мочеиспускания являются PVS, в то время как у животного, обработанного циклофосфамидом, большинство пустот являются SVS. Обведенная кружком таблица на каждой панели (красный контур) содержит следующую сводную статистику: количество пустот, средний пустотный объем и общий пустотный объем. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 9
Рисунок 9: Поведение при мочеиспускании у нокаутирующих и контрольных мышей Piezo1/2. Поведение мочеиспускания самок (A) и самцов (B) мышей с нокаутом Piezo1/2 (Pz1/2-KO) и контрольных аналогов (Pz1/2-C) было зарегистрировано в течение 6-часового временного окна во время темной или светлой фазы дня, и результаты были проанализированы, как описано на шаге 6.1. Данные показаны как среднее ± стандартная ошибка среднего (S.E.M.). Данные сравнивались с помощью теста Манна-Уитни. Сокращения: PVS = первичные пустоты; SVS = небольшие пустоты; NS = не значимый; * p < 0,05; ** < 0,01. Эта цифра была изменена с3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 10
Рисунок 10: Рабочие листы для расчета и графического представления кумулятивного пустотного объема в зависимости от времени. (A) Скриншот рабочего листа, сгенерированного на рисунке 7C , на котором показаны расчеты, необходимые для построения графика лестничной функции кумулятивного объема мочи, опорожненной в зависимости от времени. Время должно быть введено в десятичном формате (столбец G, красный квадрат). Для преобразования времени в десятичный формат справа от столбца времени аннулирования были добавлены три столбца (красные стрелки) для раздельного аннотирования значений часов (столбец D), минут (столбец E) и секунд (столбец F), а также окончательный результат времени в десятичном формате (столбец G). Чтобы преобразовать пустоту времени в десятичный формат, используйте следующую функцию: (h) + (min/60) + (s/3,600). Один столбец был добавлен справа от столбца объема мочи для отображения совокупного объема мочи (синий прямоугольник), который рассчитывается как сумма всех объемов мочи (столбец J), полученных до момента нового события мочеиспускания (включая новое значение события). (B) Снимок экрана, показывающий данные, скопированные с листа на панели A и вставленные в столбец X (время в десятичном формате) и столбец Y (совокупные объемы мочи) в графическом программном проекте. Первая и последняя точки времени графика устанавливаются в строки 0 и 6 (максимальное значение), как показано красными стрелками. (C) Для создания пошагового графика график форматируется путем отмены выбора поля «Показать символы», включения параметра «Показать соединительную линию/кривую» и выбора стиля выживания, как показано в полях, обведенных красным цветом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 11
Рисунок 11: Репрезентативные результаты мочеиспускания мышей в базальных условиях или после введения циклофосфамида. Произвольное мочеиспускание мыши оценивалось методом RT-VSA во время темновой фазы до (базальной) и через 7 ч после введения циклофосфамида (CYP), как описано в репрезентативных результатах. Время и объем событий пустоты представлены в виде пошагового графика, который был сгенерирован, как описано на шаге 6.2. Вставка графика представляет собой площадь графика, отмеченную зеленым прямоугольником, и соответствует первым 30 минутам анализируемого периода. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 12
Рисунок 12: Идентификация перекрывающихся пятен мочи с помощью RT-VSA. Скриншоты видеокадров, снятых верхней камерой в темной фазе эксперимента RT-VSA (изображения 1 и 2). Область в коробке на рисунке 2 увеличена на рисунке 3. Мышь опорожнялась в том же правом верхнем углу еще два раза в течение следующих нескольких часов (изображения 4–6). Несмотря на перекрытие пустотных пятен, отдельные случаи мочеиспускания были легко обнаружены с помощью RT-VSA. Чтобы визуализировать, как эти события будут выглядеть в качестве анализа конечной точки, мы подвергли угол фильтровальной бумаги различным условиям освещения. При видимом окружающем освещении можно было идентифицировать только одно большое пустотное пятно (рис. 7). Точно так же, если эта же область была исследована под ультрафиолетовым светом, было различимо только одно темное пятно (рис. 8). Таким образом, множественные пустоты в одной и той же области легко обнаруживаются с помощью RT-VSA, но такая дискриминация невозможна, если анализ выполняется в качестве конечного анализа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Включение видеонаблюдения является экономически эффективной модификацией, которая имеет ряд преимуществ по сравнению с классическим VSA. В классическом VSA, который обычно используется в качестве анализа конечной точки, трудно различить перекрывающиеся пустоты. Это нетривиальная проблема, так как мыши, как правило, мочатся несколько раз в одной и той же области, когда анализ длится несколько часов, как правило, в углах клетки. Таким образом, первое преимущество RT-VSA заключается в том, что исследователь может легко идентифицировать отдельные пятна, которые были частично или полностью наложены друг на друга. Это хорошо проиллюстрировано в эксперименте, показанном на рисунке 12. В этом случае видеозапись подтверждает, что мышь трижды опорожнялась в одном и том же углу, откладывая перекрывающиеся пустотные пятна. Если бы фильтровальная бумага анализировалась только в конце эксперимента, как это типично для VSA, можно было бы различить только одно пятно. Таким образом, в то время как классическая конечная VSA может быть полезна для выявления больших различий в поведении мочеиспускания, она может не различать более тонкие фенотипы. С текущими достижениями в области генетики и создания трансгенных животных разработка методов, которые могут точно оценить поведение при мочеиспускании, имеет важное значение.

