Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

القياس الكمي لمعقدات الميلوبيروكسيديز - الحمض النووي و Neutrophil Elastase-DNA من مصائد العدلات خارج الخلية باستخدام شطيرة ELISA المعدلة

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/64644
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 2
1Department of Biochemistry and Biotechnology, University of Science and Technology Chittagong (USTC), 2Department of Emergency and Critical Care Medicine, Aichi Medical University

Summary

نقدم بروتوكولا لتقنية مقايسة الممتز المناعي المرتبط بإنزيم شطيرة معدلة لقياس مكونين من بقايا فخ العدلات خارج الخلية كميا ، وهما الحمض النووي المترافق للميلوبيروكسيديز ومجمعات الحمض النووي المترافق لإيلاستاز العدلات ، المشتقة من العدلات المنشطة.

Abstract

تتسبب بعض المحفزات ، مثل الكائنات الحية الدقيقة ، في إطلاق العدلات لمصائد العدلات خارج الخلية (NETs) ، وهي في الأساس هياكل تشبه الويب تتكون من الحمض النووي مع البروتينات الحبيبية ، مثل الميلوبيروكسيديز (MPO) وإيلاستاز العدلات (NE) ، والبروتينات السيتوبلازمية والهيكلية الخلوية. على الرغم من أن الاهتمام بالشبكات قد زاد مؤخرا ، إلا أنه لا توجد طريقة فحص حساسة وموثوقة متاحة لقياس الشبكات في البيئات السريرية. تصف هذه المقالة مقايسة ممتز مناعي معدل مرتبط بالإنزيم لقياس مكونين من مكونات الشبكات المنتشرة كميا ، مجمعات MPO-DNA و NE-DNA ، وهي مكونات محددة من NETs ويتم إطلاقها في الفضاء خارج الخلية كمنتجات انهيار NETs. يستخدم الفحص أجساما مضادة وحيدة النسيلة محددة ل MPO أو NE كأجسام مضادة للالتقاط وجسم مضاد للكشف عن الحمض النووي. يرتبط MPO أو NE بموقع واحد من الجسم المضاد الذي يتم التقاطه أثناء الحضانة الأولية للعينات التي تحتوي على مجمعات MPO-DNA أو NE-DNA. يظهر هذا الفحص خطيا جيدا ودقة عالية بين المقايسة وداخل المقايسة. استخدمناه في 16 مريضا مصابا ب COVID-19 يعانون من متلازمة الضائقة التنفسية الحادة المصاحبة ووجدنا أن تركيزات البلازما من MPO-DNA و NE-DNA كانت أعلى بكثير من البلازما التي تم الحصول عليها من الضوابط الصحية. يعد اختبار الكشف هذا طريقة موثوقة وحساسة للغاية ومفيدة للتحقيق في خصائص الشبكات في البلازما البشرية وطافات الثقافة.

Introduction

توضح هذه المقالة طريقة لتحديد تكوين مصيدة العدلات خارج الخلية (NET) في السوائل البيولوجية باستخدام مقايسة الممتز المناعي المرتبط بإنزيم الساندويتش (ELISA) للكشف عن معقدات الميلوبيروكسيديز (MPO) وإيلاستاز العدلات (NE) مع الحمض النووي1،2. تتكون الشبكات من العمود الفقري للحمض النووي المزين بالبروتياز المضاد للميكروبات الناشئة من حبيبات العدلات 3,4. تعد كل من معقدات MPO-DNA و NE-DNA مكونات مهمة ومحددة للشبكات ويتم إطلاقها في الفضاء خارج الخلية كمنتجات انهيار ل NETs 3,4.

إلى جانب دورها الفسيولوجي الهام في الدفاع المضاد للميكروبات3 ، فإن الشبكات لها أيضا تأثيرات مرضية مختلفة 4,5 ، بما في ذلك تعزيز تكوين الخثار6 وتفاقم الإنتان7. وبناء على ذلك، حظيت الشبكات بالاهتمام في الآونة الأخيرة. ومع ذلك، فقد ثبت أن القياس الكمي للشبكات في الجسم الحي يمثل تحديا بسبب عدم وجود طريقة اختبار كمية حساسة وموثوقة.

تتوفر بعض الطرق ، بما في ذلك القياس المباشر للشبكات بواسطة المجهر الفلوري 8,9 وقياس التدفق الخلوي 10 والقياس غير المباشر للحمض النووي الخالي من الخلايا ، والنيوكليوسومات ، وهيستون سيترولين H3 ، ولكن كل طريقة لها مزاياها وقيودهاالخاصة 11. على الرغم من أن الطريقة المجهرية المناعية خاصة بالشبكات وتظهر بوضوح توطين ودرجة تكوين NET ، إلا أن العينات تقتصر على أنسجة الخزعة والمواد المفرزة. علاوة على ذلك ، يجب أن يتم تنفيذ هذه الطريقة من قبل باحثين مهرة وتتطلب وقتا طويلا للحصول على النتائج. يعد قياس المستويات المتداولة للمكونات المرتبطة بالشبكة عن طريق قياس التدفق الخلوي أمرا سهلا ويوفر نتائج سريعة ؛ ومع ذلك ، فإن الطريقة ليست خاصة بالشبكات12.

لقد طورنانحن 13 وآخرون 1,2 مقايسة حساسة للغاية وموثوقة لقياس مكونات NET المتداولة ، الحمض النووي المترافق MPO أو NE المترافق ، في البلازما البشرية باستخدام تقنية ELISA المعدلة التي تستخدم أجساما مضادة محددة ل MPO أو NE كأجسام مضادة للالتقاط وجسم مضاد للكشف عن الحمض النووي. يمكن أيضا استخدام هذا الاختبار خارج الجسم الحي لتحديد مكونات NET في طافات زراعة الخلايا التي تطلقها العدلات المنشطة استجابة لتحفيز phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

أجريت هذه الدراسة وفقا لإعلان هلسنكي وتمت الموافقة عليها من قبل مجالس المراجعة المؤسسية لجامعة أيشي الطبية (2017-H341 ، 2019-H137). تم الحصول على موافقة خطية مستنيرة من كل مشارك.

1. إعداد الكاشف

ملاحظة: لإجراء فحص شطيرة ELISA ، يتم تحضير الكواشف كما هو موضح أدناه.

  1. طلاء العازلة:
    1. لعمل مخزن مؤقت 0.1 مول / لتر من كربونات بيكربونات ، قم بوزن 10.6 جم من كربونات الصوديوم اللامائية (الوزن الجزيئي ، 106 جم / مول) و 8.4 جم من بيكربونات الصوديوم (الوزن الجزيئي ، 84 جم / مول).
    2. أضفه إلى حوالي 900 مل من الماء المقطر في كأس زجاجية.
    3. اضبط الرقم الهيدروجيني للمخزن المؤقت على 9.6 عن طريق إضافة الكمية المطلوبة من حمض الهيدروكلوريك المخفف أو هيدروكسيد الصوديوم.
    4. تحقق من درجة الحموضة باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني.
    5. ثم أضف الحجم المطلوب من الماء المقطر لتحقيق حجم إجمالي قدره 1000 مل.
    6. قم بتخزين هذا المخزن المؤقت 0.1 مول / لتر من كربونات البيكربونات في الثلاجة عند 4 درجات مئوية.
  2. حظر المخزن المؤقت:
    1. أضف ما يقرب من 250 ميكرولتر من 20٪ أزيد الصوديوم و 1 جم من ألبومين مصل الأبقار (BSA) إلى 70 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) يتكون من 137 مليمول / لتر كلوريد الصوديوم ، 8.1 مليمول / لتر Na 2 HPO 4 ،2.68 مليمول / لتر KCl ، و 1.47 مول / لتر KH2PO 4 (درجة الحموضة7.4) ، واخلطهم بلطف.
    2. أضف الماء المقطر لتحقيق حجم إجمالي قدره 100 مل. التركيزات النهائية لألبومين مصل الأبقار وأزيد الصوديوم هي 1٪ و 0.05٪ على التوالي. انتظر لمدة 10 دقائق ، ثم يصبح الحل جاهزا للاستخدام.
  3. محلول الغسيل: تحضير 0.5٪ t-octylphenoxypolyethoxyethanol ، البولي إيثيلين جلايكول ثلاثي أوكتيل فينيل الأثير (Triton X-100) في الماء المقطر.
    1. تمييع 100٪ Triton X-100 إلى 10٪ بالماء المقطر ، والسماح لمحلول 10٪ بالوقوف لمدة يوم واحد قبل الاستخدام.
    2. ثم أعد تخفيف محلول Triton X-100 بنسبة 10٪ 20 ضعفا بالماء المقطر لتحقيق تركيز 0.5٪.
  4. تخفيف الأجسام المضادة:
    1. قم بتخفيف الجسم المضاد للالتقاط (الجسم المضاد المضاد ل MPO [1 مجم / مل] أو الجسم المضاد المضاد ل NE [1 مجم / مل]) إلى 1: 2000 في محلول الطلاء (درجة الحموضة 9.6) قبل الاستخدام في اليوم الأول من الفحص (انظر أدناه) والجسم المضاد للكشف (الجسم المضاد للحمض النووي المترافق بالبيروكسيداز) إلى 1:40 مع برنامج تلفزيوني قبل الاستخدام في اليوم الثالث من الفحص (انظر أدناه).
      ملاحظة: بالنسبة للتجربة الأولية ، قم بتخفيف الأجسام المضادة من النوع iso (أرنب IgG [5 مجم / مل] واستنساخ الماوس IgG1 Ci4 [0.5 مجم / مل]) إلى 1: 10000 و 1: 1000 في المخزن المؤقت للطلاء (درجة الحموضة 9.6).
  5. محلول ركيزة ABTS: اعتمادا على عدد العينات ، قم بإذابة واحد أو اثنين أو ثلاثة أقراص 2,2'-azino-bis(3 أقراص إيثيل بنزوثيازولين -6-حمض السلفونيك (ABTS) في 5 مل أو 10 مل أو 15 مل من المخزن المؤقت ABTS (يحتوي على بيربورات الصوديوم وحامض الستريك وفوسفات هيدروجين الصوديوم) ؛ هناك حاجة إلى 100 ميكرولتر لكل عينة. قم بتخزين المحلول المحضر في درجة حرارة 2-8 درجة مئوية محمية من الضوء. الحل مستقر لمدة تصل إلى 3 أشهر.

2. جمع العينات وتخزينها

  1. عزل البلازما:
    1. اجمع 4 مل من عينات الدم المحيطية في أنبوب جمع دم الهيبارين الليثيوم عن طريق بزل الوريد باستخدام حقنة 22 جم ، وأجهزة طرد مركزي عند 1600 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    2. انقل المادة الطافية إلى أنبوب عينة آمن القفل سعة 2 مل.
    3. أعد الطرد المركزي للطافد عند 16000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية لإزالة أي خلايا متبقية.
    4. اجمع المادة الطافية في أنبوب عينة جديد آمن القفل دون إزعاج الحبيبات الموجودة في أسفل الأنبوب.
    5. قم بتخزين البلازما التي تم الحصول عليها في درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى الاستخدام مرة أخرى.
      ملاحظة: للحصول على نتائج عالية الإنتاجية باستخدام هذا الفحص ، يلزم وجود عينات عالية الجودة. إذا تم استخدام عينات البلازما ، فقم بإجراء طرد مركزي ثان لإزالة أي خلايا متبقية. تجنب الذوبان المتكرر للعينات. استخدم الهيبارين كمضاد للتخثر لأن EDTA يؤثر على نشاط DNase.
  2. عزل العدلات متعددة الأشكال النووية
    1. اجمع عينات الدم المحيطية في أنبوب جمع الدم من الهيبارين الليثيوم عن طريق بزل الوريد باستخدام حقنة 22 جرام.
    2. ضع 6 مل من الدم على 6 مل من الأشكال المتعددة ذات الخطوة الواحدة ، وطرد مركزي الأنابيب عند 1000 × جم لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
    3. احصد طبقة معطف بافي الثالثة التي تحتوي على العدلات ، واغسلها ثلاث مرات في RPMI-1640 الخالي من الفينول الأحمر عند 400 × جم لمدة 10 دقائق في RT.
    4. أعد تعليق العدلات في RPMI-1640 الخالي من الفينول الأحمر الذي يحتوي على 2 mM L-glutamine المكمل بمصل بقري جنيني معطل بالحرارة بنسبة 6٪ ، وعد الخلايا في حقل المجهر باستخدام مقياس الدم.
      ملاحظة: تنتج هذه الطريقة نقاء بنسبة 96٪ إلى 98٪ مع قابلية صلاحية أكبر من 95٪ ، كما تم تقييمها من خلال استبعاد صبغة التريبان الزرقاء.
  3. تفعيل العدلات متعددة الأشكال النووية و NETosis في المختبر
    1. تمييع العدلات متعددة الأشكال النووية المعزولة حديثا إلى 1 × 105 خلايا / مل في RPMI-1640 الخالي من الفينول الأحمر الخالي من الفينول الذي يحتوي على 2 mM L-glutamine المكمل بمصل بقري جنيني معطل بالحرارة بنسبة 6٪ ، وزرعها في أطباق استزراع 35 مم.
    2. للحث على الشبكات ، قم بتحفيز العدلات متعددة الأشكال النووية مع 25 نانومتر PMA لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO2/95٪ هواء.
    3. بعد 4 ساعات من الحضانة ، قم بهضم الشبكات جزئيا عن طريق إضافة 0.6 ميكروغرام / مل DNase I مباشرة إلى أطباق الاستزراع لمدة 15 دقيقة في RT ، وإيقاف نشاط DNase I بإضافة 5 mM EDTA.
    4. اجمع الوسط الذي يحتوي على الشبكات المركبة وأجهزة الطرد المركزي عند 400 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية لإزالة حطام الخلية.
    5. احصل على المواد الطافية من أربعة عناصر تحكم صحية ، واخلطها ، واحفظها في درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
      ملاحظة: يتم استخدام العدلات المحفزة ب DNase التي تم الحصول عليها من أربعة عناصر تحكم صحية كمعيار NET1،14،15. قم بإنشاء منحنى معايرة من معيار NET مخفف بشكل متسلسل باستخدام PBS ، وقم بتعيين قيم الكثافة الضوئية (OD) التي تم الحصول عليها من معيار NET غير مخفف ك 100٪ NET.

3. طريقة الفحص

ملاحظة: يتم وصف خطوات إجراء الفحص بالتفصيل أدناه.

  1. اليوم 1
    1. ضع ما مجموعه 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة المخففة المضادة ل MPO أو المضادة ل NE التي تحتوي على 0.05 ميكروغرام من الجسم المضاد على كل بئر من اللوحة ، بما في ذلك البئر الفارغة.
      ملاحظة: يجب ألا يحتوي المخزن المؤقت للطلاء على أي نوع من المنظفات لأنه ، بخلاف ذلك ، قد لا ترتبط الأجسام المضادة بشكل متساو وسلس بجدران كل بئر. لمنع تأثير الخطاف ، يجب ألا يزيد تركيز بروتين الطلاء عن 20 ميكروغرام / مل ، لأن التركيزات فوق هذا المستوى ستشبع معظم المواقع المتاحة على لوحة المعايرة الدقيقة. نطاق التركيز النموذجي لمحاليل طلاء البروتين هو 2-10 ميكروغرام / مل. بالنسبة للتجربة الأولية ، استخدم أرنب IgG المخفف للتحكم في الأجسام المضادة من نوع iso للطلاء بدلا من الأجسام المضادة أحادية النسيلة المحددة ضد MPO. استخدم ماوس IgG1 المخفف للتحكم في الأجسام المضادة من نوع iso للطلاء بدلا من الأجسام المضادة أحادية النسيلة المحددة ضد NE.
    2. قم بتغطية اللوحة بغطاء بلاستيكي لاصق لمنع تبخر العينة ، واحتضانها طوال الليل عند 4 درجات مئوية للسماح بربط الأجسام المضادة للالتقاط.
  2. اليوم 2
    1. تخلص من محلول الأجسام المضادة المخفف من الآبار ، ثم ماصة 300 ميكرولتر من محلول الغسيل لكل بئر ، وكرر إجراء الغسيل هذا ثلاث إلى أربع مرات.
    2. قم بإزالة PBS الزائد عن طريق النقر على اللوحة الجافة على منشفة ورقية.
    3. سد كل بئر من لوحة ELISA مع 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للحظر.
    4. قم بتغطية اللوحة بإحكام بغطاء بلاستيكي لاصق ، واحتضانها لمدة 1.5-2 ساعة في RT لعرقلة الآبار.
    5. تخلص من محلول الانسداد تماما من الآبار ، ثم ماصة 300 ميكرولتر من محلول الغسيل لكل بئر ، وكرر إجراء الغسيل هذا ثلاث إلى أربع مرات.
    6. قم بإزالة PBS الزائد عن طريق النقر على اللوحة الجافة على منشفة ورقية.
    7. ضع ما مجموعه 25 ميكرولتر من البلازما أو الوسط على كل بئر باستثناء البئر الفارغ ، وأضف 75 ميكرولتر من PBS كمخفف لجعل الحجم النهائي 100 ميكرولتر ؛ أضف 100 ميكرولتر من PBS إلى البئر الفارغة.
    8. بعد ذلك ، امزج العينات في RT لمدة 10 ثوان عن طريق وضع اللوحة على شاكر عند 250 دورة في الدقيقة.
    9. ضع 2 ميكرولتر من DNase I المخفف 100 ضعف (0.03 مجم / مل) على كل بئر ، بما في ذلك البئر الفارغ (التركيز النهائي ل DNase I في خليط التفاعل: 0.6 ميكروغرام / مل).
    10. أغلق اللوحة بغطاء بلاستيكي لاصق ، وامزج العينات جيدا في RT لمدة 10 ثوان عن طريق وضع اللوحة على شاكر عند 250 دورة في الدقيقة.
      ملاحظة: لتقييم الظروف المثلى لهضم الحمض النووي ، عند تطوير الفحص ، قمنا باحتضان عينات تحتوي على الحمض النووي المرتبط ب MPO من مرضى COVID-19 مع 0-0.9 ميكروغرام / مل DNase I لمدة 15 دقيقة في RT واستخدمنا لوحات مغلفة بجسم مضاد التقاط محدد ل MPO أو جسم مضاد للتحكم من نوع iso مطابق للأنواع.
    11. احتضان العينات لمدة 15 دقيقة في RT.
    12. قم بإزالة الغطاء البلاستيكي اللاصق ، وقم بتطبيق 1 ميكرولتر من 0.5 M EDTA على كل بئر لإيقاف تفاعل DNase.
    13. أعد إغلاق اللوحة بغطاء بلاستيكي لاصق ، ورجها في RT لمدة 15 ثانية عن طريق وضعها على شاكر عند 250 دورة في الدقيقة.
    14. بعد ذلك ، احتضن اللوحة طوال الليل عند 4 درجات مئوية للسماح لمكونات البروتين في الشبكات بالالتصاق بالأجسام المضادة الملتقطة .
  3. اليوم 3
    1. قم بإزالة الغطاء البلاستيكي اللاصق ، وتخلص من المحلول من الآبار.
    2. تخلص من المحلول تماما من الآبار ، ثم ماصة 300 ميكرولتر من محلول الغسيل لكل بئر ، وكرر إجراء الغسيل هذا ثلاث إلى أربع مرات.
    3. ضع ما مجموعه 100 ميكرولتر من الجسم المضاد للكشف عن الحمض النووي المخفف المترافق بالبيروكسيديز على كل بئر.
    4. أغلق اللوحة بإحكام بغطاء بلاستيكي لاصق ، واحتضنها لمدة 1.5 ساعة في RT.
    5. تخلص من المحلول تماما من الآبار ، ثم ماصة 300 ميكرولتر من محلول الغسيل لكل بئر ، وكرر إجراء الغسيل هذا ثلاث إلى أربع مرات.
    6. قم بإزالة الحل المتبقي بعناية.
    7. ضع ما مجموعه 100 ميكرولتر من محلول ركيزة ABTS على كل بئر ، وقم بتغطية اللوحة بغطاء بلاستيكي لاصق.
    8. احتضان اللوحة في الظلام في RT لمدة 20-30 دقيقة على شاكر عند 250 دورة في الدقيقة.
      ملاحظة: راقب اللوحة على فترات 5 دقائق حتى يتم الحصول على قراءات OD المطلوبة.
    9. أضف إجمالي 50 ميكرولتر من 2 M من حمض الكبريتيك لإيقاف التفاعل.
    10. امزج المحتويات السائلة للآبار عن طريق النقر بعناية على جانب اللوحة.
    11. قم بتشغيل قارئ الألواح الدقيقة ، وقم بتوصيله بالكمبيوتر.
    12. افتح التطبيق البرمجي على الكمبيوتر.
    13. من شريط الحالة، أنشئ تجربة جديدة وقم بتسميتها.
    14. اضبط جميع المعلمات التالية لقراءة اللوحة: نوع القراءة ، الامتصاص ؛ وضع القراءة ، نقطة النهاية ؛ الأطوال الموجية ، 2 ؛ Lm-1 ، 405 نانومتر ؛ Lm-2 ، 490 نانومتر ؛ خلط تلقائي وطمس قبل ، إيقاف ؛ لوحة ما قبل القراءة ، إيقاف ؛ المعايرة التلقائية ، تشغيل ؛ شرائط ، قراءة لوحة كاملة. أولوية الطول الموجي للعمود ، أولوية العمود ؛ سرعة النقل ، عادي ؛ والقراءة التلقائية، إيقاف.
    15. ثم ضع اللوحة المكونة من 96 بئرا والتي تحتوي على العينات في الدرج وأغلقها.
    16. أخيرا ، حدد ملف قراءة زر بحيث تتم قراءة اللوحة على الفور.
    17. اقرأ امتصاص كل بئر بطول موجي 405 نانومتر باستخدام قارئ الصفائح الدقيقة (في هذه المرحلة ، استخدم طولا موجيا يبلغ 490 نانومتر كمرجع).
    18. قم بإجراء الطرح التلقائي لقيمة الامتصاص لوسط الفحص وحده من جميع العينات غير المعروفة ، واحفظ البيانات.
      ملاحظة: استخدم منحنى قياسيا تم الحصول عليه من معيار NET المخفف بشكل متسلسل لحساب التركيز النسبي ل NET في العينة1،14،15. هنا ، يتم تقديم النتائج النهائية على أنها "مجمعات MPO أو NE-DNA (٪ من معيار NET)." تم حساب حد الكشف (LOD) من الانحراف المعياري (SD) وميل منحنى المعايرة (S) على النحو التالي: LOD = 3.3 (SD / S).

4. الإحصاء

  1. إجراء جميع التحليلات الإحصائية باستخدام برامج التحليل الإحصائي المناسبة. هنا تم استخدام SigmaPlot v14.5. يتم عرض النسب المئوية والمتغيرات المستمرة كوسيط مع النطاق الربيعي بسبب التوزيع المنحرف لمعظم المعلمات.
  2. قارن مستويات MPO-DNA و NE-DNA في البلازما بين مرضى COVID-19 والضوابط الصحية باستخدام اختبار مجموع رتبة ويلكوكسون. استخدم تحليل الارتباط لاستكشاف العلاقة بين الكثافة الضوئية والنسبة المئوية لمعيار NET.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

استخدمت هذه الطريقة شطيرة ELISA مع الأجسام المضادة أحادية النسيلة المضادة ل MPO و anti-NE والمضادة للحمض النووي لقياس الحمض النووي المرتبط ب MPO والمرتبط ب NE (الشكل 1). في هذه الطريقة ، تم طلاء آبار صفيحة العيار الدقيق بجسم مضاد أحادي النسيلة خاص ب MPO أو خاص ب NE لالتقاط MPO المرتبط بالحمض النووي و NE المرتبط بالحمض النووي ، بالإضافة إلى MPO و NE غير المرتبط بالحمض النووي. لحساب معامل التباين داخل المقايسة (CV) ، تم إجراء قياسات مكررة داخل نفس اللوحة ل 30 عينة تم جمعها من مرضى COVID-19 والضوابط الصحية ، وتم حساب النسبة المئوية للسيرة الذاتية كمتوسط للقياسات المكررة. لحساب السيرة الذاتية بين المقايسة (أي الاتساق من لوحة إلى لوحة) ، تم قياس نوعين من العينات من مرضى COVID-19 والضوابط الصحية في أربعة أضعاف على 10 لوحات مختلفة ؛ لإثبات خصوصية هذا الفحص ، تم فحص تركيزات مختلفة من مجمعات MPO-DNA و NE-DNA باستخدام ألواح مغلفة بأجسام مضادة للتحكم من نوع iso بدلا من أجسام مضادة وحيدة النسيلة محددة ضد MPO و NE ؛ ولحساب حساسية وخطية الفحص ، تم فحص معيار NET المخفف بشكل متسلسل عن طريق تحفيز العدلات البشرية المعزولة باستخدام PMA وهضم DNase المعتدل ، وتم حساب معامل الارتباط وحد الكشف (LOD).

يوضح الشكل 2 منحنيات المعايرة ل MPO-DNA و NE-DNA المستمدة من معيار NET مخفف بشكل متسلسل. يتم الحصول على منحنيات قياسية موثوقة ل MPO-DNA و NE-DNA (R2 = 0.958 و 0.963 ، على التوالي) عندما لا تتجاوز قيم الامتصاص تركيزات 0.93 و 0.90 ، على التوالي. كانت قيم LOD المحسوبة من SD وميل منحنى المعايرة 0.132٪ و 0.126٪ ل MPO-DNA و NE-DNA (٪ NET standard) ، على التوالي.

تم الحصول على أعلى OD عندما تم تطبيق 0.6 ميكروغرام / مل DNase I (الشكل 3). ومن ثم، اقتصر هضم الحمض النووي على إضافة خليط تفاعل 0.6 ميكروغرام/مل من إنزيم DNase I لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. عندما تم طلاء الألواح بالجسم المضاد للتحكم من نوع iso بدلا من الجسم المضاد أحادي النسيلة المحدد ضد MPO ، تم الكشف عن قيم OD منخفضة جدا (<0.09 وحدة امتصاص [AU]) بتركيزات مختلفة من DNase I.

لحساب معامل التباين داخل الفحص (CV) ل MPO-DNA و NE-DNA ، تم إجراء قياسات مكررة في 30 عينة من مرضى COVID-19 وضوابط صحية في نفس اللوحة. تم حساب ٪CV باستخدام المتوسط المكرر. كانت السير الذاتية داخل الفحص ل MPO-DNA و NE-DNA 1.871 و 0.987 ، على التوالي ، في الضوابط الصحية و 2.532 و 2.010 ، على التوالي ، في مرضى COVID-19 (الجدول 1). كان متوسط السير الذاتية داخل الفحص ل MPO-DNA و NE-DNA 2.202 ± 0.467 و 1.497 ± 0.723 ، على التوالي (متوسط ± SD) (الجدول 1).

لحساب السيرة الذاتية بين المقايسة ل MPO-DNA و NE-DNA ، تم قياس نوعين من العينات التي تم جمعها من مرضى COVID-19 والضوابط الصحية في أربعة أضعاف على 10 لوحات مختلفة لمراقبة اتساق اللوحة إلى اللوحة. كان متوسط السير الذاتية بين المقايسات ل MPO-DNA و NE-DNA 6.524 ± 2.672 و 4.389 ± 0.923 ، على التوالي (متوسط ± SD) (الجدول 2).

لتقييم خصوصية الأجسام المضادة الملتقطة لمجمعات MPO-DNA و NE-DNA ، قمنا بفحص تركيزات مختلفة من مجمعات MPO-DNA و NE-DNA باستخدام لوحات مغلفة بأجسام مضادة للتحكم من نوع iso بدلا من الأجسام المضادة وحيدة النسيلة المحددة ضد MPO و NE. يوضح الجدول 3 أن الأجسام المضادة للتحكم من نوع iso تفاعلت قليلا مع معقدات MPO-DNA و NE-DNA بتركيزات مختلفة (0.035 AU إلى 0.078 AU و -0.007 AU إلى 0.096 AU ، على التوالي).

تم تعريف مستويات MPO-DNA و NE-DNA في طاف العدلات المحفزة ب PMA المهضومة ب DNase على أنها معيار NET بنسبة 100٪ ، وتم التعبير عن بيانات عينة البلازما على أنها ٪NET-standard. كانت مستويات MPO-DNA (٪ NET-STANDARD) أعلى بكثير في البلازما من مرضى COVID-19 (ن = 16 ؛ 29.1٪ [IQR ، 25.8 ، 41.5]) مقارنة بالبلازما من الضوابط الصحية (ن = 10 ؛ 13.4٪ [IQR ، 12.4 ، 14.8]) ، وكذلك مستويات NE-DNA (٪ NET-STANDARD) (46.4٪ [IQR ، 32.7 ، 53.7] مقابل 12.1٪ [IQR ، 9.9 ، 14.7] ، على التوالي ، P < 0.01 ؛ الشكل 4).

Figure 1
الشكل 1: المراحل الأساسية لطريقة مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم الساندويتش لقياس الميلوبيروكسيداز-DNA أو الحمض النووي (DNA) لإلاستاز العدلات في العينات. (أ) الآبار مغلفة بجسم مضاد لالتقاط الميلوبيروكسيديز (MPO) أو مضاد للإلاستاز المضاد للعدلات (NE). (ب) تسد مواقع ارتباط البروتين المتبقية بواسطة العوامل المانعة. (ج) تضاف عينات تحتوي على الحمض النووي المترافق NE والحمض النووي المترافق مع MPO. (د) يجرى هضم إنزيم DNase محدود، وتحضن العينة في الآبار لترتبط بالجسم المضاد الملتقط. ه: يضاف جسم مضاد ثانوي يسمى البيروكسيديز المضاد للحمض النووي (DNA). (F) تتم إزالة الجسم المضاد للحمض النووي الثانوي غير المرتبط بالبيروكسيداز. (ز) تتم إضافة الركيزة 2،2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) ، ويتم مراقبة تطور اللون. الاختصارات: ABTS = 2،2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) ؛ MPO = الميلوبيروكسيداز. NE = إيلاستاز العدلات الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: خطية العلاقات بين قيم الشدة والتخفيفات المختلفة لمعيار مصيدة العدلات خارج الخلية. تم تخفيف طاف العدلات المحفزة ب 4 ميريستات 13 أسيتات المهضومة ب DNase بشكل متسلسل ، وتم فحص مستويات الميلوبيروكسيداز-DNA و elastase-DNA العدلات لتوليد منحنى معايرة. تم تعيين وحدات الامتصاص (AU) التي تم الحصول عليها من معيار مصيدة العدلات خارج الخلية غير المخفف (معيار NET) على أنها 100٪ NET ، وكشف رسم قيمة الشدة عند 405 نانومتر مقابل معيار NET٪ عن وجود علاقة خطية. الاختصارات: MPO = الميلوبيروكسيداز. NE = إيلاستاز العدلات ؛ NET = مصيدة العدلات خارج الخلية الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: استجابة جرعة إنزيم DNase I في عملية هضم الحمض النووي (DNA) في فخ العدلات خارج الخلية. تم إدخال العينة في الآبار المغلفة بالمايلوبيروكسيداز. ثم أضيف إنزيم DNase I (0 ميكروغرام/مل، 0.3 ميكروغرام/مل، 0.6 ميكروغرام/مل، أو 0.9 ميكروغرام/مل). بعد 15 دقيقة من الهضم ، تم إيقاف نشاط الإنزيم ، وتم إجراء الخطوات المتبقية من مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم وفقا لذلك. يتم عرض البيانات كمتوسط ± SD. N = 12. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: مستويات البلازما من معقدات الميلوبيروكسيداز-الحمض النووي وإيلاستاز-الحمض النووي العدلات في مرضى COVID-19. يتم التعبير عن البيانات كنسب مئوية من محتوى معيار مصيدة العدلات خارج الخلية (معيار NET) وتقديمها كمتوسطات ونطاقات ربعية. المرضى الذين يعانون من COVID-19 ، ن = 16 ؛ ضوابط صحية ، ن = 10. ** P < 0.01 مقابل الضوابط الصحية. الاختصارات: HC = ضوابط صحية ؛ NET = مصيدة العدلات خارج الخلية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: معامل التباين داخل المقايسة. تم قياس ثلاثين عينة في نسختين لرصد معاملات التباين الفردية ، وبالتالي تحديد معامل التباين داخل المقايسة. الاختصارات: AU = وحدات الامتصاص. CV = معاملات التباين الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 2: معامل التباين بين المقايسة. تم قياس العينات في نسخ رباعي على 10 لوحات مختلفة لرصد التباين من لوحة إلى أخرى ، وبالتالي تحديد معامل التباين بين المقايسة. الاختصارات: AU = وحدات الامتصاص. السيرة الذاتية = معامل التباين. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 3: اختبار الخصوصية لالتقاط الأجسام المضادة. تم طلاء الألواح بأجسام مضادة للتحكم من نوع iso لمضاد الميلوبيروكسيديز (MPO) والإيلاستاز المضاد للعدلات (NE) لتقييم خصوصية الأجسام المضادة الملتقطة لمجمعات MPO-DNA و NE-DNA. الاختصارات: AU = وحدات الامتصاص. MPO = الميلوبيروكسيداز. NE = إيلاستاز العدلات الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

لقد وصفنا طريقة شطيرة ELISA التي يرتبط فيها MPO أو NE بموقع واحد من الجسم المضاد الذي تم التقاطه أثناء الحضانة الأولية للعينات التي تحتوي على مجمعات MPO-DNA أو NE-DNA. بعد الغسيل ، يتم الانتهاء من "الساندويتش" عن طريق احتضان العينات بجسم مضاد أحادي النسيلة مضاد للحمض النووي مرتبط بالبيروكسيداز. بعد إزالة الجسم المضاد الثانوي غير المنضم ، يتم الكشف عن اقتران البيروكسيديز المرتبط عن طريق إضافة ركيزة بيروكسيديز ABTS كروموجينيك ، والتي تنتج منتجا نهائيا قابلا للذوبان يمكن قراءته طيفيا عند 405 نانومتر. تشير الخطية الجيدة والدقة العالية بين المقايسة والدقة داخل الفحص إلى أن مقايسة ELISA الموصوفة في هذه الورقة وغيرها 1,2 موثوقة ومجدية للتطبيق السريري. علاوة على ذلك ، عندما يتم تعيين طاف العدلات المحفزة ب PMA المعالجة ب DNase كإشارة قصوى لمعيار NET ، يمكن استخدام اختبار ELISA هذا كطريقة شبه كمية1،14،15.

تم تزيين خيوط الكروماتين الطويلة ل NETs ببروتينات MPO و NE. لزيادة الارتباط بين الجسم المضاد للالتقاط ومجمعات MPO-DNA أو NE-DNA ، يتم قطع الخيوط إلى قطع أقصر عن طريق هضم الحمض النووي المحدود مع إنزيم DNase. يمكن أن تؤدي إضافة تركيز DNase مرتفع جدا إلى الهضم المفرط للحمض النووي ، وبالتالي انخفاض في الامتصاص. أظهرت نتائج تجربة أولية (انظر الشكل 3) أن كمية مناسبة من إضافة DNase ضرورية لتخفيف البقايا المشتقة من NETs. أظهرت التجارب التي استخدمت الأجسام المضادة للتحكم من نوع iso بدلا من الأجسام المضادة المحددة أن الأجسام المضادة المستخدمة في هذا الفحص كانت خاصة بمجمعات MPO-DNA و NE-DNA.

تتميز المرحلة المبكرة من تكوين NET بالكروماتين غير المكثف والحفاظ على شدة غشاء البلازما9،16،17. تم تحديد العدلات ذات النواة المكثفة على أنها عدلات تخضع لتكوين NET ويمكن قياسها كميا عن طريق قياس التدفق الخلوي10. على الرغم من أن قياس التدفق الخلوي يمكنه تحليل عدد كبير من الصور من الخلايا في وقت قصير ، إلا أنه لا يمكن استخدامه لتقييم المراحل اللاحقة من تكوين NET بعد تمزق غشاء الخلية وقذف الكروماتين. يمكن الكشف عن الهستونات السيترولين H3 ، المعروفة بأنها علامات خاصة بالشبكة ، عن طريق النشاف الغربي18 و ELISA19 ؛ ومع ذلك ، فإن هذه الطرق خاصة فقط بتكوين NET المرتبط ب PAD4 ولا يمكن استخدامها لتقييم شبكات PAD4المستقلة 20.

تتفق النتيجة القائلة بأن مستويات بقايا المصل الصافي كانت أعلى لدى مرضى COVID-19 مقارنة بالضوابط الصحية مع التقارير السابقة21,22. تشير هذه النتيجة إلى أن تنشيط العدلات ، بما في ذلك تكوين NET ، قد يلعب دورا مهما في التسبب في COVID-19.

هذا الفحص له قيود. أظهرت التقارير الأخيرة أن الجينات المرتبطة بالمناعة ، بما في ذلك MPO و ELANE ، التي تشفر MPO و NE ، على التوالي ، يتم التعبير عنها بشكل كبير في ظل ظروف التهابية غير خاضعة للرقابة23 وترتبط ارتباطا إيجابيا بشدة المرض والوفيات24. نظرا لأن MPO و NE يشاركان في تكوين شبكات مستقلة عن تلك الأنشطة الأنزيمية15 ، فإن زيادة مستويات البروتين في NE و MPO في العدلات قد تؤثر على نتائج هذا الفحص.

نستنتج أن طريقة شطيرة ELISA هذه تقيس مباشرة الحمض النووي خارج الخلية مع البروتينات الحبيبية ، بما في ذلك NE و MPO ، وهي خاصة بتكوين NET. يعد اختبار الكشف هذا طريقة موثوقة وحساسة للغاية ومفيدة للتحقيق في خصائص الشبكات في العينات البشرية وطافات الثقافة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يتم تضمين جميع البيانات التي تم إنشاؤها و / أو تحليلها خلال هذه الدراسة في هذه المقالة المنشورة. يعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم مصالح متنافسة.

Acknowledgments

يشكر المؤلفون الدكتور حق محمد أمينول على مساعدته في مراجعة المخطوطة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Step Polymorphs Accurate Chemical and Scientific Corporation AN221725 Isolation of PMN's from human blood.
96-well microtiter plate Thermo Fisher Scientific 467466 flat bottom
ABTS buffer solution Sigma-Aldrich Merck 11 204 530 001 Contains sodium perborate, citric acid, and disodium hydrogen phosphate. 
ABTS tablets Sigma-Aldrich Merck 11 204 521 001  Each tablet contains 5 mg ABTS substrate and 60 mg vehicle substances.
Adhesive plastic cover, Axygen Thermo Fisher Scientific 14222348
Anti-MPO antibody Sigma-Aldrich Merck  07-496-I Store at 2-8 °C. stable for 1 year. Host species is rabbit.
Anti-NE antibody, clone AHN-10 Sigma-Aldrich Merck MABS461 Store at 2-8 °C. stable for 1 year. Host species is mouse.
Bovine serum albumin Biomedical Science BR-220700081 Albumin from bovine fraction V. Store at 2–8 °C. stable for 2 year.
DNase I New England BioLabs M0303M Store at -20 °C
IgG, rabbit, Isotype Control GENETEX, Inc. GTX35035 Store as concentrated solution at 2–8 °C.
IgG1, mouse Isotype Control, clone Ci4 Merck  MABC002 Store as concentrated solution at 2–8 °C.
Lithium heparin blood collection tube Becton Dickinson and Company
Microplate mixer As one corporation NS-P
Microplate Reader Molecular Devices SpectraMax 190  Any microplate plate reader capable of reading wavelengths from 405–490 nm can use.
Microplate reader application Molecular Devices SoftMax pro
Peroxidase-conjugated anti-DNA antibody, Cell death Detection ELISA Roche Diagnostics 1154467500  bottle 2. Store at 2–8 °C. stable for 1 year.
Phorbol 12-myristate 13-acetate Sigma-Aldrich Merck P8139 Activation of PMN's from human blood.
Phosphate buffered solution Takara Bio T9181 Store at room temperature. Stable for 6 months.
SigmaPlot v14.5  Systat Software Inc. San Jose, CA, USA
Sodium azide Fujifilm Wako Chemicals 190-14901 Store at room temperature.
t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether Fujifilm Wako Chemicals 9002-93-1 Store at room temperature.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sil, P., Yoo, D. G., Floyd, M., Gingerich, A., Rada, B. High throughput measurement of extracellular DNA release and quantitative NET formation in human neutrophils in vitro. Journal of Visualized Experiments. (112), e52779 (2016).
  2. Yoo, D. G., Floyd, M., Winn, M., Moskowitz, S. M., Rada, B. NET formation induced by Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis isolates measured as release of myeloperoxidase-DNA and neutrophil elastase-DNA complexes. Immunology Letters. 160 (2), 186-194 (2014).
  3. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  4. Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews Immunology. 18, 134-147 (2018).
  5. Chamardani, T. M., Amiritavassoli, S. Inhibition of NETosis for treatment purposes: Friend or foe. Molecular and Cellular Biochemistry. 477 (3), 673-688 (2022).
  6. Rao, A. N., Kazzaz, N. M., Knight, J. S. Do neutrophil extracellular traps contribute to the heightened risk of thrombosis in inflammatory diseases. World Journal of Cardiology. 7 (12), 829-842 (2015).
  7. Sørensen, O. E., Borregaard, N. Neutrophil extracellular traps - The dark side of neutrophils. Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1612-1620 (2016).
  8. Abrams, S. T., et al. A novel assay for neutrophil extracellular traps (NETs) formation independently predicts disseminated intravascular coagulation and mortality in critically ill patients. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 200 (7), 869-880 (2019).
  9. Brinkmann, V., Goosmann, C., Kühn, L. I., Zychlinsky, A. Automatic quantification of in vitro NET formation. Frontiers in Immunology. 3, 413 (2012).
  10. Zhao, W., Fogg, D. K., Kaplan, M. J. A novel image-based quantitative method for the characterization of NETosis. Journal of Immunological Methods. 423, 104-110 (2015).
  11. Masuda, S., et al. NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers. Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).
  12. Rada, B. Neutrophil extracellular traps. Methods in Molecular Biology. 1982, 517-528 (2019).
  13. Kano, H., Huq, M. A., Tsuda, M., Noguchi, H., Takeyama, N. Sandwich ELISA for circulating myeloperoxidase- and neutrophil elastase-DNA complexes released from neutrophil extracellular traps. Advanced Techniques in Biology & Medicine. 5 (1), 1000196 (2016).
  14. Prevel, R., et al. Plasma markers of neutrophil extracellular trap are linked to survival but not to pulmonary embolism in COVID-19-related ARDS patients. Frontiers in Immunology. 13, 851497 (2022).
  15. Schechter, M. C., et al. et al. extracellular trap (NET) levels in human plasma are associated with active TB. PLoS One. 12, e0182587 (2017).
  16. Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps. Journal of Cell Biology. 191 (3), 677-691 (2010).
  17. Gupta, S., Chan, W., Zaal, K. J., Kaplan, M. J. A high-throughput real-time imaging technique to quantify NETosis and distinguish mechanisms of cell death in human neutrophils. Journal of Immunology. 200 (2), 869-879 (2018).
  18. Li, M., Lin, C., Leso, A., Nefedova, Y. Quantification of citrullinated histone H3 bound DNA for detection of neutrophil extracellular traps. Cancers. 12 (11), 3424 (2020).
  19. Thålin, C., et al. Quantification of citrullinated histones: Development of an improved assay to reliably quantify nucleosomal H3Cit in human plasma. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 18 (10), 2732-2743 (2020).
  20. Li, P., et al. PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps. Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1853-1862 (2010).
  21. Zuo, Y., et al. Neutrophil extracellular traps in COVID-19. JCI Insight. 5 (11), e138999 (2020).
  22. Masso-Silva, J. A., et al. Increased peripheral blood neutrophil activation phenotypes and neutrophil extracellular trap formation in critically ill Coronavirus disease 2019 (COVID-19) patients: A case series and review of the literature. Clinical Infectious Diseases. 74 (3), 479-489 (2022).
  23. Gong, F. C., et al. Identification of potential biomarkers and immune features of sepsis using bioinformatics analysis. Mediators of Inflammation. 2020, 3432587 (2020).
  24. Almansa, R., et al. Transcriptomic correlates of organ failure extent in sepsis. Journal of Infection. 70 (5), 445-456 (2015).

Tags

المناعة والعدوى العدد 195
القياس الكمي لمعقدات الميلوبيروكسيديز - الحمض النووي و Neutrophil Elastase-DNA من مصائد العدلات خارج الخلية باستخدام شطيرة ELISA المعدلة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Islam, M. M., Salma, U., Irahara,… More

Islam, M. M., Salma, U., Irahara, T., Watanabe, E., Takeyama, N. Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA. J. Vis. Exp. (195), e64644, doi:10.3791/64644 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter