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Ensayo de punto vacío en tiempo real

Published: February 10, 2023 doi: 10.3791/64621
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1,2
1Renal-Electrolyte Division, Department of Medicine, University of Pittsburgh, 2Department of Cell Biology, University of Pittsburgh

Summary

Este artículo describe un nuevo método para estudiar el comportamiento de micción del ratón mediante la incorporación de la supervisión de vídeo en el ensayo convencional de micción de la micción. Este enfoque proporciona información temporal, espacial y volumétrica sobre los eventos de micción y detalles del comportamiento del mouse durante las fases de luz y oscuridad del día.

Abstract

El comportamiento miccional normal es el resultado de la función coordinada de la vejiga, la uretra y los esfínteres uretrales bajo el control adecuado del sistema nervioso. Para estudiar el comportamiento de micción voluntaria en modelos de ratón, los investigadores han desarrollado el ensayo de punto vacío (VSA), un método que mide el número y el área de manchas de orina depositadas en un papel de filtro que recubre el piso de la jaula de un animal. Aunque técnicamente simple y barato, este ensayo tiene limitaciones cuando se usa como un ensayo de punto final, incluida la falta de resolución temporal de los eventos miccionales y las dificultades para cuantificar las manchas de orina superpuestas. Para superar estas limitaciones, desarrollamos un VSA monitoreado por video, que llamamos VSA EN TIEMPO REAL (RT-VSA), y que nos permite determinar la frecuencia de micción, evaluar el volumen vaciado y los patrones de micción, y realizar mediciones durante las ventanas de tiempo de 6 h durante las fases oscura y clara del día. El método descrito en este informe se puede aplicar a una amplia variedad de estudios basados en ratones que exploran los aspectos fisiológicos y neuroconductuales de la micción voluntaria en estados de salud y enfermedad.

Introduction

El almacenamiento de orina y la micción están coordinados por un circuito central (sistema nervioso central) que recibe información sobre el estado de llenado de la vejiga a través de los nervios pélvico e hipogástrico. El urotelio, el epitelio que recubre el tracto urinario desde la pelvis renal hasta la uretra proximal, forma una barrera estrecha contra los productos de desecho metabólicos y patógenos presentes en la orina. Es un componente integral de una red sensorial, que detecta y comunica el estado de llenado de la vejiga a los tejidos subyacentes y nervios aferentes 1,2. La ruptura de la barrera urotelial, o alteraciones en las vías de mecanotransducción urotelial, puede conducir a una disfunción miccional junto con síntomas del tracto urinario inferior como frecuencia, urgencia, nicturia e incontinencia 3,4,5,6,7. Del mismo modo, se sabe que el envejecimiento, la diabetes, las infecciones del tracto urinario inferior, la cistitis intersticial y otros procesos de enfermedades que afectan la vejiga urinaria, o el circuito asociado que controla su función, causan disfunción de la vejiga 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17, 18,19. Una mejor comprensión del comportamiento miccional normal y anormal depende del desarrollo de métodos que puedan discriminar de manera confiable entre diferentes patrones de micción.

Tradicionalmente, el comportamiento de micción voluntaria de ratones ha sido estudiado utilizando el ensayo de punto vacío (VSA), desarrollado por Desjardins y colegas 20, y ampliamente adoptado debido a su simplicidad, bajo costo y enfoque no invasivo 8,21,22,23,24. Este ensayo se realiza típicamente como un ensayo de punto final, en el que un ratón pasa una cantidad definida de tiempo en una jaula forrada por un papel de filtro, que posteriormente se analiza contando el número y evaluando el tamaño de las manchas de orina cuando el papel de filtro se coloca bajo luz ultravioleta (UV) (las manchas de orina fluorescen en estas condiciones)20. A pesar de estas muchas ventajas, el VSA tradicional presenta algunas limitaciones importantes. Debido a que los ratones a menudo orinan en las mismas áreas, los investigadores tienen que restringir la duración del ensayo a un período de tiempo relativamente corto (≤4 h)25. Incluso cuando el VSA se realiza durante períodos de tiempo más cortos, es casi imposible resolver pequeños puntos vacíos (SVS) que caen sobre grandes puntos vacíos o discriminar SVS del arrastre de orina adherida a colas o patas. También es muy difícil distinguir si las SVS son consecuencia de eventos miccionales frecuentes pero individuales (fenotipo que a menudo se observa en respuesta a la cistitis 4,26), o debido al goteo postmiccional (fenotipo asociado a la obstrucción de la salida de la vejiga 27). Además, el deseo de completar el ensayo durante las horas de trabajo, junto con las dificultades para acceder a las instalaciones de vivienda cuando se apagan las luces, a menudo limita estos ensayos al período de luz del ciclo circadiano de 24 h. Por lo tanto, estas limitaciones de tiempo impiden la evaluación del comportamiento miccional del ratón durante su fase nocturna activa, disminuyendo la capacidad de analizar genes específicos o tratamientos que se rigen por ritmos circadianos.

Para superar algunas de estas limitaciones, los investigadores han desarrollado métodos alternativos para evaluar el comportamiento miccional en tiempo real 26,28,29,30,31,32. Algunos de estos enfoques implican el uso de equipos costosos como jaulas metabólicas26,28,29, o el uso de cámaras térmicas30; Sin embargo, estos también tienen limitaciones. Por ejemplo, en las jaulas metabólicas, la orina tiende a adherirse a los cables del piso de malla y a las paredes del embudo, reduciendo la cantidad de orina que se recolecta y se mide. Por lo tanto, puede ser difícil recopilar con precisión datos sobre pequeños vacíos. Además, las jaulas metabólicas no proporcionan información sobre la distribución espacial de los eventos miccionales (es decir, micción en las esquinas frente al centro de la cámara). Dado que la radiación infrarroja de longitud de onda larga utilizada por las cámaras termográficas no penetra en los sólidos, la actividad miccional evaluada por termografía de video debe realizarse en un sistema abierto, lo que puede ser un desafío con ratones activos, ya que pueden saltar varias pulgadas en el aire. Otro sistema es el enfoque automatizado de tinción en papel (aVSOP)33, que consiste en papel de filtro enrollado que se enrolla a una velocidad constante debajo del piso de malla de alambre de una jaula para ratones. Este enfoque evita el daño del papel y la superposición de manchas de orina que ocurren en el VSA clásico, y su implementación permite al investigador realizar experimentos durante varios días. Sin embargo, no proporciona al investigador el momento preciso de los eventos de micción, y no hay capacidad para examinar el comportamiento y cómo se correlaciona con la detección. Para obtener esta información, los investigadores han incorporado la videomonitorización a los ensayos de micción, un enfoque que permite la evaluación simultánea de la actividad del ratón y los eventos de micción31,32. Un enfoque consiste en colocar un diodo emisor de luz azul (LED) y una cámara de video con un filtro de proteína de fluorescencia verde colocado debajo de la jaula experimental para visualizar los eventos de micción, y un LED infrarrojo y una cámara de video sobre la jaula para capturar la posición32 del ratón. Esta configuración se ha utilizado para monitorear el comportamiento de micción mientras se realiza la fotometría de fibra; Sin embargo, el ambiente brillantemente iluminado de este sistema requirió que los investigadores trataran a sus ratones con un agente diurético para estimular la micción. En otro diseño experimental, se colocaron cámaras gran angular por encima y por debajo de la jaula experimental para visualizar la actividad motora del ratón y los eventos de micción, respectivamente. En este caso, las manchas de orina depositadas en un papel de filtro que recubre el piso de la jaula se revelaron iluminando el papel de filtro con luces UV colocadas debajo de la jaula31. Esta configuración fue utilizada en ensayos cortos, de 4 min de duración, durante la fase ligera del día para estudiar las neuronas del tronco encefálico involucradas en el comportamiento de micción voluntaria31. No se informó la idoneidad de este sistema para su uso durante la fase oscura o por períodos de tiempo >4 min.

En este artículo, se describe un método que mejora el VSA tradicional al permitir el monitoreo de video a largo plazo del comportamiento de vaciado del mouse. Este enfoque rentable proporciona información temporal, espacial y volumétrica sobre eventos miccionales durante largos períodos de tiempo durante las fases de luz y oscuridad del día, junto con detalles relacionados con el comportamiento del ratón 3,4,34. Se proporciona información detallada para la construcción de las cámaras de vaciación, la implementación de un VSA EN TIEMPO REAL (RT-VSA) y el análisis de los datos. El RT-VSA es valioso para los investigadores que buscan comprender los mecanismos fisiológicos que controlan la función del sistema urinario, desarrollar enfoques farmacológicos para controlar la micción y definir las bases moleculares de los procesos de enfermedad que afectan el tracto urinario inferior.

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Protocol

Ratones Piezo1 /2 uroteliales de doble knockout (Pz1/2-KO, genotipo: Piezo1 fl/fl; Piezo2 fl/fl; Upk2CRE+/-) y controles (Pz1/2-C, genotipo: Piezo1 fl/fl; Piezo2 fl/fl; Upk2CRE-/-) se generaron internamente a partir de cepas parentales obtenidas de los laboratorios Jax (cepa Piezo1 fl/fl # 029213; Piezo2 fl/fl cepa # 027720; Upk2CRE+/- cepa # 029281). Tanto ratones hembra (1,5-3 meses de edad y 17-20 g de peso) como machos (2-4 meses de edad y 23-29 g de peso) se utilizaron en los experimentos. Para experimentos de cistitis inducida por ciclofosfamida, se utilizaron hembras C57Bl/6J de tipo salvaje (3 meses de edad y ~20 g de peso) (los laboratorios de Jackson, cepa # 000664). Los animales fueron alojados y los experimentos se realizaron en el Centro de Cuidado de Animales de la Universidad de Pittsburgh bajo la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Pittsburgh. Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices y reglamentos pertinentes de la Política del Servicio de Salud Pública sobre el Cuidado Humanitario y el Uso de Animales de Laboratorio y la Ley de Bienestar Animal.

1. Montaje de jaulas para ensayo de punto vacío en tiempo real (RT-VSA)

  1. El equipo RT-VSA consiste en un soporte UV que contiene dos bombillas UV y dos cámaras gran angular (cámaras inferiores), que se utilizan para registrar la actividad miccional durante la fase de luz del día. Coloque dos cámaras para ratones para que descansen en el soporte. Conecte cámaras gran angular (cámaras superiores) a la tapa de cada cámara del ratón, utilizadas para registrar la actividad miccional durante la fase oscura del día (Figura 1A).
  2. Construya el marco del soporte UV y las cámaras del ratón de 1 en x 1 en perfiles de aluminio ranurados en T. Consulte la Tabla 1 para obtener una lista de los componentes utilizados para construir dos cámaras para ratones y el soporte UV y la Figura 1B-D para obtener las diferentes vistas de los componentes y dimensiones ensamblados.
  3. Construya cada cámara de ratón con ocho perfiles de aluminio ranurados en T cortados a 10 pulgadas y cuatro cortados a 14.75 pulgadas. Comience ensamblando la parte inferior de la cámara del ratón y utilice sujetadores de extremo estándar (Tabla 1) para ensamblar los perfiles ranurados en T de acuerdo con la Figura 1. Monte el 38,5 cm x 26,5 cm UV transmitiendo acrílico en el canal interno de los perfiles para construir el suelo de las cámaras del ratón.
    NOTA: Para obtener información detallada sobre cómo ensamblar los perfiles ranurados en T con sujetadores de extremo estándar, visite la página web de la compañía.
  4. Construye las paredes de la cámara del ratón con el resto de perfiles. Monte los paneles de policarbonato de 38,5 cm x 21,5 cm y 26,5 cm x 21,5 cm resistentes a la abrasión (AR) en los perfiles para ensamblar las paredes externas de la cámara del ratón. Utilice los paneles de policarbonato AR de 37,5 cm x 23,9 cm y 24,4 cm x 23,9 cm para construir el interior de la cámara del ratón.
  5. Asegure los paneles de policarbonato AR con un cierre final estándar de 1/4-20 de la banda de rodadura. Consulte las instrucciones de cómo montar los paneles en los perfiles de la página web en la NOTA del paso 1.3. Use masilla de silicona comercial para sellar las uniones entre los paneles internos.
  6. Utilice dos perfiles ranurados en T de 12 pulgadas y dos de 14,75 pulgadas para montar la tapa de la jaula como se indica en la Figura 1B. Monte un panel de policarbonato AR de 38,5 cm x 26,5 cm en el canal interno de los perfiles para completar la tapa.
  7. Monte el soporte del perfil de cámara de 12 pulgadas perpendicular a los ejes largos de la parte superior del armazón y asegúrelo con dos soportes de esquina interiores de transición ligera (marcados 3 en la Figura 1B). Utilice una placa plana recta (marcada con 2) como soporte de montaje de la cámara web y móntela como se muestra en la Figura 1B. Acople la cámara al soporte con el tornillo de montaje de la cámara.
  8. Utilice el conjunto de bisagra de despegue estándar de la serie 10 para fijar la tapa al cuerpo de la cámara del ratón (marcado 1 en la figura 1B).
  9. Construya el soporte UV con cuatro perfiles ranurados en T cortados a 40 pulgadas, cuatro perfiles ranurados en T cortados a 32 pulgadas y cuatro perfiles ranurados en T cortados a 10 pulgadas, de acuerdo con la Figura 1C, D. Monte una lámina de espejo acrílico de 82,5 cm x 26,5 cm en los perfiles para construir la parte inferior de la cámara UV.
  10. Utilice la lámina de espejo acrílico de 82,5 cm x 30,5 cm y 26,5 cm x 30,5 cm para construir la pared del soporte UV.
  11. Coloque las placas planas T de cinco orificios de la serie 10 (marcadas 2 en la Figura 1 C), las placas planas L de cinco orificios de la serie 10 (marcadas 3 en la Figura 1 C) y las placas planas en T de cinco orificios de la serie 10 (marcadas 1 en la Figura 1 C) para asegurar el soporte UV.
  12. Monte las cámaras inferiores en un perfil ranurado en T cortado a 32 pulgadas y colóquelo en la parte inferior del soporte con dos soportes de esquina de transición lite como se muestra en la Figura 1D. Utilice placas planas rectas para conectar las cámaras web al perfil ranurado en T.
  13. Monte las lámparas UV en el interior, el frente y los perfiles traseros, y conéctelas a las placas planas rectas como se muestra en la Figura 1D.
  14. Conecte las cuatro cámaras web a los puertos USB de un ordenador que ejecute un software de videovigilancia.

2. Alojamiento de animales antes de la experimentación

  1. Ratones experimentales domésticos, ya sea criados específicamente u obtenidos de un sitio externo, en grupos de cuatro. Cuando sea posible, use ratones hembra o machos de la misma edad para estos experimentos. Si los animales se obtienen de una fuente externa, permítales aclimatarse durante al menos 7 días antes de realizar cualquier procedimiento experimental.
  2. A lo largo de su tiempo en el animalario, aloje a los animales en jaulas estándar que contengan ropa de cama y enriquecimiento (por ejemplo, iglú de plástico, rueda, pedazo de papel para triturar) y manténgalos bajo un ciclo de día / noche de 12 h, con acceso a agua y comida seca de ratón ad libitum.

3. Grabaciones RT-VSA durante las fases de luz y oscuridad del día

NOTA: El siguiente protocolo describe el uso de RT-VSA para evaluar el comportamiento de vaciado del ratón durante las fases de luz y oscuridad del día. Los animales se mantienen en un ciclo de luz de 12 h y 12 h de oscuridad con tiempo Zeitgeber (ZT) = 0 a las 07:00 a.m. Las grabaciones comienzan entre las 10:30 a.m. y las 11:00 a.m. (ZT = 3.5–4.0) para los experimentos de fase de luz y entre las 06:00 p.m. y las 06:30 p.m. (ZT = 11.0–11.5) para los experimentos de fase oscura. Cuando los animales se prueban en ambas condiciones, los experimentos se realizan típicamente en dos días separados, con al menos 5 días consecutivos entre las pruebas de luz y oscuridad. Los experimentos no deben realizarse en los días en que se limpian las habitaciones de los animales o se cambian las jaulas, ya que esto puede provocar tensiones que afectan el comportamiento miccional. Todos los pasos deben realizarse en condiciones de estrés mínimo para los ratones.

  1. Transporte a los animales experimentales desde su ubicación de alojamiento hasta la sala de procedimientos donde se encuentran las cámaras de grabación RT-VSA.
  2. Preparación de la cámara de grabación RT-VSA
    1. Coloque un trozo de papel de filtro (24,3 cm x 36,3 cm) en la parte inferior de cada jaula de grabación RT-VSA. Dependiendo de la hora del día, use papel de filtro delgado (experimentos de fase clara) o grueso (experimentos de fase oscura).
      NOTA: El papel de filtro grueso se utiliza durante la fase oscura activa, ya que es más resistente a la trituración que el papel de filtro delgado. Las cámaras superiores se utilizan para visualizar las manchas de orina depositadas en papel de filtro grueso durante la fase oscura. Por el contrario, durante la fase de luz, se utilizan las cámaras inferiores porque la luz ambiental evita que las cámaras superiores detecten manchas de orina depositadas en el papel de filtro. En este caso, se utiliza papel de filtro delgado. Descubrimos que las cámaras inferiores son ineficaces para detectar pequeños eventos miccionales depositados en papel de filtro grueso.
    2. Encima del papel de filtro, coloque los siguientes artículos: un iglú de plástico (que permite un espacio para dormir), un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 ml para enriquecimiento y un plato de plástico de 60 mm x 15 mm que contenga dos o tres piezas de comida seca para ratones y 14-16 g de agua en forma de un paquete de gel (gel de agua no humedeciente; Figura 2).
      NOTA: El uso de tubos de microcentrífuga de 1,5 ml para fines de enriquecimiento fue específico para el recinto utilizado en este estudio.
    3. Una vez que las cámaras de grabación estén listas, coloque suavemente los ratones experimentales dentro colocándolos suavemente sobre el papel de filtro. Asegúrese de que la transferencia de los animales de la jaula de alojamiento a las jaulas de registro se produce con un estrés mínimo.
    4. Una vez que todos los animales de experimentación estén dentro de sus jaulas de grabación, con sus tapas cerradas, cubra la parte superior de las tapas con un panel azul absorbente para minimizar los reflejos directos de la luz ambiental en la superficie de la tapa de plexiglás.
    5. Encienda las luces UV en la cámara inferior.
      NOTA: Los animales no tienen contacto directo con la luz UV. La luz UV recomendada se detalla en la sección de materiales.
  3. Grabaciones RT-VSA
    1. Para grabar vídeo desde las cámaras superior e inferior, utilice un software de grabación de videovigilancia, que se puede configurar para grabar desde varias cámaras web o cámaras en red a la vez.
    2. Al abrir el programa, inicie la grabación presionando Comando y R en la ventana del programa. Realice grabaciones de vídeo a una velocidad de 1 fotograma por s.
    3. Inmediatamente después de iniciar las grabaciones, salga de la habitación y cierre la puerta suavemente. Asegúrese de que la habitación permanezca en silencio durante toda la duración del experimento.
  4. Finalizar grabaciones RT-VSA
    1. Regrese a la sala de procedimientos después de 7 h (experimentos de fase clara) o a la mañana siguiente (experimentos de fase oscura).
    2. Detenga las grabaciones presionando Comando y T. Apague las luces UV.
    3. Después de detener la grabación, el software genera automáticamente un archivo de película (en formato .m4v) para cada cámara y lo guarda bajo el nombre de la cámara en una carpeta de destino previamente seleccionada. Verifique que, dentro de cada carpeta de la cámara, los experimentos estén organizados en carpetas por fecha.
    4. En cada carpeta de fecha o experimento, compruebe que hay un archivo .m4v y todos los archivos de .jpeg individuales que corresponden a cada uno de los fotogramas de película.
    5. NOTA: Los archivos .jpeg se pueden utilizar para recuperar el experimento en caso de que los archivos de película se dañen.
    6. Cree una carpeta en el escritorio con el nombre y la fecha del experimento y transfiera todos los archivos .m4v a esta carpeta. Si es necesario, elimine los archivos .jpeg una vez que los archivos de película estén guardados y respaldados.
    7. NOTA: Para los experimentos de fase de luz, el software generará una película por cámara, mientras que para los experimentos de fase oscura, generará dos películas para cada cámara. Esto se debe a que se genera un nuevo archivo .m4v después de la medianoche cuando cambia la fecha.
    8. Copie la carpeta que contiene las películas en una unidad flash para analizarla en un equipo externo. Este paso puede tardar varios minutos y se puede realizar en paralelo a los pasos 3.5.1 a 3.5.3.
  5. Limpieza de jaulas de grabación y traslado de ratones experimentales a su ubicación de alojamiento
    1. Retire la almohadilla azul que cubre las tapas de las jaulas. Transfiera los animales de las jaulas de registro a su jaula de alojamiento.
    2. Retire los accesorios y alimentos en las cámaras de grabación (es decir, iglús de plástico, tubos de plástico, plato con restos de comida y gel de agua, y papel de filtro) y deséchelos en desechos biopeligrosos.
    3. Limpie las jaulas con una aspiradora de mano, eliminando la comida y los gránulos fecales presentes en el fondo de la jaula. Luego, rocíe el piso y las paredes internas de la jaula con etanol al 70% y limpie el interior con un trozo de paño suave. Deje la tapa de las jaulas abierta para que se sequen al aire.
    4. Coloque la jaula de alojamiento con los animales en un contenedor secundario y transporte a los animales de regreso a su ubicación de alojamiento.

4. Generación de curvas de calibración

NOTA: Se necesita una curva de calibración para convertir las áreas de manchas vacías en volúmenes de orina. Si se realizan experimentos durante las fases de luz y oscuridad del día, se deben generar dos curvas de calibración, una para cada tipo de papel de filtro utilizado (papeles de filtro finos y gruesos). Las curvas de calibración se generan por duplicado. Cada réplica se ejecuta en un papel de filtro colocado en una cámara de grabación RT-VSA. Dada su compleja composición y excitabilidad UV, use orina de ratón para hacer las curvas de calibración.

  1. Recolección de orina de ratón
    1. Tome un trozo de película transparente flexible (10 cm x 15 cm) y colóquelo en un banco.
    2. Elige un ratón por su cola y fruffínalo. Masajear suavemente la parte inferior del abdomen para inducir la micción. Recoja la orina en la superficie de la lámina de plástico de película transparente.
    3. Suelte al animal suavemente dentro de su jaula. Con una pipeta, transfiera la orina de la superficie de la película transparente a un tubo estéril de microcentrífuga de 1,5 ml. Repita el procedimiento con varios ratones hasta que se recojan ~ 10 ml de orina de ratón, acumule la orina y guárdela a -20 ° C.
      NOTA: Se requiere un total de ~ 10 ml de orina de ratón para generar curvas de calibración duplicadas para las fases clara y oscura. Para evitar estresar a los ratones experimentales, no use ratones que serán sometidos a experimentos RT-VSA para la recolección de orina.
  2. Registros de curvas de calibración
    1. Descongele la orina recogida en el paso 4.1 y mézclela con un vórtice suave durante 10-15 s.
    2. Coloque un trozo de papel de filtro delgado (24,3 cm x 36,3 cm) en cada una de las dos jaulas de grabación RT-VSA.
    3. Pipetear los siguientes volúmenes de orina (en μL) en cada uno de los papeles de filtro: 2, 5, 10, 25, 50, 80, 100, 200, 300, 400, 500 y 750. Para evitar la superposición de puntos como resultado de la difusión, asigne los puntos a una distancia suficiente entre sí.
    4. Cierre la tapa de las jaulas y cúbralas con almohadillas.
    5. Comience a grabar presionando Comando y R, aplicando los mismos parámetros de software utilizados para grabar los experimentos (paso 3.3.).
    6. Registre la curva de calibración durante 1 h para permitir la máxima difusión de las manchas de orina. Presione Comando y T para detener la grabación.
    7. Cree una nueva carpeta en el escritorio, coloque los archivos .m4v en ella y, a continuación, transfiera los datos a una unidad flash para su posterior análisis.
    8. Realice un procedimiento similar para generar curvas duplicadas con papel de filtro grueso. En este caso, agregue capas adicionales de almohadillas para oscurecer el interior y simular las condiciones de fase oscura.
  3. Análisis de los registros de la curva de calibración
    1. Abra los archivos .m4v en un software de reproductor de películas, maximizando la ventana para llenar la pantalla. Para analizar las curvas de calibración realizadas en papel de filtro grueso, utilice los archivos obtenidos con las cámaras superiores (Figura 3A). Para analizar las curvas de calibración realizadas en papel de filtro fino, utilice los archivos obtenidos con las cámaras inferiores (Figura 3B).
    2. Reproduzca el archivo .m4v, moviendo el control deslizante de tiempo hacia adelante y hacia atrás para obtener una visión general de la película completa de la curva de calibración de 1 h.
    3. Identifique el rango de tiempo donde las manchas de orina más pequeñas (<25 μL) tienen la mayor intensidad y se han diseminado al máximo. Tome una captura de pantalla dentro de este rango de tiempo. Asigne un nombre al archivo de captura de pantalla y guárdelo como un archivo .png (Figura 3A, panel superior).
      NOTA: Las capturas de pantalla se toman presionando la tecla F6. Para configurar F6 para la adquisición de capturas de pantalla, seleccione: Preferencias del sistema > Atajos de teclado > y escriba F6 en el cuadro que se encuentra a la derecha de la opción Guardar imagen de pantalla como archivo .
    4. Identifique el rango de tiempo donde las manchas de orina medianas y grandes (>50 μL) tienen un área máxima y tome una captura de pantalla. Es posible que algunas de las manchas de orina más pequeñas no sean visibles para cuando las manchas de orina más grandes exhiban una difusión máxima. Asigne un nombre al archivo y guarde la captura de pantalla como un archivo .png (Figura 3A, panel inferior).
    5. Abra el software ImageJ (NIH) y, a continuación, arrastre y suelte el icono de archivo .png obtenido en el paso 4.3.3 para abrir el archivo de imagen (Figura 4A).
    6. En la barra de herramientas, seleccione el icono Selecciones de polígono y delinee el borde del papel de filtro.
    7. Luego, seleccione Analizar en la barra de menús, elija Establecer medidas en el menú expandido y, en la ventana que aparece, seleccione Área. Haga clic en Aceptar. Esto permite obtener valores de área cuando se realiza el paso 4.3.8.
    8. A continuación, seleccione Analizar de nuevo en la barra de menús y elija Medir en las opciones expandidas. Aparece una ventana de resultados que contiene un área de columna que muestra los valores de área en el píxel2 (Figura 4B-D).
    9. Seleccione el icono Selecciones a mano alzada de la barra de herramientas y utilícelo para dibujar una línea alrededor del perímetro de un punto vacío individual. Mida el área como en el paso 4.3.8. El software actualiza la tabla de resultados a medida que se realizan nuevas mediciones. El nuevo conjunto de números aparece debajo de los anteriores. Registre el número que aparece debajo del área de columna de la ventana de resultados para cada punto analizado (Figura 4E-G).
    10. Repita los pasos 4.3.5 a 4.3.7 para cada uno de los puntos replicados.
    11. Establezca el área total del papel de filtro como 100% y calcule el porcentaje de área (% área) para cada mancha de orina. Esta normalización corregirá los errores que puedan producirse como consecuencia de diferencias en el zoom o posicionamiento de las cámaras.
    12. Cree una nueva tabla XY en un programa gráfico e inserte los valores del volumen de orina (en μL) en la columna X y los valores duplicados del área % en la columna Y.
    13. A continuación, seleccione Análisis > Analizar > Análisis XY > Regresión no lineal (ajuste de curva). En la ventana de parámetros que aparece, seleccione Modelo > Polinomio > Polinomio de segundo orden (cuadrático).
    14. A continuación, en la ficha método, haga clic para marcar las siguientes selecciones: Regresión de mínimos cuadrados, Sin ponderación y Considere cada valor Replicate Y como un punto individual.
    15. En la ficha Restricciones, seleccione B0, Tipo de restricción > Constante igual a y escriba 0 en la columna Valor. Haga clic en Aceptar.

5. Análisis de las grabaciones experimentales de ratones

  1. Abra un archivo de película recopilado durante la fase clara (cámara inferior) u oscura (cámara superior) para su análisis.
  2. Evalúe la calidad del archivo de película moviendo el desplazamiento de tiempo hacia adelante y hacia atrás, confirmando que el papel de filtro permanece intacto (sin rasgar ni masticar) durante la ventana de tiempo de 6 h a analizar. Si el papel está roto, no realice más análisis, ya que el ratón podría haber orinado sobre el plástico expuesto que no se puede cuantificar (Figura 5).
  3. Para analizar los experimentos recopilados en las fases de luz u oscuridad, utilice el comando de avance rápido o el control deslizante de la barra de tiempo para desplazarse a la ventana de tiempo deseada. La actividad miccional durante la fase de luz se registra entre las 11:00 a.m. y las 05:00 p.m. (ZT = 4.0–10.0) y durante la fase oscura entre la medianoche y las 06:00 a.m. (ZT = 17.0–23.0).
  4. Reproduzca la película en modo de avance rápido haciendo clic en el icono de >> (o desplácese manualmente por la película), buscando evidencia de que el mouse se está vaciando. La forma más fácil de saber que esto está ocurriendo es buscar la aparición repentina de puntos brillantes de orina en el papel de filtro. Otro indicador es buscar cambios de comportamiento, incluido el movimiento a las esquinas de la jaula y un breve período de inactividad cuando el mouse está miccionando.
    NOTA: A medida que uno se vuelve mejor en la detección de vacíos, uno puede aumentar la velocidad de desplazamiento o avance rápido. Sin embargo, en ratones con cistitis inducida bacteriana y químicamente, que tienen un gran número de pequeños vacíos 4,34, uno puede pasar por alto eventos miccionales si uno se mueve demasiado rápido a través de la película.
  5. Registre la hora a la que se produce cada vacío. Como convención, el tiempo del vacío se registra a la primera señal de que se detecta orina (Figura 6A, B).
  6. Para hacer mediciones del vacío, primero use la barra de desplazamiento para avanzar (o retroceder) en el tiempo, buscando el punto en el tiempo cuando se ha producido la difusión máxima de la mancha de orina. Pause la película en este punto y tome una captura de pantalla como se describe en el paso 4.3.3. Coloque la flecha del ratón del ordenador en el punto bajo análisis, de modo que el punto de interés se marque en la captura de pantalla (Figura 6C,D).
  7. Asigne un nombre al archivo de captura de pantalla utilizando números correlativos para tener en cuenta el orden de aparición en la película.
  8. Continúe analizando el archivo, repitiendo los pasos 5.5 y 5.7 para cada punto vacío en la película. Una vez que se hayan analizado todos los puntos vacíos, mida el área total del papel de filtro capturando una captura de pantalla y siguiendo los pasos descritos en 4.3.6.
  9. Calcular el % de área de cada una de las manchas de orina como se describe en el paso 4.3.9. Transforme los valores de % de área en volumen de orina (μL) para cada punto de vacío utilizando las curvas de calibración generadas en el paso 4 y la función interpolar en el software gráfico.
    1. En el software gráfico, abra la tabla XY que contiene los datos de la curva de calibración e inserte los valores de área % en la columna Y debajo del último valor de la curva de calibración (Figura 7A).
    2. Haga clic en la ficha Tabla de resultados y, en la ficha modelo, haga clic para seleccionar Interpolar incógnitas de la curva estándar y pulse OK. Aparece una ficha denominada valores medios X interpolados junto a la ficha de tabla de resultados. Esta pestaña contiene una tabla con los valores interpolados que corresponden al volumen de orina en μL para cada punto de vacío. (Figura 7A,B).
  10. Repita los pasos 5.1 a 5.9 para analizar todos los ratones experimentales.
  11. Cree un archivo de libro que contenga los datos obtenidos de los pasos 5.5 a 5.10, utilizando una hoja de cálculo por mouse (Figura 7C). Cree un archivo para los experimentos de fase clara y otro para los de fase oscura. Estos archivos maestros contienen todos los datos sin procesar y los cálculos necesarios utilizados en análisis posteriores.

6. Análisis del patrón de micción de ratones experimentales

  1. Genere perfiles de puntos de vacío primarios y secundarios (Figura 8A, B y Figura 9).
    NOTA: De acuerdo con los estudios de distribución de frecuencias 23, los puntos vacíos que son ≥20 μL típicamente representan >95% del volumen vaciado total y se consideran puntos vacíos primarios (PVS)8,23,35. Las manchas vacías que son ≤20 μL se consideran manchas vacías secundarias o pequeñas (SVS). Se ha demostrado que la discriminación entre PVS y SVS es un enfoque útil para caracterizar los fenotipos miccionales. Un número elevado de SVS indica disfunción miccional35.
    1. A partir del archivo maestro que contiene los datos puntuales de vaciado de interés (fase clara o fase oscura), clasifique los puntos en función de su volumen como PVS cuando su volumen es ≥20 μL, o SVS cuando su volumen es <20 μL.
    2. Cuente el número y calcule el volumen anulado promedio y el volumen total para los PVS. Cuente el número y calcule el volumen total para los SVS.
    3. Genere una barra gráfica que compare el control con los ratones tratados para cada uno de los parámetros calculados: número de PVS, volumen anulado de PVS, volumen total de PVS, número de SVS, volumen total de SVS.
  2. Opcional: Genere una gráfica de volumen anulado acumulativo (función de escalera) para mostrar el comportamiento de vaciado a lo largo del tiempo (Figura 10 y Figura 11).
    1. Abra el archivo maestro del libro y convierta el tiempo de vaciación, que se expresa en horas, minutos y segundos, en forma decimal. Calcule el volumen acumulado de orina (en μL) para cada punto de tiempo.
    2. Genere una tabla XY en el software gráfico con tiempo en forma decimal en la columna X y volúmenes de orina acumulados en la columna Y. Copie los datos de tiempo y volumen de orina en la tabla. Agregue (0; 0) y (6; valor máximo) puntos de datos. Estos puntos son necesarios para completar las líneas horizontales de la gráfica al inicio del experimento (tiempo: 0 h) cuando el volumen anulado es cero (0; 0), y al final del experimento (tiempo: 6 h) cuando el valor acumulado de la orina evacuada es igual al valor obtenido para el último evento miccional (6; valor máximo).
    3. Haga doble clic en el gráfico; Debería aparecer la ventana Formato de gráfico. Seleccione la ficha Apariencia , haga clic para anular la selección del botón Mostrar símbolos y haga clic para seleccionar Mostrar línea/curva de conexión. Haga clic en la opción Estilo y seleccione Supervivencia.

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Representative Results

Comportamiento miccional de ratones picos piezo1/2 uroteliales

Durante la fase de almacenamiento del ciclo miccional, se plantea la hipótesis de que el urotelio detecta la tensión ejercida por la orina acumulada en la vejiga y transduce este estímulo mecánico en respuestas celulares como la liberación de ATP seroso 1,3. Hemos demostrado previamente que los canales PIEZO1 y PIEZO2 activados mecánicamente se expresan en el urotelio de ratón 3,36. Para determinar si los canales PIEZO uroteliales son importantes para el comportamiento miccional normal, realizamos RT-VSA en ratones Piezo1/2 doble knockout condicionales uroteliales (Pz1/2-KO) y controles emparejados por edad y sexo (Pz1/2-C; Figura 9). Probamos ratones hembra y machos durante 6 h durante las fases oscura y clara del día, y analizamos los datos como se describe en el paso 6.1. Cuando comparamos la actividad miccional entre las fases de luz y oscuridad del día para los grupos control, se observó que tanto las mujeres como los hombres exhibieron un aumento en el número y el volumen total de PVS durante su período activo. Esta observación indica que, a pesar de que los ratones estaban en un ambiente extraño, se conservó la naturaleza circadiana del comportamiento miccional del ratón (más alto durante su fase oscura activa). Durante su fase de luz inactiva, no observamos diferencias significativas en ninguno de los parámetros analizados para ratones hembra o machos Pz1/2-KO en comparación con los homólogos control (Pz1/2-C). Sin embargo, cuando probamos a los animales durante la fase oscura activa, tanto los ratones hembra como los machos Pz1/2-KO mostraron un fenotipo miccional alterado, caracterizado por un aumento significativo en el número y en el volumen total de SVS (Figura 9). No hubo diferencias significativas en el número de PVS, el volumen promedio por PVS o el volumen total de PVS en mujeres o hombres Pz1/2-KO en comparación con sus controles correspondientes. Estos resultados indican que los canales PIEZO1/2 uroteliales no desempeñan un papel significativo en la función miccional durante la fase de luz inactiva del ratón, pero son importantes para prevenir el manchado frecuente durante su fase oscura activa.

Los resultados presentados en la Figura 9 ilustran dos de las ventajas de emplear RT-VSA frente al punto final VSA. En primer lugar, si el análisis se realizó sólo durante la fase de luz, habríamos concluido erróneamente que los canales uroteliales PIEZO1/2 no tenían ningún papel en la función miccional. En segundo lugar, en la mayoría de los estudios de VSA de punto final, los SVS fueron tratados como ruido experimental, y en algunos casos excluidos del análisis posterior23. En el RT-VSA, pudimos determinar que los SVS eran eventos individuales, no secundarios a PVS (remanente o goteo miccional final) y eran voluntarios en el sentido de que los animales se movían a la periferia de la jaula, se anulaban y luego se iban. Esta observación nos proporcionó información valiosa sobre el fenotipo de los ratones Pz1/2-KO que de otro modo se habría pasado por alto.

Comportamiento miccional de ratones hembra en condiciones basales y después del tratamiento con ciclofosfamida

En este experimento piloto, probamos los efectos de la ciclofosfamida (CYP) en el comportamiento de micción voluntaria del ratón. Se sabe que la ciclofosfamida, un fármaco utilizado para tratar algunas formas de cáncer o trastornos inmunológicos, causa cistitis en pacientes y animales de experimentación, lo que resulta en un fenotipo de vejiga hiperactiva caracterizado por múltiples y pequeños eventos miccionales 26,37,38. Para determinar el comportamiento miccional basal, colocamos un ratón hembra no tratado en el RT-VSA durante la fase oscura. El mismo ratón fue inyectado por vía intraperitoneal con una dosis de CYP (150 mg / kg) 5 días después para causar cistitis aguda. Inmediatamente después de la inyección, el ratón se colocó en una jaula RT-VSA para su grabación. El comportamiento miccional se representa en un diagrama de pasos (Figura 11), con las líneas verticales que representan el volumen de orina anulada y las líneas horizontales que representan el tiempo. En comparación con los resultados obtenidos en condiciones basales, es evidente que la cantidad de orina liberada por micción es menor después del tratamiento con CYP, y que los eventos miccionales son mucho más frecuentes. Esto se puede apreciar mejor en el recuadro del gráfico, donde se magnifican los primeros 30 minutos del período analizado (correspondiente a la medianoche a las 00:30 a.m. [7.0 a 7.5 h después de la inyección]).

Figure 1
Figura 1: La cámara de grabación RT-VSA. (A) El sistema de grabación RT-VSA incluye una parte superior, que se compone de dos cámaras de acrílico transparentes una al lado de la otra y cámaras superiores asociadas. La mitad inferior del dispositivo es un soporte de una sola unidad que sostiene las cámaras superiores del ratón y contiene las cámaras inferiores y las luces UV. El interior de las paredes del stand está hecho de paneles de espejo que reflejan la luz UV para proporcionar una iluminación uniforme al fondo de las jaulas. No se muestra una computadora que recibe una transmisión de video de las cámaras y registra los datos. (B) Modelo de la cámara del ratón con componentes y dimensiones. 1) bisagra de despegue estándar; 2) soporte de montaje de la cámara; y 3) soporte de esquina de transición lite. Vistas frontal (C) y superior (D) del soporte UV con componentes y dimensiones. Las luces UV están montadas en el interior de los perfiles delantero y trasero con placas planas rectas. Para montar las cámaras se utiliza un perfil de 32 pulgadas asegurado al marco principal del soporte con dos soportes de esquina de transición lite. Se utilizan placas planas rectas para fijar las cámaras al perfil de 32. Un panel espejado está montado en el interior del stand (no se muestra). 1) placa plana en tee de cinco agujeros; 2) placa plana T de cinco agujeros; y 3) placas planas L de cinco orificios. Todos los valores presentados están en pulgadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Cámara de ratón RT-VSA. Antes de los procedimientos experimentales, cada cámara experimental de ratón se prepara forrándola con un trozo de papel de filtro (numerado 1). Dependiendo del período del día en que se realiza el experimento, el papel de filtro utilizado es grueso (fase oscura) o delgado (fase clara). Se coloca una cúpula de plástico en el centro de la cámara (numerada 2), un plato de plástico con agua (en forma de gel de agua no humedeciente) y se coloca comida a un lado de la cúpula (numerado 3), y un tubo de microcentrífuga de plástico de 1,5 ml, una forma de enriquecimiento, se coloca en el lado opuesto (numerado 4). La disposición inicial de los elementos dentro de la jaula se mantiene consistente en todos los experimentos. Observe que se coloca un trozo de papel de filtro entre las dos jaulas vecinas y se marca en la figura con un asterisco. Esto es para evitar la influencia de señales visuales que surgen del ratón vecino. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Curva de calibración. Imágenes representativas de papeles de filtro gruesos (A, paneles izquierdos) y delgados (B, panel izquierdo) vistos con cantidades conocidas de orina de ratón. Las imágenes son capturas de pantalla de grabaciones de vídeo obtenidas con las cámaras superior (A, paneles izquierdos) o inferior (B, panel izquierdo). Las flechas rojas apuntan a las manchas de orina de 2 μL, y los números debajo de las manchas son los valores de volumen puntual en μL. Observe que las pequeñas manchas de orina (<50 μL) en la imagen superior del panel A que son visibles poco después de la mancha de orina (5 min) ya no se notan después de 30 min (panel inferior). Paneles derechos: Gráfica del área del punto vacío (expresada como el porcentaje del área total del papel de filtro) en función del volumen de orina. Como señalaron otros, los datos del área del punto vacío en función del volumen de orina no siguen una relación lineal30. Por lo tanto, ajustamos los datos a un polinomio de segundo orden utilizando regresión no lineal. Los datos se limitaron de tal manera que X = 0 a Y = 0. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Determinación de papel de filtro y áreas de manchas de orina usando ImageJ. (A) Una captura de pantalla de la curva de calibración que se muestra en la Figura 3A abierta en ImageJ. La región en caja en (A) se muestra con más detalle en (B). (B) Se selecciona el icono de selecciones de polígono (marcado con un círculo rojo) para dibujar un polígono a lo largo del perímetro del papel de filtro (vista parcial; línea amarilla con flechas rojas que apuntan a los nodos generados por la herramienta de selección). (C) El área del polígono refleja el área total del papel de filtro y se mide seleccionando Analizar > medida (círculo rojo). (D) El valor del área (en píxeles) aparece en una ventana de resultados (círculo rojo). (E) Para medir el área de un punto vacío individual, se elige la herramienta de selección a mano alzada (círculo rojo) y en (F) se utiliza para dibujar una línea alrededor del borde del punto (la flecha roja apunta al punto). Usando el mismo comando que en (C), se mide el área del punto vacío, y el resultado aparece como un nuevo valor en la ventana de resultados, inmediatamente debajo de la última medición tomada (panel G, círculo rojo). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Evaluación del estado del papel de filtro después de terminar los experimentos RT-VSA. Imágenes representativas de la cámara del ratón que muestran diferentes condiciones del papel de filtro durante o después de un experimento RT-VSA. El papel de filtro que permaneció intacto hasta el final del período de prueba se muestra en (A) y representa la situación más común y la condición bajo la cual un experimento puede ser analizado más a fondo (marca de verificación verde). Los ejemplos de papel de filtro dañado se muestran en (B) y (C), y son representativos de experimentos que no deben analizarse más a fondo (X roja). En (B), el papel de filtro fue triturado por el ratón (flecha roja) en una de las esquinas. La línea amarilla discontinua marca el borde del piso de la jaula. La región en caja se amplía en la imagen de la derecha. En (C), la integridad del experimento se vio comprometida como resultado de que el gel de agua no humedecedor (flecha roja) fuera movido por el ratón hacia la esquina, dejando tres grandes manchas de agua (asteriscos rojos). Estos movimientos fueron confirmados al ver el video. Las imágenes son capturas de pantalla de archivos de película obtenidos durante la fase oscura, utilizando la cámara superior y con la jaula forrada con papel de filtro grueso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Determinación del tiempo de vaciado y adquisición de capturas de pantalla para mediciones de área de punto vacío. (A,B) Captura de pantalla de un ratón en una esquina de su cámara, con un punto vacío que acaba de hacerse visible. El tiempo de este marco se anota como el tiempo de micción. (C,D) Una vez que el punto de vacío alcanza la difusión máxima, se toma una captura de pantalla para determinar el volumen del vacío. Las imágenes son capturas de pantalla de archivos de película obtenidos con la cámara superior, utilizando papel de filtro grueso y durante la fase oscura. El período de análisis fue de medianoche a 06:00 a.m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: Transformación del área de punto vacío en volumen de orina y generación de un archivo de hoja de trabajo con datos brutos experimentales. (A) Captura de pantalla de la ventana del software gráfico que muestra los valores de los puntos vacíos expresados como el porcentaje del área total de papel de filtro (datos descritos en verde). La hoja de cálculo (flecha verde) se guarda en la sección tablas de datos. (B) Conversión del porcentaje del área total al volumen de orina (datos descritos en rojo). Estos últimos valores se muestran en la sección de resultados (flecha roja) y se calculan a partir de la curva de calibración utilizando interpolar incógnitas de la función de curva estándar. (C) Captura de pantalla de una hoja de trabajo con datos sin procesar y calculados compilados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 8
Figura 8: Clasificación de los puntos vacíos en PVS y SVS y su análisis. Capturas de pantalla de hojas de trabajo (generadas como se muestra en la Figura 7C) de un ratón en condiciones basales (A) y 7 h después de recibir una dosis de ciclofosfamida (150 mg/kg) (B). Los puntos vacíos se clasifican como puntos vacíos primarios (PVS) si el volumen es ≥20 μL, o como pequeños puntos vacíos (SVS) si el volumen es <20 μL. Tenga en cuenta que en el ratón no tratado (A), todos los eventos miccionales son PVS, mientras que en el animal tratado con ciclofosfamida, la mayoría de los vacíos son SVS. La tabla con un círculo en cada panel (contorno rojo) incluye las siguientes estadísticas de resumen: número de vacíos, volumen promedio anulado y volumen total anulado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 9
Figura 9: Comportamiento miccional de ratones Piezo1/2 knockout y control. El comportamiento miccional de ratones hembra (A) y macho (B) Piezo1 /2 knockout (Pz1/2-KO) y contrapartes de control (Pz1/2-C) se registró durante una ventana de tiempo de 6 h durante la fase oscura o clara del día, y los resultados se analizaron como se describe en el paso 6.1. Los datos se muestran como media ± error estándar de media (S.E.M.). Los datos se compararon mediante una prueba de Mann-Whitney. Abreviaturas: PVS = puntos vacíos primarios; SVS = pequeños puntos vacíos; NS = no significativo; * p < 0,05; ** p < 0,01. Esta cifra se ha modificado de3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 10
Figura 10: Hojas de trabajo para el cálculo y la representación gráfica del volumen anulado acumulado en función del tiempo. (A) Captura de pantalla de la hoja de trabajo generada en la Figura 7C que muestra los cálculos necesarios para generar una gráfica de función de escalera del volumen acumulado de orina anulada en función del tiempo. La hora debe introducirse en formato decimal (columna G, cuadrado rojo). Para transformar el tiempo al formato decimal, se agregaron tres columnas (flechas rojas) a la derecha de la columna de tiempo de anulación para anotar por separado los valores de horas (columna D), minutos (columna E) y segundos (columna F), y el resultado final del tiempo en formato decimal (columna G). Para transformar la anulación de tiempo a un formato decimal, utilice la siguiente función: (h) + (min/60) + (s/3.600). Se agregó una columna a la derecha de la columna de volumen de orina, para mostrar el volumen acumulado de orina (rectángulo azul), que se calcula como la suma de todos los volúmenes de orina (columna J) obtenidos hasta el momento de un nuevo evento miccional (incluido el nuevo valor del evento). (B) Captura de pantalla que muestra los datos copiados de la hoja de trabajo en el panel A y pegados en la columna X (tiempo en formato decimal) y la columna Y (volúmenes acumulados de orina) en un proyecto de software gráfico. El primer y el último punto de tiempo de la gráfica se establecen en 0 y 6 filas (valor máximo) como se indica mediante las flechas rojas. (C) Para generar un gráfico de pasos, el gráfico se formatea anulando la selección del campo mostrar símbolos, habilitando la opción mostrar la línea/curva de conexión y seleccionando el estilo de supervivencia, como se muestra en los campos rodeados en rojo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 11
Figura 11: Resultados representativos del comportamiento miccional del ratón en condiciones basales o después de la administración de ciclofosfamida. El comportamiento miccional voluntario de un ratón fue evaluado por RT-VSA durante la fase oscura antes (basal) y 7 h después de la administración de ciclofosfamida (CYP), como se describe en los Resultados representativos. El tiempo y el volumen de los eventos de micción se representan en una gráfica de pasos que se generó como se describe en el paso 6.2. El recuadro del gráfico representa el área de la gráfica marcada con un rectángulo verde y corresponde a los primeros 30 min del período analizado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 12
Figura 12: Identificación de manchas de orina superpuestas por RT-VSA. Capturas de pantalla de fotogramas de vídeo capturados con la cámara superior en la fase oscura de un experimento RT-VSA (imágenes 1 y 2). La región en caja en la imagen 2 se magnifica en la imagen 3. El ratón se anuló en la misma esquina superior derecha dos veces más durante las siguientes horas (imágenes 4-6). A pesar de la superposición de puntos vacíos, los eventos miccionales individuales se detectaron fácilmente utilizando RT-VSA. Para visualizar cómo aparecerían estos eventos como un ensayo de punto final, expusimos la esquina del papel de filtro a diferentes condiciones de iluminación. Bajo luz ambiental visible, solo se pudo identificar un único punto vacío grande (imagen 7). Del mismo modo, si esta misma región se examinó bajo luz UV, solo se distinguió una sola mancha oscura (imagen 8). Por lo tanto, RT-VSA detecta fácilmente múltiples vacíos en la misma región, pero tal discriminación no es posible si el análisis se realiza como un ensayo de punto final. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

La incorporación de la videomonitorización es una modificación rentable que presenta varias ventajas sobre el VSA clásico. En el VSA clásico, que se usa típicamente como un ensayo de punto final, es difícil distinguir puntos vacíos superpuestos. Esta no es una preocupación trivial, ya que los ratones tienden a orinar varias veces en la misma área cuando el ensayo se prolonga durante varias horas, generalmente en las esquinas de su jaula. Por lo tanto, la primera ventaja de RT-VSA es que el investigador puede identificar fácilmente manchas individuales que se han depositado parcial o totalmente una encima de la otra. Esto está bien ilustrado en el experimento que se muestra en la Figura 12. En este caso, la grabación de video confirma que el mouse anuló tres veces en la misma esquina, depositando puntos vacíos superpuestos. Si el papel de filtro se analizaba solo al final del experimento, de la manera típica de un VSA, solo se podía distinguir un punto. Por lo tanto, mientras que el VSA clásico de punto final puede ser útil para identificar grandes diferencias en el comportamiento miccional, puede no discriminar entre fenotipos más sutiles. Con los avances actuales en genética y la generación de animales transgénicos, el desarrollo de métodos que puedan evaluar con precisión el comportamiento miccional es esencial.

En segundo lugar, RT-VSA proporciona al investigador información temporal sobre los eventos miccionales. Por lo tanto, uno puede determinar las verdaderas frecuencias miccionales, así como establecer relaciones entre los eventos miccionales. Por ejemplo, en una situación en la que se observa un grupo de SVS junto a un solo PVS grande, en el VSA clásico, no se puede discriminar fácilmente si el ratón vació varias veces durante el experimento (con tres vacíos pequeños y uno grande) o si el animal depositó un gran volumen de orina, y los tres puntos más pequeños son el resultado del goteo o arrastre posterior a la micción de la piel. RT-VSA se puede utilizar para abordar estas preguntas.

En tercer lugar, RT-VSA permite analizar el comportamiento de un ratón antes, durante y después del evento de micción. El investigador también puede monitorear el perfil de actividad general del ratón mediante el análisis de grabaciones RT-VSA con software disponible gratuitamente, como Mouse Behavior Tracker39. Además, se puede discriminar si un animal se detiene para orinar (comportamiento típico de las hembras), si el animal está en movimiento durante la micción (lo que en los machos puede resultar en el arrastre de manchas vacías) o si se vacía durante su fase de sueño / descanso. Hemos observado este último comportamiento, aunque normalmente es raro. Por lo tanto, si se valida e interpreta adecuadamente, observar el comportamiento miccional puede proporcionar al investigador información valiosa sobre la disfunción miccional, que incluye, por ejemplo, nicturia o incontinencia. RT-VSA (y VSA) permite a los investigadores determinar la fracción de eventos de vacío que ocurren en el área central de una jaula, en lugar de las esquinas. Normalmente, la micción central es rara, y el aumento del número de tales eventos es un signo de disfunción vesical 8,22. La única excepción son los machos alfa dominantes, que orinan con frecuencia y en la totalidad de sus recintos20. Para realizar un análisis de la micción central utilizando RT-VSA, se debe considerar mover el plato de comida a una pared lateral y quitar la cúpula (o fijarla a una región particular de la jaula), para que los patrones espaciales de micción puedan establecerse más fácilmente.

En cuarto lugar, el RT-VSA permite gestionar de manera más efectiva las tensiones asociadas con el intercambio de jaulas en comparación con el VSA clásico. Los ratones son asustadizos por naturaleza y manipularlos o transferirlos a un nuevo entorno causa estrés, que se sabe que afecta el comportamiento miccional35. Por su naturaleza, es difícil incorporar un período de aclimatación en el VSA estándar. En contraste, en RT-VSA, un período de aclimatación puede ser fácilmente incorporado en cada experimento, y cualquier evento miccional durante este período no se tiene en cuenta durante el análisis. Un aspecto adicional para aliviar el estrés de RT-VSA implementado en este protocolo es la duplicación de las condiciones bajo las cuales normalmente se alojan los ratones (es decir, acceso a alimentos y agua ad libitum, una cúpula y un juguete). Este es, hasta donde sabemos, uno de los entornos más ricos descritos para este tipo de experimentos. En un punto final típico VSA, los ratones se ven privados de agua (y a veces también de alimentos)8,22, que proporcionamos ad libitum.

En quinto lugar, además del efecto positivo que este ambiente enriquecido puede tener en los niveles de estrés de los ratones, permite al investigador realizar RT-VSA durante largos períodos de tiempo, generalmente en ventanas de tiempo de 6 h; Sin embargo, más recientemente hemos estado realizando experimentos que duran 24 h (datos no mostrados). Esto es ideal cuando se evalúan los efectos de la ritmicidad circadiana o cuando se estudian ratones que pueden exhibir un fenotipo de vejiga poco activa y, por lo tanto, orinar con poca frecuencia.

Para el monitoreo de video las 24 horas, recomendamos usar papel de filtro delgado y analizar los experimentos con las cámaras inferiores. Esta combinación de tipo de papel y cámara es la mejor opción que permite la sensibilidad de detección en las fases oscura y clara. Como se mencionó anteriormente, las cámaras inferiores no pueden detectar fácilmente los puntos vacíos en el papel de filtro grueso y las cámaras superiores no detectan de manera confiable los puntos vacíos durante la fase de luz. Si se realizan estos análisis extendidos, sugerimos colocar a los animales en las jaulas de grabación a las 05:00 p.m., analizar a partir de las 06:00 p.m. del día 1 y completar el experimento a las 06:00 p.m. del día siguiente.

Si bien RT-VSA tiene muchos aspectos positivos, hay algunas advertencias que vale la pena señalar. Si bien hacemos todo lo posible para limitar el estrés al realizar estos análisis, no podemos replicar completamente el hábitat del ratón, ya que los animales normalmente están alojados en grupos. También beben agua de una botella en lugar de obtener agua del gel de agua no humedeciente. Sin embargo, nuestra observación de que los ratones tienen menos vacíos durante su fase de luz inactiva en comparación con su fase oscura activa nos indica que los ratones conservan sus patrones normales de comportamiento miccional circadiano40. Reflejando su naturaleza fácilmente estresada, encontramos que los ratones exhiben un comportamiento miccional interrumpido en los días de limpieza de la jaula. Por lo tanto, uno debe limitar el análisis a períodos de tiempo en los que los animales se verán menos afectados por la cría de animales de rutina. Un factor importante a considerar es si la luz UV tiene algún impacto en la función miccional. Debido a que nuestros hallazgos muestran una clara diferencia circadiana en los parámetros VSA entre las fases de luz y oscuridad, que son consistentes con otras técnicas que describen un fenómeno similar pero que no usan luz UV40, concluimos que la iluminación de luz UV no afecta la función de micción. Observe que el papel de filtro evita que la luz pase de la cámara inferior a la cámara superior.

Una advertencia adicional es que cuanto más tiempo se mantenga a los ratones en la cámara, más probabilidades hay de que mastiquen o dañen el papel de filtro (independientemente del grosor del papel). Si bien ninguno de los animales interrumpió el papel durante la fase de luz, casi el 30% de los ratones dañaron el papel durante la fase activa oscura. En el análisis de los experimentos de 24 h, observamos que una proporción similar (un tercio) de los experimentos no pudo analizarse debido al daño del papel, lo que significa que no solo la cantidad de tiempo, sino también la fase del día afecta el comportamiento de trituración del animal. Desafortunadamente, en nuestra experiencia, hemos notado que un animal que interrumpe el papel de la jaula continuará haciéndolo incluso después de volver a realizar la prueba. Como se señaló anteriormente, los ratones a veces orinan en el piso acrílico desnudo y, por lo tanto, la pérdida del papel hace que el análisis sea incompleto y de valor limitado.

Además, el análisis del comportamiento miccional masculino puede ser más difícil ya que tienden a orinar con mayor frecuencia, pueden gotear después de la micción, y hay una población de machos (20%) con un fenotipo macho alfa más agresivo caracterizado por un gran número de pequeños vacíos que se distribuyen por toda la jaula, como se discutió en una publicación anterior3. Como este comportamiento del macho alfa puede constituir un factor de confusión para establecer fenotipos miccionales, excluimos del análisis a los animales con vacíos de ≥50 (experimentos de fase clara) o ≥100 (experimentos de fase oscura).

Hay situaciones en las que la discriminación de los vacíos en función de su volumen (es decir, PVS vs SVS) no está necesariamente justificada. Por ejemplo, en nuestra experiencia, los ratones con cistitis bacteriana o química tienden a orinar volúmenes más pequeños que los controles 4,34. Sin embargo, hay grandes diferencias en el volumen anulado entre ratones individuales; en algunos, la mayoría de los vacíos tienen un volumen ≤20 μL, mientras que en otros la mayoría es de >20 μL. En consecuencia, la discriminación del volumen anulado no proporciona ninguna ventaja para la caracterización de estos fenotipos.

En resumen, RT-VSA es una herramienta fácil de implementar para analizar el comportamiento de vaciación del mouse en ratones libremente móviles. A diferencia de herramientas como la cistometría, no requiere la implantación quirúrgica de un catéter o tasas no fisiológicas de llenado de la vejiga. Permite la determinación del comportamiento miccional en ambos sexos de ratones, durante largos períodos de tiempo y durante las fases de luz y oscuridad del ciclo diurno. También es relativamente asequible, especialmente cuando se compara con dispositivos más especializados y costosos, como las jaulas metabólicas. Si bien hay advertencias asociadas con esta herramienta, generalmente son fáciles de administrar. Finalmente, esta técnica podría adaptarse fácilmente a otras especies animales, incluidos otros roedores.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por una subvención de los NIH R01DK119183 (a G.A. y M.D.C.), una subvención de proyecto piloto a través de P30DK079307 (a M.G.D.), un premio de Desarrollo Profesional de la Asociación Americana de Urología y una subvención de la Fundación Winters (a N.M.), y por los Núcleos de Imágenes Renales de Fisiología Celular y Organismos Modelo del Centro de Investigación Renal de Pittsburgh (P30DK079307).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots –  cut to 10 inches 80/20 1010 Amount: 20
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots –  cut to 12 inches 80/20 1010 Amount: 6
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots –  cut to 40 inches 80/20 1010 Amount: 4
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots – cut to 14.75 inches 80/20 1010 Amount: 12
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots – cut to 32 inches 80/20 1010 Amount: 5
1/4-20 Double Slide-in Economy T-Nut 80/20 3280 Amount: 16
1/4-20 Triple Slide-in Economy T-Nut 80/20 3287 Amount: 18
10 & 25 Series 2 Hole - 18mm Slotted Inside Corner Bracket with Dual Support 80/20 14061 Amount: 6
10 Series 3 Hole - Straight Flat Plate 80/20 4118 Amount: 8
10 Series 5 Hole - "L" Flat Plate 80/20 4081 Amount: 8
10 Series 5 Hole - "T" Flat Plate 80/20 4080 Amount: 8
10 Series 5 Hole - Tee Flat Plate 80/20 4140 Amount: 2
10 Series Standard Lift-Off Hinge - Right Hand Assembly 80/20 2064 Amount: 2
10 to 15 Series 2 Hole - Lite Transition Inside Corner Bracket 80/20 4509 Amount: 6
24”-long UV tube lights ADJ Products LLC T8-F20BLB24 Amount: 2
20W bulb – 24” Wavelength: 365nm
Acrylic Mirror Sheet Profesional Plastics Amount: 1
82.5 cm x 26.5 cm
Acrylic Mirror Sheet Profesional Plastics Amount: 2
26.5 cm X 30.5 cm
Acrylic Mirror Sheet Profesional Plastics Amount: 2
82.5 cm x 30.5 cm
AR polycarbonate (UV resistance) 80/20 65-2641 Amount: 2
4.5mm Thick, Clear, 38.5 cm x 26.5 cm
AR polycarbonate (UV resistance) 80/20 65-2641 Amount: 4
4.5mm Thick, Clear, 38.5 cm x 21.5 cm
AR polycarbonate (UV resistance) 80/20 65-2641 Amount: 4
4.5mm Thick, Clear, 26.5 cm x 21.5 cm
AR polycarbonate (UV resistance) 80/20 65-2641 Amount: 4
4.5mm Thick, Clear 37.5 cm x 23.9 cm
AR polycarbonate (UV resistance) 80/20 65-2641 Amount: 4
4.5mm Thick, Clear , 24.4 cm x 23.9 cm
Chromatography paper (thin paper)  Thermo Fisher Scientific 57144
Cosmos blotting paper (thick paper) Blick Art Materials 10422-1005
Excel Microsoft Corporation
GraphPad Prism GraphPad Software Version 9.4.0 graphing and statistics software
ImageJ FIJI NIH
Parafilm Merck transparent film
Quick Time Player 10.5 software  Apple multimedia player
Security spy Ben software video surveillance software system
Standard End Fastener, 1/4-20 80/20 3381 Amount: 80
UV transmitting acrylic Spartech Polycast Solacryl SUVT Amount: 2
38.5 cm x 26.5 cm 
Water gel: HydroGel ClearH2O   70-01-5022 (https://www.clearh2o.com/product/hydrogel/)
Webcam Logitech C930e Amount: 4

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References

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Retracción Número 192 Ensayo de punto vacío Vejiga urinaria función miccional cistometría
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Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Wheeler, T. B., Apodaca, G., Carattino, M. D. Real-Time Void Spot Assay. J. Vis. Exp. (192), e64621, doi:10.3791/64621 (2023).

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