Во-вторых, RT-VSA предоставляет исследователю временную информацию о событиях мочеиспускания. Таким образом, можно определить истинные частоты мочеиспускания, а также установить взаимосвязи между событиями мочеиспускания. Например, в ситуации, когда кластер SVS наблюдается рядом с одним большим PVS, в классическом VSA нельзя легко различить, опорожнялась ли мышь несколько раз во время эксперимента (с тремя маленькими и одной большой пустотой) или если животное отложило один большой объем мочи, а три меньших пятна являются результатом пост-мочеиспускания или переноса с меха. RT-VSA может быть использован для решения этих вопросов.

В-третьих, RT-VSA позволяет анализировать поведение мыши до, во время и после события мочеиспускания. Исследователь также может отслеживать общий профиль активности мыши, анализируя записи RT-VSA с помощью свободно доступного программного обеспечения, такого как Mouse Behavior Tracker39. Кроме того, можно различать, останавливается ли животное для мочеиспускания (типичное поведение самок), находится ли животное в движении во время мочеиспускания (что у самцов может привести к образованию пустотных пятен) или опорожняется ли оно во время фазы сна / отдыха. Мы наблюдали последнее поведение, хотя обычно оно встречается редко. Таким образом, при правильной проверке и интерпретации наблюдение за поведением мочеиспускания может дать исследователю ценную информацию о дисфункции мочеиспускания, включая, например, никтурию или недержание мочи. RT-VSA (и VSA) позволяет исследователям определить долю пустотных событий, которые происходят в центральной области клетки, а не в углах. В норме центральное мочеиспускание встречается редко, и повышенное количество таких событий является признаком дисфункции мочевого пузыря 8,22. Единственным исключением являются доминантные альфа-самцы, которые мочатся часто и по всей территории своих вольеров20. Чтобы выполнить анализ центрального мочеиспускания с использованием RT-VSA, следует рассмотреть возможность перемещения миски с едой к боковой стенке и удаления купола (или закрепления его в определенной области клетки), чтобы можно было легче установить пространственные паттерны мочеиспускания.

В-четвертых, RT-VSA позволяет более эффективно управлять напряжениями, связанными с сепараторным обменом, по сравнению с классическим VSA. Мыши пугливы по своей природе, и обращение с ними или перенос их в новую среду вызывает стресс, который, как известно, влияет на поведение при мочеиспускании35. По своей природе трудно включить период акклиматизации в стандартный VSA. Напротив, в RT-VSA период акклиматизации может быть легко включен в каждый эксперимент, и любые события мочеиспускания в течение этого периода не учитываются во время анализа. Дополнительным аспектом снятия стресса RT-VSA, реализованным в этом протоколе, является дублирование условий, в которых обычно содержатся мыши (т. е. доступ к пище и воде ad libitum, куполу и игрушке). Насколько нам известно, это одна из самых богатых сред, описанных для такого рода экспериментов. В типичной конечной точке VSA мыши лишены воды (а иногда и пищи)8,22, которую мы предоставляем ad libitum.

