Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Tredimensionel kultur af vaskulariseret termogenisk fedtvæv fra mikrovaskulære fragmenter

Published: February 3, 2023 doi: 10.3791/64650
Automatic Translation
1, 2,3, 2, 2, 2,3, 2,3
1Department of Biochemistry and Structural Biology, University of Texas Health Science Center, 2Department of Biomedical Engineering and Chemical Engineering, University of Texas at San Antonio, 3Institute of Regenerative Medicine, University of Texas at San Antonio

Summary

Her præsenterer vi en detaljeret protokol, der skitserer brugen af mikrovaskulære fragmenter isoleret fra gnaver- eller humant fedtvæv som en ligetil tilgang til at konstruere funktionelt, vaskulariseret beige fedtvæv.

Abstract

Engineering termogeniske fedtvæv (fx beige eller brune fedtvæv) er blevet undersøgt som en potentiel terapi for metaboliske sygdomme eller for design af personlige mikrovæv til sundhedsscreening og lægemiddeltestning. Nuværende strategier er ofte ret komplekse og undlader nøjagtigt fuldt ud at skildre de multicellulære og funktionelle egenskaber af termogeniske fedtvæv. Mikrovaskulære fragmenter, små intakte mikrokar bestående af arteriol, venuler og kapillærer isoleret fra fedtvæv, tjener som en enkelt autolog kilde til celler, der muliggør vaskularisering og dannelse af fedtvæv. Denne artikel beskriver metoder til optimering af dyrkningsbetingelser for at muliggøre generering af tredimensionelle, vaskulariserede og funktionelle termogeniske fedtvæv fra mikrovaskulære fragmenter, herunder protokoller til isolering af mikrovaskulære fragmenter fra fedtvæv og dyrkningsbetingelser. Derudover diskuteres bedste praksis, ligesom teknikker til karakterisering af de konstruerede væv, og prøveresultater fra både gnavere og humane mikrovaskulære fragmenter tilvejebringes. Denne tilgang har potentiale til at blive brugt til forståelse og udvikling af behandlinger for fedme og metabolisk sygdom.

Introduction

Målet med denne protokol er at beskrive en tilgang til udvikling af vaskulariseret beige fedtvæv fra en enkelt, potentielt autolog kilde, mikrovaskulært fragment (MVF). Brunt og beige fedtvæv har vist sig at vise gavnlige egenskaber relateret til metabolisk regulering; Den lille mængde af disse fedtvævsdepoter hos voksne begrænser imidlertid den potentielle indvirkning på systemisk metabolisme, især ved syge tilstande som fedme eller type 2-diabetes 1,2,3,4,5,6,7. Der er betydelig interesse for brunt / beige fedt som et terapeutisk mål for forebyggelse af de skadelige metaboliske virkninger forbundet med fedme og dens comorbiditeter 8,9,10,11,12.

MVF'er er karstrukturer, der kan isoleres direkte fra fedtvæv, dyrkes og vedligeholdes i en tredimensionel konfiguration i længere perioder13,14,15. Tidligere arbejde fra vores gruppe og andre er begyndt at udnytte MVF'ernes multicellulære og multipotente kapacitet, specifikt da det vedrører dannelse af fedtvæv16,17,18. Som en opbygning af dette arbejde demonstrerede vi for nylig, at MVF'er afledt af gnavermodeller af sund og type 2-diabetes19 og fra mennesker (voksne over 50 år)20 indeholdt celler, der kunne induceres til dannelse af termogent eller beige fedtvæv.

Heri er en innovativ tilgang, hvorfra en enkelt kilde MVF anvendes, ikke kun i stand til at skabe beige fedtvæv, men også dets tilknyttede og kritiske vaskulære komponent21. Brugen af denne teknik kunne være af stor værdi for undersøgelser på udkig efter en ligetil væv-manipuleret tilgang til termogeniske fedtvæv dannelse. I modsætning til andre metoder, der stræber efter at konstruere beige fedtvæv 22,23,24,25,26,27,28, kræver processen beskrevet i denne undersøgelse ikke anvendelse af flere celletyper eller komplekse induktionsregimer. Vaskulariserede beige og hvide fedtmodeller kan oprettes med MVF'er, der stammer fra gnavere og menneskelige kilder, hvilket viser et stort oversættelsespotentiale. Slutproduktet af denne protokol er en konstrueret beige termogeniske fedtvæv med en struktur og metabolisk funktion kan sammenlignes med brunt fedtvæv. Samlet set præsenterer denne protokol ideen om, at en let tilgængelig og muligvis autolog kilde MVF kan være en værdifuld terapeutisk intervention og værktøj til at studere metaboliske lidelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne undersøgelse blev udført i overensstemmelse med dyrevelfærdsloven og gennemførelsesforordningerne om dyrevelfærd i overensstemmelse med principperne i vejledningen om pasning og brug af forsøgsdyr. Alle dyreforsøg blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee ved University of Texas i San Antonio.

BEMÆRK: Til nedenstående trin anvendes Lewis-hanrotter. Der skal foretages små protokoljusteringer for en kvindelig såvel som musemikrovaskulært fragment (MVF) samling29. For protokoller, der anvender humane MVF'er (h-MVF'er), er de eneste nødvendige trin resuspension af h-MVF'er i overensstemmelse med fabrikantens protokol, forberedelse af vækstmedier (1.3), dannelse af fibrinhydrogeler (5) og dyrkning (6). For en oversigt over protokollen, se figur 1.

Figure 1
Figur 1: Eksperimentel oversigt. Opdeling af seks nøgletrin, før analyse, til dannelse af termogenisk fedtvæv ved hjælp af MVF. Klik her for at se en større version af denne figur.

1. Fremstilling af reagens

BEMÆRK: Reagenser nedenfor svarer til en rotte, vejet og fremstillet inde i en biohood.

  1. Der fremstilles bovin serumalbumin (BSA) i PBS.
    1. Klargør 10 mg/ml (1,0%) BSA i PBS, der skal fortyndes til vasketrin (1 mg/ml, 0,1%) og fordøjelse (4 mg/ml, 0,4%).
    2. Der fremstilles forskellige BSA-koncentrationer som nævnt i trin 1.1.1 ved at følge trin 1.1.3-1.1.5.
    3. 10 mg/ml BSA i PBS (1% BSA i PBS)
      1. Der tilsættes 500 mg BSA og 500 ml PBS til et 50 ml konisk rør og hvirvel opløsningen for at opløse BSA.
      2. Hvis der dannes for store bobler, centrifugeres opløsningen ved 350 x g i 2 min. Filter steriliser opløsningen med et 0,22 μm nylonnetfilter.
    4. 1 mg/ml BSA i PBS (0,1% BSA i PBS)
      1. 15 ml 10 mg/ml BSA i PBS 1:10 fortyndes med PBS ved at tilsætte 15 ml 10 mg/ml BSA i PBS til 135 ml PBS i en 500 ml steril flaske og ryste forsigtigt flasken for at sikre en homogen blanding.
    5. 4 mg/ml BSA i PBS (0,4% BSA i PBS)
      1. 35 ml 10 mg/ml BSA fortyndes i PBS 1:2,5 med PBS ved at tilsætte 35 ml 10 mg/ml BSA i PBS + 57,5 ml PBS i en 100 ml steril flaske og rystes forsigtigt på flasken for at sikre en homogen blanding.
  2. Forbered kollagenase i BSA til fordøjelsen af hakket fedtpuder.
    1. Forbered 6 mg/ml collagenase.
      1. I et 50 ml konisk rør vejes 72 mg kollagenase (etiket "for Epi").
      2. I tre 50 ml koniske rør vejes 144 mg kollagenase (etiket "for Ing 1", "for Ing 2" og "for SubQ") hver.
      3. Den udvejede collagenase opbevares ved 4 °C indtil brug.
        BEMÆRK: Tilsæt ikke BSA/PBS før lige før fordøjelsen.
      4. Der tilsættes 12 ml 4 mg/ml BSA i PBS til tuben indeholdende 72 mg collagenase.
      5. Der tilsættes 24 ml 4 mg/ml BSA i PBS til reagensglassene indeholdende 144 mg collagenase.
      6. Ryst rørene for at sikre en homogen opløsning og filtrer opløsningen med et 0,22 μm nylonnetfilter.
  3. Forbered vækstmedier suppleret med aminocapronsyre (ACA) for at fodre / differentiere den isolerede MVF.
    1. Vækstmedier (GM): Supplement DMEM med 20% FBS, 1% penicillin-streptomycin (pen strep), 0,2% mycoplasma profylaktisk og 1 mg / ml ACA.
    2. Forbered hvide adipogene medier (WAM).
      1. WAM induktion: Suppler DMEM / F12 med 20% FBS, 1% pen strep, 0,2% mycoplasma profylaktisk, 10 μg / ml insulin, 10 μm forskolin, 1 μm dexamethason og 1 mg / ml ACA.
        BEMÆRK: For h-MVF'er tilsættes desuden 125 μM indomethacin.
      2. WAM vedligeholdelse: Suppler DMEM / F12 med 20% FBS, 1% pen strep, 0,2% mycoplasma profylaktisk, 5 μg / ml insulin og 1 mg / ml ACA.
        BEMÆRK: For h-MVF'er ændres insulinkoncentrationen til 10 μg/ml.
    3. Forbered beige adipogene medier (BAM).
      1. BAM induktion: Supplement DMEM / F12 med 20% FBS, 1% pen strep, 0,2% mycoplasma profylaktisk, 10 μg / ml insulin, 10 μm forskolin, 1 μm dexamethason, 1 μm rosiglitazon , 20 nM 3,3′,5-Triiodo-L-thyronin (T3), og 1 mg / ml ACA.
        BEMÆRK: For h-MVF'er ændres koncentrationen af T3 til 120 nM.
      2. BAM vedligeholdelse: Suppler DMEM / F12 med 20% FBS, 1% pen strep, 0,2% mycoplasma profylaktisk, 5 μg / ml insulin, 10 μm forskolin, 1 μm rosiglitazon 20 nM T3 og 1 mg / ml ACA.
        BEMÆRK: For h-MVF'er ændres insulinkoncentrationen til 10 μg/ml og T3-koncentrationen til 120 nM.
  4. Forbered thrombin (skal kun fremstilles, hvis stamaliquoteret opløsning ikke er tilgængelig) for at fremstille koagulationsmidlet, der skal anvendes i fibringeler.
    1. 10 E/ml thrombin i ddH2O:
      1. Trombinpulver resuspenderes med 1-5 ml ddH2O i hætteglasset fra producenten, og resuspensionen overføres til et 250 ml bægerglas.
      2. Bring opløsningen op til 100 ml og pipet opløsningen op og ned adskillige gange for at sikre en homogen blanding. Opløsningen afsendes i 15 ml koniske rør (~10 ml/reagensglas), og delprøverne opbevares i en fryser til -20 °C.
        BEMÆRK: For at bruge, optø thrombinet ved stuetemperatur (RT).

2. Forberedelse af værktøj/materialer

BEMÆRK: Alle instrumenter skal autoklaveres/steriliseres før brug.

  1. Epididmal/lyske/subkutan fedtisolering (kirurgi skal udføres i et defineret kirurgisk område)
    1. Sørg for tilgængeligheden af engangsunderlag, to saks, en hemostat (valgfrit), to pincet og fire 50 ml koniske rør med 10-15 ml 1 mg / ml BSA (0,1%) i PBS.
  2. Isolering af mikrovaskulært fragment
    1. Til hakning (skal udføres i en biohood) skal du sikre tilgængeligheden af tre ubelagte sterile 100 mm petriskåle, et par tang og et par buede saks.
    2. Til fordøjelse og isolering (skal udføres i en biohood) skal du sikre tilgængeligheden af en saks, et par tang, otte ubelagte sterile 100 mm petriskåle, tre ubelagte sterile 35 mm petriskåle, kollagenasevejet og ved 4 °C, fire 250 ml kolber, en plastholder med et hul i midten, fire 500 μM skærme (skåret i 3 i afrundede firkanter), fire 37 μM skærme (skåret i 3 i afrundede firkanter) og 11 50 ml koniske rør.
  3. Resuspension af fibrin
    1. For fibrinhydrogeler (skal udføres i en biohætte) skal du sikre dig, at fibrinogen, thrombin og vækstmedier (fremstillet under reagensforberedelse) er tilgængelige.

3. Protokol for fedtisolering

  1. Indledende trin
    1. Fyld et bægerglas med ethanol for at vaske og desinficere de kirurgiske instrumenter, før du bruger dem. Forbered derefter bordet til håndtering af rotten og hav et vakuum klar til at aspirere pelsen, der genereres under barberingstrinnet.
    2. Forbered en spand med is, hvor de tidligere fremstillede 50 ml koniske rør, der hver indeholder 10 ml 1 mg / ml BSA, vil blive placeret. Mærk rørene i overensstemmelse hermed.
      BEMÆRK: Det kan være nødvendigt at have to separate koniske rør til lyskefedtet, da to sider skal ekstraheres, og mængden af fedt indsamlet fra denne region har tendens til at være den største sammenlignet med epididymal og posterior subkutan.
    3. Start med en aflivet rotte i det definerede kirurgiske område med de nødvendige kirurgiske værktøjer. Generelt bruges CO2 til at aflive rotterne efter IACUC -protokoller.
    4. Brug hårklippere til at barbere rotten omkring interesseområdet. Specielt barbering mellem lysken og halvdelen af maven for epididymal og lyskefedtisolering (brug den mindre barbermaskine til pelsen i denne region). Barber hele ryggen for at få det bageste subkutane fedt placeret mellem skulderbladene (det er bedst at bruge en større barbermaskine, da pelsen er tykkere på bagsiden af rotten).
    5. Forbered rotten aseptisk ved at sprøjte den ned med 70% ethanol. Generelt anbefales det at rengøre det område, der skal skæres to gange.
  2. Isolering af forskellige fedtdepoter
    1. Inguinal (subkutan)
      1. I liggende stilling løftes huden under penis med en saks. Start snittet med en saks, start i midten og skær sideværts, danner en "V" -form og sløjfer til rottens bagside for at få adgang til hele fedtdepotet. Husk at skære overfladisk, så fedtet nedenunder er intakt. Under skæretrinnet skal du sikre adskillelsen af huden fra fedtet ved at skære det sammenkoblede fasciavæv (figur 2A).
      2. Når fascia er korrekt skåret, skal du sørge for, at de to sider af lyskefedtet er synlige (lyskefedtet strækker sig fra lyskeområdet mod ryggen). Derefter fjernes fedtet fra de to sider i to separate koniske rør indeholdende 10 ml 1 mg / ml BSA (figur 2B).
    2. Epididymal (visceral)
      1. Høst det epididymale fedt ved at skære gennem mavehuden og forsigtigt gennem det tynde lag omkring testiklerne (figur 2C).
      2. Med tang skal du forsigtigt trække fedtvævet ud og skære det ud ved hjælp af en saks. Undgå at dissekere større synlige blodkar (hvis testiklerne og epididymis høstes, skal du fjerne dem under rengøringstrinnet i biohætten).
      3. Anbring forsigtigt det fjernede fedt i et 50 ml konisk rør med 10 ml 1 mg / ml BSA i PBS.
        BEMÆRK: Fjernelse af epididymalt fedt skal ske, efter at lyskefedtet er fjernet. Det epididymale fedt er generelt mindre i volumen og placeret under lyskefedtet, under mavehuden omkring testiklerne og epididymis.
    3. Bageste subkutane
      1. Vend rotten udsat (dorsal side opad), og skær huden på ryggen med en stor saks (huden i denne region er tyk) helt op til hovedbunden, og pas på ikke at skære for dybt lige under huden (figur 2D).
      2. Skær fasciaen, der forbinder huden med vævet; Fedtet er placeret i den interscapulære region. Vær opmærksom på at differentiere/adskille det subkutane fedt fra det brune fedt. Det brune fedt er tættere på rygsøjlen (figur 2E).
      3. Isoler og anbring fedtet i de(t) tilsvarende 50 ml koniske rør med 10 ml 1 mg/ml BSA i PBS.

Figure 2
Figur 2: Isolering af forskellige fedtvævsdepoter . (A) Indledende snit, der er nødvendige for udskæring af det lyskefedtvæv. B) Lyskefedtdepotets beliggenhed. (C) Placering af det epididymale fedtdepot, idet der noteres indsnit i den ydre hud, der er nødvendigt for adgang. (D) Yderligere snit er nødvendige, når musene er placeret tilbøjelige til at få adgang til yderligere fedt. E) Placering af det bageste subkutane fedtdepot. Klik her for at se en større version af denne figur.

4. Protokol for isolering af mikrovaskulære fragmenter

  1. 50 ml konisk rør, der indeholder udskåret fedt fra rotten, anbringes i biohætten.
  2. Brug tang til at placere fedtet i en standard 100 mm petriskål (med ~ 0,5 ml 1 mg / ml BSA i PBS for at holde vævet hydreret).
  3. Rens og fjern synlige blodkar og muskler/fremmed væv fra fedt.
  4. Hak fedtet med en saks i ~10 min (hakket nok til at det kan overføres med en 10 ml pipør).
  5. Kontroller for klumper ved at tilføje ~ 0,5 ml 1 mg / ml BSA i PBS; Fortsæt om nødvendigt med at hakke.
  6. Det hakkede fedt overføres til en steril 250 ml kolbe med en 10 ml pipet.
    BEMÆRK: Bemærk lydstyrken ved hjælp af en pipet.
  7. Tilsæt nok BSA (1 mg/ml), så det endelige volumen er 20 ml.
  8. Der tilsættes 4 mg/ml BSA i PBS til collagenase (endelig koncentration af collagenase: 6 mg/ml) (dvs. 12 ml for 72 mg collagenase eller 24 ml for 144 mg collagenase).
    BEMÆRK: Tilføj ikke, før hakkeningen er færdig, da den er tidsfølsom.
  9. Ryst forsigtigt det koniske rør for at sikre en homogen opløsning og filtrer opløsningen med et 0,22 μm nylonnetfilter.
  10. For det epididymale fedt fordøjes i ~ 8-10 minutter; for det lyskede og bageste subkutane fedt, fordøjes i ~ 15-20 minutter i et 37 ° C vandbad, ryst kolben i en cirkulær bevægelse hele vejen igennem (stop i det øjeblik fedtet kommer til det sted, hvor der kun er få klumper tilbage).
  11. Overfør det fordøjede fedt til et 50 ml konisk rør (der skal være ~ 30 ml / rør), og mærk røret som "fordøjet fedt".
  12. Drej røret ved 400 x g i 4 minutter; efter spinding, skal pelleten være rød (figur 3A).
  13. Under centrifugeringen anbringes den sterile 37 μM skærm og 500 μM skærme i en steril petriskål med 5 ml 1 mg/ml BSA i PBS for at lægge den i blød før brug.
  14. Efter centrifugeringen dekanteres supernatanten i et 50 ml konisk rør mærket som "affald". Udfør dekanteringen forsigtigt for at fjerne det overfladiske fedt og for ikke at forstyrre pellet lavet af MVF'er.
  15. Der tilsættes 10 ml 1 mg/ml BSA i PBS til røret indeholdende pellet ("fordøjet fedt"). Triturere (pipet op og ned) pellet 2x.
  16. Undgå at være for ru på pillen for ikke at forstyrre fragmenterne.
  17. Anbring 500 μM-skærmen i en ny petriskål over plastikholderen (figur 3B).
  18. Pipet 10 ml fra røret "fordøjet pellet" over en 500 μM skærm ved hjælp af koncentriske cirkler (figur 3C).
  19. Filteret vaskes med yderligere 5 ml 1 mg/ml BSA i PBS. De ønskede celler filtreres igennem i petriskålen; Kassér derfor 500 μM-skærmen, men gem den filtrerede væske inde i petriskålen.
  20. Placer 37 μM skærmen i en ny petriskål over plastikholderen.
  21. Skift pipetten ud for at fjerne eventuelle klumper, før du bruger 37 μM-skærmen.
  22. Pipetten væsken opnået fra den første filtrering over 37 μM-skærmen ved hjælp af koncentriske cirkler.
  23. Filteret vaskes med yderligere 5 ml 1 mg/ml BSA i PBS. De ønskede celler forbliver i filteret, kassér derfor den filtrerede væske, men gem 37 μM-skærmen.
  24. Skub 37 μM-skærmen ind i en ny petriskål, der indeholder 5 ml 1 mg/ml BSA i PBS.
  25. Ryst fadet ved at banke det mod en konisk holder for at løsne fragmenterne. Ryst ikke for kraftigt, da væsken/cellerne kan løbe ud af petriskålen.
  26. Skyl filteret med yderligere 5 ml 1 mg/ml BSA i PBS. De ønskede celler forbliver i flydende opløsning i petriskålen. Gem 37 μM-skærmen og det løsrevne fragment indeholdende væske inde i petriskålen til følgende trin.
  27. Overfør BSA + -fragmentet indeholdende væske til et sterilt 50 ml konisk rør.
  28. Gentag skylningen af 37 μM-skærmen flere gange (hver gang med ~5 ml 1 mg/ml BSA i PBS) og tilsæt til det koniske rør. Gentag indtil den samlede indsamlede mængde er ~ 15-20 ml. I sidste ende opsamles de ønskede celler fra den flydende opløsning i petriskålen og anbringes i et konisk rør; På dette tidspunkt kasseres 37 μM-skærmen efter den sidste skylning, men de løsrevne fragmenter, der indeholder væske, gemmes inde i det 50 ml koniske rør.
  29. Klip enden af en 200 μL pipetspids med en saks. Ryst forsigtigt 50 ml røret, fjern to prøver på 20 μL, og kom dem i en ren 35 mm petriskål.
  30. Tæl antallet af fragmenter i hver prøve i petriskålen for at opnå det samlede antal isolerede MVF'er.
    Fragmenter i alt = Equation 1
  31. Drej det resterende løsrevne fragment indeholdende væske i et 50 ml konisk rør ved 400 x g i 4 minutter for at opsamle MVF'en.

Figure 3
Figur 3: Isolering af MVF'er. (A) Efter fordøjelsen af fedtvævet, afbildning af udskillelsen af MVF'er indeholdende pellet og supernatant efter spin-down. (B) Layout af forsyninger til filtrering og indfangning af MVF'er. (C) Illustration af koncentrcirkelmetoden til filtrerings-/vasketrin. Klik her for at se en større version af denne figur.

5. Dannelse af fibrinhydrogeler

  1. Eksempler på beregninger:
    BEMÆRK: Nedenfor er beregningerne for MVF'er podet ved ~ 15.000-20.000 MVF / ml og fibrinogen: thrombingelforholdet ved 2: 5, med fibrinogen anvendt ved en koncentration på 20 mg / ml.
    1. Til fremstilling af fem 250 μL geler kræves et samlet volumen på 1.250 μL. Tag altid højde for pipetteringsfejl, og lav derfor nok til 1,5 ml geler.
      1. Beregn mængden af fibrinogen, der kræves som følger:
        Equation 2, X1 = 428,57 μL fibrinogen
      2. Det krævede volumen thrombin beregnes som følger:
        Equation 3, X2 = 1,071,43 μL thrombin
      3. For det krævede volumen på 428,57 μL fremstilles 500 μL fibrinogen som følger:
        20 mg/ml * 0,5 ml = 10 mg fibrinogen. Resuspender dette i 500 μL DMEM
      4. For at opnå hver gel beregnes volumenet af fibrinogen og thrombin som følger:
        1. Fibrinogen:
          Equation 4, X1 = 71,43 μL fibrinogen (i DMEM) + MVF
        2. Thrombin:
          Equation 5, X2 = 178,57 μL thrombin
  2. MVF fibrin gel støbning
    1. Det meste af væsken dekanteres i det nedspundne fragment i det 50 ml koniske rør. Brug en pipette til at fjerne den lille mængde væske, der fanger på kanten af det koniske rør.
    2. Tilsæt thrombin i huller, hvor geler vil blive fremstillet (figur 4A).
    3. Klip enden af en 200 μL pipetspids, og resuspender MVF'erne forsigtigt ved hjælp af fibrinogen for at opnå en slutdensitet på ~15.000-20.000 MVF/ml én gang i gelen.
    4. Klip enden af en 200 μL pipetspids og pipet MVF+fibrinogen forsigtigt ind i trombinopløsningen. Pipet hurtigt op og ned for at sikre en homogen blanding. Gentag indtil alle geler er lavet (figur 4B).
    5. Brøndpladen/brøndpladerne anbringes i en inkubator (37 °C, 5 % CO2) i ~15 minutter for at muliggøre geltværbinding (figur 4C).
    6. Tilsæt 100-150 μL vækstmedier til hver brønd.

Figure 4
Figur 4: Dannelse af MVF fibrin geler . (A) En 5/7-delt trombinblanding pipetteres i den tilsvarende brønd. (B) Derefter pipetteres en 2/7-delt fibrinogen+MVF-blanding med en afklippet pipetspids (for ikke at forstyrre MVF'er) i brønden og blandes forsigtigt. (C) Endelig anbringes alle færdige geléer i en inkubator ved 37 °C, hvilket gør det muligt for hydrogelen at størkne fuldstændigt, før mediet placeres ovenpå. Klik her for at se en større version af denne figur.

6. Dyrkningsbetingelser for MVF'er

  1. Til dyrkning af ikke-vaskulariseret hvidt og beige fedtvæv (+ GM-kontrol) skal du bruge tidslinjerne19 vist i figur 5.
  2. Til dyrkning af vaskulariseret hvidt og beige fedtvæv (+ GM-kontrol) skal du bruge tidslinjerne19 vist i figur 6.
  3. Hydrogeler bør opbevares i en inkubator (37 °C, 5% CO2) under hele dyrkningen til undersøgelsen, idet mediet skiftes hver anden dag. For fiksering og håndtering af prøver til analyse henvises til tidligere offentliggjorte værker16,19,20.

Figure 5
Figur 5: Tidspunkt for ikke-vaskulariseret fedtvævsdannelse. Dette tal er ændret fra Acosta et al.19. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Tidspunkt for dannelse af vaskulariseret fedtvæv. Dette tal er ændret fra Acosta et al.19. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Der er et par vigtige fænotypiske morfologiske egenskaber ved beige / brunt fedtvæv: det er multilokulært / indeholder små lipiddråber, besidder et stort antal mitokondrier (årsagen til dets karakteristiske "brunlige" udseende in vivo), har tilsvarende en høj iltforbrugshastighed / mitokondriel bioenergetik, er stærkt vaskulariseret, har øget lipolyse / insulinstimuleret glukoseoptagelse og mest berygtet udtrykker høje niveauer af afkoblingsprotein 1 (UCP1), et mitokondrieprotein involveret i termogen respiration19,30.

Når man karakteriserer MVF'ernes evne til at differentiere sig til beige fedtvæv, blev der derfor udført en analyse, som ville give os mulighed for at visualisere (figur 7, figur 8), genetisk bekræfte (figur 9, figur 10) og funktionelt måle (figur 11) transformationen af MVF.

I figur 7 og figur 8 blev visualiseringen af størrelsen og placeringen af lipiderne i de differentierede adipocytterset 16,17,19 ved brug af BODIPY, en lipidplet og billeddannelse af hydrogelerne ved hjælp af konfokalmikroskopi. Især i denne analyse, især i sammenligning mellem tilstande, bør BAM-grupperne vise mindre lipidstørrelser (tegn på dannelse af beige fedtvæv), kvantificerbare gennem NIH ImageJ19,20.

Ved anvendelse af RT-qPCR 16,19,20, i figur 9 og figur 10, mest markant, øges udtrykket af UCP1 over hele linjen signifikant ved MVF-eksponering for BAM.

Endelig, når man ser på mitokondriel bioenergetik (figur 11), er det tydeligt, at BAM-grupper har karakteristisk højere iltforbrugshastighed (OCR) niveauer, målt ved hjælp af en Seahorse mito stresstest19,20.

Figure 7
Figur 7: r-MVF histologisk evaluering. Magre eller type 2 diabetisk afledte r-MVF'er blev udsat for enten direkte (øverste panel, ADIPO) eller indirekte (nedre panel, ANGIO + ADIPO) WAM eller BAM adipogene medier for at opnå henholdsvis ikke-vaskulariseret eller vaskulariseret hvidt eller beige fedtvæv (skalastænger = 200 μm). Dette tal er ændret fra Acosta et al.19. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 8
Figur 8: h-MVF histologisk evaluering. h-MVF blev udsat for direkte (ADIPO) WAM eller BAM for at opnå henholdsvis ikke-vaskulariseret hvidt eller beige fedtvæv (skalastænger = 200 μm). Dette tal er blevet ændret fra Gonzalez Porras et al.20. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 9
Figur 9: r-MVF-evaluering gennem RT-qPCR. Mager (L) eller type 2 diabetisk (Db) afledt r-MVF udsat for enten (A-C) direkte eller (E-G) indirekte WAM eller BAM blev evalueret for (A, E) adipogenese (Adiponectin), (B, F) termogenese (UCP1) og (C, G) angiogenese (ANGPT1). Resultaterne rapporteres som gennemsnitlige ± standardfejl for to eksperimentelle replikater (n = 4). * = p < 0,05, ** = p < 0,01, *** = p < 0,001 og **** = p < 0,0001. D0 = Dag 0. Tovejsanalyse af varians (ANOVA) test med Holm-Sidaks multiple sammenligningsanalyser for at bestemme forskelle mellem grupper. Statistisk signifikans blev defineret som p < 0,05. Dette tal er ændret fra Acosta et al.19. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 10
Figur 10: h-MVF-evaluering gennem RT-qPCR. h-MVF'er udsat for direkte WAM eller BAM blev evalueret for (A) adipogenese (Adiponectin) og (B) termogenese (UCP1). Resultaterne rapporteres som gennemsnitlige ± standardfejl for to eksperimentelle replikater (n = 4). * = p < 0,05, ** = p < 0,01, *** = p < 0,001 og **** = p < 0,0001. One-way analyse af varians (ANOVA) tests med Holm-Sidaks multiple sammenligningsanalyser for at bestemme forskelle mellem grupper. Statistisk signifikans blev defineret som p < 0,05. Dette tal er blevet ændret fra Gonzalez Porras et al.20. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 11
Figur 11: r-MVF og h-MVF funktionel vurdering. Lean (L) eller type 2 diabetisk (Db) afledt r-MVF'er udsat for enten (A) direkte eller (B) indirekte WAM eller BAM eller (C) h-MVF'er udsat for direkte WAM eller BAM blev evalueret funktionelt gennem måling af iltforbrugshastighed (OCR). Resultaterne rapporteres som gennemsnitlige ± standardfejl for to eksperimentelle replikater (n = 4). Dette tal er ændret fra Acosta et al.19. og Gonzalez Porras et al.20. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Området brun / beige fedtvævsteknik er stort set umoden 22,23,24,25,26,27,28, hvor hovedparten af fedtmodeller udvikles til hvidt fedtvæv 8,22,31. Konstrueret brunt / beige mikrovæv består typisk af flere cellekilder eller genetiske ændringer for at opnå en delmængde af de fænotypiske egenskaber ved naturligt brunt fedtvæv 8,11,32. Tilgangen beskrevet heri præsenterer en enkeltkildet, potentielt autolog18,33 måde at skabe funktionelle, strukturelt relevante og vaskulariserede beige fedtstoffer ved hjælp af mikrovaskulære fragmenter (MVF'er). MVF'er er især kendt som en kilde til dannelse af hvidt fedtvæv 14,16,17,1 8,34, selvom vi for nylig har demonstreret deres evne til dannelse af beige fedt, der stammer fra gnaver, mennesker og syge kilder, som vist her 19,20. I betragtning af den betydelige interesse i at udnytte beige / brunt fedt til dets terapeutiske eller sygdomsmodelleringspotentiale, har denne teknik vidtrækkende anvendelser inden for metabolisme, fedme og relaterede lidelser.

Der er flere nøglepunkter beskrevet i protokollen. For det første er der forskelle mellem udnyttelsen af rotte versus menneskelige MVF'er. Brugen af gnaverafledt (enten fra mus 29 eller rotter) har hidtil stort set domineret forskning med MVF'er, hvor arbejdet ser på dem i en lang række tilstande som fedme 35, type 1-diabetes 36,37, type 2-diabetes 19 og aldring 38 og endda forskelle mellem fedtdepoter 39 eller køn 40. Selvom MVF'er i betragtning af deres oprindelse kan isoleres autologt fra de subkutane fedtdepoter hos voksne ved hjælp af standard minimalt invasive procedurer41, er MVF-baseret vaskularisering ikke blevet udført i klinisk praksis. Imidlertid har prækliniske undersøgelser, hvor humane MVF'er blev høstet fra lipoaspirat, vist sin mulighed18,33. For vores gruppe specifikt, som vist i de repræsentative data, er dannelsen af vaskulariseret beige fedtvæv i øjeblikket begrænset til MVF'er afledt af gnavere. Som tidligere demonstreret af vores gruppe og andre18 er opnåelse af balancen mellem karvækst og adipocytdifferentiering meget følsom, bevist at være afhængig af de indførte faktorer42, og tidspunktdifferentiering fremkaldes16. En begrænsning af den beskrevne protokol er, at yderligere udvikling er nødvendig for at optimere de betingelser, der fremmer vaskulariseret h-MVF beige fedtvævsdannelse. Derudover er der behov for yderligere arbejde, der ser på responsen fra disse stilladser in vivo og stammer fra andre syge tilstande sammen med tilhørende optimeringstrin.

Desuden er beskrevet her en protokol til isolering af r-MVF'er fra tre forskellige fedtvævsdepoter hos hanrotter. Tidligere arbejde fra Später et al.39 diskuterede forskelle mellem vaskulariseringsevnen hos viscerale versus subkutane depotafledte MVF'er og bemærkede, at subkutane depot-MVF'er havde en nedsat evne til at vaskularisere, en funktion, de tilskrev overskydende bindevævsforurening. Det skal bemærkes, at til vores undersøgelser, som præsenteret her i de "repræsentative data", blev kun de inguinale subkutane og bageste subkutane depoter anvendt. Valget om udelukkende at bruge subkutane afledte MVF'er blev truffet for i højere grad at efterligne translationelle studier, hvor lipoaspirat eller lignende procedurer udelukkende indsamler subkutant fedtvæv. Derudover gav det faktum, at in vivo-undersøgelser pin-pointing beige fedtvæv udvikles inden for subkutant fedtvæv, som indeholder en særskilt delmængde af preadipocytter eller hvide adipocytter, der transdifferentierer, en yderligere begrundelse for vores beslutning43. Tidligere arbejde fra vores gruppe viste ingen mærkbare forskelle mellem MVF'erne, der stammer fra enten viscerale eller subkutane depoter af sunde gnavere til at gennemgå både angiogenese og dannelse af hvidt fedtvæv16. Alle disse variabler bør overvejes ved udformningen af fremtidige undersøgelser.

Endelig, når man forsøger at enten ændre eller fejlfinde den beskrevne metode, skal et par væsentlige punkter overvejes. For det første er trinnet med enzymatisk fordøjelse af fedtvævet ekstremt vigtigt; Der skal udvises særlig omhu, og der skal sikres optimering for konsekvent at reproducere MVF'er af samme størrelse og kvalitet. I betragtning af den store variation mellem fedttyper og fedtmængder (meget afhængig af dyrets alder, størrelse, sundhed og omhu på tidspunktet for fedtisolering [undgåelse af forurenende stoffer og ekstraktionseffektivitet]), kan fordøjelsestiden variere, således intervaller, der passer bedst til vores udstyr / dyr, leveres. Tilpasning bør dog overvejes for optimale resultater. Derudover skal der ved håndtering af MVF under postenzymatisk fordøjelse udvises særlig omhu for at undgå unødvendig ruhed og yderligere nedbrydning af fragmenter. Endelig skal man være opmærksom på, at medieformuleringer, den valgte hydrogel44 og kulturbetingelser i høj grad kan tilpasses baseret på tilsigtede resultater. Som vist her har MVF'er afledt af forskellige kilder (f.eks. Mager vs. diabetiske MVF'er) forskellige grader af differentiering, så når man designer eksperimenter, bør korrekte kontroller og eksperimentelle grupper inkluderes.

Afslutningsvis, som området for engineering termogeniske fedtvæv vokser, er det afgørende at konstruere biologisk-relevante systemer, der strukturelt, genetisk, og funktionelt efterligne indfødte beige / brune fedtvæv. MVF'er præsenterer en spændende og unik tilgang til denne udfordring, da de, som beskrevet her, giver en simpel eneste kildemetode til at skabe biologiske efterligninger af beige fedt. Derfor rummer de et betydeligt potentiale for udnyttelse af forståelsen eller udviklingen af behandlinger for fedme og metabolisk sygdom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at forskningen blev udført i mangel af kommercielle eller finansielle forbindelser, der kunne fortolkes som en potentiel interessekonflikt.

Acknowledgments

Dr. Acosta støttes af National Institutes of Health tilskud CA148724 og TL1TR002647. Dr. Gonzalez Porras støttes af National Institute of Diabetes og fordøjelses- og nyresygdomme ved National Institutes of Health under tildelingsnummer F32-0DK122754. Dette arbejde blev delvist støttet af National Institutes of Health (5SC1DK122578) og University of Texas i San Antonio Department of Biomedical Engineering. Indholdet er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter fra National Institutes of Health. Figurer blev delvist oprettet med Biorender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aminocaproic Acid Sigma Aldrich A2504-100G Added in DMEM at the concentration of 1 mg/mL
Blunt-Tipped Scissors Fisher scientific 12-000-172 Sterilize in autoclave
Bovin Serum Albumin (BSA) Millipore 126575-10GM Diluted in PBS to 4 mg/mL and 1 mg/mL
Collagenase Type 1 Fisher scientific NC9633623 Diluted to 6 mg/mL in BSA 4 mg/mL, Digestion of minced fat
Dexamethasone Thermo Scientific AC230302500 Diluted in ethanol at a 2 mg/ml stock concentration
Disposable underpads Fisher scientific 23-666-062 For fluid absorption during surgery
Dissecting Scissors Fisher scientific 08-951-5 Sterilize in autoclave
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium (DMEM) Fisher scientific 11885092
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham (DMEM/F12) Sigma Aldrich D8062
Fetal Bovine Serum  Fisher scientific 16140089 Added in DMEM to 20% v/v.
Fibrinogen  Sigma Aldrich F8630-25G Solubilized in DMEM at the concentration of 20 mg/mL, Protein found in blood plasma and main component of hydrogel
Flask, 250 mL Fisher scientific FB500250 Allows for digestion of fat using a large surface area
Forceps Fisher scientific 50-264-21 Sterilize in autoclave, For handling of tissue and filters
Forskolin Sigma Aldrich F6886 Diluted in ethanol at a 10 mM stock concentration
Human MVF Advanced Solutions Life Scienes, LLC https://www.advancedsolutions.com/microvessels Human MVFs (hMVFs) isolated from three different patients (52-, 54-, and 56-year old females) were used in the current study. 
Indomethacine  Sigma Aldrich I7378 Diluted in ethanol at a 12.5 mM stock concentration
Insulin from porcine pancreas Sigma Aldrich I5523 Diluted in 0.01 N HCl at a 5 mg/ml stock concentration
MycoZap Fisher scientific NC9023832 Added in DMEM to 0.2% w/v, Mycoplasma Prophylactic 
Pennycilin/Streptomycin (10,000 U/mL) Fisher scientific 15140122 Added in DMEM to 1% v/v.
Petri dishes, polystyrene (100 mm x 15 mm). Fisher scientific 351029 3 for removal of blood vessels and mincing, 8 (lid) for presoaking of screens & 8 (dish) for use when filtering with 500 or 37 µM screens
Petri dishes, polystyrene (35 mm x 10 mm). Fisher scientific 50-202-036 For counting fragments
Phosphate Buffer Saline (PBS) Fisher scientific 14-190-250 Diluted to 1x with sterile deionized water.
Rat Clippers (Andwin Mini Arco Pet Trimmer) Fisher scientific NC0854141
Rosiglitazone Fisher scientific R0106200MG Diluted in DMSO at a 10 mM stock concentration
Scissors Fine Science Tools 14059-11 1 for initial incision, 1 for epididymal incision, 1 for tip clipping
Screen  37 µM  Carolina Biological Supply Company 652222R Cut into 3" rounded squares and sterilized in ethylene oxide, Fragment entrapment and removal of very small fragments/single cells and debris
Screen 500 µM  Carolina Biological Supply Company 652222F Cut into 3" rounded squares and sterilized in ethylene oxide, Removes larger fragments/debris
Serrated Hemostat Fisher scientific 12-000-171 Sterilize in autoclave, For clamping of skin before incision
Steriflip Filter 0.22 μm  Millipore SE1M179M6
Thrombin Fisher scientific 6051601KU Diluted in deionzed water to 10 U/mL, Used as a clotting agent turning fibrinogen to fibrin
Thyroid hormone (T3) Sigma Aldrich T2877 Diluted in 1N NaOH at a 0.02 mM stock concentration
Zucker diabetic fatty (ZDF) rats - obese (FA/FA) or lean (FA/+) male  Charles River https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-lean-fa?region=3611
https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-obese?region=3611		 Obtained from Charles River (Wilmington, MA). Rats were acquired at 4 weeks of age and fed Purina 5008 until euthanasia (15-19 weeks of age). Glucose levels (blood from the lateral saphenous vein) were greater than 300 mg/dL in all FA/FA rats used in the study. All animals were housed in a temperature-controlled environment with a 12-h light-dark cycle and fed ad libitum.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cohen, P., Spiegelman, B. M. Brown and beige fat: molecular parts of a thermogenic machine. Diabetes. 64 (7), 2346-2351 (2015).
  2. Liu, X., et al. Brown adipose tissue transplantation reverses obesity in Ob/Ob mice. Endocrinology. 156 (7), 2461-2469 (2015).
  3. Tharp, K. M., Stahl, A. Bioengineering beige adipose tissue therapeutics. Frontiers in Endocrinology. 6, 164 (2015).
  4. Barquissau, V., et al. White-to-brite conversion in human adipocytes promotes metabolic reprogramming towards fatty acid anabolic and catabolic pathways. Molecular Metabolism. 5 (5), 352-365 (2016).
  5. Kim, S. H., Plutzky, J. Brown fat and browning for the treatment of obesity and related metabolic disorders. Diabetes & Metabolism Journal. 40 (1), 12-21 (2016).
  6. Lizcano, F., Vargas, D. Biology of beige adipocyte and possible therapy for type 2 diabetes and obesity. International Journal of Endocrinology. 2016, 9542061 (2016).
  7. Mulya, A., Kirwan, J. P. Brown and beige adipose tissue: therapy for obesity and its comorbidities. Endocrinology and Metabolism Clinics of North America. 45 (3), 605-621 (2016).
  8. Murphy, C. S., Liaw, L., Reagan, M. R. In vitro tissue-engineered adipose constructs for modeling disease. BMC Biomedical Engineering. 1, 27 (2019).
  9. Srivastava, S., Veech, R. L. Brown and brite: The fat soldiers in the anti-obesity fight. Frontiers in Physiology. 10, 38 (2019).
  10. Samuelson, I., Vidal-Puig, A. Studying brown adipose tissue in a human in vitro context. Frontiers in Endocrinology. 11, 629 (2020).
  11. Wang, C. -H., et al. CRISPR-engineered human brown-like adipocytes prevent diet-induced obesity and ameliorate metabolic syndrome in mice. Science Translational Medicine. 12 (558), (2020).
  12. Kaisanlahti, A., Glumoff, T. Browning of white fat: agents and implications for beige adipose tissue to type 2 diabetes. Journal of Physiology and Biochemistry. 75 (1), 1-10 (2019).
  13. Sato, N., et al. Development of capillary networks from rat microvascular fragments in vitro: the role of myofibroblastic cells. Microvascular Research. 33 (2), 194-210 (1987).
  14. Laschke, M. W., Später, T., Menger, M. D. Microvascular fragments: More than just natural vascularization units. Trends in Biotechnology. 39 (1), 24-33 (2021).
  15. Hoying, J. B., Boswell, C. A., Williams, S. K. Angiogenic potential of microvessel fragments established in three-dimensional collagen gels. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Animal. 32 (7), 409-419 (1996).
  16. Acosta, F. M., Stojkova, K., Brey, E. M., Rathbone, C. R. A straightforward approach to engineer vascularized adipose tissue using microvascular fragments. Tissue Engineering. Part A. 26 (15-16), 905-914 (2020).
  17. Acosta, F. M., et al. Adipogenic differentiation alters properties of vascularized tissue-engineered skeletal muscle. Tissue Engineering. Part A. 28 (1-2), 54-68 (2021).
  18. Strobel, H. A., Gerton, T., Hoying, J. B. Vascularized adipocyte organoid model using isolated human microvessel fragments. Biofabrication. 13 (3), 035022 (2021).
  19. Acosta, F. M., et al. Engineering functional vascularized beige adipose tissue from microvascular fragments of models of healthy and type II diabetes conditions. Journal of Tissue Engineering. 13, 20417314221109337 (2022).
  20. Gonzalez Porras, M. A., Stojkova, K., Acosta, F. M., Rathbone, C. R., Brey, E. M. Engineering human beige adipose tissue. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 906395 (2022).
  21. Herold, J., Kalucka, J. Angiogenesis in adipose tissue: The interplay between adipose and endothelial cells. Frontiers in Physiology. 11, 1861 (2021).
  22. McCarthy, M., et al. Fat-On-A-Chip models for research and discovery in obesity and its metabolic comorbidities. Tissue Engineering Part B: Reviews. 26 (6), 586-595 (2020).
  23. Klingelhutz, A. J., et al. Scaffold-free generation of uniform adipose spheroids for metabolism research and drug discovery. Scientific Reports. 8 (1), 523 (2018).
  24. Yang, J. P., et al. Metabolically active three-dimensional brown adipose tissue engineered from white adipose-derived stem cells. Tissue Engineering. Part A. 23 (7-8), 253-262 (2017).
  25. Vaicik, M. K., et al. Hydrogel-based engineering of beige adipose tissue. Journal of Materials Chemistry B. 3 (40), 7903-7911 (2015).
  26. Tharp, K. M., Stahl, A. Bioengineering beige adipose tissue therapeutics. Frontiers in Endocrinology. 6, 164 (2015).
  27. Tharp, K. M., et al. Matrix-assisted transplantation of functional beige adipose tissue. Diabetes. 64 (11), 3713-3724 (2015).
  28. Harms, M. J., et al. Mature human white adipocytes cultured under membranes maintain identity, function, and can transdifferentiate into brown-like adipocytes. Cell Reports. 27 (1), 213-225 (2019).
  29. Frueh, F. S., Später, T., Scheuer, C., Menger, M. D., Laschke, M. W. Isolation of murine adipose tissue-derived microvascular fragments as vascularization units for tissue engineering. Journal of Visualized Experiments. (122), e55721 (2017).
  30. Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: Function and physiological significance. Physiological Reviews. 84 (1), 277-359 (2004).
  31. Unser, A. M., Tian, Y., Xie, Y. Opportunities and challenges in three-dimensional brown adipogenesis of stem cells. Biotechnology Advances. 33, 962-979 (2015).
  32. Dani, V., Yao, X., Dani, C. Transplantation of fat tissues and iPSC-derived energy expenditure adipocytes to counteract obesity-driven metabolic disorders: Current strategies and future perspectives. Reviews in Endocrine & Metabolic Disorders. 23 (1), 103-110 (2022).
  33. Xu, X., et al. Adipose tissue-derived microvascular fragments as vascularization units for dental pulp regeneration. Journal of Endodontics. 47 (7), 1092-1100 (2021).
  34. McDaniel, J. S., Pilia, M., Ward, C. L., Pollot, B. E., Rathbone, C. R. Characterization and multilineage potential of cells derived from isolated microvascular fragments. Journal of Surgical Research. 192 (1), 214-222 (2014).
  35. Gealekman, O., et al. Depot-specific differences and insufficient subcutaneous adipose tissue angiogenesis in human obesity. Circulation. 123 (2), 186-194 (2011).
  36. Altalhi, W., Hatkar, R., Hoying, J. B., Aghazadeh, Y., Nunes, S. S. Type I diabetes delays perfusion and engraftment of 3D constructs by impinging on angiogenesis; which can be rescued by hepatocyte growth factor supplementation. Cellular and Molecular Bioengineering. 12 (5), 443-454 (2019).
  37. Altalhi, W., Sun, X., Sivak, J. M., Husain, M., Nunes, S. S. Diabetes impairs arterio-venous specification in engineered vascular tissues in a perivascular cell recruitment-dependent manner. Biomaterials. 119, 23-32 (2017).
  38. Laschke, M. W., et al. Adipose tissue-derived microvascular fragments from aged donors exhibit an impaired vascularisation capacity. European Cells & Materials. 28, 287-298 (2014).
  39. Später, T., et al. Vascularization of microvascular fragment isolates from visceral and subcutaneous adipose tissue of mice. Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 19 (1), 161-175 (2021).
  40. Später, T., et al. Adipose tissue-derived microvascular fragments from male and female fat donors exhibit a comparable vascularization capacity. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 777687 (2021).
  41. Laschke, M. W., Menger, M. D. The simpler, the better: tissue vascularization using the body's own resources. Trends in Biotechnology. 40 (3), 281-290 (2022).
  42. Yang, F., Cohen, R. N., Brey, E. M. Optimization of co-culture conditions for a human vascularized adipose tissue model. Bioengineering. 7 (3), 114 (2020).
  43. Pilkington, A. -C., Paz, H. A., Wankhade, U. D. Beige adipose tissue identification and marker specificity-Overview. Frontiers in Endocrinology. 12, 599134 (2021).
  44. Chiou, G., et al. Scaffold architecture and matrix strain modulate mesenchymal cell and microvascular growth and development in a time dependent manner. Cellular and Molecular Bioengineering. 13 (5), 507-526 (2020).

Tags

Tilbagetrækning nr. 192
Tredimensionel kultur af vaskulariseret termogenisk fedtvæv fra mikrovaskulære fragmenter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Acosta, F. M., Gonzalez Porras, M.… More

Acosta, F. M., Gonzalez Porras, M. A., Stojkova, K., Pacelli, S., Rathbone, C. R., Brey, E. M. Three-Dimensional Culture of Vascularized Thermogenic Adipose Tissue from Microvascular Fragments. J. Vis. Exp. (192), e64650, doi:10.3791/64650 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter