Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Tredimensjonal kultur av vaskularisert termogent fettvev fra mikrovaskulære fragmenter

Published: February 3, 2023 doi: 10.3791/64650
Automatic Translation
1, 2,3, 2, 2, 2,3, 2,3
1Department of Biochemistry and Structural Biology, University of Texas Health Science Center, 2Department of Biomedical Engineering and Chemical Engineering, University of Texas at San Antonio, 3Institute of Regenerative Medicine, University of Texas at San Antonio

Summary

Her presenterer vi en detaljert protokoll som beskriver bruken av mikrovaskulære fragmenter isolert fra gnagere eller humant fettvev som en enkel tilnærming til å konstruere funksjonelt, vaskularisert beige fettvev.

Abstract

Engineering termogenic fettvev (f.eks beige eller brunt fettvev) har blitt undersøkt som en potensiell terapi for metabolske sykdommer eller for utforming av personlige mikrovev for helse screening og narkotika testing. Nåværende strategier er ofte ganske komplekse og klarer ikke å nøyaktig skildre de multicellulære og funksjonelle egenskapene til termogent fettvev. Mikrovaskulære fragmenter, små intakte mikrofartøyer som består av arteriol, venuler og kapillærer isolert fra fettvev, tjener som en enkelt autolog kilde til celler som muliggjør vaskularisering og fettvevdannelse. Denne artikkelen beskriver metoder for å optimalisere kulturforhold for å muliggjøre generering av tredimensjonale, vaskulariserte og funksjonelle termogene fettvev fra mikrovaskulære fragmenter, inkludert protokoller for isolering av mikrovaskulære fragmenter fra fettvev og kulturforhold. I tillegg diskuteres beste praksis, som er teknikker for å karakterisere de konstruerte vevene, og prøveresultater fra både gnagere og humane mikrovaskulære fragmenter er gitt. Denne tilnærmingen har potensial til å bli utnyttet for forståelse og utvikling av behandlinger for fedme og metabolsk sykdom.

Introduction

Målet med denne protokollen er å beskrive en tilnærming for å utvikle vaskularisert beige fettvev fra en enkelt, potensielt autolog kilde, mikrovaskulært fragment (MVF). Brunt og beige fettvev har vist seg å vise fordelaktige egenskaper knyttet til metabolsk regulering; Det lille volumet av disse fettvevsdepotene hos voksne begrenser imidlertid den potensielle effekten på systemisk metabolisme, spesielt ved syke tilstander som fedme eller type 2 diabetes 1,2,3,4,5,6,7. Det er betydelig interesse for brunt/beige fett som terapeutisk mål for å forebygge skadelige metabolske effekter knyttet til fedme og dets komorbiditeter 8,9,10,11,12.

MVFer er fartøystrukturer som kan isoleres direkte fra fettvev, dyrkes og opprettholdes i en tredimensjonal konfigurasjon i lengre perioder13,14,15. Tidligere arbeid fra vår gruppe, og andre, har begynt å utnytte den multicellulære og multipotente kapasiteten til MVFer, spesielt når det gjelder fettvevdannelse16,17,18. Som en oppbygging av dette arbeidet demonstrerte vi nylig at MVFer avledet fra gnagermodeller av sunn og type 2 diabetes19 og fra mennesker (voksne over 50 år)20 inneholdt celler som kunne induseres til å danne termogent eller beige fettvev.

Her er en innovativ tilnærming hvorfra en enkelt kilde MVF benyttes, ikke bare i stand til å skape beige fettvev, men også den tilhørende og kritiske vaskulære komponenten21. Bruken av denne teknikken kan være av stor verdi for studier som leter etter en enkel vevskonstruert tilnærming for termogen fettvevdannelse. I motsetning til andre metoder som aspirerer til å konstruere beige fettvev 22,23,24,25,26,27,28, krever prosessen beskrevet i denne studien ikke bruk av flere celletyper eller komplekse induksjonsregimer. Vaskulariserte beige og hvite fettmodeller kan opprettes med MVF-er som stammer fra gnagere og menneskelige kilder, noe som viser stort oversettelsespotensial. Sluttproduktet av denne protokollen er et konstruert beige termogent fettvev med en struktur og metabolsk funksjon som kan sammenlignes med brunt fettvev. Samlet sett presenterer denne protokollen ideen om at en lett tilgjengelig og muligens autolog kilde MVF kan være et verdifullt terapeutisk inngrep og verktøy for å studere metabolske forstyrrelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne studien ble gjennomført i henhold til dyrevelferdsloven og gjennomføringsforskriften for dyrevelferd i henhold til prinsippene i veilederen for stell og bruk av forsøksdyr. Alle dyreprosedyrer ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved University of Texas i San Antonio.

MERK: For trinnene beskrevet nedenfor brukes mannlige Lewis-rotter. Små protokolljusteringer må gjøres for en kvinnelig, så vel som musens mikrovaskulære fragmentsamling (MVF)29. For protokoller som bruker humane MVFer (h-MVFer), er de eneste trinnene som kreves resuspendering av h-MVFer etter produsentens protokoll, vekstmedieforberedelse (1.3), dannelse av fibrinhydrogeler (5) og dyrking (6). For en oversikt over protokollen, se figur 1.

Figure 1
Figur 1: Eksperimentell disposisjon. Fordeling av seks viktige trinn, før analyse, for dannelse av termogent fettvev ved bruk av MVF. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

1. Forberedelse av reagens

MERK: Reagenser nedenfor tilsvarer en rotte, veid og laget inne i en biohood.

  1. Klargjør bovint serumalbumin (BSA) i PBS.
    1. Klargjør 10 mg/ml (1,0 %) BSA i PBS som skal fortynnes for vasketrinn (1 mg/ml, 0,1 %) og fordøyelse (4 mg/ml, 0,4 %).
    2. Forbered ulike konsentrasjoner av BSA, som nevnt i trinn 1.1.1, etter trinn 1.1.3-1.1.5.
    3. 10 mg/ml BSA i PBS (1 % BSA i PBS)
      1. Tilsett 500 mg BSA og 500 ml PBS til et 50 ml konisk rør og virvel løsningen for å oppløse BSA.
      2. Hvis det dannes for store bobler, sentrifugerer du oppløsningen ved 350 x g i 2 minutter. Filtrer steriliser løsningen med et 0,22 μm nylonnettfilter.
    4. 1 mg/ml BSA i PBS (0,1 % BSA i PBS)
      1. Fortynn 15 ml 10 mg/ml BSA i PBS 1:10 med PBS ved å tilsette 15 ml 10 mg/ml BSA i PBS til 135 ml PBS i en 500 ml steril flaske og rist flasken forsiktig for å sikre en homogen blanding.
    5. 4 mg/ml BSA i PBS (0,4 % BSA i PBS)
      1. Fortynn 35 ml 10 mg/ml BSA i PBS 1:2,5 med PBS ved å tilsette 35 ml 10 mg/ml BSA i PBS + 57,5 ml PBS i en steril 100 ml flaske og rist flasken forsiktig for å sikre en homogen blanding.
  2. Forbered kollagenase i BSA for fordøyelsen av hakkede fettputer.
    1. Tilbered 6 mg/ml kollagenase.
      1. I et 50 ml konisk rør veier du 72 mg kollagenase (etikett "for Epi").
      2. I tre 50 ml koniske rør veier du 144 mg kollagenase (etiketten "for Ing 1", "for Ing 2" og "for SubQ") hver.
      3. Oppbevar veid kollagenase ved 4 °C til bruk.
        MERK: Ikke legg til BSA / PBS før rett før fordøyelsen.
      4. Tilsett 12 ml 4 mg / ml BSA i PBS til røret som inneholder 72 mg kollagenase.
      5. Tilsett 24 ml 4 mg / ml BSA i PBS til rørene som inneholder 144 mg kollagenase.
      6. Rist rørene for å sikre en homogen løsning og filtrer steriliser løsningen med et 0,22 μm nylonnettfilter.
  3. Forbered vekstmedier supplert med aminokapronsyre (ACA) for å mate / differensiere den isolerte MVF.
    1. Vekstmedier (GM): Supplement DMEM med 20% FBS, 1% penicillin-streptomycin (penn streptokokker), 0,2% mykoplasma profylaktisk, og 1 mg / ml ACA.
    2. Forbered hvite adipogene medier (WAM).
      1. WAM induksjon: Supplement DMEM / F12 med 20% FBS, 1% penn streptokokker, 0,2% mykoplasma profylaktisk, 10 μg / ml insulin, 10 μm av forskolin, 1 μm av deksametason, og 1 mg / ml ACA.
        MERK: For h-MVF, i tillegg, legg til 125 μM indometacin.
      2. WAM vedlikehold: Suppler DMEM / F12 med 20% FBS, 1% penn streptokokker, 0,2% mykoplasma profylaktisk, 5 μg / ml insulin og 1 mg / ml ACA.
        MERK: For h-MVF, endre insulinkonsentrasjonen til 10 μg / ml.
    3. Forbered beige adipogene medier (BAM).
      1. BAM induksjon: Supplement DMEM / F12 med 20% FBS, 1% penn streptokokker, 0,2% mykoplasma profylaktisk, 10 μg / ml insulin, 10 μm av forskolin, 1 μm av deksametason , 1 μm rosiglitazon, 20 nM 3,3 ',5-Triiodo-L-tyronin (T3), og 1 mg / ml ACA.
        MERK: For h-MVF, endre konsentrasjonen av T3 til 120 nM.
      2. BAM vedlikehold: Tilskudd DMEM / F12 med 20% FBS, 1% penn streptokokker, 0,2% mykoplasma profylaktisk, 5 μg / ml insulin, 10 μm av forskolin, 1 μm rosiglitazon, 20 nM T3, og 1 mg / ml ACA.
        MERK: For h-MVF, endre insulinkonsentrasjonen til 10 μg / ml og T3-konsentrasjonen til 120 nM.
  4. Klargjør trombin (trenger bare å lages hvis stamløsningen ikke er tilgjengelig) for å lage koagulasjonsmiddelet som skal brukes i fibringeler.
    1. 10 E/ml trombin i ddH2O:
      1. Skyll trombinpulveret på nytt med 1-5 ml ddH2O i hetteglasset fra produsenten og overfør resuspensjonen til et 250 ml beger.
      2. Ta opp oppløsningen til 100 ml og rør oppløsningen opp og ned flere ganger for å sikre en homogen blanding. Aliquot oppløsningen i 15 ml koniske rør (~ 10 ml / rør) og oppbevar alikotene i en -20 ° C fryser.
        MERK: For å bruke, tine trombinet ved romtemperatur (RT).

2. Klargjøring av verktøy/materialer

MERK: All instrumentering skal autoklaveres/steriliseres før bruk.

  1. Isolering av epididymal/inguinal/subkutan fett (kirurgi som skal gjøres i et definert operasjonsområde)
    1. Sørg for tilgjengeligheten av engangsunderlag, to sakser, en hemostat (valgfritt), to tanger og fire 50 ml koniske rør med 10-15 ml 1 mg / ml BSA (0,1%) i PBS.
  2. Mikrovaskulær fragmentisolasjon
    1. For hakking (som skal gjøres i en biohood), sørg for tilgjengeligheten av tre ubelagte sterile 100 mm petriskåler, ett par tang og ett par buet saks.
    2. For fordøyelse og isolasjon (som skal gjøres i en biohood), sørg for tilgjengeligheten av ett par saks, ett par tang, åtte ubelagte sterile 100 mm petriskåler, tre ubelagte sterile 35 mm petriskåler, kollagenase veid og ved 4 ° C, fire 250 ml kolber, en plastholder med et hull i midten, fire 500 μM skjermer (kuttet i 3 i avrundede firkanter), fire 37 μM skjermer (kuttet i 3 i avrundede firkanter), og 11 50 ml koniske rør.
  3. Fibrin resuspensjon
    1. For fibrinhydrogeler (som skal gjøres i en biohood), sørg for at fibrinogen, trombin og vekstmedier (laget under reagensfremstilling) er tilgjengelige.

3. Fettisolasjonsprotokoll

  1. Innledende trinn
    1. Fyll et beger med etanol for å vaske og desinfisere de kirurgiske instrumentene før du bruker dem. Forbered deretter bordet for håndtering av rotta og ha et vakuum klart til å aspirere pelsen som genereres under barberingstrinnet.
    2. Klargjør en bøtte med is hvor de tidligere tilberedte 50 ml koniske rørene, hver inneholdende 10 ml 1 mg/ml BSA, vil bli plassert. Merk rørene tilsvarende.
      MERK: Det kan være nødvendig å ha to separate koniske rør for inngangsfettet, siden to sider må ekstraheres og mengden fett samlet fra denne regionen har en tendens til å være den største sammenlignet med epididymal og bakre subkutan.
    3. Start med en avlivet rotte i det definerte kirurgiske området med de nødvendige kirurgiske verktøyene. Vanligvis brukes CO2 til å avlive rottene etter IACUC-protokoller.
    4. Bruk hårklippere til å barbere rotta rundt interesseområdet. Spesielt barbering mellom lyskene og halvparten av magen for epididymal og inguinal fettisolasjon (bruk den mindre barbermaskinen for pelsen i denne regionen). Barber hele ryggen for å få det bakre subkutane fettet plassert mellom scapulaene (det er best å bruke en større barbermaskin da pelsen er tykkere på baksiden av rotta).
    5. Forbered rotta aseptisk ved å sprøyte den ned med 70% etanol. Generelt anbefales det å rengjøre området som skal kuttes to ganger.
  2. Isolering av forskjellige fettdepoter
    1. Lyske (subkutant)
      1. I den bakre posisjonen, løft huden under penis med en saks. Begynn snittet med saks, start i midten og kutt sideveis, danner en "V" -form og går i loop til rottens bakside for å få tilgang til hele fettdepotet. Husk å skjære overfladisk slik at fettet under er intakt. Under skjæretrinnet må du sørge for separasjon av huden fra fettet ved å kutte det sammenkoblede fascievevet (figur 2A).
      2. Når fascia er riktig kuttet, sørg for at de to sidene av inguinal fett er synlige (inguinal fett strekker seg fra lysken området mot baksiden). Fjern deretter fettet fra de to sidene i to separate koniske rør som inneholder 10 ml 1 mg/ml BSA (figur 2B).
    2. Epididymal (visceral)
      1. Høst det epididymale fettet ved å skjære gjennom bukhuden og forsiktig gjennom det tynne laget som omgir testiklene (figur 2C).
      2. Trekk forsiktig fettvevet ut med tang og kutt det ut med saks. Unngå å dissekere store synlige blodkar (hvis testikkel og bitestikkel høstes, fjern dem under rengjøringstrinnet i biohood).
      3. Plasser det fjernede fettet forsiktig i et 50 ml konisk rør med 10 ml 1 mg/ml BSA i PBS.
        MERK: Fjerning av bitestikkelfettet bør gjøres etter at lyskefettet er fjernet. Det epididymale fettet er generelt mindre i volum og ligger under inngangsfettet, under bukhuden som omgir testis og bitestikkel.
    3. Posterior subkutan
      1. Snu rotten utsatt (ryggsiden opp) og, med stor saks, klipp huden på ryggen (huden i denne regionen er tykk) helt opp til hodebunnen, pass på at du ikke kutter for dypt, like under huden (figur 2D).
      2. Klipp fascia som forbinder huden til vevet; Fettet ligger i interscapular regionen. Noter deg å skille/skille det subkutane fettet fra det brune fettet. Det brune fettet er nærmere ryggraden (figur 2E).
      3. Isoler og legg fettet i tilsvarende 50 ml koniske rør med 10 ml 1 mg/ml BSA i PBS.

Figure 2
Figur 2 Isolering av ulike fettvevsdepoter. (A) Innledende snitt som trengs for eksisjon av lyskefettvevet. (B) Plassering av inguinal fett depot. (C) Plassering av det epididymale fettdepotet, og noter snitt av den ytre huden som trengs for tilgang. (D) Ytterligere snitt som trengs når musene er plassert utsatt for å få tilgang til ekstra fett. (E) Plassering av det bakre subkutane fettdepotet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

4. Mikrovaskulær fragmentisolasjonsprotokoll

  1. Plasser 50 ml koniske rør som inneholder utskåret fett fra rotta inn i biohood.
  2. Bruk tang, legg fettet i en standard 100 mm petriskål (med ~ 0,5 ml 1 mg / ml BSA i PBS for å holde vevet hydrert).
  3. Rengjør og fjern eventuelle synlige blodkar og muskler / fremmed vev fra fett.
  4. Hakk fettet med saks i ~10 min (hakk nok til at det kan overføres med en 10 ml pipet).
  5. Se etter klumper ved å legge til ~0,5 ml 1 mg/ml BSA i PBS; Fortsett å hakke om nødvendig.
  6. Overfør kjøttdeigen til en steril 250 ml kolbe med en 10 ml pipette.
    MERK: Legg merke til volumet med en pipette.
  7. Tilsett nok BSA (1 mg/ml) slik at det endelige volumet blir 20 ml.
  8. Tilsett 4 mg / ml BSA i PBS til kollagenase (kollagenase endelig konsentrasjon: 6 mg / ml) (dvs. 12 ml for 72 mg kollagenase eller 24 ml for 144 mg kollagenase).
    MERK: Ikke legg til før hakkingen er fullført, da den er tidssensitiv.
  9. Rist forsiktig det koniske røret for å sikre en homogen løsning og filtrer steriliser løsningen med et 0,22 μm nylonnettfilter.
  10. For epididymalt fett, fordøye i ~ 8-10 min; for inguinal og posterior subkutant fett, fordøye i ~ 15-20 min i et 37 ° C vannbad, rist kolben i en sirkulær bevegelse gjennom hele (stopp i det øyeblikket fettet kommer til der det bare er noen få klumper igjen).
  11. Overfør det fordøyde fettet til et 50 ml konisk rør (det skal være ~ 30 ml / rør), og merk røret som "fordøyd fett".
  12. Spinn røret ved 400 x g i 4 minutter; etter spinning må pelleten være rød (figur 3A).
  13. Under sentrifugeringen plasserer du den sterile 37 μM-skjermen og 500 μM-skjermene i en steril petriskål med 5 ml 1 mg/ml BSA i PBS for å legge den i bløt før bruk.
  14. Etter spinningen, dekanter supernatanten til et 50 ml konisk rør merket som "avfall". Utfør dekanteringen forsiktig for å fjerne overfladisk fett og for ikke å forstyrre pelleten laget av MVF.
  15. Tilsett 10 ml 1 mg/ml BSA i PBS til slangen som inneholder pelleten ("fordøyd fett"). Triturat (pipet opp og ned) pelleten 2x.
  16. Unngå å være for grov på pelleten for ikke å forstyrre fragmentene.
  17. Plasser skjermen på 500 μM i en ny petriskål over skjermholderen i plast (figur 3B).
  18. Pipet 10 ml fra "fordøyd pellets" rør over en 500 μM skjerm ved hjelp av konsentriske sirkler (figur 3C).
  19. Vask filteret med ytterligere 5 ml 1 mg/ml BSA i PBS. De ønskede cellene vil filtrere gjennom i petriskålen; kast derfor 500 μM-skjermen, men lagre den filtrerte væsken inne i petriskålen.
  20. Plasser skjermen på 37 μM i en ny petriskål over plastskjermholderen.
  21. Bytt ut pipetten for å fjerne klumper før du bruker skjermen på 37 μM.
  22. Pipet væsken oppnådd fra den første filtreringen over 37 μM-skjermen ved hjelp av konsentriske sirkler.
  23. Vask filteret med ytterligere 5 ml 1 mg/ml BSA i PBS. De ønskede cellene forblir i filteret, kast derfor den filtrerte væsken, men lagre 37 μM-skjermen.
  24. Skyv skjermen på 37 μM inn i en ny petriskål som inneholder 5 ml 1 mg/ml BSA i PBS.
  25. Rist fatet ved å banke det mot en konisk holder for å løsne fragmentene. Ikke rist for kraftig, da væsken/cellene kan spyle ut av petriskålen.
  26. Skyll filteret med ytterligere 5 ml 1 mg/ml BSA i PBS. De ønskede cellene vil forbli i flytende oppløsning i petriskålen. Lagre 37 μM-skjermen og det løsnede fragmentet som inneholder væske inne i petriskålen for følgende trinn.
  27. Overfør BSA + -fragmentet som inneholder væske til et sterilt 50 ml konisk rør.
  28. Gjenta skylling av 37 μM-skjermen flere ganger (hver gang med ~5 ml 1 mg/ml BSA i PBS) og legg til det koniske røret. Gjenta til det totale innsamlede volumet er ~ 15-20 ml. Til slutt vil de ønskede cellene bli samlet fra væskeløsningen i petriskålen og plassert i et konisk rør; På dette tidspunktet kaster du 37 μM-skjermen etter den siste skyllingen, men lagrer de løsrevne fragmentene som inneholder væske inne i det 50 ml koniske røret.
  29. Klipp enden av en 200 μL pipetspiss med en saks. Rist forsiktig 50 ml røret, fjern to prøver på 20 μL, og legg dem i en ren 35 mm petriskål.
  30. Tell antall fragmenter i hver prøve i petriskålen for å oppnå totalt antall isolerte MVFer.
    Totale fragmenter = Equation 1
  31. Spinn det gjenværende løsrevne fragmentet som inneholder væske i et 50 ml konisk rør ved 400 x g i 4 minutter for å samle MVF.

Figure 3
Figur 3: Isolering av MVF. (A) Post fordøyelse av fettvevet, avbildning av separasjon av MVFer som inneholder pellet og supernatant etter en spin-down. (B) Utforming av forsyninger for filtrering og innfangning av MVFer. (C) Illustrasjon av den konsentriske sirkelmetoden for filtrering / vasketrinn. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

5. Dannelse av fibrinhydrogeler

  1. Eksempel på beregninger:
    MERK: Nedenfor er beregningene for MVFer sådd ved ~ 15,000-20,000 MVF / ml og fibrinogen: trombingelforholdet ved 2: 5, med fibrinogen brukt ved en 20 mg / ml konsentrasjon.
    1. For å lage fem 250 μL geler, er det nødvendig med et totalt volum på 1,250 μL. Ta alltid høyde for pipetteringsfeil, og lag derfor nok til 1,5 ml geler.
      1. Beregn volumet av fibrinogen som kreves som følger:
        Equation 2, X1 = 428,57 μL fibrinogen
      2. Beregn volumet av trombin som kreves som følger:
        Equation 3, X2 = 1 071,43 mikrol trombin
      3. For det nødvendige volumet på 428,57 μL, lag 500 μL fibrinogen som følger:
        20 mg/ml * 0,5 ml = 10 mg fibrinogen. Resuspender dette i 500 μL DMEM
      4. For å oppnå hver gel, beregne volumet av fibrinogen og trombin som følger:
        1. Fibrinogen:
          Equation 4, X1 = 71,43 μL fibrinogen (i DMEM) + MVF
        2. Trombin:
          Equation 5, X2 = 178,57 mikrol trombin
  2. MVF støping av fibringel
    1. Dekanter det meste av væsken i det spunnet ned fragmentet i 50 ml konisk rør. Bruk en pipette for å fjerne det lille volumet av væske som fanger på kanten av det koniske røret.
    2. Tilsett trombin i brønner hvor det skal lages geler (figur 4A).
    3. Klipp enden av en 200 μL pipetspiss og resuspender MVFene forsiktig med fibrinogen for å oppnå en endelig tetthet på ~ 15.000-20.000 MVF / ml en gang i gelen.
    4. Klem enden av en 200 mikrol pipetspiss og pipett MVF+Fibrinogen forsiktig inn i trombinoppløsningen. Piper raskt opp og ned for å sikre en homogen blanding. Gjenta til alle gelene er laget (figur 4B).
    5. Plasser brønnplaten(e) i en inkubator (37 °C, 5 % CO2) i ~15 minutter for å tillate geltverrbinding (figur 4C).
    6. Tilsett 100-150 μL vekstmedier til hver brønn.

Figure 4
Figur 4: Dannelse av MVF-fibringeler . (A) En 5/7-delt trombinblanding pipetteres inn i den tilsvarende brønnen. (B) Deretter, med en klippet pipetspiss (for ikke å forstyrre MVF), pipetteres en 2/7-delt fibrinogen + MVF-blanding inn i brønnen og blandes forsiktig. (C) Til slutt plasseres alle ferdige geler i en inkubator ved 37 ° C, slik at hydrogel kan størkne helt før mediet plasseres på toppen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

6. Dyrkingsforhold for MVFer

  1. For dyrking av ikke-vaskularisert hvitt og beige fettvev (+ GM-kontroll), bruk tidslinjene19 vist i figur 5.
  2. For dyrking av vaskularisert hvitt og beige fettvev (+ GM-kontroll), bruk tidslinjene19 vist i figur 6.
  3. Hydrogeler bør opprettholdes i en inkubator (37 ° C, 5% CO2) i løpet av kulturen for studien, med media som endres annenhver dag. For fiksering og håndtering av prøver for analyse, se tidligere publiserte arbeider16,19,20.

Figure 5
Figur 5: Tidspunkt for ikke-vaskularisert fettvevsdannelse. Denne figuren er modifisert fra Acosta et al.19. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Tidspunkt for vaskularisert fettvevsdannelse. Denne figuren er modifisert fra Acosta et al.19. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Det er noen viktige fenotypiske morfologiske egenskaper ved beige/brunt fettvev: det er multilokulært / inneholder små lipiddråper, har et stort antall mitokondrier (årsaken til det karakteristiske "brunlige" utseendet in vivo), har tilsvarende høyt oksygenforbruk / mitokondriell bioenergetikk, er sterkt vaskularisert, har økt lipolyse / insulinstimulert glukoseopptak, og mest notorisk, uttrykker høye nivåer av frakoblingsprotein 1 (UCP1), et mitokondrielt protein involvert i termogen respirasjon19,30.

Følgelig, ved karakterisering av MVFs evne til å differensiere til beige fettvev, ble det utført en analyse som ville tillate oss å visualisere (figur 7, figur 8), genetisk bekrefte (figur 9, figur 10) og funksjonelt måle (figur 11) transformasjonen av MVF.

I figur 7 og figur 8, ved bruk av BODIPY, en lipidflekk og avbildning av hydrogelene ved bruk av konfokalmikroskopi, ble visualiseringen av størrelsen og plasseringen av lipidene i de differensierte adipocytter sett16,17,19. Spesielt i denne analysen, spesielt i sammenligning mellom forhold, bør BAM-gruppene vise mindre lipidstørrelser (indikativ for beige fettvevdannelse), kvantifiserbare gjennom NIH ImageJ19,20.

Ved å bruke RT-qPCR 16,19,20, i figur 9 og figur 10, mest særegent, er uttrykket av UCP1 over hele linjen økt betydelig ved MVF-eksponering for BAM.

Til slutt, når man ser på mitokondriell bioenergetikk (figur 11), er det tydelig at BAM-grupper har karakteristisk høyere oksygenforbruksrate (OCR) nivåer, målt ved hjelp av en Seahorse mito stresstest19,20.

Figure 7
Figur 7: r-MVF histologisk evaluering. Magre eller type 2 diabetiske deriverte r-MVFer ble utsatt for enten direkte (øvre panel, ADIPO) eller indirekte (nedre panel, ANGIO + ADIPO) WAM eller BAM adipogene medier for å oppnå ikke-vaskularisert eller vaskularisert hvitt eller beige fettvev, henholdsvis (skalastenger = 200 μm). Denne figuren er modifisert fra Acosta et al.19. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 8
Figur 8: h-MVF histologisk evaluering. h-MVF ble eksponert for direkte (ADIPO) WAM eller BAM for å oppnå ikke-vaskularisert hvitt eller beige fettvev, henholdsvis (skalastenger = 200 μm). Denne figuren er modifisert fra Gonzalez Porras et al.20. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 9
Figur 9: r-MVF-evaluering gjennom RT-qPCR. Mager (L) eller type 2 diabetiker (Db) derivert r-MVF eksponert for enten (A-C) direkte eller (E-G) indirekte WAM eller BAM ble evaluert for (A,E) adipogenese (adiponektin), (B,F) termogenese (UCP1) og (C,G) angiogenese (ANGPT1). Resultatene rapporteres som gjennomsnittlig ± standardfeil av to eksperimentelle replikater (n = 4). * = p < 0,05, ** = p < 0,01, *** = p < 0,001 og **** = p < 0,0001. D0 = Dag 0. Toveis variansanalyse (ANOVA) tester med Holm-Sidaks multiple sammenligningsanalyser for å bestemme forskjeller mellom grupper. Statistisk signifikans ble definert som p < 0,05. Denne figuren er modifisert fra Acosta et al.19. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 10
Figur 10: h-MVF-evaluering gjennom RT-qPCR. h-MVFer eksponert for direkte WAM eller BAM ble evaluert for (A) adipogenese (adiponektin) og (B) termogenese (UCP1). Resultatene rapporteres som gjennomsnittlig ± standardfeil av to eksperimentelle replikater (n = 4). * = p < 0,05, ** = p < 0,01, *** = p < 0,001 og **** = p < 0,0001. Enveis variansanalyse (ANOVA) tester med Holm-Sidaks multiple sammenligningsanalyser for å bestemme forskjeller mellom grupper. Statistisk signifikans ble definert som p < 0,05. Denne figuren er modifisert fra Gonzalez Porras et al.20. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 11
Figur 11: r-MVF og h-MVF funksjonsvurdering. Lean (L) eller type 2 diabetiker (Db) avledet r-MVFer utsatt for enten (A) direkte eller (B) indirekte WAM eller BAM eller (C) h-MVFer utsatt for direkte WAM eller BAM ble evaluert funksjonelt gjennom måling av oksygenforbrukshastighet (OCR). Resultatene rapporteres som gjennomsnittlig ± standardfeil av to eksperimentelle replikater (n = 4). Denne figuren er modifisert fra Acosta et al.19. og Gonzalez Porras et al.20. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Feltet brun/beige fettvevsteknikk er stort sett umodent 22,23,24,25,26,27,28, med hovedtyngden av fettmodeller utviklet for hvitt fettvev 8,22,31. Konstruerte brune / beige mikrovev består vanligvis av flere cellekilder eller genetiske endringer for å oppnå en delmengde av de fenotypiske egenskapene til innfødt brunt fettvev 8,11,32. Tilnærmingen beskrevet her presenterer en enkeltkilde, potensielt autolog18,33 måte å skape funksjonelt, strukturelt relevant og vaskularisert beige fett ved hjelp av mikrovaskulære fragmenter (MVF). MVF er mest kjent som en kilde til dannelse av hvitt fettvev 14,16,17,1 8,34, selv om vi nylig har demonstrert deres evne til beige fettdannelse som stammer fra gnager, menneskelige og syke kilder, som vist her 19,20. Gitt den betydelige interessen for å utnytte beige / brunt fett for sitt terapeutiske eller sykdomsmodelleringspotensial, har denne teknikken usannsynlige applikasjoner innen metabolisme, fedme og relaterte lidelser.

Det er flere sentrale punkter beskrevet i protokollen. For det første er det forskjeller mellom bruk av rotte versus menneskelige MVFer. Bruken av gnageravledet (enten fra mus 29 eller rotter) har hittil i stor grad dominert forskning med MVF, med arbeid som ser på dem i en rekke forhold som fedme 35, type 1 diabetes 36,37, type 2 diabetes 19 og aldring 38, og til og med forskjeller mellom fettdepoter 39 eller kjønn40. Selv om MVF, gitt sin opprinnelse, kan isoleres autologøst fra de subkutane fettdepotene hos voksne ved bruk av standard minimalt invasive prosedyrer41, har MVF-basert vaskularisering ikke blitt utført i klinisk praksis. Imidlertid har prekliniske studier hvor humane MVFer ble høstet fra lipoaspirat vist sin mulighet18,33. For vår gruppe spesielt, som vist i de representative dataene, er dannelsen av vaskularisert beige fettvev for tiden begrenset til MVFer avledet fra gnagere. Som tidligere demonstrert av vår gruppe og andre18, er oppnåelse av balansen mellom karvekst og adipocytdifferensiering svært følsom, vist seg å være avhengig av faktorene introdusert42, og punktdifferensiering er provosert16. En begrensning av protokollen som er beskrevet er at videreutvikling er nødvendig for å optimalisere forholdene som bidrar til vaskularisert h-MVF beige fettvevdannelse. I tillegg er det behov for videre arbeid som ser på responsen til disse stillasene in vivo og stammer fra andre syke tilstander, sammen med tilhørende optimaliseringstrinn.

Videre er beskrevet her en protokoll for isolering av r-MVFer fra tre forskjellige fettvevsdepoter hos hannrotter. Tidligere arbeid fra Später et al.39 diskuterte forskjeller mellom vaskulariseringsevnen til viscerale versus subkutane depotavledede MVFer, og bemerket at subkutane depot-MVFer hadde redusert evne til vaskularisering, en funksjon de tilskrev overflødig bindevevsforurensning. Det skal bemerkes at for våre studier, som presentert her i "representative data", ble bare de inguinale subkutane og bakre subkutane depotene benyttet. Valget om kun å bruke subkutane MVFer ble valgt for å etterligne translasjonsstudier der lipoaspirat, eller lignende prosedyrer, utelukkende samler subkutant fettvev. I tillegg ga det faktum at in vivo-studier pinpekende beige fettvev utvikles i subkutant fettvev, som inneholder en distinkt delmengde av preadipocytter eller hvite adipocytter som transdifferensierer, en ytterligere begrunnelse for vår beslutning43. Tidligere arbeid fra vår gruppe viste ingen merkbare forskjeller mellom MVFene som stammer fra enten viscerale eller subkutane depoter av friske gnagere for å gjennomgå både angiogenese og dannelse av hvitt fettvev16. Alle disse variablene bør vurderes ved utforming av fremtidige studier.

Til slutt, når du prøver å enten endre eller feilsøke metoden som er beskrevet, bør noen viktige punkter overveies. For det første er trinnet med enzymatisk å fordøye fettvevet ekstremt viktig; spesiell forsiktighet bør utvises og optimalisering sikres for konsekvent å reprodusere MVFer av lignende størrelse og kvalitet. Gitt den store variasjonen mellom fetttyper og fettvolum (svært avhengig av dyrs alder, størrelse, helse og omsorg tatt på tidspunktet for fettisolering [unngåelse av forurensninger og ekstraksjonseffektivitet]), kan tidspunktet for fordøyelsen variere, og dermed varierer som passer best med utstyret / dyrene våre. Imidlertid bør tilpasning vurderes for optimale resultater. I tillegg, når du håndterer MVF, under postenzymatisk fordøyelse, bør det utvises spesiell forsiktighet for å unngå unødvendig ruhet og ytterligere bryte opp fragmenter. Til slutt bør man være oppmerksom på at medieformuleringer, hydrogelen til valg44 og kulturforhold er svært tilpassbare basert på tiltenkte resultater. Som vist her, har MVFer avledet fra forskjellige kilder (f.eks. magre vs diabetiske MVFer) forskjellige grader av differensiering, så når du designer eksperimenter, bør riktige kontroller og eksperimentelle grupper inkluderes.

For å konkludere, etter hvert som feltet engineering termogent fettvev vokser, er det avgjørende å konstruere biologisk relevante systemer som strukturelt, genetisk og funksjonelt etterligner innfødt beige / brunt fettvev. MVF-er presenterer en spennende og unik tilnærming til denne utfordringen, da de, som beskrevet her, gir en enkel enekildemetode for å skape biologiske imitasjoner av beige fett. Derfor har de et betydelig potensial for utnyttelse av forståelsen eller utviklingen av behandlinger for fedme og metabolske sykdommer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at forskningen ble utført i fravær av kommersielle eller økonomiske forhold som kan tolkes som en potensiell interessekonflikt.

Acknowledgments

Dr. Acosta støttes av National Institutes of Health tilskudd CA148724 og TL1TR002647. Dr. Gonzalez Porras støttes av National Institute of Diabetes og fordøyelses- og nyresykdommer ved National Institutes of Health, under prisnummer F32-0DK122754. Dette arbeidet ble delvis støttet av National Institutes of Health (5SC1DK122578) og University of Texas i San Antonio Department of Biomedical Engineering. Innholdet er utelukkende forfatternes ansvar og representerer ikke nødvendigvis de offisielle synspunktene til National Institutes of Health. Figurene ble delvis laget med Biorender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aminocaproic Acid Sigma Aldrich A2504-100G Added in DMEM at the concentration of 1 mg/mL
Blunt-Tipped Scissors Fisher scientific 12-000-172 Sterilize in autoclave
Bovin Serum Albumin (BSA) Millipore 126575-10GM Diluted in PBS to 4 mg/mL and 1 mg/mL
Collagenase Type 1 Fisher scientific NC9633623 Diluted to 6 mg/mL in BSA 4 mg/mL, Digestion of minced fat
Dexamethasone Thermo Scientific AC230302500 Diluted in ethanol at a 2 mg/ml stock concentration
Disposable underpads Fisher scientific 23-666-062 For fluid absorption during surgery
Dissecting Scissors Fisher scientific 08-951-5 Sterilize in autoclave
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium (DMEM) Fisher scientific 11885092
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham (DMEM/F12) Sigma Aldrich D8062
Fetal Bovine Serum  Fisher scientific 16140089 Added in DMEM to 20% v/v.
Fibrinogen  Sigma Aldrich F8630-25G Solubilized in DMEM at the concentration of 20 mg/mL, Protein found in blood plasma and main component of hydrogel
Flask, 250 mL Fisher scientific FB500250 Allows for digestion of fat using a large surface area
Forceps Fisher scientific 50-264-21 Sterilize in autoclave, For handling of tissue and filters
Forskolin Sigma Aldrich F6886 Diluted in ethanol at a 10 mM stock concentration
Human MVF Advanced Solutions Life Scienes, LLC https://www.advancedsolutions.com/microvessels Human MVFs (hMVFs) isolated from three different patients (52-, 54-, and 56-year old females) were used in the current study. 
Indomethacine  Sigma Aldrich I7378 Diluted in ethanol at a 12.5 mM stock concentration
Insulin from porcine pancreas Sigma Aldrich I5523 Diluted in 0.01 N HCl at a 5 mg/ml stock concentration
MycoZap Fisher scientific NC9023832 Added in DMEM to 0.2% w/v, Mycoplasma Prophylactic 
Pennycilin/Streptomycin (10,000 U/mL) Fisher scientific 15140122 Added in DMEM to 1% v/v.
Petri dishes, polystyrene (100 mm x 15 mm). Fisher scientific 351029 3 for removal of blood vessels and mincing, 8 (lid) for presoaking of screens & 8 (dish) for use when filtering with 500 or 37 µM screens
Petri dishes, polystyrene (35 mm x 10 mm). Fisher scientific 50-202-036 For counting fragments
Phosphate Buffer Saline (PBS) Fisher scientific 14-190-250 Diluted to 1x with sterile deionized water.
Rat Clippers (Andwin Mini Arco Pet Trimmer) Fisher scientific NC0854141
Rosiglitazone Fisher scientific R0106200MG Diluted in DMSO at a 10 mM stock concentration
Scissors Fine Science Tools 14059-11 1 for initial incision, 1 for epididymal incision, 1 for tip clipping
Screen  37 µM  Carolina Biological Supply Company 652222R Cut into 3" rounded squares and sterilized in ethylene oxide, Fragment entrapment and removal of very small fragments/single cells and debris
Screen 500 µM  Carolina Biological Supply Company 652222F Cut into 3" rounded squares and sterilized in ethylene oxide, Removes larger fragments/debris
Serrated Hemostat Fisher scientific 12-000-171 Sterilize in autoclave, For clamping of skin before incision
Steriflip Filter 0.22 μm  Millipore SE1M179M6
Thrombin Fisher scientific 6051601KU Diluted in deionzed water to 10 U/mL, Used as a clotting agent turning fibrinogen to fibrin
Thyroid hormone (T3) Sigma Aldrich T2877 Diluted in 1N NaOH at a 0.02 mM stock concentration
Zucker diabetic fatty (ZDF) rats - obese (FA/FA) or lean (FA/+) male  Charles River https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-lean-fa?region=3611
https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-obese?region=3611		 Obtained from Charles River (Wilmington, MA). Rats were acquired at 4 weeks of age and fed Purina 5008 until euthanasia (15-19 weeks of age). Glucose levels (blood from the lateral saphenous vein) were greater than 300 mg/dL in all FA/FA rats used in the study. All animals were housed in a temperature-controlled environment with a 12-h light-dark cycle and fed ad libitum.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cohen, P., Spiegelman, B. M. Brown and beige fat: molecular parts of a thermogenic machine. Diabetes. 64 (7), 2346-2351 (2015).
  2. Liu, X., et al. Brown adipose tissue transplantation reverses obesity in Ob/Ob mice. Endocrinology. 156 (7), 2461-2469 (2015).
  3. Tharp, K. M., Stahl, A. Bioengineering beige adipose tissue therapeutics. Frontiers in Endocrinology. 6, 164 (2015).
  4. Barquissau, V., et al. White-to-brite conversion in human adipocytes promotes metabolic reprogramming towards fatty acid anabolic and catabolic pathways. Molecular Metabolism. 5 (5), 352-365 (2016).
  5. Kim, S. H., Plutzky, J. Brown fat and browning for the treatment of obesity and related metabolic disorders. Diabetes & Metabolism Journal. 40 (1), 12-21 (2016).
  6. Lizcano, F., Vargas, D. Biology of beige adipocyte and possible therapy for type 2 diabetes and obesity. International Journal of Endocrinology. 2016, 9542061 (2016).
  7. Mulya, A., Kirwan, J. P. Brown and beige adipose tissue: therapy for obesity and its comorbidities. Endocrinology and Metabolism Clinics of North America. 45 (3), 605-621 (2016).
  8. Murphy, C. S., Liaw, L., Reagan, M. R. In vitro tissue-engineered adipose constructs for modeling disease. BMC Biomedical Engineering. 1, 27 (2019).
  9. Srivastava, S., Veech, R. L. Brown and brite: The fat soldiers in the anti-obesity fight. Frontiers in Physiology. 10, 38 (2019).
  10. Samuelson, I., Vidal-Puig, A. Studying brown adipose tissue in a human in vitro context. Frontiers in Endocrinology. 11, 629 (2020).
  11. Wang, C. -H., et al. CRISPR-engineered human brown-like adipocytes prevent diet-induced obesity and ameliorate metabolic syndrome in mice. Science Translational Medicine. 12 (558), (2020).
  12. Kaisanlahti, A., Glumoff, T. Browning of white fat: agents and implications for beige adipose tissue to type 2 diabetes. Journal of Physiology and Biochemistry. 75 (1), 1-10 (2019).
  13. Sato, N., et al. Development of capillary networks from rat microvascular fragments in vitro: the role of myofibroblastic cells. Microvascular Research. 33 (2), 194-210 (1987).
  14. Laschke, M. W., Später, T., Menger, M. D. Microvascular fragments: More than just natural vascularization units. Trends in Biotechnology. 39 (1), 24-33 (2021).
  15. Hoying, J. B., Boswell, C. A., Williams, S. K. Angiogenic potential of microvessel fragments established in three-dimensional collagen gels. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Animal. 32 (7), 409-419 (1996).
  16. Acosta, F. M., Stojkova, K., Brey, E. M., Rathbone, C. R. A straightforward approach to engineer vascularized adipose tissue using microvascular fragments. Tissue Engineering. Part A. 26 (15-16), 905-914 (2020).
  17. Acosta, F. M., et al. Adipogenic differentiation alters properties of vascularized tissue-engineered skeletal muscle. Tissue Engineering. Part A. 28 (1-2), 54-68 (2021).
  18. Strobel, H. A., Gerton, T., Hoying, J. B. Vascularized adipocyte organoid model using isolated human microvessel fragments. Biofabrication. 13 (3), 035022 (2021).
  19. Acosta, F. M., et al. Engineering functional vascularized beige adipose tissue from microvascular fragments of models of healthy and type II diabetes conditions. Journal of Tissue Engineering. 13, 20417314221109337 (2022).
  20. Gonzalez Porras, M. A., Stojkova, K., Acosta, F. M., Rathbone, C. R., Brey, E. M. Engineering human beige adipose tissue. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 906395 (2022).
  21. Herold, J., Kalucka, J. Angiogenesis in adipose tissue: The interplay between adipose and endothelial cells. Frontiers in Physiology. 11, 1861 (2021).
  22. McCarthy, M., et al. Fat-On-A-Chip models for research and discovery in obesity and its metabolic comorbidities. Tissue Engineering Part B: Reviews. 26 (6), 586-595 (2020).
  23. Klingelhutz, A. J., et al. Scaffold-free generation of uniform adipose spheroids for metabolism research and drug discovery. Scientific Reports. 8 (1), 523 (2018).
  24. Yang, J. P., et al. Metabolically active three-dimensional brown adipose tissue engineered from white adipose-derived stem cells. Tissue Engineering. Part A. 23 (7-8), 253-262 (2017).
  25. Vaicik, M. K., et al. Hydrogel-based engineering of beige adipose tissue. Journal of Materials Chemistry B. 3 (40), 7903-7911 (2015).
  26. Tharp, K. M., Stahl, A. Bioengineering beige adipose tissue therapeutics. Frontiers in Endocrinology. 6, 164 (2015).
  27. Tharp, K. M., et al. Matrix-assisted transplantation of functional beige adipose tissue. Diabetes. 64 (11), 3713-3724 (2015).
  28. Harms, M. J., et al. Mature human white adipocytes cultured under membranes maintain identity, function, and can transdifferentiate into brown-like adipocytes. Cell Reports. 27 (1), 213-225 (2019).
  29. Frueh, F. S., Später, T., Scheuer, C., Menger, M. D., Laschke, M. W. Isolation of murine adipose tissue-derived microvascular fragments as vascularization units for tissue engineering. Journal of Visualized Experiments. (122), e55721 (2017).
  30. Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: Function and physiological significance. Physiological Reviews. 84 (1), 277-359 (2004).
  31. Unser, A. M., Tian, Y., Xie, Y. Opportunities and challenges in three-dimensional brown adipogenesis of stem cells. Biotechnology Advances. 33, 962-979 (2015).
  32. Dani, V., Yao, X., Dani, C. Transplantation of fat tissues and iPSC-derived energy expenditure adipocytes to counteract obesity-driven metabolic disorders: Current strategies and future perspectives. Reviews in Endocrine & Metabolic Disorders. 23 (1), 103-110 (2022).
  33. Xu, X., et al. Adipose tissue-derived microvascular fragments as vascularization units for dental pulp regeneration. Journal of Endodontics. 47 (7), 1092-1100 (2021).
  34. McDaniel, J. S., Pilia, M., Ward, C. L., Pollot, B. E., Rathbone, C. R. Characterization and multilineage potential of cells derived from isolated microvascular fragments. Journal of Surgical Research. 192 (1), 214-222 (2014).
  35. Gealekman, O., et al. Depot-specific differences and insufficient subcutaneous adipose tissue angiogenesis in human obesity. Circulation. 123 (2), 186-194 (2011).
  36. Altalhi, W., Hatkar, R., Hoying, J. B., Aghazadeh, Y., Nunes, S. S. Type I diabetes delays perfusion and engraftment of 3D constructs by impinging on angiogenesis; which can be rescued by hepatocyte growth factor supplementation. Cellular and Molecular Bioengineering. 12 (5), 443-454 (2019).
  37. Altalhi, W., Sun, X., Sivak, J. M., Husain, M., Nunes, S. S. Diabetes impairs arterio-venous specification in engineered vascular tissues in a perivascular cell recruitment-dependent manner. Biomaterials. 119, 23-32 (2017).
  38. Laschke, M. W., et al. Adipose tissue-derived microvascular fragments from aged donors exhibit an impaired vascularisation capacity. European Cells & Materials. 28, 287-298 (2014).
  39. Später, T., et al. Vascularization of microvascular fragment isolates from visceral and subcutaneous adipose tissue of mice. Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 19 (1), 161-175 (2021).
  40. Später, T., et al. Adipose tissue-derived microvascular fragments from male and female fat donors exhibit a comparable vascularization capacity. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 777687 (2021).
  41. Laschke, M. W., Menger, M. D. The simpler, the better: tissue vascularization using the body's own resources. Trends in Biotechnology. 40 (3), 281-290 (2022).
  42. Yang, F., Cohen, R. N., Brey, E. M. Optimization of co-culture conditions for a human vascularized adipose tissue model. Bioengineering. 7 (3), 114 (2020).
  43. Pilkington, A. -C., Paz, H. A., Wankhade, U. D. Beige adipose tissue identification and marker specificity-Overview. Frontiers in Endocrinology. 12, 599134 (2021).
  44. Chiou, G., et al. Scaffold architecture and matrix strain modulate mesenchymal cell and microvascular growth and development in a time dependent manner. Cellular and Molecular Bioengineering. 13 (5), 507-526 (2020).

Tags

Tilbaketrekking utgave 192
Tredimensjonal kultur av vaskularisert termogent fettvev fra mikrovaskulære fragmenter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Acosta, F. M., Gonzalez Porras, M.… More

Acosta, F. M., Gonzalez Porras, M. A., Stojkova, K., Pacelli, S., Rathbone, C. R., Brey, E. M. Three-Dimensional Culture of Vascularized Thermogenic Adipose Tissue from Microvascular Fragments. J. Vis. Exp. (192), e64650, doi:10.3791/64650 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter