Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Kvantificering af myeloperoxidase-DNA og neutrofile elastase-DNA-komplekser fra neutrofile ekstracellulære fælder ved hjælp af en modificeret sandwich-ELISA

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/64644
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 2
1Department of Biochemistry and Biotechnology, University of Science and Technology Chittagong (USTC), 2Department of Emergency and Critical Care Medicine, Aichi Medical University

Summary

Vi præsenterer en protokol for en modificeret sandwichenzymbundet immunosorbentassayteknik til kvantitativt at måle to komponenter af neutrofile ekstracellulære fælderester, myeloperoxidasekonjugeret DNA og neutrofilelastasekonjugerede DNA-komplekser, afledt af aktiverede neutrofiler.

Abstract

Visse stimuli, såsom mikroorganismer, får neutrofiler til at frigive neutrofile ekstracellulære fælder (NET'er), som grundlæggende er weblignende strukturer sammensat af DNA med granulatproteiner, såsom myeloperoxidase (MPO) og neutrofil elastase (NE) og cytoplasmatiske og cytoskeletale proteiner. Selvom interessen for NETs er steget for nylig, findes der ingen følsom, pålidelig analysemetode til måling af NETs i kliniske omgivelser. Denne artikel beskriver et modificeret sandwichenzymbundet immunosorbentassay til kvantitativt at måle to komponenter i cirkulerende NET'er, MPO-DNA og NE-DNA-komplekser, som er specifikke komponenter i NET'er og frigives i det ekstracellulære rum som nedbrydningsprodukter af NET'er. Assayet bruger specifikke monoklonale antistoffer til MPO eller NE som indfangningsantistoffer og et DNA-specifikt detektionsantistof. MPO eller NE binder sig til et sted af indfangningsantistoffet under den indledende inkubation af prøver indeholdende MPO-DNA- eller NE-DNA-komplekser. Dette assay viser god linearitet og høj inter-assay og intra-assay præcision. Vi brugte det hos 16 patienter med COVID-19 med ledsagende akut respiratorisk distress syndrom og fandt ud af, at plasmakoncentrationerne af MPO-DNA og NE-DNA var signifikant højere end i plasma opnået fra raske kontroller. Denne detektionsanalyse er en pålidelig, meget følsom og nyttig metode til undersøgelse af NETs karakteristika i humane plasma- og kultursupernatanter.

Introduction

Denne artikel skitserer en metode til kvantificering af dannelse af neutrofil ekstracellulær fælde (NET) i biologiske væsker ved anvendelse af sandwichenzymbundet immunosorbentassay (ELISA) til påvisning af komplekser af myeloperoxidase (MPO) og neutrofilelastase (NE) med DNA 1,2. NETs består af en DNA-rygrad dekoreret med antimikrobielle proteaser, der stammer fra neutrofilgranulat 3,4. Både MPO-DNA- og NE-DNA-komplekser er vigtige og specifikke komponenter i NETs og frigives i det ekstracellulære rum som nedbrydningsprodukter af NETs 3,4.

Udover deres vigtige fysiologiske rolle i antimikrobielt forsvar3 har NET'er også forskellige patologiske virkninger4,5, herunder fremme af trombogenese6 og forværring af sepsis7. Derfor har NETs fået opmærksomhed for nylig. Ikke desto mindre har in vivo-kvantificeringen af NETs vist sig at være en udfordring på grund af manglen på en følsom, pålidelig kvantitativ analysemetode.

Nogle få metoder er tilgængelige, herunder direkte måling af NET'er ved fluorescensmikroskopi8,9 og flowcytometri 10 og indirekte måling af cirkulerende cellefrit DNA, nukleosomer og citrullineret histon H3, men hver metode har sine egne fordele og begrænsninger11. Selvom den immunofluorescensmikroskopiske metode er specifik for NET'er og tydeligt viser lokalisering og grad af NET-dannelse, er prøver begrænset til biopsivæv og udskillede materialer. Desuden skal denne metode udføres af dygtige forskere og kræver lang tid for at opnå resultater. Måling af cirkulerende niveauer af NET-relaterede komponenter ved flowcytometri er let og giver resultater hurtigt; Metoden er imidlertid ikke specifik for NETs12.

Vi13 og andre1,2 har udviklet et meget følsomt og pålideligt assay til måling af de cirkulerende NET-komponenter, MPO-konjugeret eller NE-konjugeret DNA, i humant plasma med en modificeret ELISA-teknik, der bruger specifikke antistoffer til MPO eller NE som indfangningsantistoffer og et DNA-specifikt detektionsantistof. Dette assay kan også anvendes ex vivo til at identificere NET-komponenter i cellekultursupernatanter frigivet af aktiverede neutrofiler som reaktion på phorbol 12-myristat 13-acetat (PMA) stimulering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne undersøgelse blev udført i overensstemmelse med Helsingforserklæringen og blev godkendt af de institutionelle bedømmelsesudvalg ved Aichi Medical University (2017-H341, 2019-H137). Der blev indhentet skriftligt informeret samtykke fra hver deltager.

1. Fremstilling af reagens

BEMÆRK: For at udføre sandwich-ELISA-analysen fremstilles reagenserne som beskrevet nedenfor.

  1. Belægning buffer:
    1. For at lave en 0,1 mol / L carbonat-bicarbonatbuffer vejes 10,6 g vandfrit natriumcarbonat (molekylvægt, 106 g / mol) og 8,4 g natriumbicarbonat (molekylvægt, 84 g / mol).
    2. Der tilsættes ca. 900 ml destilleret vand i et bægerglas.
    3. Bufferens pH-værdi justeres til 9,6 ved tilsætning af den nødvendige mængde fortyndet saltsyre eller natriumhydroxid.
    4. Kontroller pH-værdien med en pH-meter.
    5. Derefter tilsættes den nødvendige mængde destilleret vand for at opnå et samlet volumen på 1.000 ml.
    6. Opbevar denne 0,1 mol/L carbonat-bicarbonatbuffer i køleskabet ved 4 °C.
  2. Blokering af buffer:
    1. Der tilsættes ca. 250 μL 20 % natriumazid og 1 g bovin serumalbumin (BSA) til 70 ml fosfatbufret saltvand (PBS) bestående af 137 mmol/l NaCl, 8,1 mmol/l Na2HPO 4, 2,68 mmol/l KCl og 1,47 mol/lKH2PO4(pH 7,4), og bland forsigtigt.
    2. Tilsæt destilleret vand for at opnå et samlet volumen på 100 ml. De endelige koncentrationer af bovin serumalbumin og natriumazid er henholdsvis 1% og 0,05%. Vent i 10 min, og så er opløsningen klar til brug.
  3. Vaskeopløsning: Forbered 0,5% t-octylphenoxypolyethoxyethanol, polyethylenglycol tert-octylphenylether (Triton X-100) i destilleret vand.
    1. Fortynd 100% Triton X-100 til 10% med destilleret vand, og lad 10% opløsningen stå i 1 dag før brug.
    2. Fortynd derefter 10% Triton X-100-opløsningen 20 gange med destilleret vand for at opnå en koncentration på 0,5%.
  4. Fortynding af antistoffer:
    1. Indfangningsantistoffet (anti-MPO-antistof [1 mg/ml] eller anti-NE-antistof [1 mg/ml]) fortyndes til 1:2.000 i belægningsbufferen (pH 9,6) før brug på dag 1 i analysen (se nedenfor) og detektionsantistoffet (peroxidasekonjugeret anti-DNA-antistof) til 1:40 med PBS før brug på dag 3 i analysen (se nedenfor).
      BEMÆRK: Til det indledende forsøg fortyndes iso-type antistoffer (IgG kanin [5 mg / ml] og IgG1 museklon Ci4 [0,5 mg / ml]) til 1:10.000 og 1: 1.000 i belægningsbufferen (pH 9,6).
  5. ABTS-substratopløsning: Afhængigt af antallet af prøver opløses en, to eller tre 2,2'-azino-bis(3 ethylbenzothiazolin-6-sulfonsyretabletter (ABTS) i 5 ml, 10 ml eller 15 ml ABTS-buffer (indeholdende natriumperborat, citronsyre og dinatriumhydrogenphosphat); Der kræves 100 μL pr. prøve. Den tilberedte opløsning opbevares ved 2-8 °C beskyttet mod lys. Opløsningen er stabil i op til 3 måneder.

2. Indsamling og opbevaring af prøver

  1. Plasmaisolering:
    1. Der opsamles 4 ml perifere blodprøver i et lithiumheparinblodopsamlingsrør ved venipunktur med en 22 G sprøjte, og centrifugeres ved 1.600 x g i 10 minutter ved 4 °C.
    2. Supernatanten overføres til et 2 ml prøveglas med sikker låsning.
    3. Supernatanten centrifugeres igen ved 16.000 x g i 10 minutter ved 4 °C for at fjerne eventuelle resterende celler.
    4. Supernatanten samles i et nyt prøveglas med sikker lås, uden at pelletsen i bunden af glasset forstyrres.
    5. Det opnåede plasma opbevares ved -80 °C indtil yderligere anvendelse.
      BEMÆRK: For at opnå resultater med høj kapacitet med dette assay kræves prøver af god kvalitet. Hvis der anvendes plasmaprøver, udføres en anden centrifugering for at fjerne eventuelle resterende celler. Undgå gentagen optøning af prøverne. Brug heparin som antikoagulant, fordi EDTA påvirker DNase-aktiviteten.
  2. Isolering af polymorfonukleære neutrofiler
    1. De perifere blodprøver samles i et lithiumheparinblodopsamlingsrør ved venipunktur med en 22 G sprøjte.
    2. Lag 6 ml blod på 6 ml et-trins polymorfer, og centrifuger rørene ved 1.000 x g i 45 minutter ved stuetemperatur (RT).
    3. Høst det tredje buffy coat-lag, der indeholder neutrofiler, og vask det tre gange i phenolrødfri RPMI-1640 ved 400 x g i 10 minutter ved RT.
    4. Resuspender neutrofilerne i phenolrødfri RPMI-1640 indeholdende 2 mM L-glutamin suppleret med 6% varmeinaktiveret føtalt bovint serum, og tæl cellerne i mikroskopfeltet med et hæmocytometer.
      BEMÆRK: Denne metode giver 96% til 98% renhed med større end 95% levedygtighed, vurderet ved udelukkelse af trypanblåt farvestof.
  3. Aktivering af polymorfonukleære neutrofiler og NETosis in vitro
    1. Fortynd frisk isolerede polymorfonukleære neutrofiler til 1 × 105 celler/ml i phenolrødfri RPMI-1640 indeholdende 2 mM L-glutamin suppleret med 6% varmeinaktiveret føtalt kvægserum, og frø dem i 35 mm kulturskåle.
    2. For at inducere NETs stimulerer polymorfonukleære neutrofiler med 25 nM PMA i 4 timer ved 37 °C i 5% CO2 / 95% luft.
    3. Efter 4 timers inkubation fordøjes NET'erne delvist ved at tilsætte 0,6 μg/ml DNase I direkte til dyrkningsskålene i 15 minutter ved RT, og DNase I-aktiviteten stoppes ved tilsætning af 5 mM EDTA.
    4. Mediet indeholdende de syntetiserede net opsamles, og centrifugeres ved 400 x g i 10 minutter ved 4 °C for at fjerne celleaffaldet.
    5. Supernatanterne fremstilles af fire sunde kontrolstoffer, blandes og opbevares ved -80 °C indtil brug.
      BEMÆRK: DNase-fordøjede PMA-stimulerede neutrofiler opnået fra fire raske kontroller anvendes som NET-standard 1,14,15. Der genereres en kalibreringskurve ud fra en serielt fortyndet NET-standard med PBS, og de optiske densitetsværdier (OD) opnået fra en ufortyndet NET-standard tildeles som 100 % NET.

3. Assay metode

BEMÆRK: Trinene til udførelse af analysen er beskrevet detaljeret nedenfor.

  1. Dag 1
    1. Der påføres i alt 100 μL fortyndet anti-MPO- eller anti-NE-antistof indeholdende 0,05 μg antistof på hvert hul på pladen, inklusive blindprøvelaboratoriet.
      BEMÆRK: Belægningsbufferen må ikke indeholde nogen form for rengøringsmiddel, da antistofferne ellers muligvis ikke binder sig lige og glat til væggene i hvert hul. For at forhindre krogeffekten må overfladebehandlingsproteinkoncentrationen ikke være mere end 20 μg/ml, da koncentrationer over dette niveau vil mætte de fleste tilgængelige steder på mikrotiterpladen. Det typiske koncentrationsområde for proteinbelægningsopløsninger er 2-10 μg/ml. Til det foreløbige forsøg skal du bruge fortyndet iso-type kontrolantistof IgG kanin til belægning i stedet for specifikke monoklonale antistoffer mod MPO. Brug fortyndet iso-type kontrolantistof IgG1-mus til belægning i stedet for specifikke monoklonale antistoffer mod NE.
    2. Pladen dækkes med et klæbende plastdæksel for at forhindre fordampning af prøven, og der inkuberes natten over ved 4 °C for at muliggøre binding af indfangningsantistofferne.
  2. Dag 2
    1. Kassér den fortyndede antistofopløsning fra hullerne, og pipette derefter 300 μL vaskeopløsning pr. hul, og gentag denne vaskeprocedure tre til fire gange.
    2. Fjern overskydende PBS ved at banke pladen tør på et køkkenrulle.
    3. Hvert hul på ELISA-pladen blokeres med 200 μL blokerende buffer.
    4. Dæk pladen tæt med et klæbende plastdæksel, og inkuber det i 1,5-2 timer ved RT for at blokere brøndene.
    5. Kassér blokeringsopløsningen helt fra hullerne, og pipette derefter 300 μL vaskeopløsning pr. hul, og gentag denne vaskeprocedure tre til fire gange.
    6. Fjern overskydende PBS ved at banke pladen tør på et køkkenrulle.
    7. Der påføres i alt 25 μL plasma eller substrat i hvert hul undtagen blindprøven, og der tilsættes 75 μL PBS som fortyndingsmiddel, så det endelige volumen bliver 100 μL. Der tilsættes 100 μL PBS til tomprøven.
    8. Bland derefter prøverne ved RT i 10 s ved at placere pladen på en ryster ved 250 o / min.
    9. Der påføres 2 μL 100 gange fortyndet DNase I (0,03 mg/ml) i hvert hul, herunder blindprøveemnet (slutkoncentration af DNase I i reaktionsblandingen: 0,6 μg/ml).
    10. Pladen forsegles med et klæbende plastdæksel, og prøverne blandes grundigt ved RT i 10 sekunder ved at placere pladen på en ryster ved 250 o / min.
      BEMÆRK: For at vurdere de optimale betingelser for DNA-fordøjelse inkuberede vi ved udviklingen af analysen prøver indeholdende MPO-associeret DNA fra patienter med COVID-19 med 0-0,9 μg/ml DNase I i 15 minutter ved RT og brugte plader belagt med specifikt indfangningsantistof til MPO eller et artsmatchet iso-type kontrolantistof.
    11. Inkuber prøverne i 15 minutter ved RT.
    12. Fjern det klæbende plastdæksel, og påfør 1 μL 0,5 M EDTA på hvert hul for at stoppe DNase-reaktionen.
    13. Pladen forsegles igen med et klæbende plastdæksel, og ryst den ved RT i 15 s ved at placere den på en ryster ved 250 o / min.
    14. Derefter inkuberes pladen natten over ved 4 °C for at lade proteinkomponenterne i NET'erne binde sig til indfangningsantistofferne.
  3. Dag 3
    1. Fjern det klæbende plastdæksel, og kassér opløsningen fra brøndene.
    2. Kassér opløsningen helt fra hullerne, og pipette derefter 300 μL af vaskeopløsningen pr. hul, og gentag denne vaskeprocedure tre til fire gange.
    3. Der påføres i alt 100 μL af det fortyndede peroxidasekonjugerede anti-DNA-detektionsantistof i hvert hul.
    4. Pladen forsegles tæt med et klæbende plastdæksel, og inkuber den i 1,5 time ved RT.
    5. Kassér opløsningen helt fra hullerne, og pipette derefter 300 μL vaskeopløsning pr. hul, og gentag denne vaskeprocedure tre til fire gange.
    6. Fjern forsigtigt den resterende opløsning.
    7. Påfør i alt 100 μL ABTS-substratopløsning på hvert hul, og dæk pladen med et klæbende plastdæksel.
    8. Inkuber pladen i mørke ved RT i 20-30 minutter på en ryster ved 250 o / min.
      BEMÆRK: Overvåg pladen med 5 minutters mellemrum, indtil de ønskede OD-aflæsninger opnås.
    9. Der tilsættes i alt 50 μL 2 M svovlsyre for at stoppe reaktionen.
    10. Bland væskeindholdet i brøndene ved forsigtigt at banke på siden af pladen.
    11. Tænd mikropladelæseren, og slut den til computeren.
    12. Åbn softwareprogrammet på computeren.
    13. Opret et nyt eksperiment på statuslinjen, og navngiv det.
    14. Indstil alle følgende parametre til pladelæsning: Læs type, Absorbans; Læsetilstand, slutpunkt; Bølgelængder, 2; Lm-1, 405 nm; Lm-2, 490 nm; Automatisk blanding & Blanking før, Fra; Forlæst plade, Fra; Automatisk kalibrering, Til; Strimler, læs hele pladen; Kolonnebølgelængdeprioritet, kolonneprioritet; Vognhastighed, normal; og Automatisk læsning, Fra.
    15. Sæt derefter 96-brøndspladen med prøverne i skuffen og luk den.
    16. Til sidst skal du vælge knappen Læs , så pladen læses med det samme.
    17. Absorbansen af hvert hul aflæses ved en bølgelængde på 405 nm ved hjælp af en mikropladelæser (på dette stadium anvendes en bølgelængde på 490 nm som reference).
    18. Udfør automatisk subtraktion af absorbansværdien af analysesubstratet alene fra alle de ukendte prøver, og gem dataene.
      BEMÆRK: Anvend en standardkurve fra serielt fortyndet NET-standard til beregning af den relative koncentration af NET i prøven 1,14,15. Her præsenteres de endelige resultater som "MPO- eller NE-DNA-komplekser (% af NET-standard)." Detektionsgrænsen (LOD) blev beregnet ud fra standardafvigelsen (SD) og kalibreringskurvens hældning (S) som følger: LOD = 3,3(SD/S).

4. Statistik

  1. Udfør alle statistiske analyser ved hjælp af passende statistisk analysesoftware. Her blev SigmaPlot v14.5 brugt. Procentdele og kontinuerlige variabler vises som medianen med interkvartilområdet på grund af den skæve fordeling af de fleste parametre.
  2. Sammenlign plasma MPO-DNA og NE-DNA niveauer mellem COVID-19 patienter og raske kontroller ved hjælp af Wilcoxon rangsum test. Brug korrelationsanalyse til at undersøge forholdet mellem optisk densitet og procentdelen af NET-standard.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne metode anvendte en sandwich ELISA med anti-MPO, anti-NE og anti-DNA monoklonale antistoffer til måling af MPO-associeret og NE-associeret DNA (figur 1). I denne metode blev brøndene i en mikrotiterplade belagt med et MPO-specifikt eller NE-specifikt monoklonalt antistof for at fange DNA-associeret MPO og DNA-associeret NE såvel som ikke-DNA-associeret MPO og NE. For at beregne intra-assay-variabilitetskoefficienten (CV) blev der udført dobbeltmålinger inden for samme plade for 30 prøver indsamlet fra patienter med COVID-19 og raske kontroller, og %CV blev beregnet som gennemsnittet af de dobbelte målinger; for at beregne inter-assay CV (dvs. plade-til-plade-konsistensen) blev to typer prøver fra patienter med COVID-19 og raske kontroller målt i fire gange på 10 forskellige plader; for at påvise specificiteten af dette assay blev forskellige koncentrationer af MPO-DNA- og NE-DNA-komplekser analyseret ved anvendelse af plader belagt med iso-type kontrolantistoffer i stedet for specifikke monoklonale antistoffer mod MPO og NE; og for at beregne analysens følsomhed og linearitet blev der analyseret en serielt fortyndet NET-standard fremstillet ved at stimulere isolerede humane neutrofiler med PMA og mild DNase-fordøjelse, og korrelationskoefficienten og detektionsgrænsen (LOD) blev beregnet.

Kalibreringskurverne for MPO-DNA og NE-DNA fra en serielt fortyndet NET-standard er vist i figur 2. Pålidelige standardkurver for MPO-DNA og NE-DNA (R2 = henholdsvis 0, 958 og 0, 963) opnås, når absorbansværdierne ikke overstiger koncentrationer på henholdsvis 0, 93 og 0, 90. LOD-værdierne beregnet ud fra SD og kalibreringskurvens hældning var henholdsvis 0,132% og 0,126% for MPO-DNA og NE-DNA (%NET-standard).

Den højeste OD blev opnået, når 0,6 μg/ml DNase I blev anvendt (figur 3). DNA-fordøjelsen var derfor begrænset til tilsætning af en 0,6 μg/ml reaktionsblanding af DNase I i 15 minutter ved stuetemperatur. Når pladerne blev belagt med iso-type kontrolantistoffet i stedet for det specifikke monoklonale antistof mod MPO, blev der påvist meget lave OD-værdier (<0,09 absorbansenheder [AU]) ved forskellige koncentrationer af DNase I.

For at beregne intra-assay-variabilitetskoefficienten (CV) for MPO-DNA og NE-DNA blev der udført dobbeltmålinger i 30 prøver fra patienter med COVID-19 og sunde kontroller i samme plade; %CV blev beregnet ved hjælp af duplikatmiddelværdien. Intra-assay-CV'erne for MPO-DNA og NE-DNA var henholdsvis 1.871 og 0.987 hos raske kontroller og henholdsvis 2.532 og 2.010 hos COVID-19-patienter (tabel 1). De gennemsnitlige intra-assay CV'er for MPO-DNA og NE-DNA var henholdsvis 2,202 ± 0,467 og 1,497 ± 0,723 (gennemsnit ± SD) (tabel 1).

For at beregne inter-assay CV for MPO-DNA og NE-DNA blev to typer prøver indsamlet fra patienter med COVID-19 og raske kontroller målt i fire gange på 10 forskellige plader for at overvåge plade-til-plade-konsistensen. De gennemsnitlige interassay-CV'er for MPO-DNA og NE-DNA var henholdsvis 6,524 ± 2,672 og 4,389 ± 0,923 (gennemsnit ± SD) (tabel 2).

For at evaluere specificiteten af indfangningsantistofferne mod MPO-DNA- og NE-DNA-komplekser analyserede vi forskellige koncentrationer af MPO-DNA- og NE-DNA-komplekser ved at bruge plader belagt med iso-type kontrolantistoffer i stedet for specifikke monoklonale antistoffer mod MPO og NE. Tabel 3 viser, at iso-type kontrolantistofferne reagerede lidt med MPO-DNA- og NE-DNA-komplekserne ved de forskellige koncentrationer (0,035 AU til 0,078 AU og -0,007 AU til 0,096 AU, henholdsvis).

Niveauerne af MPO-DNA og NE-DNA i supernatanten af DNase-fordøjede PMA-stimulerede neutrofiler blev defineret som 100% NET-standard, og plasmaprøvedataene blev udtrykt som %NET-standard. Niveauerne af MPO-DNA (%NET-standard) var signifikant højere i plasma fra patienter med COVID-19 (n = 16; 29,1% [IQR, 25,8; 41,5]) end i plasma fra raske kontroller (n = 10; 13,4% [IQR, 12,4; 14,8]), ligesom niveauerne af NE-DNA (%NET-standard) (46,4% [IQR, 32,7; 53,7] vs. 12,1% [IQR, 9,9; 14,7], P < 0,01; Figur 4).

Figure 1
Figur 1: Grundlæggende stadier af en sandwichenzymbundet immunosorbentassaymetode til måling af myeloperoxidase-DNA eller neutrofil-elastase-DNA i prøver. (A) Brøndene er belagt med et anti-myeloperoxidase (MPO) eller anti-neutrofil elastase (NE) indfangningsantistof. B) De resterende proteinbindingssteder blokeres af blokeringsmidler. C) Der tilsættes prøver indeholdende NE-konjugeret og MPO-konjugeret DNA. (D) Der udføres begrænset DNase-nedbrydning, og prøven inkuberes i hullerne for at binde med indfangningsantistoffet. (E) Et sekundært peroxidasemærket anti-DNA-antistof tilsættes. (F) Ubundet sekundært peroxidasemærket antistof fjernes. (G) Substratet 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonsyre) tilsættes, og farveudviklingen overvåges. Forkortelser: ABTS = 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonsyre); MPO = myeloperoxidase; NE = neutrofil elastase Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Linearitet af forholdet mellem intensitetsværdierne og de forskellige fortyndinger af den neutrofile ekstracellulære fældestandard. Supernatanten af DNase-fordøjet phorbol 12-myristat 13-acetat-stimulerede neutrofiler blev serielt fortyndet, og niveauerne af myeloperoxidase-DNA og neutrofil elastase-DNA blev analyseret for at generere en kalibreringskurve. Absorbansenhederne (AU) opnået fra den ufortyndede neutrofile ekstracellulære fældestandard (NET-standard) blev tildelt som 100% NET, og tegning af intensitetsværdien ved 405 nm mod %NET-standarden afslørede et lineært forhold. Forkortelser: MPO = myeloperoxidase; NE = neutrofil elastase; NET = neutrofil ekstracellulær fælde Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Dosis-respons af DNase I i neutrofil ekstracellulær fælde-DNA-fordøjelse. Prøven blev indsat i myeloperoxidasebelagte brønde. Derefter blev DNase I (0 μg / ml, 0,3 μg / ml, 0,6 μg / ml eller 0,9 μg / ml) tilføjet. Efter 15 minutters fordøjelse blev enzymaktiviteten stoppet, og de resterende trin i det sandwichenzymbundne immunosorbentassay blev udført i overensstemmelse hermed. Dataene vises som gennemsnittet ± SD. N = 12. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Plasmaniveauer af myeloperoxidase-DNA og neutrofile elastase-DNA-komplekser hos patienter med COVID-19. Dataene udtrykkes som procentdele af neutrofilt ekstracellulær fældestandardindhold (NET-standard) og præsenteres som medianer og interkvartile intervaller. Patienter med COVID-19, n = 16; sunde kontroller, n = 10. ** P < 0,01 versus raske kontroller. Forkortelser: HC = sund kontrol; NET = neutrofil ekstracellulær fælde. Klik her for at se en større version af denne figur.

Tabel 1: Variabilitetskoefficient inden for assayet. Tredive prøver blev målt i to eksemplarer for at overvåge individuelle variabilitetskoefficienter og således bestemme variabilitetskoefficienten inden for assayet. Forkortelser: AU = absorbansenheder; CV = variationskoefficienter Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 2: Variationskoefficient mellem assay. Prøverne blev målt i fire eksemplarer på 10 forskellige plader for at overvåge plade-til-plade-variation og dermed bestemme variationskoefficienten mellem assay. Forkortelser: AU = absorbansenheder; CV = variabilitetskoefficient. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 3: Specificitetstest for indfangningsantistoffer. Pladerne blev belagt med iso-type kontrolantistoffer for anti-myeloperoxidase (MPO) og anti-neutrofil elastase (NE) for at evaluere specificiteten af indfangningsantistofferne for MPO-DNA- og NE-DNA-komplekserne. Forkortelser: AU = absorbansenheder; MPO = myeloperoxidase; NE = neutrofil elastase Klik her for at downloade denne tabel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi har beskrevet en sandwich ELISA-metode, hvor MPO eller NE binder til et sted af indfangningsantistoffet under den indledende inkubation af prøver indeholdende MPO-DNA eller NE-DNA-komplekser. Efter vask afsluttes "sandwich" ved at inkubere prøverne med et peroxidaseassocieret anti-DNA monoklonalt antistof. Efter fjernelse af ubundet sekundært antistof påvises det bundne peroxidasekonjugat ved tilsætning af et kromogent ABTS-peroxidasesubstrat, som giver et opløseligt slutprodukt, der kan aflæses spectrophotometrisk ved 405 nm. Den gode linearitet og høje interassay- og intraassaypræcision indikerer, at ELISA-analysen beskrevet i dette papir og andre 1,2 er pålidelig og gennemførlig til klinisk anvendelse. Når supernatanten af DNasebehandlede PMA-stimulerede neutrofiler tildeles som maksimalt signal for NET-standarden, kan dette ELISA-assay anvendes som en semikvantitativ metode 1,14,15.

De lange kromatintråde i NETs er dekoreret med MPO- og NE-proteiner. For at øge bindingen mellem indfangningsantistoffet og MPO-DNA- eller NE-DNA-komplekserne skæres trådene i kortere stykker ved begrænset DNA-fordøjelse med enzymet DNase; tilsætning af en DNase-koncentration, der er for høj, kan føre til overdreven fordøjelse af DNA'et og dermed et fald i absorbansen. Resultaterne af et indledende forsøg (se figur 3) viste, at en passende mængde DNase-tilsætning er nødvendig for at løsne resterne fra NETs. Eksperimenterne, der anvendte iso-type kontrolantistoffer i stedet for specifikke indfangningsantistoffer, viste, at de indfangningsantistoffer, der blev anvendt i dette assay, var specifikke for MPO-DNA- og NE-DNA-komplekser.

Det tidlige stadium af NET-dannelse er karakteriseret ved dekondenseret kromatin og bevarelsen af plasmamembranens intensitet 9,16,17. Neutrofiler med en kondenseret kerne er blevet identificeret som neutrofiler, der gennemgår NET-dannelse og kan kvantificeres ved flowcytometri10. Selvom flowcytometri kan analysere et stort antal billeder fra celler på kort tid, kan det ikke bruges til at evaluere de senere stadier af NET-dannelse efter cellemembranbrud og ekstrudering af kromatin. Citrullinerede histoner H3, som vides at være NET-specifikke markører, kan påvises ved western blotting18 og ELISA19; Disse metoder er dog kun specifikke for PAD4-relateret NET-dannelse og kan ikke bruges til at vurdere PAD4-uafhængige NETs20.

Konklusionen om, at niveauerne af serum NET-rester var højere hos patienter med COVID-19 end hos raske kontroller, stemmer overens med tidligere rapporter21,22. Dette fund tyder på, at neutrofilaktivering, herunder NET-dannelse, kan spille en vigtig rolle i patogenesen af COVID-19.

Dette assay har en begrænsning. Nylige rapporter har vist, at immunrelaterede gener, herunder MPO og ELANE, som koder for henholdsvis MPO og NE, udtrykkes stærkt under ukontrollerede inflammatoriske tilstande23 og er positivt korreleret med sygdommens sværhedsgrad og dødelighed24. Da MPO og NE er involveret i dannelsen af NET'er uafhængigt af disse enzymatiske aktiviteter15, kan øgede proteinniveauer af NE og MPO i neutrofiler påvirke resultaterne af dette assay.

Vi konkluderer, at denne sandwich ELISA-metode direkte måler ekstracellulært DNA med granulatproteiner, herunder NE og MPO, som er specifikke for NET-dannelse. Denne detektionsanalyse er en pålidelig, meget følsom og nyttig metode til undersøgelse af NETs karakteristika i humane prøver og kultursupernatanter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Alle de data, der genereres og / eller analyseres under denne undersøgelse, er inkluderet i denne offentliggjorte artikel. Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Forfatterne takker Dr. Huq Muhammad Aminul for at have hjulpet med at gennemgå manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Step Polymorphs Accurate Chemical and Scientific Corporation AN221725 Isolation of PMN's from human blood.
96-well microtiter plate Thermo Fisher Scientific 467466 flat bottom
ABTS buffer solution Sigma-Aldrich Merck 11 204 530 001 Contains sodium perborate, citric acid, and disodium hydrogen phosphate. 
ABTS tablets Sigma-Aldrich Merck 11 204 521 001  Each tablet contains 5 mg ABTS substrate and 60 mg vehicle substances.
Adhesive plastic cover, Axygen Thermo Fisher Scientific 14222348
Anti-MPO antibody Sigma-Aldrich Merck  07-496-I Store at 2-8 °C. stable for 1 year. Host species is rabbit.
Anti-NE antibody, clone AHN-10 Sigma-Aldrich Merck MABS461 Store at 2-8 °C. stable for 1 year. Host species is mouse.
Bovine serum albumin Biomedical Science BR-220700081 Albumin from bovine fraction V. Store at 2–8 °C. stable for 2 year.
DNase I New England BioLabs M0303M Store at -20 °C
IgG, rabbit, Isotype Control GENETEX, Inc. GTX35035 Store as concentrated solution at 2–8 °C.
IgG1, mouse Isotype Control, clone Ci4 Merck  MABC002 Store as concentrated solution at 2–8 °C.
Lithium heparin blood collection tube Becton Dickinson and Company
Microplate mixer As one corporation NS-P
Microplate Reader Molecular Devices SpectraMax 190  Any microplate plate reader capable of reading wavelengths from 405–490 nm can use.
Microplate reader application Molecular Devices SoftMax pro
Peroxidase-conjugated anti-DNA antibody, Cell death Detection ELISA Roche Diagnostics 1154467500  bottle 2. Store at 2–8 °C. stable for 1 year.
Phorbol 12-myristate 13-acetate Sigma-Aldrich Merck P8139 Activation of PMN's from human blood.
Phosphate buffered solution Takara Bio T9181 Store at room temperature. Stable for 6 months.
SigmaPlot v14.5  Systat Software Inc. San Jose, CA, USA
Sodium azide Fujifilm Wako Chemicals 190-14901 Store at room temperature.
t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether Fujifilm Wako Chemicals 9002-93-1 Store at room temperature.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sil, P., Yoo, D. G., Floyd, M., Gingerich, A., Rada, B. High throughput measurement of extracellular DNA release and quantitative NET formation in human neutrophils in vitro. Journal of Visualized Experiments. (112), e52779 (2016).
  2. Yoo, D. G., Floyd, M., Winn, M., Moskowitz, S. M., Rada, B. NET formation induced by Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis isolates measured as release of myeloperoxidase-DNA and neutrophil elastase-DNA complexes. Immunology Letters. 160 (2), 186-194 (2014).
  3. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  4. Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews Immunology. 18, 134-147 (2018).
  5. Chamardani, T. M., Amiritavassoli, S. Inhibition of NETosis for treatment purposes: Friend or foe. Molecular and Cellular Biochemistry. 477 (3), 673-688 (2022).
  6. Rao, A. N., Kazzaz, N. M., Knight, J. S. Do neutrophil extracellular traps contribute to the heightened risk of thrombosis in inflammatory diseases. World Journal of Cardiology. 7 (12), 829-842 (2015).
  7. Sørensen, O. E., Borregaard, N. Neutrophil extracellular traps - The dark side of neutrophils. Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1612-1620 (2016).
  8. Abrams, S. T., et al. A novel assay for neutrophil extracellular traps (NETs) formation independently predicts disseminated intravascular coagulation and mortality in critically ill patients. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 200 (7), 869-880 (2019).
  9. Brinkmann, V., Goosmann, C., Kühn, L. I., Zychlinsky, A. Automatic quantification of in vitro NET formation. Frontiers in Immunology. 3, 413 (2012).
  10. Zhao, W., Fogg, D. K., Kaplan, M. J. A novel image-based quantitative method for the characterization of NETosis. Journal of Immunological Methods. 423, 104-110 (2015).
  11. Masuda, S., et al. NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers. Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).
  12. Rada, B. Neutrophil extracellular traps. Methods in Molecular Biology. 1982, 517-528 (2019).
  13. Kano, H., Huq, M. A., Tsuda, M., Noguchi, H., Takeyama, N. Sandwich ELISA for circulating myeloperoxidase- and neutrophil elastase-DNA complexes released from neutrophil extracellular traps. Advanced Techniques in Biology & Medicine. 5 (1), 1000196 (2016).
  14. Prevel, R., et al. Plasma markers of neutrophil extracellular trap are linked to survival but not to pulmonary embolism in COVID-19-related ARDS patients. Frontiers in Immunology. 13, 851497 (2022).
  15. Schechter, M. C., et al. et al. extracellular trap (NET) levels in human plasma are associated with active TB. PLoS One. 12, e0182587 (2017).
  16. Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps. Journal of Cell Biology. 191 (3), 677-691 (2010).
  17. Gupta, S., Chan, W., Zaal, K. J., Kaplan, M. J. A high-throughput real-time imaging technique to quantify NETosis and distinguish mechanisms of cell death in human neutrophils. Journal of Immunology. 200 (2), 869-879 (2018).
  18. Li, M., Lin, C., Leso, A., Nefedova, Y. Quantification of citrullinated histone H3 bound DNA for detection of neutrophil extracellular traps. Cancers. 12 (11), 3424 (2020).
  19. Thålin, C., et al. Quantification of citrullinated histones: Development of an improved assay to reliably quantify nucleosomal H3Cit in human plasma. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 18 (10), 2732-2743 (2020).
  20. Li, P., et al. PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps. Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1853-1862 (2010).
  21. Zuo, Y., et al. Neutrophil extracellular traps in COVID-19. JCI Insight. 5 (11), e138999 (2020).
  22. Masso-Silva, J. A., et al. Increased peripheral blood neutrophil activation phenotypes and neutrophil extracellular trap formation in critically ill Coronavirus disease 2019 (COVID-19) patients: A case series and review of the literature. Clinical Infectious Diseases. 74 (3), 479-489 (2022).
  23. Gong, F. C., et al. Identification of potential biomarkers and immune features of sepsis using bioinformatics analysis. Mediators of Inflammation. 2020, 3432587 (2020).
  24. Almansa, R., et al. Transcriptomic correlates of organ failure extent in sepsis. Journal of Infection. 70 (5), 445-456 (2015).

Tags

Immunologi og infektion nummer 195
Kvantificering af myeloperoxidase-DNA og neutrofile elastase-DNA-komplekser fra neutrofile ekstracellulære fælder ved hjælp af en modificeret sandwich-ELISA
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Islam, M. M., Salma, U., Irahara,… More

Islam, M. M., Salma, U., Irahara, T., Watanabe, E., Takeyama, N. Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA. J. Vis. Exp. (195), e64644, doi:10.3791/64644 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter