Summary
Denne artikkelen beskriver en ny metode for å studere atferd ved tømming av mus ved å innlemme videoovervåking i den konvensjonelle tomromspotanalysen. Denne tilnærmingen gir tidsmessig, romlig og volumetrisk informasjon om tomromshendelsene og detaljer om museadferd i dagens lyse og mørke faser.
Abstract
Normal tømmingsadferd er resultatet av den koordinerte funksjonen til blæren, urinrøret og urinrørsfinkterne under riktig kontroll av nervesystemet. For å studere frivillig tømmingsadferd i musemodeller har forskere utviklet VSA, en metode som måler antall og areal av urinflekker avsatt på et filterpapir som fôrer gulvet i et dyrs bur. Selv om den er teknisk enkel og billig, har denne analysen begrensninger når den brukes som en endepunktsanalyse, inkludert mangel på tidsmessig oppløsning av tømmingshendelser og vanskeligheter med å kvantifisere overlappende urinflekker. For å overvinne disse begrensningene utviklet vi en videoovervåket VSA, som vi kaller sanntids VSA (RT-VSA), og som lar oss bestemme tømmingsfrekvens, vurdere tømmervolum og tømmingsmønstre, og foreta målinger over 6 timers tidsvinduer i både mørke og lyse faser av dagen. Metoden beskrevet i denne rapporten kan brukes på et bredt spekter av musebaserte studier som undersøker de fysiologiske og nevroatferdsmessige aspektene ved frivillig vannlating i helse- og sykdomstilstander.
Introduction
Urinlagring og vannlating koordineres av en sentralkrets (sentralnervesystemet) som mottar informasjon om blærefyllingsstatus gjennom bekkenet og hypogastriske nerver. Urotelet, epitelet som strekker urinveiene fra nyrebekkenet til det proksimale urinrøret, danner en tett barriere mot metabolske avfallsprodukter og patogener som er tilstede i urinen. Det er en integrert del av et sensorisk nett, som sanser og kommuniserer blærens fyllingstilstand til underliggende vev og afferente nerver 1,2. Forstyrrelse av urotelbarrieren, eller endringer i uroteliale mekanotransduksjonsveier, kan føre til tømming av dysfunksjon sammen med nedre urinveissymptomer som frekvens, haster, nokturi og inkontinens 3,4,5,6,7. På samme måte er aldring, diabetes, nedre urinveisinfeksjoner, interstitiell cystitt og andre sykdomsprosesser som påvirker urinblæren, eller tilhørende kretsløp som styrer funksjonen, kjent for å forårsake blæredysfunksjon 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17, 18,19. En bedre forståelse av normal og unormal tømming atferd avhenger av utvikling av metoder som kan pålitelig diskriminere mellom ulike vannlating mønstre.
Tradisjonelt har musens frivillige tømmingsadferd blitt studert ved hjelp av void spot assay (VSA), utviklet av Desjardins og kolleger20, og bredt vedtatt på grunn av sin enkelhet, lave kostnader og ikke-invasiv tilnærming 8,21,22,23,24. Denne analysen utføres vanligvis som en endepunktsanalyse, der en mus tilbringer en definert tid i et bur foret med et filterpapir, som deretter analyseres ved å telle antallet og vurdere størrelsen på urinflekker når filterpapiret plasseres under ultrafiolett (UV) lys (urinflekkene fluorescerer under disse forholdene)20. Til tross for disse mange fordelene, presenterer den tradisjonelle VSA noen store begrensninger. Fordi mus ofte urinerer i de samme områdene, må etterforskerne begrense varigheten av analysen til en relativt kort periode (≤4 timer) 25. Selv når VSA utføres over kortere tidsperioder, er det nesten umulig å løse små tomromsflekker (SVS) som faller over store tomromsflekker eller, for å diskriminere SVS-er fra overføring av urin festet til haler eller poter. Det er også svært vanskelig å skille om SVS-er er en konsekvens av hyppige, men individuelle tømmingshendelser (en fenotype som ofte observeres som respons på cystitt 4,26), eller på grunn av dribling etter miksjon (en fenotype assosiert med blæreutløpsobstruksjon27). Videre begrenser ønsket om å fullføre analysen i arbeidstiden, kombinert med vanskeligheter med å få tilgang til boligfasiliteter når lysene er slått av, ofte disse analysene til lysperioden i 24 timers sirkadisk syklus. Dermed forhindrer disse tidsbegrensningene evaluering av musetømmingsadferd i løpet av deres aktive nattfase, og reduserer evnen til å analysere spesifikke gener eller behandlinger som styres av sirkadiske rytmer.
For å overvinne noen av disse begrensningene har forskere utviklet alternative metoder for å vurdere tømmingsadferd i sanntid 26,28,29,30,31,32. Noen av disse tilnærmingene innebærer bruk av dyrt utstyr som metabolske bur26,28,29, eller bruk av termiske kameraer30; Men også disse har begrensninger. For eksempel, i metabolske bur, har urinen en tendens til å holde seg til ledningene i nettgulvet og til traktens vegger, og reduserer mengden urin som samles og måles. Dermed kan det være vanskelig å samle inn data om små hulrom nøyaktig. Videre gir metabolske bur ikke informasjon om den romlige fordelingen av tømmingshendelsene (dvs. vannlating i hjørnene vs. midten av kammeret). Gitt at langbølget infrarød stråling som brukes av termografiske kameraer ikke trenger gjennom faste stoffer, må tømmingsaktivitet vurdert ved videotermografi utføres i et åpent system, noe som kan være utfordrende med aktive mus, da de kan hoppe flere centimeter i luften. Et annet system er den automatiserte tomme flekken på papir (aVSOP) tilnærming33, som består av valset filterpapir som vinder opp med konstant hastighet under nettinggulvet i et musebur. Denne tilnærmingen forhindrer papirskader og overlapping av urinflekker som forekommer i den klassiske VSA, og implementeringen gjør det mulig for etterforskeren å utføre eksperimenter over flere dager. Det gir imidlertid ikke etterforskeren nøyaktig timing av tømmingshendelsene, og det er ingen evne til å undersøke atferd og hvordan den korrelerer med spotting. For å få denne informasjonen har forskere innlemmet videoovervåking til tømmingsanalyser, en tilnærming som tillater samtidig vurdering av museaktivitet og urineringshendelser31,32. En tilnærming består av å plassere en blålysdiode (LED) og et videokamera med et grønt fluorescensproteinfilter satt under forsøksburet for å visualisere tømmingshendelsene, og en infrarød LED og et videokamera over buret for å fange museposisjon32. Dette oppsettet har blitt brukt til å overvåke tømmingsadferd mens du utfører fiberfotometri; Imidlertid krevde det sterkt opplyste miljøet i dette systemet at etterforskerne behandlet musene sine med et vanndrivende middel for å stimulere tømming. I et annet eksperimentelt design ble vidvinkelkameraer plassert over og under eksperimentburet for å visualisere henholdsvis musemotoraktivitet og urineringshendelser. I dette tilfellet ble urinflekker avsatt på et filterpapir som fôrer burets gulv avslørt ved å belyse filterpapiret med UV-lys plassert under buret31. Dette oppsettet ble brukt i korte analyser, 4 min i varighet, i lysfasen av dagen for å studere hjernestammenevronene som er involvert i frivillig tømmingsadferd31. Egnetheten til dette systemet for bruk i mørkefasen eller i perioder >4 minutter ble ikke rapportert.
I denne artikkelen beskrives en metode som forbedrer den tradisjonelle VSA ved å tillate langsiktig videoovervåking av musetømmingsadferd. Denne kostnadseffektive tilnærmingen gir tidsmessig, romlig og volumetrisk informasjon om tømmingshendelser i lengre perioder i løpet av dagens lyse og mørke faser, sammen med detaljer relatert til museadferd 3,4,34. Detaljert informasjon for bygging av tømmerommene, implementering av en sanntids VSA (RT-VSA) og analyse av dataene er gitt. RT-VSA er verdifull for forskere som ønsker å forstå de fysiologiske mekanismene som styrer funksjonen til urinsystemet, å utvikle farmakologiske tilnærminger for å kontrollere mikturering, og å definere det molekylære grunnlaget for sykdomsprosesser som påvirker nedre urinveiene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Urotelial piezo1/2 dobbel knockoutmus (Pz1/2-KO, genotype: Piezo1 fl/fl; Piezo2 fl/fl; Upk2CRE+/-) og kontroller (Pz1/2-C, genotype: Piezo1 fl/fl; Piezo2 fl/fl; Upk2CRE-/-) ble generert internt fra foreldrestammer hentet fra Jax-laboratoriene (Piezo1 fl/fl-stamme # 029213; Piezo2 fl/fl stamme # 027720; Upk2CRE+/- stamme # 029281). Både kvinnelige (1,5-3 måneder gamle og 17-20 g i vekt) og mannlige (2-4 måneder gamle og 23-29 g i vekt) mus ble brukt i forsøkene. For cyklofosfamid-indusert blærekatarr eksperimenter, villtype C57Bl / 6J kvinner (3 måneder gammel og ~ 20 g i vekt) ble brukt (Jackson laboratorier, stamme # 000664). Dyrene ble plassert og forsøkene ble utført ved University of Pittsburgh Animal Care Facility under godkjenning av University of Pittsburgh Institutional Animal Care and Use Committee. Alle dyreforsøk ble utført i henhold til relevante retningslinjer og forskrifter i Human helsetjenestepolicy for humant stell og bruk av forsøksdyr og dyrevelferdsloven.
1. Montering av merder for sanntids tomromspotanalyse (RT-VSA)
- RT-VSA-riggen består av et UV-stativ som rommer to UV-lyspærer og to vidvinkelkameraer (nederste kameraer), som brukes til å registrere tømmingsaktivitet i dagens lysfase. Ordne to musekamre til å hvile på stativet. Fest vidvinkelkameraer (toppkameraer) til lokket på hvert musekammer, som brukes til å registrere tømming i den mørke fasen av dagen (figur 1A).
- Konstruer rammen til UV-stativet og musekamrene fra 1 til x 1 i T-slissede aluminiumsprofiler. Se tabell 1 for en liste over komponentene som brukes til å bygge to musekamre og UV-stativet og figur 1B–D for de forskjellige visningene av de sammensatte komponentene og dimensjonene.
- Konstruer hvert musekammer med åtte T-slissede aluminiumsprofiler kuttet til 10 tommer og fire kuttet til 14,75 tommer. Start med å montere bunnen av musekammeret og bruk standard endefester (tabell 1) for å montere de T-slissede profilene i henhold til figur 1. Monter 38,5 cm x 26,5 cm UV-senderakrylen i profilenes indre kanal for å bygge gulvet i musekamrene.
NOTAT: For detaljert informasjon om hvordan du monterer T-slissede profiler med standard endefester, besøk selskapets nettside. - Bygg veggene i musekammeret med resten av profilene. Monter 38,5 cm x 21,5 cm og 26,5 cm x 21,5 cm slitesterke (AR) polykarbonatpaneler i profilene for å montere ytterveggene til musekammeret. Bruk 37,5 cm x 23,9 cm og 24,4 cm x 23,9 cm AR-polykarbonatpanelene til å bygge det indre av musekammeret.
- Fest AR-polykarbonatpanelene med standard endefeste 1/4-20 slitebane. Se instruksjoner om hvordan du monterer panelene i profilene på nettsiden i MERKNADEN til trinn 1.3. Bruk kommersiell silikon caulk for å forsegle kryssene mellom de interne panelene.
- Bruk to 12 tommer og to 14,75 i T-slissede profiler for å montere lokket på buret som angitt i figur 1B. Monter et 38,5 cm x 26,5 cm AR-polykarbonatpanel i profilens indre kanal for å fullføre lokket.
- Monter 12 i kameraprofilstøtte vinkelrett på de lange aksene på toppen av buret og fest med to lite overganger inne i hjørnebraketter (merket 3 i figur 1B). Bruk en rett flatplate (merket 2) som monteringsstøtte for webkameraet, og monter den som vist i figur 1B. Fest kameraet til støtten med kameraets monteringsskrue.
- Bruk 10-serien med standard hengsel til høyre for å feste lokket til musekammeret (merket 1 i figur 1B).
- Konstruer UV-stativet med fire T-slissede profiler kuttet til 40 tommer, fire T-slissede profiler kuttet til 32 tommer, og fire T-slissede profiler kuttet til 10 tommer, i henhold til figur 1C, D. Monter et 82,5 cm x 26,5 cm akrylspeilark i profilene for å bygge bunnen av UV-kammeret.
- Bruk speilplaten 82,5 cm x 30,5 cm og 26,5 cm x 30,5 cm til å konstruere veggen på UV-stativet.
- Fest 10-serien fem-hulls T flate plater (merket 2 i figur 1 C), 10-serien fem-hulls L flate plater (merket 3 i figur 1 C), og 10-serien fem-hulls tee flate plater (merket 1 i figur 1C) for å sikre UV-stativet.
- Monter bunnkameraene i en T-slisset profil kuttet til 32 tommer og fest til bunnen av stativet med to lite overgangshjørnebraketter som vist i figur 1D. Bruk rette flate plater for å feste webkameraene til T-slisseprofilen.
- Monter UV-lampene på innsiden, fronten og bakprofilen, og fest dem til de rette flatplatene som vist i figur 1D.
- Koble de fire webkameraene til USB-portene på en datamaskin som kjører en programvare for videoovervåking.
2. Dyrehold før eksperimentering
- Huseksperimentelle mus, enten formålsavlet eller hentet fra et eksternt sted, i grupper på fire. Når det er mulig, bruk aldersmatchede kvinnelige eller mannlige mus for disse forsøkene. Hvis dyr er hentet fra en ekstern kilde, la dem akklimatisere i minst 7 dager før du utfører eksperimentelle prosedyrer.
- Gjennom hele sin tid på dyreavdelingen, hus dyrene i standard bur som inneholder sengetøy og berikelse (f.eks. plastiglo, hjul, stykke papir for makulering) og hold dem under en 12 timers dag / natt syklus, med tilgang til vann og tørr mus chow ad libitum.
3. RT-VSA-opptak i dagens lyse og mørke faser
MERK: Protokollen nedenfor beskriver bruken av RT-VSA for å vurdere musetømmingsadferd i dagens lyse og mørke faser. Dyrene holdes på en 12 timers lys og 12 timers mørk syklus med Zeitgeber-tid (ZT) = 0 kl. 07:00. Opptakene starter mellom kl. 10.30 og 11.00 (ZT = 3,5–4,0) for lysfaseeksperimentene og mellom kl. 18.00 og 18.30 (ZT = 11.0–11.5) for mørkefaseeksperimentene. Når dyr testes under begge forhold, utføres eksperimenter vanligvis på to separate dager, med minst 5 påfølgende dager mellom lys- og mørketestene. Forsøk bør ikke utføres på dager hvor dyrerommene rengjøres eller burene skiftes, da disse kan resultere i påkjenninger som påvirker tømmingsatferd. Alle trinn skal utføres under forhold med minimal stress for musene.
- Transporter forsøksdyrene fra deres boligsted til prosedyrerommet der RT-VSA-opptakskamrene er plassert.
- RT-VSA opptakskammer forberedelse
- Plasser et stykke filterpapir (24,3 cm x 36,3 cm) i bunnen av hvert RT-VSA-opptaksbur. Avhengig av tidspunktet på dagen, bruk tynt (lysfaseeksperimenter) eller tykt (mørkfaseeksperimenter) filterpapir.
MERK: Tykt filterpapir brukes i den aktive mørke fasen, da det er mer motstandsdyktig mot makulering enn tynt filterpapir. Toppkameraer brukes til å visualisere urinflekker avsatt på tykt filterpapir i den mørke fasen. I kontrast, i lysfasen, brukes de nederste kameraene fordi omgivelseslyset hindrer toppkameraene i å oppdage urinflekker som er avsatt på filterpapiret. I dette tilfellet brukes tynt filterpapir. Vi fant ut at de nederste kameraene er ineffektive til å oppdage små tømmingshendelser avsatt på tykt filterpapir. - På toppen av filterpapiret plasserer du følgende elementer: en plastiglo (som gir soveplass), et sterilt 1,5 ml mikrosentrifugerør for anrikningsformål, og en 60 mm x 15 mm plastfat som inneholder to eller tre stykker musetørr chow og 14-16 g vann i form av en gelpakke (ikke-fuktende vanngel; Figur 2).
MERK: Bruken av 1,5 ml mikrosentrifugerør for anrikningsformål var spesifikk for kapslingen som ble brukt i denne studien. - Når opptakskamrene er klare, plasser de eksperimentelle musene forsiktig inni ved å legge dem mykt ned på filterpapiret. Pass på at overføringen av dyrene fra buret til opptaksburene skjer med minst mulig stress.
- Når alle forsøksdyrene er inne i opptaksburene sine, med lokkene lukket, dekk toppen av lokkene med en absorberende benkblåpute for å minimere direkte omgivelseslysrefleksjoner på pleksiglasslokkoverflaten.
- Slå på UV-lysene i underkammeret.
MERK: Dyrene har ingen direkte kontakt med UV-lyset. Det anbefalte UV-lyset er beskrevet i materialdelen.
- Plasser et stykke filterpapir (24,3 cm x 36,3 cm) i bunnen av hvert RT-VSA-opptaksbur. Avhengig av tidspunktet på dagen, bruk tynt (lysfaseeksperimenter) eller tykt (mørkfaseeksperimenter) filterpapir.
- RT-VSA-opptak
- For å ta opp video fra topp- og bunnkameraene, bruk en programvare for opptak av videoovervåking, som kan konfigureres til å ta opp fra flere webkameraer eller nettverkskameraer samtidig.
- Når du åpner programmet, starter du opptaket ved å trykke på Kommando og R i programvinduet. Utfør videoopptak med en hastighet på 1 ramme per s.
- Umiddelbart etter å ha startet opptakene, gå ut av rommet og lukk døren forsiktig. Sørg for at rommet forblir stille under hele eksperimentets varighet.
- Fullfør RT-VSA-opptak
- Gå tilbake til prosedyrerommet etter 7 timer (lysfaseeksperimenter) eller neste morgen (mørkfaseeksperimenter).
- Stopp opptakene ved å trykke på Kommando og T. Slå av UV-lysene.
- Etter å ha stoppet opptaket, genererer programvaren automatisk en filmfil (i .m4v format) for hvert kamera og lagrer den under kameraets navn i en tidligere valgt målmappe. Kontroller at eksperimentene er organisert i mapper etter dato i hver kameramappe.
- I hver dato-/eksperimentmappe kontrollerer du at det finnes én .m4v-fil og alle individuelle .jpeg-filer som samsvarer med hvert av filmbildene.
- MERK: De .jpeg filene kan brukes til å gjenopprette eksperimentet i tilfelle filmfiler blir ødelagt.
- Opprett en mappe på skrivebordet med navn og dato for eksperimentet, og overfør alle .m4v filer til denne mappen. Hvis det er nødvendig, sletter du de .jpeg filene når filmfilene er lagret og sikkerhetskopiert.
- MERK: For lysfaseeksperimenter vil programvaren generere en film per kamera, mens den for mørkfaseeksperimenter vil generere to filmer for hvert kamera. Dette skyldes at en ny .m4v-fil genereres etter midnatt når datoen endres.
- Kopier mappen som inneholder filmene til en flash-stasjon for analyse i en ekstern datamaskin. Dette trinnet kan ta flere minutter og kan utføres parallelt med trinn 3.5.1 til 3.5.3.
- Rengjøring av opptaksmerder og overføring av forsøksmus tilbake til bosted
- Fjern blåputen som dekker lokkene på burene. Overfør dyrene fra opptaksburene til buret.
- Fjern tilbehør og matvarer i opptakskamrene (dvs. plastigloer, plastrør, tallerken med rester av chow og vanngel og filterpapir) og kast dem i biologisk farlig avfall.
- Rengjør burene med en håndstøvsuger, fjern chow og fecal pellets som er tilstede på bunnen av buret. Spray deretter gulvet og innvendige vegger i buret med 70% etanol og rengjør interiøret med et stykke myk klut. La lokket på burene stå åpent slik at de kan lufttørke.
- Plasser buret med dyrene i en sekundær beholder og transporter dyrene tilbake til deres boligsted.
4. Generering av kalibreringskurver
MERK: En kalibreringskurve er nødvendig for å konvertere tomme flekkområder til urinvolumer. Hvis du utfører eksperimenter i dagens lyse og mørke faser, bør det genereres to kalibreringskurver, en for hver type filterpapir som brukes (tynne og tykke filterpapir). Kalibreringskurver genereres i duplikat. Hver replikat kjøres på et filterpapir plassert i et RT-VSA-opptakskammer. Gitt sin komplekse sammensetning og UV-spenning, bruk musurin til å lage kalibreringskurvene.
- Mus urin samling
- Ta et stykke fleksibel gjennomsiktig film (10 cm x 15 cm) og legg den på en benk.
- Velg en mus ved halen og skrubb den. Masser underlivet mykt for å indusere vannlating. Samle urin på overflaten av det gjennomsiktige filmplastarket.
- Slipp dyret forsiktig inn i buret. Bruk en pipette til å overføre urinen fra overflaten av den gjennomsiktige filmen til et sterilt mikrosentrifugerør på 1,5 ml. Gjenta prosedyren med flere mus til ~10 ml museurin er samlet, samle urinen og oppbevar ved -20 °C.
MERK: Totalt ~ 10 ml museurin er nødvendig for å generere dupliserte kalibreringskurver for lyse og mørke faser. For å unngå å stresse eksperimentelle mus, ikke bruk mus som vil bli utsatt for RT-VSA-eksperimenter for urininnsamling.
- Opptak av kalibreringskurve
- Tine urinen som samles opp i trinn 4.1 og bland den forsiktig ved å virvle forsiktig i 10–15 s.
- Plasser et stykke tynt filterpapir (24,3 cm x 36,3 cm) i hver av de to RT-VSA-opptaksburene.
- Pipetter følgende urinvolumer (i μL) på hvert av filterpapirene: 2, 5, 10, 25, 50, 80, 100, 200, 300, 400, 500 og 750. For å forhindre flekkoverlapping som følge av diffusjon, tilordne flekkene i tilstrekkelig avstand fra hverandre.
- Lukk lokket på burene og dekk dem med pads.
- Start opptaket ved å trykke på Kommando og R, og bruk de samme programvareparametrene som ble brukt til å registrere eksperimentene (trinn 3.3.).
- Registrer kalibreringskurven i 1 time for å muliggjøre maksimal diffusjon av urinflekkene. Trykk på Kommando og T for å stoppe opptaket.
- Opprett en ny mappe på skrivebordet, plasser de .m4v filene i den, og overfør deretter dataene til en flash-stasjon for senere analyse.
- Utfør en lignende prosedyre for å generere dupliserte kurver med tykt filterpapir. I dette tilfellet legger du til ekstra lag med pads for å mørke interiøret og simulere mørke faseforhold.
- Analyse av registreringene av kalibreringskurven
- Åpne de .m4v filene i en filmspillerprogramvare, og maksimer vinduet for å fylle skjermen. For å analysere kalibreringskurvene som utføres på tykt filterpapir, bruk filene som er oppnådd med de øverste kameraene (figur 3A). For å analysere kalibreringskurvene som utføres på tynt filterpapir, bruk filene som er oppnådd med de nederste kameraene (figur 3B).
- Spill av .m4v filen, flytt tidsglidebryteren fremover og bakover for å få en oversikt over hele filmen med 1 timers kalibreringskurve.
- Identifiser tidsintervallet der de mindre urinflekkene (<25 μL) har størst intensitet og har spredt seg maksimalt. Ta et skjermbilde innenfor dette tidsintervallet. Gi skjermbildefilen et navn, og lagre den som en .png fil (figur 3A, øvre panel).
MERK: Skjermbilder tas ved å trykke på tasten F6. For å konfigurere F6 for skjermbildeinnhenting, velg: Systemvalg > tastatur > snarveier, og skriv F6 i boksen til høyre for alternativet Lagre bilde av skjerm som en fil . - Identifiser tidsområdet der de mellomstore og store urinflekkene (>50 μL) har maksimalt område og ta et skjermbilde. Det er mulig at noen av de mindre urinflekkene ikke vil være synlige når de større urinflekkene utviser maksimal diffusjon. Gi filen et navn, og lagre skjermbildet som en .png fil (figur 3A, nedre panel).
- Åpne ImageJ-programvaren (NIH) og dra og slipp deretter filikonet .png i trinn 4.3.3 for å åpne bildefilen (figur 4A).
- Velg ikonet Polygonvalg på verktøylinjen, og avgrens kantlinjen på filterpapiret.
- Velg deretter Analyser fra menylinjen, velg Angi mål fra den utvidede menyen, og velg Område fra vinduet som dukker opp. Klikk OK. Dette gjør det mulig å oppnå verdier av areal når trinn 4.3.8 utføres.
- Velg deretter Analyser igjen fra menylinjen og velg Mål fra de utvidede alternativene. Det vises et resultatvindu som inneholder et kolonneområde som viser områdeverdiene i piksel2 (figur 4B–D).
- Velg frihåndsvalgikonet fra verktøylinjen, og bruk det til å tegne en linje rundt omkretsen av et enkelt tomrom. Mål området som i trinn 4.3.8. Programvaren oppdaterer resultattabellen etter hvert som nye målinger utføres. Det nye settet med tall vises under de forrige. Registrer tallet som vises under kolonneområdet i resultatvinduet for hvert analyserte punkt (figur 4E–G).
- Gjenta trinn 4.3.5 til 4.3.7 for hvert av de replikerende punktene.
- Sett det totale arealet av filterpapiret til 100% og beregne prosentandelen av arealet (% areal) for hvert urinpunkt. Denne normaliseringen vil rette opp feil som kan oppstå som følge av forskjeller i kameraets zoom eller plassering.
- Opprett en ny XY-tabell i et grafprogram og sett inn verdiene for urinvolum (i μL) i X-kolonnen og dupliserte verdier av% område i Y-kolonnen.
- Velg deretter Analyse > Analyser > XY-analyse > ikke-lineær regresjon (kurvetilpasning). Fra parametervinduet som vises, velger du Modell > polynom > andre ordens polynom (kvadratisk).
- Deretter, fra metodefanen, klikker du for å merke følgende valg: Minste kvadraters regresjon, Ingen vekting, og Vurder hver replikere Y-verdi som et individuelt punkt.
- Fra betingelsesfanen velger du for B0, Betingelsestype > Konstant lik og 0 under Verdi-kolonnen. Klikk OK.
5. Analyse av de eksperimentelle museopptakene
- Åpne en filmfil samlet inn i lysfasen (nederste kamera) eller mørk fase (øvre kamera) for analyse.
- Vurder kvaliteten på filmfilen ved å flytte tidsrullen fremover og bakover, og bekreft at filterpapiret forblir intakt (uten riving eller tygging) i løpet av tidsvinduet på 6 timer som skal analyseres. Hvis papiret er revet, må du ikke utføre ytterligere analyser, da musen kan ha urinert på den eksponerte plasten som ikke kan kvantifiseres (figur 5).
- Hvis du vil analysere eksperimenter som er samlet inn i lyse eller mørke faser, bruker du hurtigspolingskommandoen eller glidebryteren for tidslinje for å gå til ønsket tidsvindu. Tømmingsaktivitet i lysfasen registreres mellom kl. 11.00 og kl. 17.00 (ZT = 4.0–10.0) og i mørkefasen mellom midnatt og kl. 06.00 (ZT = 17.0–23.0).
- Spill av filmen i hurtigspolingsmodus ved å klikke på >> -ikonet (eller bla manuelt gjennom filmen), på jakt etter bevis på at musen tømmer. Den enkleste måten å fortelle at dette skjer, er å se etter det plutselige utseendet på lyse flekker av urin på filterpapiret. En annen indikator er å se etter atferdsendringer, inkludert bevegelse til hjørnene av buret og en kort periode med inaktivitet når musen tømmer.
MERK: Etter hvert som man blir flinkere til å oppdage tomrom, kan man øke hastigheten på rulling eller spole fremover. Men hos mus med bakteriell og kjemisk indusert blærebetennelse, som har svært stort antall små tomrom 4,34, kan man gå glipp av tømmingshendelser hvis man beveger seg for raskt gjennom filmen. - Registrer tidspunktet da hvert tomrom oppstår. Som konvensjon registreres tidspunktet for tomrommet ved første tegn på at urin oppdages (figur 6A,B).
- For å gjøre målinger av tomrommet, bruk først rullefeltet til å bevege deg fremover (eller bakover) i tide, og se etter tidspunktet når maksimal diffusjon av urinflekken har skjedd. Sett filmen på pause nå, og ta et skjermbilde som beskrevet i trinn 4.3.3. Plasser pilen til datamusen på stedet som analyseres, slik at interessepunktet markeres i skjermbildet (figur 6C,D).
- Gi skjermbildefilen et navn ved hjelp av korrelative tall for å ta hensyn til rekkefølgen på utseendet i filmen.
- Fortsett å analysere filen ved å gjenta trinn 5.5 og 5.7 for hvert tomrom i filmen. Når alle tomromspunktene er analysert, måler du det totale arealet av filterpapiret ved å ta et skjermbilde og bruke trinnene beskrevet i 4.3.6.
- Beregn %-arealet av hver av urinflekkene som beskrevet i trinn 4.3.9. Transformer verdiene av % areal til volum av urin (μL) for hvert tomrom spot ved hjelp av kalibreringskurvene generert i trinn 4 og interpolatfunksjonen i grafprogramvaren.
- I grafikkprogramvaren åpner du XY-tabellen som inneholder dataene for kalibreringskurven og setter inn %-områdeverdiene i Y-kolonnen under den siste verdien av kalibreringskurven (figur 7A).
- Klikk på kategorien Resultattabell , og under modellfanen klikker du for å velge Interpolere ukjente fra standardkurve og trykker OK. En tabulator kalt interpolerte X-middelverdier vises ved siden av resultattabellen. Denne kategorien inneholder en tabell med de interpolerte verdiene som tilsvarer volumet av urin i μL for hvert tomromspunkt. (Figur 7A,B).
- Gjenta trinn 5.1 til 5.9 for å analysere alle eksperimentelle mus.
- Opprett en arbeidsbokfil som inneholder dataene fra trinn 5.5 til 5.10, ved hjelp av ett regneark per mus (figur 7C). Lag en fil for lysfaseeksperimentene og en annen for de mørke faseeksperimentene. Disse masterfilene inneholder alle rådata og nødvendige beregninger som brukes i videre analyser.
6. Analyse av urineringsmønsteret til eksperimentelle mus
- Generer primære og sekundære voidpunktprofiler (figur 8A, B og figur 9).
MERK: Ifølge frekvensfordelingsstudier 23 representerer tomme flekker som er ≥20 μL typisk >95% av det totale tømmede volumet og regnes som primære voidpunkter (PVS)8,23,35. Tomme flekker som er ≤20 μL betraktes som sekundære eller små tomromsflekker (SVS). Diskriminering mellom PVS og SVS har vist seg å være en nyttig tilnærming for å karakterisere tømming av fenotyper. Et forhøyet antall SVS-er indikerer vannlatingsdysfunksjon35.- Fra hovedfilen som inneholder tømmingspunktdata av interesse (lysfase eller mørk fase), klassifiserer du flekkene basert på volumet som PVS-er når volumet er ≥20 μL, eller SVS-er når volumet er <20 μL.
- Tell tallet og beregn gjennomsnittlig tømmet volum og totalvolumet for PVS-ene. Tell tallet og beregn totalvolumet for SVS-ene.
- Generer en graflinje som sammenligner kontrollen med de behandlede musene for hver av de beregnede parameterne: antall PVS-er, tømmet volum av PVS-er, totalt volum av PVS-er, antall SVS-er, totalt volum av SVS-er.
- Valgfritt: Generer et kumulativt tomt volumplott (trappefunksjon) for å vise uttømmingsatferd over tid (figur 10 og figur 11).
- Åpne arbeidsbokens hovedfil og konverter tidspunktet for tømming, som uttrykkes i timer, minutter og sekunder, til desimalform. Beregn kumulativt urinvolum (i μL) for hvert tidspunkt.
- Generer en XY-tabell i grafprogramvaren med tid i desimalform i X-kolonnen og kumulative urinvolumer i Y-kolonnen. Kopier klokkeslett- og urinvolumdataene til tabellen. Legg til datapunkter (0; 0) og (6; maksimumsverdi). Disse punktene er nødvendige for å fullføre de horisontale linjene i plottet ved starten av forsøket (tid: 0 timer) når det tømmede volumet er null (0; 0), og ved slutten av forsøket (tid: 6 timer) når den kumulative verdien av den tømmede urinen er lik verdien oppnådd for den siste tømmingshendelsen (6; maksimumsverdi).
- Dobbeltklikk på grafen; Vinduet Formater graf skal vises. Velg kategorien Utseende , klikk for å fjerne merket for knappen for Vis symboler , og klikk for å velge Vis koblingslinje/kurve. Klikk på Stil-alternativet og velg Overlevelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tømming av oppførsel av urotelial Piezo1/2 knockoutmus
Under lagringsfasen av miksjonssyklusen antas urotelet å føle spenningen som utøves av urinen som akkumuleres i blæren og å transducere denne mekaniske stimulansen til cellulære responser som serosal ATP-frigjøring 1,3. Vi har tidligere vist at mekanisk aktiverte PIEZO1- og PIEZO2-kanaler uttrykkes i museurotelet 3,36. For å avgjøre om uroteliale PIEZO-kanaler er viktige for normal tømmingsatferd, utførte vi RT-VSA på urotelbetingede Piezo1/2 doble knockoutmus (Pz1/2-KO) mus og alders- og kjønnsmatchede kontroller (Pz1/2-C; Figur 9). Vi testet både hunnmus og hannmus i 6 timer i løpet av dagens mørke og lyse faser, og analyserte dataene som beskrevet i trinn 6.1. Når vi sammenlignet tømmingsaktiviteten mellom dagens lyse og mørke faser for kontrollgruppene, ble det lagt merke til at både kvinner og menn viste en økning i antall og totalt volum av PVS i løpet av deres aktive periode. Denne observasjonen indikerer at selv om musene var i et fremmed miljø, ble den sirkadiske karakteren av musetømmingsadferd (høyest under deres aktive mørke fase) bevart. Under deres inaktive lysfase observerte vi ingen signifikante forskjeller i noen av parametrene analysert for kvinnelige eller mannlige Pz1/2-KO-mus sammenlignet med kontrollmotpartene (Pz1/2-C). Men da vi testet dyrene i den aktive mørke fasen, viste både kvinnelige og mannlige Pz1/2-KO-mus en endret tømmingsfenotype, karakterisert ved en signifikant økning i antallet og i det totale volumet av SVS-er (figur 9). Det var ingen signifikante forskjeller i PVS-tall, gjennomsnittlig volum per PVS eller totalt PVS-volum hos hunnlig eller mannlig Pz1/2-KO sammenlignet med tilsvarende kontroller. Disse resultatene indikerer at uroteliale PIEZO1/2-kanaler ikke spiller en betydelig rolle i tømmingsfunksjonen under musens inaktive lysfase, men er viktige for å forhindre hyppige flekker i den aktive mørke fasen.
Resultatene som presenteres i figur 9 illustrerer to av fordelene ved å bruke RT-VSA versus endepunktet VSA. For det første, hvis analysen bare ble utført i lysfasen, ville vi ha feilkonkludert med at urotelial PIEZO1/2-kanaler ikke hadde noen rolle i tømmingsfunksjonen. For det andre ble SVS-er i de fleste endepunkt VSA-studiene behandlet som eksperimentell støy, og i noen tilfeller ekskludert fra senere analyse23. I RT-VSA kunne vi fastslå at SVS-ene var individuelle hendelser, ikke sekundære til PVS-er (overføring eller slutt på miksjonsdribling) og var frivillige i den forstand at dyrene beveget seg til periferien av buret, annullerte og deretter dro. Denne observasjonen ga oss verdifull informasjon om fenotypen til Pz1/2-KO-mus som ellers ville ha blitt savnet.
Tømmingsatferd hos hunnmus under basale forhold og etter cyklofosfamidbehandling
I dette piloteksperimentet testet vi effekten av cyklofosfamid (CYP) på musens frivillige tømmingsadferd. Cyklofosfamid, et stoff som brukes til å behandle noen former for kreft eller immunologiske lidelser, er kjent for å forårsake blærekatarr hos pasienter og forsøksdyr, noe som resulterer i en overaktiv blærefenotype preget av flere, små tømmingshendelser 26,37,38. For å bestemme grunnlinjen for tømming, plasserte vi en ubehandlet hunnmus i RT-VSA i den mørke fasen. Samme mus ble injisert intraperitonealt med en dose CYP (150 mg/kg) 5 dager senere for å forårsake akutt cystitt. Umiddelbart etter injeksjonen ble musen plassert i et RT-VSA-bur for opptak. Tømmingsatferden er representert i et trinnplott (figur 11), der de vertikale linjene representerer volumet av urin som er tømmet og de horisontale linjene representerer tiden. Sammenlignet med resultatene oppnådd under basale forhold, er det tydelig at mengden urin som frigjøres per tomrom er mindre etter CYP-behandling, og at miksjonshendelsene er mye hyppigere. Dette kan bli bedre verdsatt i begynnelsen av grafen, der de første 30 minuttene av den analyserte perioden (tilsvarer midnatt til 00:30 [7,0 til 7,5 timer etter injeksjon]) er forstørret.
Figur 1: RT-VSA-opptakskammeret. (A) RT-VSA-opptakssystemet inkluderer en øvre del, som består av to side-ved-side, klare, akrylkamre og tilhørende øvre kameraer. Den nedre halvdelen av enheten er et enkelt enhetsstativ som holder de øvre musekamrene og inneholder bunnkameraene og UV-lysene. Interiøret i veggene på stativet er laget av speilpaneler som reflekterer UV-lyset for å gi jevn belysning til bunnen av burene. Not depicted er en datamaskin som mottar en videofeed fra kameraene og registrerer dataene. (B) Modell av musekammeret med komponenter og dimensjoner. 1) standard løftehengsel; 2) kamera montering brakett; og 3) lite overgang hjørne brakett. Fremre (C) og topp (D) visning av UV-stativet med komponenter og dimensjoner. UV-lys er montert i det indre av front- og bakprofilene med rette flate plater. En 32 i profil festet til stativets hovedramme med to lite overgang hjørnebraketter brukes til å montere kameraene. Rette flate plater brukes til å feste kameraene til 32 i profil. Et speilpanel er montert på innsiden av stativet (ikke vist). 1) fem-hulls tee flat plate; 2) fem-hulls T flat plate; og 3) fem-hulls L flate plater. Alle verdier som presenteres er i tommer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: RT-VSA musekammer. Før eksperimentelle prosedyrer fremstilles hvert eksperimentelle musekammer ved å fôre det med et stykke filterpapir (nummerert 1). Avhengig av hvilken periode på dagen eksperimentet utføres, er filterpapiret som brukes enten tykt (mørk fase) eller tynt (lysfase). En plastkuppel er plassert i midten av kammeret (nummerert 2), en plastfat med vann (i form av ikke-fuktende vanngel) og chow er plassert på den ene siden av kuppelen (nummerert 3), og et plast 1,5 ml mikrosentrifugerør, en form for anrikning, plasseres på motsatt side (nummerert 4). Det første arrangementet av elementer i buret holdes konsistent i alle eksperimenter. Legg merke til at et stykke filterpapir er plassert mellom de to naboburene og er merket i figuren med en stjerne. Dette er for å forhindre påvirkning av visuelle signaler som oppstår fra nabomusen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Kalibreringskurve. Representative bilder av tykke (A, venstre paneler) og tynne (B, venstre panel) filterpapir flekket med kjente mengder museurin. Bilder er skjermbilder fra videoopptak tatt med toppkamera (A, venstre panel) eller bunnkamera (B, venstre panel). Røde piler peker på de 2 μL urinflekkene, og tallene under flekkene er spotvolumverdiene i μL. Legg merke til at de små urinflekkene (<50 μL) i det øvre bildet av panel A som er synlige kort tid etter urinspotting (5 min), ikke lenger er merkbare etter 30 min (nedre panel). Høyre paneler: Plott av tomromsflekkareal (uttrykt som prosentandelen av det totale filterpapirarealet) som en funksjon av urinvolumet. Som nevnt av andre, følger dataene om tomromsflekkareal som en funksjon av urinvolumet ikke et lineært forhold30. Dermed tilpasser vi dataene til et andreordens polynom ved hjelp av ikke-lineær regresjon. Data var begrenset slik at X = 0 til Y = 0. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Bestemmelse av filterpapir og urinflekkområder ved bruk av ImageJ. (A) Et skjermbilde av kalibreringskurven vist i figur 3A åpnet i ImageJ. Det boksede området i (A) vises mer detaljert i (B). (B) Mangekantmarkeringsikonet velges (sirklet inn i rødt) for å tegne en polygon langs omkretsen av filterpapiret (delvis visning; gul linje med røde piler som peker mot nodene som genereres av markeringsverktøyet). (C) Arealet av polygonen gjenspeiler det totale arealet av filterpapiret og måles ved å velge Analyser > mål (rød sirkel). (D) Verdien av området (i piksler) vises i et resultatvindu (rød sirkel). (E) For å måle arealet til et enkelt tomromspunkt velges frihåndsvalgverktøyet (rød sirkel) og i (F) brukes til å tegne en linje rundt kanten av flekken (den røde pilen peker mot stedet). Ved å bruke samme kommando som i (C) måles arealet av tomromspunktet, og resultatet vises som en ny verdi i resultatvinduet, rett under den siste målingen som ble tatt (panel G, rød sirkel). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Vurdering av filterpapirstatus etter avsluttet RT-VSA-eksperimenter. Representative bilder av musekammeret som viser forskjellige forhold for filterpapiret under eller etter et RT-VSA-eksperiment. Filterpapir som forblir intakt til slutten av testperioden, vises i (A) og representerer den vanligste situasjonen og tilstanden som et eksperiment kan analyseres under (grønt hake). Eksempler på skadet filterpapir er vist i (B) og (C), og er representative for eksperimenter som ikke må analyseres videre (rød X). I (B) ble filterpapiret makulert av musen (rød pil) i et av hjørnene. Den stiplede gule linjen markerer grensen til burets gulv. Det boksede området forstørres i bildet til høyre. I (C) ble integriteten til eksperimentet kompromittert som et resultat av at ikke-fuktende vanngel (rød pil) ble flyttet av musen inn i hjørnet, og etterlot tre store vannflekker (røde stjerner). Disse bevegelsene ble bekreftet ved å se videoen. Bilder er skjermbilder fra filmfiler oppnådd i den mørke fasen, ved hjelp av toppkameraet, og med buret foret med tykt filterpapir. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Bestemmelse av tidspunktet for tømming og innsamling av skjermbilder for målinger av ugyldige flekkarealer. (A,B) Skjermbilde av en mus i et hjørne av kammeret, med et tomrom som nettopp har blitt synlig. Tidspunktet for denne rammen er annotert som tidspunktet for ugyldighet. (C,D) Når tomromspunktet når maksimal diffusjon, tas et skjermbilde for å bestemme volumet på tomrommet. Bilder er skjermbilder fra filmfiler oppnådd med toppkameraet, ved hjelp av tykt filterpapir og i den mørke fasen. Analyseperioden var midnatt til klokken 06.00. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: Transformasjon av tomromsområde til urinvolum og generering av en regnearkfil med eksperimentelle rådata. (A) Skjermbilde av vinduet for grafisk programvare som viser verdier for ugyldige flekker uttrykt som prosentandelen av det totale filterpapirområdet (data skissert i grønt). Regnearket (grønn pil) lagres under datatabeller-delen. (B) Omregning av prosentandelen av totalt areal til urinvolum (data skissert i rødt). De sistnevnte verdiene er vist i resultatdelen (rød pil) og beregnes fra kalibreringskurven ved hjelp av interpolere ukjente fra standard kurvefunksjon. (C) Skjermbilde av et regneark med kompilerte rå og beregnede data. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Klassifisering av tomromsflekker i PVS og SVS og deres analyse. Skjermbilder av regneark (generert som vist i figur 7C) fra en mus under basale forhold (A) og 7 timer etter å ha mottatt en dose cyklofosfamid (150 mg / kg) (B). Tomme flekker klassifiseres som primære voidpunkter (PVS) hvis volumet er ≥20 μL, eller som små tomromsflekker (SVS) hvis volumet er <20 μL. Merk at i den ubehandlede musen (A) er alle vannlatingshendelser PVS, mens i det cyklofosfamidbehandlede dyret er de fleste hulrom SVS. Den sirklede tabellen i hvert panel (rødt omriss) inkluderer følgende sammendragsstatistikk: antall tomrom, gjennomsnittlig tømmet volum og totalt tømmet volum. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 9: Tømmingsatferd av Piezo1/2 knockout og kontrollmus. Tømmingsoppførselen til kvinnelige (A) og mannlige (B) Piezo1/2 knockout (Pz1/2-KO) mus og kontrollmotparter ( Pz1/2-C ) ble registrert i løpet av et 6 timers tidsvindu i den mørke eller lyse fasen av dagen, og resultatene analysert som beskrevet i trinn 6.1. Data vises som gjennomsnitt ± standard gjennomsnittsfeil (S.E.M.). Data ble sammenlignet med en Mann-Whitney-test. Forkortelser: PVS = primære tomromsflekker; SVS = små tomromsflekker; NS = ikke signifikant; * p < 0,05; ** p < 0,01. Dette tallet er endret fra3. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 10: Regneark for beregning og grafisk fremstilling av det kumulative tømmede volumet som en funksjon av tid. (A) Skjermbilde av regnearket generert i figur 7C som viser beregningene som trengs for å generere et trappfunksjonsplott av det kumulative volumet av urin som er fjernet som en funksjon av tid. Tiden må angis i desimalformat (kolonne G, rød firkant). For å transformere klokkeslettet til desimalformat ble det lagt til tre kolonner (røde piler) til høyre for kolonnen for tømming for å kommentere separat verdiene av timer (kolonne D), minutter (kolonne E) og sekunder (kolonne F) og det endelige resultatet av tid i et desimalformat (kolonne G). Hvis du vil transformere tidstømmingen til et desimalformat, bruker du følgende funksjon: (h) + (min/60) + (s/3 600). En kolonne ble lagt til til høyre for urinvolumkolonnen for å vise kumulativt urinvolum (blått rektangel), som beregnes som summen av alle urinvolumer (kolonne J) oppnådd frem til tidspunktet for en ny tømmingshendelse (inkludert den nye hendelsesverdien). (B) Skjermbilde som viser data kopiert fra regnearket i panel A og limt inn i kolonne X (tid i desimalformat) og kolonne Y (kumulative urinvolumer) i et grafisk programvareprosjekt. Første og siste tidspunkt i tegningen settes til radene 0 og 6 (maksimumsverdi), som angitt av de røde pilene. (C) For å generere et trinnplott, formateres grafen ved å fjerne markeringen for vis symbolfeltet, aktivere alternativet vis koblingslinje/kurve og velge overlevelsesstil, som vist i feltene omkranset av rødt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 11: Representative resultater av musetømmingsatferd under basale forhold eller etter cyklofosfamidadministrasjon. Den frivillige tømmingsatferden til en mus ble vurdert av RT-VSA i den mørke fasen før (basal) og 7 timer etter administrering av cyklofosfamid (CYP), som beskrevet i de representative resultatene. Tidspunktet og volumet for ugyldighetshendelsene er representert i et trinnplott som ble generert som beskrevet i trinn 6.2. Innfellingen av grafen representerer området av tomten merket med et grønt rektangel og tilsvarer de første 30 minuttene av den analyserte perioden. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 12: Identifisering av overlappende urinflekker med RT-VSA. Skjermbilder av videobilder tatt med det øverste kameraet i den mørke fasen av et RT-VSA-eksperiment (bilde 1 og 2). Det boksede området i bilde 2 er forstørret i bilde 3. Musen tømmes i samme øvre høyre hjørne ytterligere to ganger i løpet av de neste timene (bilder 4–6). Til tross for overlapping av tomromsflekker, ble de individuelle tømmingshendelsene lett oppdaget ved hjelp av RT-VSA. For å visualisere hvordan disse hendelsene ville se ut som en endepunktanalyse, eksponerte vi hjørnet av filterpapiret for forskjellige lysforhold. Under synlig omgivelseslys kunne bare én enkelt stor flekk identifiseres (bilde 7). På samme måte, hvis denne samme regionen ble undersøkt under UV-lys, var det bare en enkelt mørk flekk som kunne skilles (bilde 8). Dermed oppdages flere hulrom i samme region lett av RT-VSA, men slik diskriminering er ikke mulig hvis analysen utføres som en endepunktsanalyse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Inkorporering av videoovervåking er en kostnadseffektiv modifikasjon som gir flere fordeler i forhold til den klassiske VSA. I klassisk VSA, som vanligvis brukes som endepunktsanalyse, er det vanskelig å skille overlappende tomromsflekker. Dette er ikke en triviell bekymring, da mus har en tendens til å urinere flere ganger i samme område når analysen forlenges i flere timer, vanligvis i hjørnene av buret. Dermed er den første fordelen med RT-VSA at etterforskeren lett kan identifisere individuelle flekker som har blitt avsatt helt eller delvis oppå hverandre. Dette er godt illustrert i forsøket vist i figur 12. I dette tilfellet bekrefter videoopptak at musen tømmes tre ganger i samme hjørne, og deponerer overlappende tomromsflekker. Hvis filterpapiret bare ble analysert på slutten av forsøket, på den måten som er typisk for en VSA, kunne bare ett sted skilles. Så mens det klassiske endepunktet VSA kan være nyttig for å identifisere store forskjeller i vannlatingsatferd, kan det mislykkes i å diskriminere mellom mer subtile fenotyper. Med dagens fremskritt innen genetikk og generering av transgene dyr, er det viktig å utvikle metoder som nøyaktig kan vurdere tømmingsadferd.
For det andre gir RT-VSA etterforskeren tidsmessig informasjon om annulleringshendelsene. Dermed kan man bestemme sanne miktureringsfrekvenser, samt etablere forhold mellom tømmingshendelser. For eksempel, i en situasjon der en klynge av SVS-er observeres ved siden av en enkelt stor PVS, i den klassiske VSA, kan man ikke lett diskriminere om musen tømmet flere ganger under forsøket (med tre små og ett stort tomrom) eller hvis dyret avsatte ett stort urinvolum, og de tre mindre flekkene er et resultat av dribling eller overføring fra pels etter mikturering. RT-VSA kan brukes til å løse disse spørsmålene.
For det tredje tillater RT-VSA en å analysere oppførselen til en mus før, under og etter tømmingshendelsen. Etterforskeren kan også overvåke musens generelle aktivitetsprofil ved å analysere RT-VSA-opptak med fritt tilgjengelig programvare som Mouse Behavior Tracker39. I tillegg kan man diskriminere om et dyr slutter å urinere (typisk oppførsel hos hunner), om dyret er i bevegelse under tømming (som hos hanner kan resultere i etterfølgende tomromsflekker), eller om det tømmes under søvn-/hvilefasen. Vi har observert sistnevnte oppførsel, selv om det normalt er sjeldent. Således, hvis riktig validert og tolket, kan observere voiding atferd gi etterforskeren verdifull innsikt i voiding dysfunksjon, inkludert for eksempel nokturi eller inkontinens. RT-VSA (og VSA) tillater etterforskere å bestemme brøkdelen av tomromhendelser som oppstår i det sentrale området av et bur, i motsetning til hjørnene. Normalt er sentertømming sjelden, og økt antall slike hendelser er et tegn på blæredysfunksjon 8,22. Det eneste unntaket er dominante alfahanner, som urinerer ofte og over hele innhegningen20. For å utføre en analyse av sentral tømming ved hjelp av RT-VSA, bør man vurdere å flytte matfatet til en sidevegg og fjerne kuppelen (eller feste den til et bestemt område av buret), slik at romlige mønstre av vannlating lettere kan etableres.
For det fjerde gjør RT-VSA det mulig å håndtere påkjenningene forbundet med merdutveksling mer effektivt sammenlignet med klassisk VSA. Mus er skvetne av natur og håndtering av dem eller overføring til et nytt miljø forårsaker stress, som er kjent for å påvirke voiding atferd35. Av sin natur er det vanskelig å innlemme en akklimatiseringsperiode i standard VSA. I motsetning til dette, i RT-VSA, kan en akklimatiseringsperiode enkelt innlemmes i hvert eksperiment, og eventuelle tømmingshendelser i denne perioden ignoreres under analysen. Et ekstra stressavlastende aspekt ved RT-VSA implementert i denne protokollen er duplisering av forhold under hvilke mus normalt er plassert (dvs. tilgang til mat og vann ad libitum, en kuppel og et leketøy). Dette er, så vidt vi vet, et av de rikeste miljøene som er beskrevet for denne typen eksperimenter. I et typisk endepunkt VSA blir mus fratatt vann (og noen ganger også mat)8,22, som vi gir ad libitum.
For det femte, i tillegg til den positive effekten som dette berikede miljøet kan ha på stressnivået til mus, tillater det etterforskeren å utføre RT-VSA i lengre perioder, vanligvis i 6 timers tidsvinduer; Men mer nylig har vi utført eksperimenter som kjører i 24 timer (data ikke vist). Dette er ideelt når man vurderer effekten av sirkadisk rytmisitet eller når man studerer mus som kan utvise en underaktiv blærefenotype, og dermed urinere sjelden.
For 24 timers videoovervåking anbefaler vi å bruke tynt filterpapir og analysere eksperimentene ved hjelp av de nederste kameraene. Denne kombinasjonen av papirtype og kamera er det beste alternativet som gir mulighet for følsomhet for deteksjon i mørke og lyse faser. Som nevnt tidligere kan bunnkameraer ikke lett oppdage tomme flekker på det tykke filterpapiret, og toppkameraer oppdager ikke pålitelig tomromspunkter i lysfasen. Hvis du utfører disse utvidede analysene, foreslår vi at du plasserer dyrene i registreringsburene kl. 17:00, analyserer fra kl. 18:00 på dag 1 og fullfører forsøket kl. 18:00 påfølgende dag.
Mens RT-VSA har mange positive aspekter, er det noen forbehold verdt å merke seg. Mens vi gjør alle forsøk på å begrense stress når vi utfører disse analysene, kan vi ikke helt replikere musens habitat, da dyrene normalt er gruppehus. De drikker også vann fra en flaske i stedet for å få vann fra ikke-fuktende vanngel. Vår observasjon om at mus har færre tomrom i løpet av sin inaktive lysfase kontra deres aktive mørke fase, indikerer imidlertid for oss at musene beholder sine normale mønstre av sirkadisk tømmingsadferd40. Reflekterer deres lett stressede natur, fant vi at mus utviser forstyrret tømmingsadferd på dagene med burrengjøring. Dermed må man begrense analysen til perioder hvor dyrene vil bli mindre påvirket av rutinemessig dyrehold. En viktig faktor å vurdere er om UV-lyset har noen innvirkning på tømmingsfunksjonen. Fordi våre funn viser en tydelig sirkadisk forskjell i VSA-parametere mellom lyse og mørke faser, som er konsistente med andre teknikker som beskriver et lignende fenomen, men ikke bruker UV-lys40, konkluderer vi med at UV-lysbelysning ikke påvirker vannlatingsfunksjonen. Legg merke til at filterpapiret hindrer lys i å passere fra det nedre kammeret til det øvre kammeret.
En ekstra advarsel er at jo lenger man holder musene i kammeret, desto mer sannsynlig er det at de tygger eller skader filterpapiret (uavhengig av tykkelsen på papiret). Mens ingen av dyrene forstyrret papiret i lysfasen, skadet nesten 30% av musene papiret i den mørke aktive fasen. I analysen av 24-timers forsøkene observerte vi at en tilsvarende andel (en tredjedel) av forsøkene ikke kunne analyseres på grunn av papirskader, noe som betyr at ikke bare mengden tid, men også fasen av dagen påvirker dyrets makuleringsoppførsel. Dessverre har vi etter vår erfaring lagt merke til at et dyr som forstyrrer burets papir, vil fortsette å gjøre det selv ved ny testing. Som nevnt ovenfor urinerer mus noen ganger på det nakne akrylgulvet, og dermed tap av papiret gjør analysen ufullstendig og av begrenset verdi.
Videre kan analysen av mannlig tømmingsadferd være vanskeligere ettersom de har en tendens til å tømme oftere, de kan drible etter tømming, og det er en populasjon av menn (20%) med en mer aggressiv alfa-mannlig fenotype preget av et stort antall små hulrom som er fordelt over buret, som diskutert i en tidligere publikasjon3. Siden denne alfahannatferden kan utgjøre en konfunderende faktor for å etablere tømmingsfenotyper, ekskluderer vi dyr med ≥50 (lysfaseforsøk) eller ≥100 (mørkfaseforsøk) tomrom fra analyse.
Det er situasjoner der diskriminering av tomrom basert på deres volum (dvs. PVS vs SVS) ikke nødvendigvis er berettiget. For eksempel, etter vår erfaring, har mus med bakteriell eller kjemisk blærebetennelse en tendens til å tømme mindre volumer enn kontroller 4,34. Det er imidlertid store forskjeller i det tømmede volumet mellom individuelle mus; i noen har de fleste hulrom et volum ≤20 μL, mens i andre er flertallet >20 μL. Følgelig gir diskrimineringen av det tomme volumet ingen fordel for karakteriseringen av disse fenotypene.
I sum er RT-VSA et enkelt å implementere verktøy for å analysere musetømmingsadferd i fritt mobile mus. I motsetning til verktøy som cystometri, krever det ikke kirurgisk implantasjon av et kateter eller ikke-fysiologiske mengder blærefylling. Det gjør det mulig å bestemme tømmingsadferd hos begge kjønn av mus, over lengre perioder, og i de lyse og mørke fasene av dagsyklusen. Det er også relativt rimelig, spesielt sammenlignet med mer spesialiserte og dyre enheter som metabolske bur. Selv om det er advarsler knyttet til dette verktøyet, er de generelt enkle å administrere. Endelig kan denne teknikken lett tilpasses andre dyrearter, inkludert andre gnagere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av en NIH-stipend R01DK119183 (til GA og MDC), en pilotprosjektpris gjennom P30DK079307 (til MGD), en American Urology Association Career Development Award og et Winters Foundation-stipend (til NM), og av Cell Physiology and Model Organisms Kidney Imaging Cores fra Pittsburgh Center for Kidney Research (P30DK079307).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots – cut to 10 inches | 80/20 | 1010 | Amount: 20 |
| 1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots – cut to 12 inches | 80/20 | 1010 | Amount: 6 |
| 1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots – cut to 40 inches | 80/20 | 1010 | Amount: 4 |
| 1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots – cut to 14.75 inches | 80/20 | 1010 | Amount: 12 |
| 1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots – cut to 32 inches | 80/20 | 1010 | Amount: 5 |
| 1/4-20 Double Slide-in Economy T-Nut | 80/20 | 3280 | Amount: 16 |
| 1/4-20 Triple Slide-in Economy T-Nut | 80/20 | 3287 | Amount: 18 |
| 10 & 25 Series 2 Hole - 18mm Slotted Inside Corner Bracket with Dual Support | 80/20 | 14061 | Amount: 6 |
| 10 Series 3 Hole - Straight Flat Plate | 80/20 | 4118 | Amount: 8 |
| 10 Series 5 Hole - "L" Flat Plate | 80/20 | 4081 | Amount: 8 |
| 10 Series 5 Hole - "T" Flat Plate | 80/20 | 4080 | Amount: 8 |
| 10 Series 5 Hole - Tee Flat Plate | 80/20 | 4140 | Amount: 2 |
| 10 Series Standard Lift-Off Hinge - Right Hand Assembly | 80/20 | 2064 | Amount: 2 |
| 10 to 15 Series 2 Hole - Lite Transition Inside Corner Bracket | 80/20 | 4509 | Amount: 6 |
| 24”-long UV tube lights | ADJ Products LLC | T8-F20BLB24 | Amount: 2 20W bulb – 24” Wavelength: 365nm |
| Acrylic Mirror Sheet | Profesional Plastics | Amount: 1 82.5 cm x 26.5 cm |
|
| Acrylic Mirror Sheet | Profesional Plastics | Amount: 2 26.5 cm X 30.5 cm |
|
| Acrylic Mirror Sheet | Profesional Plastics | Amount: 2 82.5 cm x 30.5 cm |
|
| AR polycarbonate (UV resistance) | 80/20 | 65-2641 | Amount: 2 4.5mm Thick, Clear, 38.5 cm x 26.5 cm |
| AR polycarbonate (UV resistance) | 80/20 | 65-2641 | Amount: 4 4.5mm Thick, Clear, 38.5 cm x 21.5 cm |
| AR polycarbonate (UV resistance) | 80/20 | 65-2641 | Amount: 4 4.5mm Thick, Clear, 26.5 cm x 21.5 cm |
| AR polycarbonate (UV resistance) | 80/20 | 65-2641 | Amount: 4 4.5mm Thick, Clear 37.5 cm x 23.9 cm |
| AR polycarbonate (UV resistance) | 80/20 | 65-2641 | Amount: 4 4.5mm Thick, Clear , 24.4 cm x 23.9 cm |
| Chromatography paper (thin paper) | Thermo Fisher Scientific | 57144 | |
| Cosmos blotting paper (thick paper) | Blick Art Materials | 10422-1005 | |
| Excel | Microsoft Corporation | ||
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Version 9.4.0 | graphing and statistics software |
| ImageJ FIJI | NIH | ||
| Parafilm | Merck | transparent film | |
| Quick Time Player 10.5 software | Apple | multimedia player | |
| Security spy | Ben software | video surveillance software system | |
| Standard End Fastener, 1/4-20 | 80/20 | 3381 | Amount: 80 |
| UV transmitting acrylic | Spartech | Polycast Solacryl SUVT | Amount: 2 38.5 cm x 26.5 cm |
| Water gel: HydroGel | ClearH2O | 70-01-5022 | (https://www.clearh2o.com/product/hydrogel/) |
| Webcam | Logitech | C930e | Amount: 4 |
References
- Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. The urothelium: life in a liquid environment. Physiological Reviews. 100 (4), 1621 (2020).
- de Groat, W. C., Griffiths, D., Yoshimura, N. Neural control of the lower urinary tract. Comprehensive Physiology. 5 (1), 327 (2015).
- Dalghi, M. G., et al. Functional roles for PIEZO1 and PIEZO2 in urothelial mechanotransduction and lower urinary tract interoception. JCI Insight. 6 (19), (2021).
- Montalbetti, N., et al. Bladder infection with uropathogenic Escherichia coli increases the excitability of afferent neurons. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 322 (1), 1 (2022).
- Montalbetti, N., et al. Increased urothelial paracellular transport promotes cystitis. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 309 (12), 1070 (2015).
- Montalbetti, N., et al. Urothelial tight junction barrier dysfunction sensitizes bladder afferents. eNeuro. 4 (3), (2017).
- Montalbetti, N., Stocker, S. D., Apodaca, G., Bastacky, S. I., Carattino, M. D. Urinary K+ promotes irritative voiding symptoms and pain in the face of urothelial barrier dysfunction. Scientific Reports. 9 (1), 5509 (2019).
- Kim, A. K., Hamadani, C., Zeidel, M. L., Hill, W. G. Urological complications of obesity and diabetes in males and females of three mouse models: temporal manifestations. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 318 (1), 160 (2020).
- Bartolone, S. N., et al. Micturition defects and altered bladder function in the klotho mutant mouse model of aging. American Journal of Clinical and Experimental Urology. 8 (3), (2020).
- de Rijk, M. M., et al. Aging-associated changes in oxidative stress negatively impacts the urinary bladder urothelium. International Neurourology Journal. 26 (2), 111 (2022).
- Coyne, K. S., et al. The prevalence of lower urinary tract symptoms (LUTS) and overactive bladder (OAB) by racial/ethnic group and age: results from OAB-POLL. Neurourology and Urodynamics. 32 (3), 230 (2013).
- Wittig, L., Carlson, K. V., Andrews, J. M., Crump, R. T., Baverstock, R. J. Diabetic bladder dysfunction: a review. Urology. 123, (2019).
- Irwin, D. E., et al. Population-based survey of urinary incontinence, overactive bladder, and other lower urinary tract symptoms in five countries: results of the EPIC study. European Urology. 50 (6), 1314 (2006).
- Bogart, L. M., Berry, S. H., Clemens, J. Q. Symptoms of interstitial cystitis, painful bladder syndrome and similar diseases in women: a systematic review. The Journal of Urology. 177 (2), 450 (2007).
- Foxman, B. Urinary tract infection syndromes: occurrence, recurrence, bacteriology, risk factors, and disease burden. Infectious Disease Clinics of North America. 28 (1), 1 (2014).
- Fall, M., Logadottir, Y., Peeker, R. Interstitial cystitis is bladder pain syndrome with Hunner's lesion. International Journal of Urology. 21, 79 (2014).
- Birder, L. A. Urinary bladder, cystitis and nerve/urothelial interactions. Autonomic Neuroscience: Basic & Clinical. 182, 89 (2014).
- Rosen, J. M., Klumpp, D. J. Mechanisms of pain from urinary tract infection. International Journal of Urology. 21 Suppl. 1, 26 (2014).
- Birder, L., et al. Neural control of the lower urinary tract: peripheral and spinal mechanisms. Neurourology and Urodynamics. 29 (1), 128 (2010).
- Desjardins, C., Maruniak, J. A., Bronson, F. H. Social rank in house mice: differentiation revealed by ultraviolet visualization of urinary marking patterns. Science. 182 (4115), 939 (1973).
- Sugino, Y., et al. Voided stain on paper method for analysis of mouse urination. Neurourology and Urodynamics. 27 (6), 548 (2008).
- Hill, W. G., Zeidel, M. L., Bjorling, D. E., Vezina, C. M. Void spot assay: recommendations on the use of a simple micturition assay for mice. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 315 (5), (2018).
- Rajandram, R., et al. Intact urothelial barrier function in a mouse model of ketamine-induced voiding dysfunction. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 310 (9), (2016).
- Ruetten, H., et al. A uropathogenic E. coli UTI89 model of prostatic inflammation and collagen accumulation for use in studying aberrant collagen production in the prostate. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 320 (1), 31 (2021).
- Wegner, K. A., et al. Void spot assay procedural optimization and software for rapid and objective quantification of rodent voiding function, including overlapping urine spots. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 315 (4), (2018).
- Wood, R., Eichel, L., Messing, E. M., Schwarz, E. Automated noninvasive measurement of cyclophosphamide-induced changes in murine voiding frequency and volume. The Journal of Urology. 165 (2), 653 (2001).
- Dmochowski, R. R. Bladder outlet obstruction: etiology and evaluation. Reviews in Urology. 7 (Suppl 6), S3–S13. , (2005).
- Aizawa, N., Homma, Y., Igawa, Y. Influence of high fat diet feeding for 20 weeks on lower urinary tract function in mice. Lower Urinary Tract Symptoms. 5 (2), 101 (2013).
- Wang, Z., et al. Void sorcerer: an open source, open access framework for mouse uroflowmetry. American Journal of Clinical and Experimental Urology. 7 (3), 170 (2019).
- Verstegen, A. M., Tish, M. M., Szczepanik, L. P., Zeidel, M. L., Geerling, J. C. Micturition video thermography in awake, behaving mice. Journal of Neuroscience Methods. 331, 108449 (2020).
- Keller, J. A., et al. Voluntary urination control by brainstem neurons that relax the urethral sphincter. Nature Neuroscience. 21 (9), (2018).
- Hou, X. H., et al. Central control circuit for context-dependent micturition. Cell. 167 (1), 73 (2016).
- Negoro, H., et al. Involvement of urinary bladder Connexin43 and the circadian clock in coordination of diurnal micturition rhythm. Nature Communication. 3, (2012).
- Montalbetti, N., Carattino, M. D. Acid-sensing ion channels modulate bladder nociception. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 321 (5), (2021).
- Chen, H., Zhang, L., Hill, W. G., Yu, W. Evaluating the voiding spot assay in mice: a simple method with complex environmental interactions. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 313 (6), (2017).
- Dalghi, M. G., et al. Expression and distribution of PIEZO1 in the mouse urinary tract. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 317 (2), 303 (2019).
- Birder, L., Andersson, K. E. Animal modelling of interstitial cystitis/bladder pain syndrome. International Neurourology Journal. 22, (2018).
- Okinami, T., et al. Altered detrusor gap junction communications induce storage symptoms in bladder inflammation: a mouse cyclophosphamide-induced model of cystitis. PLoS One. 9 (8), (2014).
- Tungtur, S. K., Nishimune, N., Radel, J., Nishimune, H. Mouse Behavior Tracker: An economical method for tracking behavior in home cages. Biotechniques. 63 (5), (2017).
- Negoro, H., Kanematsu, A., Yoshimura, K., Ogawa, O. Chronobiology of micturition: putative role of the circadian clock. The Journal of Urology. 190 (3), (2013).