В-пятых, в дополнение к положительному влиянию, которое эта обогащенная среда может оказывать на уровень стресса мышей, она позволяет исследователю выполнять RT-VSA в течение длительных периодов времени, обычно в течение 6 часов; Однако совсем недавно мы проводили эксперименты, которые длились 24 часа (данные не показаны). Это идеально подходит при оценке эффектов циркадной ритмичности или при изучении мышей, которые могут проявлять недостаточный фенотип мочевого пузыря и, следовательно, мочиться нечасто.

Для 24-часового видеомониторинга мы рекомендуем использовать тонкую фильтровальную бумагу и анализировать эксперименты с помощью нижних камер. Эта комбинация типа бумаги и камеры является лучшим вариантом, который обеспечивает чувствительность обнаружения в темной и светлой фазах. Как упоминалось ранее, нижние камеры не могут легко обнаружить пустоты на плотной фильтровальной бумаге, а верхние камеры не могут надежно обнаружить пустоты во время световой фазы. При выполнении этих расширенных анализов мы предлагаем поместить животных в клетки для записи в 17:00, проанализировать с 18:00 1-го дня и завершить эксперимент в 18:00 следующего дня.

Хотя RT-VSA имеет много положительных аспектов, есть некоторые предостережения, на которые стоит обратить внимание. Несмотря на то, что мы делаем все возможное, чтобы ограничить стресс при выполнении этих анализов, мы не можем полностью воспроизвести среду обитания мыши, поскольку животные обычно размещаются в группах. Они также пьют воду из бутылки вместо того, чтобы получать воду из несмачивающего водного геля. Тем не менее, наше наблюдение о том, что у мышей меньше пустот во время их неактивной световой фазы по сравнению с их активной темновой фазой, указывает нам на то, что мыши сохраняют свои нормальные паттерны циркадного поведения при мочеиспускании40. Отражая их легко подверженный стрессу характер, мы обнаружили, что мыши проявляют нарушенное мочеиспускание в дни уборки клетки. Таким образом, следует ограничить анализ периодами времени, когда животные будут меньше подвержены влиянию рутинного животноводства. Важным фактором, который следует учитывать, является то, влияет ли ультрафиолетовый свет на функцию мочеиспускания. Поскольку наши результаты показывают отчетливую циркадную разницу в параметрах VSA между светлой и темной фазами, которые согласуются с другими методами, которые описывают подобное явление, но не используют ультрафиолетовый свет40, мы пришли к выводу, что освещение ультрафиолетовым светом не влияет на функцию мочеиспускания. Обратите внимание, что фильтровальная бумага препятствует прохождению света из нижней камеры в верхнюю.

Дополнительное предостережение заключается в том, что чем дольше держать мышей в камере, тем больше вероятность того, что они будут жевать или повреждать фильтровальную бумагу (независимо от толщины бумаги). В то время как ни одно из животных не повредило бумагу во время световой фазы, почти 30% мышей повредили бумагу во время темной активной фазы. При анализе 24-часовых экспериментов мы заметили, что аналогичная доля (одна треть) экспериментов не может быть проанализирована из-за повреждения бумаги, а это означает, что не только количество времени, но и фаза дня влияет на поведение животного при измельчении. К сожалению, по нашему опыту мы заметили, что животное, которое нарушает работу клетки, будет продолжать делать это даже после повторного тестирования. Как отмечалось выше, мыши иногда мочатся на голый акриловый пол, и, таким образом, потеря бумаги делает анализ неполным и имеет ограниченную ценность.

Кроме того, анализ поведения самцов при мочеиспускании может быть более сложным, поскольку они, как правило, опорожняются чаще, они могут мочиться после мочеиспускания, и существует популяция самцов (20%) с более агрессивным фенотипом альфа-самца, характеризующимся большим количеством небольших пустот, которые распределены по клетке, как обсуждалось в более ранней публикации3. Поскольку такое поведение альфа-самца может представлять собой сбивающий с толку фактор для установления фенотипов мочеиспускания, мы исключаем из анализа животных с пустотами ≥50 (эксперименты в светлой фазе) или ≥100 (эксперименты с темной фазой).

Существуют ситуации, в которых различение пустот по их объему (например, PVS против SVS) не обязательно оправдано. Например, по нашему опыту, мыши с бактериальным или химическим циститом, как правило, опорожняют меньшие объемы, чем контрольная группа 4,34. Тем не менее, существуют большие различия в объеме пустоты между отдельными мышами; в некоторых из них большинство пустот имеют объем ≤20 мкл, в то время как в других большинство составляет >20 мкл. Следовательно, дискриминация пустого объема не дает никаких преимуществ для характеристики этих фенотипов.

В целом, RT-VSA — это простой в реализации инструмент для анализа поведения мышей при мочеиспускании у свободно подвижных мышей. В отличие от таких инструментов, как цистометрия, он не требует хирургической имплантации катетера или нефизиологичных темпов наполнения мочевого пузыря. Это позволяет определять мочеиспускание у мышей обоих полов в течение длительных периодов времени, а также во время светлых и темных фаз дневного цикла. Это также относительно доступно, особенно по сравнению с более специализированными и дорогими устройствами, такими как метаболические клетки. Хотя есть предостережения, связанные с этим инструментом, они, как правило, просты в управлении. Наконец, этот метод может быть легко адаптирован к другим видам животных, включая других грызунов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам раскрывать нечего.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана грантом NIH R01DK119183 (для G.A. и M.D.C.), наградой за пилотный проект через P30DK079307 (для M.G.D.), премией Американской ассоциации урологов за развитие карьеры и грантом Фонда Уинтерса (для Нью-Мексико), а также от Cell Physiology and Model Organisms Kidney Imaging Cores Питтсбургского центра исследований почек (P30DK079307).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots –  cut to 10 inches 80/20 1010 Amount: 20
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots –  cut to 12 inches 80/20 1010 Amount: 6
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots –  cut to 40 inches 80/20 1010 Amount: 4
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots – cut to 14.75 inches 80/20 1010 Amount: 12
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots – cut to 32 inches 80/20 1010 Amount: 5
1/4-20 Double Slide-in Economy T-Nut 80/20 3280 Amount: 16
1/4-20 Triple Slide-in Economy T-Nut 80/20 3287 Amount: 18
10 & 25 Series 2 Hole - 18mm Slotted Inside Corner Bracket with Dual Support 80/20 14061 Amount: 6
10 Series 3 Hole - Straight Flat Plate 80/20 4118 Amount: 8
10 Series 5 Hole - "L" Flat Plate 80/20 4081 Amount: 8
10 Series 5 Hole - "T" Flat Plate 80/20 4080 Amount: 8
10 Series 5 Hole - Tee Flat Plate 80/20 4140 Amount: 2
10 Series Standard Lift-Off Hinge - Right Hand Assembly 80/20 2064 Amount: 2
10 to 15 Series 2 Hole - Lite Transition Inside Corner Bracket 80/20 4509 Amount: 6
24”-long UV tube lights ADJ Products LLC T8-F20BLB24 Amount: 2
20W bulb – 24” Wavelength: 365nm
Acrylic Mirror Sheet Profesional Plastics Amount: 1
82.5 cm x 26.5 cm
Acrylic Mirror Sheet Profesional Plastics Amount: 2
26.5 cm X 30.5 cm
Acrylic Mirror Sheet Profesional Plastics Amount: 2
82.5 cm x 30.5 cm
AR polycarbonate (UV resistance) 80/20 65-2641 Amount: 2
4.5mm Thick, Clear, 38.5 cm x 26.5 cm
AR polycarbonate (UV resistance) 80/20 65-2641 Amount: 4
4.5mm Thick, Clear, 38.5 cm x 21.5 cm
AR polycarbonate (UV resistance) 80/20 65-2641 Amount: 4
4.5mm Thick, Clear, 26.5 cm x 21.5 cm
AR polycarbonate (UV resistance) 80/20 65-2641 Amount: 4
4.5mm Thick, Clear 37.5 cm x 23.9 cm
AR polycarbonate (UV resistance) 80/20 65-2641 Amount: 4
4.5mm Thick, Clear , 24.4 cm x 23.9 cm
Chromatography paper (thin paper)  Thermo Fisher Scientific 57144
Cosmos blotting paper (thick paper) Blick Art Materials 10422-1005
Excel Microsoft Corporation
GraphPad Prism GraphPad Software Version 9.4.0 graphing and statistics software
ImageJ FIJI NIH
Parafilm Merck transparent film
Quick Time Player 10.5 software  Apple multimedia player
Security spy Ben software video surveillance software system
Standard End Fastener, 1/4-20 80/20 3381 Amount: 80
UV transmitting acrylic Spartech Polycast Solacryl SUVT Amount: 2
38.5 cm x 26.5 cm 
Water gel: HydroGel ClearH2O   70-01-5022 (https://www.clearh2o.com/product/hydrogel/)
Webcam Logitech C930e Amount: 4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. The urothelium: life in a liquid environment. Physiological Reviews. 100 (4), 1621 (2020).
  2. de Groat, W. C., Griffiths, D., Yoshimura, N. Neural control of the lower urinary tract. Comprehensive Physiology. 5 (1), 327 (2015).
  3. Dalghi, M. G., et al. Functional roles for PIEZO1 and PIEZO2 in urothelial mechanotransduction and lower urinary tract interoception. JCI Insight. 6 (19), (2021).
  4. Montalbetti, N., et al. Bladder infection with uropathogenic Escherichia coli increases the excitability of afferent neurons. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 322 (1), 1 (2022).
  5. Montalbetti, N., et al. Increased urothelial paracellular transport promotes cystitis. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 309 (12), 1070 (2015).
  6. Montalbetti, N., et al. Urothelial tight junction barrier dysfunction sensitizes bladder afferents. eNeuro. 4 (3), (2017).
  7. Montalbetti, N., Stocker, S. D., Apodaca, G., Bastacky, S. I., Carattino, M. D. Urinary K+ promotes irritative voiding symptoms and pain in the face of urothelial barrier dysfunction. Scientific Reports. 9 (1), 5509 (2019).
  8. Kim, A. K., Hamadani, C., Zeidel, M. L., Hill, W. G. Urological complications of obesity and diabetes in males and females of three mouse models: temporal manifestations. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 318 (1), 160 (2020).
  9. Bartolone, S. N., et al. Micturition defects and altered bladder function in the klotho mutant mouse model of aging. American Journal of Clinical and Experimental Urology. 8 (3), (2020).
  10. de Rijk, M. M., et al. Aging-associated changes in oxidative stress negatively impacts the urinary bladder urothelium. International Neurourology Journal. 26 (2), 111 (2022).
  11. Coyne, K. S., et al. The prevalence of lower urinary tract symptoms (LUTS) and overactive bladder (OAB) by racial/ethnic group and age: results from OAB-POLL. Neurourology and Urodynamics. 32 (3), 230 (2013).
  12. Wittig, L., Carlson, K. V., Andrews, J. M., Crump, R. T., Baverstock, R. J. Diabetic bladder dysfunction: a review. Urology. 123, (2019).
  13. Irwin, D. E., et al. Population-based survey of urinary incontinence, overactive bladder, and other lower urinary tract symptoms in five countries: results of the EPIC study. European Urology. 50 (6), 1314 (2006).
  14. Bogart, L. M., Berry, S. H., Clemens, J. Q. Symptoms of interstitial cystitis, painful bladder syndrome and similar diseases in women: a systematic review. The Journal of Urology. 177 (2), 450 (2007).
  15. Foxman, B. Urinary tract infection syndromes: occurrence, recurrence, bacteriology, risk factors, and disease burden. Infectious Disease Clinics of North America. 28 (1), 1 (2014).
  16. Fall, M., Logadottir, Y., Peeker, R. Interstitial cystitis is bladder pain syndrome with Hunner's lesion. International Journal of Urology. 21, 79 (2014).
  17. Birder, L. A. Urinary bladder, cystitis and nerve/urothelial interactions. Autonomic Neuroscience: Basic & Clinical. 182, 89 (2014).
  18. Rosen, J. M., Klumpp, D. J. Mechanisms of pain from urinary tract infection. International Journal of Urology. 21 Suppl. 1, 26 (2014).
  19. Birder, L., et al. Neural control of the lower urinary tract: peripheral and spinal mechanisms. Neurourology and Urodynamics. 29 (1), 128 (2010).
  20. Desjardins, C., Maruniak, J. A., Bronson, F. H. Social rank in house mice: differentiation revealed by ultraviolet visualization of urinary marking patterns. Science. 182 (4115), 939 (1973).
  21. Sugino, Y., et al. Voided stain on paper method for analysis of mouse urination. Neurourology and Urodynamics. 27 (6), 548 (2008).
  22. Hill, W. G., Zeidel, M. L., Bjorling, D. E., Vezina, C. M. Void spot assay: recommendations on the use of a simple micturition assay for mice. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 315 (5), (2018).
  23. Rajandram, R., et al. Intact urothelial barrier function in a mouse model of ketamine-induced voiding dysfunction. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 310 (9), (2016).
  24. Ruetten, H., et al. A uropathogenic E. coli UTI89 model of prostatic inflammation and collagen accumulation for use in studying aberrant collagen production in the prostate. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 320 (1), 31 (2021).
  25. Wegner, K. A., et al. Void spot assay procedural optimization and software for rapid and objective quantification of rodent voiding function, including overlapping urine spots. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 315 (4), (2018).
  26. Wood, R., Eichel, L., Messing, E. M., Schwarz, E. Automated noninvasive measurement of cyclophosphamide-induced changes in murine voiding frequency and volume. The Journal of Urology. 165 (2), 653 (2001).
  27. Dmochowski, R. R. Bladder outlet obstruction: etiology and evaluation. Reviews in Urology. 7 (Suppl 6), S3–S13. , (2005).
  28. Aizawa, N., Homma, Y., Igawa, Y. Influence of high fat diet feeding for 20 weeks on lower urinary tract function in mice. Lower Urinary Tract Symptoms. 5 (2), 101 (2013).
  29. Wang, Z., et al. Void sorcerer: an open source, open access framework for mouse uroflowmetry. American Journal of Clinical and Experimental Urology. 7 (3), 170 (2019).
  30. Verstegen, A. M., Tish, M. M., Szczepanik, L. P., Zeidel, M. L., Geerling, J. C. Micturition video thermography in awake, behaving mice. Journal of Neuroscience Methods. 331, 108449 (2020).
  31. Keller, J. A., et al. Voluntary urination control by brainstem neurons that relax the urethral sphincter. Nature Neuroscience. 21 (9), (2018).
  32. Hou, X. H., et al. Central control circuit for context-dependent micturition. Cell. 167 (1), 73 (2016).
  33. Negoro, H., et al. Involvement of urinary bladder Connexin43 and the circadian clock in coordination of diurnal micturition rhythm. Nature Communication. 3, (2012).
  34. Montalbetti, N., Carattino, M. D. Acid-sensing ion channels modulate bladder nociception. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 321 (5), (2021).
  35. Chen, H., Zhang, L., Hill, W. G., Yu, W. Evaluating the voiding spot assay in mice: a simple method with complex environmental interactions. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 313 (6), (2017).
  36. Dalghi, M. G., et al. Expression and distribution of PIEZO1 in the mouse urinary tract. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 317 (2), 303 (2019).
  37. Birder, L., Andersson, K. E. Animal modelling of interstitial cystitis/bladder pain syndrome. International Neurourology Journal. 22, (2018).
  38. Okinami, T., et al. Altered detrusor gap junction communications induce storage symptoms in bladder inflammation: a mouse cyclophosphamide-induced model of cystitis. PLoS One. 9 (8), (2014).
  39. Tungtur, S. K., Nishimune, N., Radel, J., Nishimune, H. Mouse Behavior Tracker: An economical method for tracking behavior in home cages. Biotechniques. 63 (5), (2017).
  40. Negoro, H., Kanematsu, A., Yoshimura, K., Ogawa, O. Chronobiology of micturition: putative role of the circadian clock. The Journal of Urology. 190 (3), (2013).

Tags

Ретракция выпуск 192 Анализ пятен мочевого пузыря мочевой пузырь функция мочеиспускания мочеиспускание цистометрия
Анализ пустоты в реальном времени
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dalghi, M. G., Montalbetti, N.,… More

Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Wheeler, T. B., Apodaca, G., Carattino, M. D. Real-Time Void Spot Assay. J. Vis. Exp. (192), e64621, doi:10.3791/64621 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter