Summary
Her præsenteres en protokol til implementering af ekspansionsmikroskopi i tidlige Drosophila-embryoner for at opnå superopløsningsbilleddannelse ved hjælp af et konventionelt laserscanningskonfokalmikroskop.
Abstract
Arbejdshesten i udviklingsbiologi er det konfokale mikroskop, som gør det muligt for forskere at bestemme den tredimensionelle lokalisering af mærkede molekyler inden for komplekse biologiske prøver. Mens traditionelle konfokale mikroskoper gør det muligt at løse to tilstødende fluorescerende punktkilder, der ligger et par hundrede nanometer fra hinanden, kræver iagttagelse af de finere detaljer i subcellulær biologi evnen til at løse signaler i størrelsesordenen snesevis af nanometer. Talrige hardwarebaserede metoder til superopløsningsmikroskopi er blevet udviklet for at give forskere mulighed for at omgå sådanne opløsningsgrænser, selvom disse metoder kræver specialiserede mikroskoper, der ikke er tilgængelige for alle forskere. En alternativ metode til at øge opløsningsevnen er isotropisk at forstørre selve prøven gennem en proces kendt som ekspansionsmikroskopi (ExM), som først blev beskrevet af Boyden-gruppen i 2015. ExM er ikke en type mikroskopi i sig selv , men er snarere en metode til hævelse af en prøve, samtidig med at den relative rumlige organisering af dens bestanddele bevares. Den udvidede prøve kan derefter observeres ved en effektivt øget opløsning ved hjælp af et traditionelt konfokalmikroskop. Her beskriver vi en protokol til implementering af ExM i helmonterede Drosophila-embryoner , som bruges til at undersøge lokaliseringen af Par-3, myosin II og mitokondrier inden for overfladeepitelcellerne. Denne protokol giver en ca. fire gange stigning i prøvestørrelse, hvilket muliggør påvisning af subcellulære detaljer, der ikke er synlige med konventionel konfokal mikroskopi. Som bevis på princippet anvendes et anti-GFP-antistof til at skelne forskellige puljer af myosin-GFP mellem tilstødende cellekortika, og fluorescerende mærket streptavidin bruges til at detektere endogene biotinylerede molekyler for at afsløre de fine detaljer i mitokondrienetværksarkitekturen. Denne protokol anvender almindelige antistoffer og reagenser til fluorescensmærkning, og den skal være kompatibel med mange eksisterende immunfluorescensprotokoller.
Introduction
I celle- og udviklingsbiologi er det at se at tro, og evnen til nøjagtigt at bestemme lokaliseringsmønstre for proteiner er grundlæggende for mange typer eksperimenter. Laserscanning konfokal mikroskopi er standardværktøjet til billeddannelse af fluorescerende mærkede proteiner i tre dimensioner inden for intakte prøver. Konventionelle konfokale mikroskoper er ude af stand til at skelne (opløse) tilstødende fluorescerende signaler, der adskilles med mindre end halvdelen af bølgelængden af det lys, de udsender1. Med andre ord skal to punktkilder adskilles med mindst 200-300 nm i lateral retning (500-700 nm i aksial retning) for at løse dem som to forskellige signaler. Denne tekniske barriere er kendt som diffraktionsgrænsen, og det er en grundlæggende hindring for undersøgelser af komplekse subcellulære strukturer (fx actomyosin cytoskeletale eller mitokondrie netværk) med rumlige træk under diffraktionsgrænsen. Derfor er teknikker til at øge opløsningskraften i konventionelle konfokale mikroskoper af almen interesse for det biologiske samfund.
For at omgå diffraktionsgrænsen er der udviklet en række forskellige superopløsningsmikroskopiteknologier, der muliggør opløsning i størrelsesordenen snesevis af nanometer eller mindre 1,2,3, hvilket afslører en verden af biologisk kompleksitet, der tidligere kun var tilgængelig via elektronmikroskopi. På trods af de åbenlyse fordele ved disse hardwarebaserede metoder har superopløsningsmikroskoper ofte specifikke prøvemærkningskrav og lange anskaffelsestider, hvilket begrænser deres fleksibilitet, eller de kan simpelthen være for dyre for nogle laboratorier at få adgang til. Et alternativ til mikroskopbaseret superopløsning er ekspansionsmikroskopi (ExM), som ikke er en type mikroskopi i sig selv, men snarere er en metode til hævelse af en prøve, samtidig med at den relative rumlige organisering af dens bestanddelebevares 4. De isotropisk udvidede prøver kan derefter observeres ved en effektivt øget opløsning ved anvendelse af et traditionelt fluorescenskonfokalmikroskop. ExM blev først beskrevet af Boyden-gruppen i 20155, og grundteknikken er siden blevet tilpasset til brug i en række eksperimenter 6,7,8. ExM er også blevet tilpasset til brug i helmonterede embryoner, især i Drosophila 9,10,11, C. elegans12 og zebrafisk 13, hvilket gør det til et kraftfuldt værktøj for udviklingsbiologer.
ExM er baseret på to forskellige hydrogelkemikalier: 1) opsvulmelige polyelektrolythydrogeler, som stiger kraftigt i størrelse, når de gennemblødes i vand14, og 2) polyacrylamidhydrogeler, som har ekstremt lille polymerafstand for at muliggøre isotrop prøveudvidelse15. Selvom der er mange offentliggjorte ExM-protokoller, deler de generelt følgende trin: prøvefiksering, mærkning, aktivering, gelering, fordøjelse og ekspansion4. Fikseringsbetingelserne og fluorescensmærkningsstrategierne vil naturligvis variere afhængigt af eksperimentets og systemets behov, og i nogle protokoller sker mærkning efter udvidelse. Målmolekylerne i prøven skal grundes (aktiveres) til binding til hydrogelen, hvilket kan opnås ved hjælp af forskellige kemikalier4. Under geleringstrinnene er prøven mættet med monomerer af den fremtidige hydrogel (natriumacrylat, acrylamid og tværbindingsbisacrylamid), og hydrogelen dannes derefter ved fri radikalpolymerisation katalyseret af en initiator, såsom ammoniumpersulfat (APS) og en accelerator, såsom tetramethylendiamin (TEMED)4. Efter gelering fordøjes prøven enzymatisk for at homogenisere prøvens modstandsdygtighed over for hævelse og sikre den isotrope ekspansion af hydrogelen4. Endelig placeres den fordøjede hydrogel i vand, hvilket får den til at udvide sig til ca. fire gange sin oprindelige lineære størrelse4.
Figur 1: Oversigt over ekspansionsmikroskopi i Drosophila-embryoner . ExM er en flertrinsprotokol, der tager mindst 4 dage at gennemføre. Embryoindsamling, fiksering og devitellinisering tager 1 dag eller mere afhængigt af om embryoner fra flere samlinger samles. Immunofluorescensmærkning tager 1 dag eller 2 dage afhængigt af om embryonerne inkuberes natten over med de primære antistoffer. Embryoaktivering, gelering, fordøjelse og ekspansion kan udføres på en enkelt dag. Gelerne kan monteres og afbildes umiddelbart efter ekspansion, selvom det af praktiske årsager ofte er ønskeligt at starte billeddannelsen den følgende dag. Klik her for at se en større version af denne figur.
Denne protokol beskriver, hvordan man udfører ExM på helmonterede tidlige til mellemste fase Drosophila-embryoner 16 for at visualisere subcellulære proteinlokaliseringsmønstre ved superopløsning (figur 1). Denne metode bruger methylacrylsyre N-hydroxysuccinimidylester (MA-NHS) kemi til at aktivere og forankre proteinmolekyler til hydrogelen 17, og det er en modifikation af en tidligere offentliggjort ExM-protokol til brug i sene stadier og væv11. Denne protokol bruger polydimethylsiloxan (PDMS) brønde til at forme hydrogelerne og lette opløsningsudveksling under aktivering og gelering. En alternativ metode, der ikke kræver oprettelse af PDMS-brønde, indebærer sænkning af embryoner, der er fastgjort til dæksedler, i dråber monomeropløsning, der sidder på et stykke laboratorieforseglingsfilm22. Derudover beskriver denne protokol en metode til manuelt at fjerne den uigennemtrængelige vitellinmembran, der omgiver Drosophila-embryoner, hvilket er en forudsætning for immunofluorescensfarvning. Det er vigtigt, at denne metode til håndskrælning af embryoner kun kan bruges til at vælge korrekt iscenesatte Drosophila-embryoner inden prøvemærkning, hvilket i høj grad øger sandsynligheden for at ende med udvidede prøver af det korrekte stadium og orientering og dermed gør downstream-dataindsamlingen meget mere effektiv.
Protocol
Denne protokol følger University of Arkansas (UARK) retningslinjer for forskning på hvirvelløse dyr, såsom Drosophila melanogaster, og blev godkendt af UARK Institutional Biosafety Committee (protokol # 20001).
1. Drosophila embryofiksering og devitellinisering
BEMÆRK: Trin 1 beskriver en procedure (håndskrælning) til manuel fjernelse af vitellinmembranen, en gennemsigtig uigennemtrængelig membran, der omgiver embryoet. Det er vigtigt, at håndskrælning giver mulighed for udvælgelse af korrekt iscenesatte embryoner i starten af ExM-protokollen, hvilket i høj grad øger sandsynligheden for at opnå embryoner i en brugbar orientering i slutningen af ExM-protokollen. Denne ExM-protokol er imidlertid fuldstændig kompatibel med indsamling af bulkembryoner og standardprocedurer for methanolbaseret fjernelse af vitellinmembranen, i hvilket tilfælde man kan springe direkte til trin 2 (immunfluorescensmærkning).
- Forbered eller køb et antal fine glasnåle. De faktiske dimensioner af nålespidsen er ikke kritiske, men sørg for, at nålene er stive og skarpe nok til at gennembore vitellinmembranerne i faste embryoner. Lav nåle af glaskapillarrør (1 mm ydre diameter, 0,75 mm indvendig diameter) ved hjælp af en mikropipetudtrækker, som man ville forberede nåle til embryomikroinjektioner18; Alternativt kan du købe fortrukne nåle.
- Opsaml embryoner ved hjælp af standard Drosophila-teknikker 19 ved at placere >100 voksne Drosophila i en ventileret plastikkop forseglet med en frugtsaft/agarplade20. Brug tidsbestemte opsamlingsvinduer til at berige embryoner i det rette stadium16. For eksempel for at berige til gastrulation (trin 6) og konvergent-forlængelse (trin 7) stadier, skift frugtsaftpladen, saml embryonerne i 2 timer ved 25 ° C, fjern derefter pladen og æld den i yderligere 2 timer ved 25 ° C for at opnå embryoner, der er ~ 2-4 timer gamle.
- For at fjerne den æggeskalslignende korion fra embryonerne skal du dække overfladen af frugtsaftpladerne med 50% blegemiddel (tabel 1), frigøre embryonerne fra agarens overflade ved at omrøre dem med en lille pensel og vente 3 minutter på, at korionen opløses.
- De dechorionerede embryoner overføres med en pensel til et 30 ml scintillationshætteglas indeholdende 4 ml heptan (organisk topfase) og 4 ml fikseringsbuffer (vandig bundfase; Tabel 1). Fortynd formaldehydet frisk fra en frisklavet eller nyligt åbnet bestand, og bland med 10x PBS og deioniseret vand umiddelbart før tilsætning af embryonerne.
BEMÆRK: Forbered formaldehyd fra paraformaldehydkraft eller 16% EM-kvalitet formaldehyd i glasampuler. Lagre af koncentreret formaldehyd (f.eks. 37% formaldehyd) kan anvendes, selv om resultaterne kan være mindre konsistente. - Embryonerne akkumuleres ved grænsefladen mellem de organiske og vandige faser. Tilføj så mange embryoner, som vil danne et enkelt lag ved grænsefladen. Hvis der tilsættes for mange embryoner til et hætteglas, vil de ikke fikse så godt.
- Brug stærk tape til at immobilisere scintillationshætteglassene på deres sider på en bordryster og omrør dem i 20 minutter ved 220 o / min. For optimal fiksering opretholdes en kraftig emulsion mellem de organiske og vandige faser under hele fikseringen.
- I løbet af fikseringstiden skal du forberede et af følgende for hver af prøverne.
- Tag en plastik 6 cm petriskål bund fyldt halvvejs med 3% agar og score et ~ 5 cm x 3 cm rektangel i agaren med et barberblad eller skalpel. Frugtsaft / agarplader kan også bruges til dette formål.
- Brug en lille laboratoriespatel til at fjerne agarpladen. Vend bunden af petriskålen, og sæt den på bænken. Agarpladen anbringes oven på den omvendte skål (figur 2A).
- Tag låget på petriskålen og sørg for, at den er tør. Brug handsker, læg et stykke dobbeltsidet tape inde i låget (båndstykket skal være lidt større end agarpladen; Figur 2B).
- Fjern hætteglassene fra rysteren, sæt dem lodret på bænken, og lad de organiske og vandige faser adskilles. Korrekt faste embryoner forbliver ved grænsefladen mellem de to faser.
- Overfør de faste embryoner til agarpladen ved hjælp af en Pasteur-pipet af glas udstyret med en latexpære. For at forhindre, at embryonerne sætter sig fast på pipettens inderside, skal du forsøge at holde embryonerne inden for pipettens smalle hals og overføre embryonerne i flere små partier i stedet for alle på én gang. Når alle embryonerne er på agarpladen, fjernes det meste af den resterende heptan fra omkring embryonerne ved hjælp af en P200-pipetter. Udfør dette trin så hurtigt som muligt (<3 min) for at undgå udtørring af de faste embryoner, hvilket kan påvirke morfologien negativt.
- Fra en højde på ~ 2 cm slippes låget med det dobbeltsidede tape på agarpladen for at klæbe embryonerne til båndet (figur 2C). Fjern forsigtigt låget fra agarpladen, læg det på hovedet på bænken, og tilsæt derefter nok PBS-Tween (tabel 1) til at dække embryonerne i låget.
- Brug et stereodissekerende mikroskop ved ca. 100x forstørrelse med indirekte belysning til at identificere korrekt iscenesatte embryoner ved hjælp af morfologiske markører. For fase 6 embryoner skal du bruge markører som en synlig cephalic fure og invaginated mesoderm; For fase 7-embryoner skal du bruge markører som et udvidet kimbånd; For embryoner i fase 11 skal du bruge markører som et fuldt udvidet kimbånd og synlig segmentering langs hoved-til-hale-aksen16.
- For at indsamle de ønskede embryoner skal du først stikke vitellinmembranen (en gennemsigtig oval membran omkring embryoet) nær den forreste eller bageste ende af embryoet med en fin glasnål; Membranen tømmes lidt, når trykket frigives. Brug derefter fine tang eller en metalsonde til forsigtigt at skubbe embryoet i den anden ende gennem hullet; Vitellinmembranen forbliver klæbet til den dobbeltsidede tape. Lad uønskede embryoner klæbe til båndet.
- Saml regelmæssigt de flydende devitelliniserede embryoner med et glas Pasteur-pipør, og flyt dem til et 1,5 ml mikrofugerør.
- Udfør et af følgende trin på dette tidspunkt.
- Fortsæt direkte til immunofluorescensmærkningstrinnene. De devitelliniserede embryoner kan gå direkte ind i blokeringsopløsningen (trin 2.2). Lad ikke embryonerne forblive i PBS-Tween eller blokerende opløsning (tabel 1) i mere end 16 timer, før du fortsætter til næste trin.
- Flyt embryonerne til methanol til opbevaring. Fjern så meget af PBS-Tween som muligt, og tilsæt derefter 1 ml methanol. Når embryonerne har bundfældet sig, fjernes så meget methanol som muligt, og der tilsættes 1 ml frisk methanol. Opbevar embryonerne ved -20 °C på ubestemt tid. Methanolopbevaring giver også mulighed for pooling af embryoner fra flere samlinger.
2. Immunofluorescens mærkning
BEMÆRK: Bortset fra antistofinkubationstrinnene er nøjagtige væskemængder og -tider ikke kritiske i dette afsnit. For at udføre skylning eller vask skal du lade embryonerne slå sig ned i bunden af røret, fjerne så meget væske som muligt uden at suge embryoner op og derefter tilføje ~ 1 ml ny væske; Brug en Pasteur-pipet af glas udstyret med en latexpære for optimal klarhed og kontrol. Til skylletrinnet rystes embryonerne ikke, får bare lov til at slå sig ned; Til vasketrinnet rystes embryonerne på en nutator i den angivne tid og får derefter lov til at slå sig ned.
- Hvis embryoner ikke blev opbevaret i methanol, fortsættes til trin 2.2. Hvis embryonerne blev opbevaret i methanol, skylles to gange med PBS-Tween, og derefter vaskes i 20 min to gange med PBS-Tween.
- Vask embryonerne i 30-60 min i 1 ml blokerende opløsning.
- Embryonerne inkuberes med primære antistoffer fortyndet i antistofopløsning (tabel 1) i 2 timer ved stuetemperatur eller helst natten over ved 4 °C. Udfør dette trin i så lille et volumen som muligt (50-300 μL) for at bevare de primære antistoffer; Rocking på en nutator er ikke strengt påkrævet.
- Forøg mængden af primært antistof, der anvendes i et typisk immunfluorescenseksperiment, med mindst 50% for ExM. Brug følgende primære antistofkoncentrationer: 1:200 for anti-Par-3 marsvin polyklonal21 og 1:100 for anti-GFP kanin polyklonal.
- Fjern den primære antistofopløsning (spar evt. 4 °C), skyl to gange med PBS-Tween, og vask derefter i 15 min fire gange med PBS-Tween.
- Embryonerne inkuberes med fluorescerende sekundære antistoffer i et slutvolumen på 300 μL (fortyndet i antistofopløsning) i 1 time ved stuetemperatur på en møtrik. Fluorescerende mærket streptavidin kan tilsættes under dette trin. Fra dette trin skal embryonerne beskyttes mod overdreven og langvarig lyseksponering, når det er muligt, for eksempel ved at dække rørene med et uigennemsigtigt kasselåg eller opbevare prøverne i en skuffe.
- Brug følgende koncentrationer: 1:500 til anti-kanin IgG ged polyklonal smeltet til Alexa Fluor 488; 1:500 for anti-marsvin IgG ged polyklonal smeltet til Alexa Fluor 568; og 1:1000 for streptavidin-Alexa Fluor 488.
- Fjern og bortskaf den sekundære antistofopløsning. Embryonerne skylles to gange med PBS-Tween, og vaskes i 15 min fire gange med PBS-Tween.
- På dette tidspunkt kan embryonerne opbevares ved 4 °C i mørke, men prøverne behandles så hurtigt som muligt (<24 timer).
3. Forberedelse af PDMS-brønde
BEMÆRK: PDMS-brøndene kan laves op til 2 uger i forvejen.
- Indstil en inkubator eller kogeplade til 55 °C, og indstil en centrifuge, der kan dreje koniske rør til 15 °C.
- For at forberede PDMS-opløsningen (tabel 1) anbringes et 50 ml konisk rør i en sekundær beholder på en skala, og der tilsættes 10 g silikoneelastomerbase til røret ved hjælp af en sprøjte. Derefter tilsættes 1 g silikone elastomerhærdningsmiddel, og inverter røret flere gange for at blande.
- Opret et balancerør ved at tilføje en passende mængde vand til et andet 50 ml konisk rør. PDMS-opløsningen centrifugeres ved 500 x g i 3 minutter ved 15 °C, og hældes derefter i en 10 cm petriskål til en dybde på ~1 mm. Fjern om nødvendigt bobler ved at blæse forsigtigt på opløsningen med en luftslange. Lad PDMS-opløsningen størkne natten over ved 55 °C.
- Når PDMS-pladen er størknet, skal du ved hjælp af en skalpel score firkantede områder, der er lidt mindre end en 22 mm x 22 mm coverslip. Inde i hver firkant skal du score og fjerne en ~ 8 mm bred firkantet brønd.
- Overfør hvert kvadratisk PDMS-brønd til en 22 mm x 22 mm dæksel, og sæt den fast (figur 2D). Forberedelse af seks eller flere dæksedler skal give et stort antal udvidede embryoner til billedet.
4. Fastgørelse af embryonerne til dæksedlerne
- Påfør nok 0,1% poly-L-lysin til at dække dækseloverfladen inde i hver brønd (~ 50 μL), og læg dem i en 55 ° C inkubator for at lufttørre. Gentag dette trin for at øge klæbeevnen.
- Skyl embryonerne kort en gang i 1x PBS for at fjerne Tween-vaskemidlet, og overfør derefter >10 embryoner til hvert af de poly-L-lysinbelagte huller.
- Lad embryonerne slå sig ned i bunden af brøndene. Fjern overskydende væske fra de klæbende embryoner ved hjælp af en Pasteur-pipør. Fortsæt straks til næste trin.
5. Aktivering og gelering
BEMÆRK: Aktivering refererer til tilsætning af MA-NHS til embryonerne, som vil ændre prøveproteinerne og antistofferne, så de kan binde til hydrogelen. Gelering refererer til dannelsen af en hydrogel i og omkring embryonerne i hver brønd. Under gelering gennemsyres embryonerne med en monomeropløsning og behandles derefter med en geleringsopløsning til dannelse af hydrogelen.
- Embryonerne aktiveres i 1 time ved stuetemperatur ved at fylde hullerne med aktiveringsopløsning (1 mM MA-NHS frisk fortyndet i 1x PBS; Tabel 1). Skift denne opløsning ca. hvert 10. minut i løbet af 1 time.
- Skyl embryonerne med 1x PBS tre gange. Embryonerne inkuberes i monomeropløsning (tabel 1) i 45 minutter ved 4 °C.
- Mens embryonerne sidder i monomeropløsningen, fremstilles geleringsopløsningen (tabel 1). Forberedelse ~ 2 ml geleringsopløsning er nok til at dække PDMS-brøndene fra en hel 10 cm petriskål. Sørg for at tilføje APS sidst, da det vil starte polymerisation og begynde geleringen.
- Den katalytiske oxidant fortyndes frisk fra pulver (f.eks. 1% TEMPO w/v i vand). Kombiner 1.960 μL monomeropløsning med 30 μL 10% TEMED og 10 μL 1% TEMPO.
- For at undgå polymerisering af hele batchen af geleringsopløsning på én gang skal du arbejde i små partier. Opdel geleringsopløsningen (uden APS) i 125 μL alikvoter mellem de otte rør i en PCR-strimmel.
- Fjern monomeropløsningen fra de tre PDMS-brønde ved hjælp af et vakuum, mens du er forsigtig med ikke at forstyrre embryonerne. Der tilsættes 5 μL APS til et af PCR-rørene, der indeholder geleringsopløsningen, for at initiere polymerisation. Den polymeriserende geleringsopløsning fordeles hurtigt mellem hullerne (~40 μL pr. brønd). Gentag dette, indtil alle brønde og embryoner er dækket.
- Lad prøverne gelere i 1,5-2,5 timer ved 37 °C. Omrør hydrogelerne så ofte for at overvåge polymerisationen. Størknede hydrogeler vil ikke vrikke. Tykkere hydrogeler vil tage længere tid at fuldføre polymerisation og størkne.
6. Fordøjelse og ekspansion
BEMÆRK: Tykkere og større geler vil tage længere tid at udvide, og midten af gelerne kan tage flere timer at udvide sig helt; Dette kan fremskyndes ved at trimme gelens kanter. Når gelerne udvider sig, bliver deres brydningsindeks næsten identisk med vandets, og de bliver meget svære at se.
- Når geleringen er afsluttet, skræl PDMS-brøndene fra dæksedlen, mens du forsøger ikke at forstyrre hydrogelerne. Skær overskydende hydrogelmateriale væk, hvis det ønskes.
- Overfør hydrogelerne (stadig fastgjort til dækslerne) individuelt i brøndene på en plade med seks brønde (figur 2E). Bemærk, at hydrogelerne kan ekspandere lidt under fordøjelsen.
- Gelerne dækkes helt med fordøjelsesbuffer (tabel 1) i 1 time ved 37 °C. Generelt er 30 ml fordøjelsesbuffer tilstrækkelig til at dække gelerne i en 6-brønds plade.
- Efter fordøjelsen overføres hver hydrogel individuelt til en 6 cm petriskål ved at skubbe dem af dækslet. Det kan være nødvendigt at bruge en anden dæksel til at løsne gelen. Fyld hver petriskål med deioniseret vand for at udvide gelen. Skift vandet tre til fire gange i løbet af 1-2 timer, indtil gelerne er fuldt udvidede (forvent en omtrentlig fire gange stigning i bredden).
7. Montering og billeddannelse
BEMÆRK: Ekspanderede hydrogeler består næsten udelukkende af vand, hvilket gør dem næsten gennemsigtige og ekstremt skrøbelige. Gelerne kan manipuleres ved hjælp af lange dæksedler til at flytte dem rundt og samle dem op. Monter og billede kun en eller to geler ad gangen, da geler gradvist frigiver vand og begynder at glide rundt om dæksedlen.
- Brug en Pasteur-pipette til at fjerne så meget overskydende vand fra petriskålen som muligt for at minimere gelernes bevægelse rundt, når de håndteres.
- Manøvrer hver udvidet gel med embryonerne på bundoverfladen på et stort dæksel (f.eks. 24 mm x 40 mm) til billeddannelse.
- Monter hvert dæksel med gel over målet for et omvendt laserscanningskonfokalmikroskop. Find korrekt iscenesatte og orienterede prøver ved hjælp af epifluorescens- eller brightfieldmikroskopi-tilstande på mikroskopet med luftmål med lav forstørrelse (5x eller 10x) eller medium forstørrelse (20x).
- Hvis du vil fotografere i høj opløsning, skal du skifte til et olie- eller vandnedsænkningsmål med høj forstørrelse (60x, 63x eller 100x). Embryonernes overflade skal ligge inden for målets fokusområde (<300 μm fra dæksedlen for et 63x mål) for at blive afbildet.
- Indsaml data fra prøver ved hjælp af laserscanningskonfokal tilstand på mikroskopet. Sørg for at indsamle ikke-mættede billeder med et godt dynamisk område, og brug et passende antal pixel pr. billede til at registrere de maksimalt mulige oplysninger om eksemplet23.
Figur 2: Manuel devitellinisering og arbejde med hydrogeler . (A) Skæring af en agarplade fra en agar/frugtsaftplade. (B) Anbring dobbeltklæbende tape inde i låget på et 6 cm petrifad. C) Fastholdelse af embryoner til det tapede låg. (D) En PDMS-plade med en firkantet brønd klæbet til en 22 mm x 22 mm dæksel. (E) Dæksel med en PDMS-brønd inde i en 6-brønds plade. Klik her for at se en større version af denne figur.
Representative Results
For at karakterisere den generelle effekt af ExM i helmonterede Drosophila-embryoner blev embryolængden langs hoved-til-hale-aksen målt i uudvidede kontrolembryoner versus udvidede embryoner (figur 3A-C). De uudvidede kontrolembryoner blev udsat for de samme fikseringsbetingelser og immunfluorescensmærkningstrin som de ekspanderede embryoner, bortset fra at de blev monteret ved hjælp af et størknet monteringsmedium før billeddannelse. De enkelte ikke-udvidede embryoner strakte sig over ca. halvdelen af et synsfelt, når der blev brugt et 10x mål (figur 3A). I modsætning hertil strakte de udvidede embryoner sig over ca. to fulde synsfelter, når de anvendte det samme 10x mål (figur 3B). For at vurdere, hvordan ekspansionsgraden varierede både inden for og mellem eksperimenter, blev den samme ExM-protokol udført ved tre separate lejligheder, og embryolængden blev målt i tre forskellige geler inden for hvert enkelt eksperiment. Den gennemsnitlige længde fra hoved til hale af de uudvidede kontrolembryoner var 398,8 μm (standardafvigelse [SD] = 22,93 μm; n = 74; Figur 3C). For eksperiment 1, eksperiment 2 og eksperiment 3 var de gennemsnitlige embryolængder henholdsvis 1.596 μm (SD = 159,9 μm; n = 57), 1.868 μm (SD = 150,5 μm; n = 51) og 1.954 μm (SD = 120,3 μm; n = 44), hvilket repræsenterer ekspansionsfaktorer på henholdsvis 4,0 gange, 4,7 gange og 4,9 gange (figur 3C). Den intraeksperimentelle variation mellem gelerne var meget mindre mærkbar end den intereksperimentelle variation, som var ca. 20% (figur 3C). For at vurdere virkningerne af ExM på celle- og embryomorfologi blev et antistof mod adhærensforbindelseskomponenten Par-3 (Bazooka)21 brugt til at mærke de apikale cellemembraner, og vi afbildede de udviklende mundsegmenter i trin 11 Drosophila-embryoner - et stadium med en kompleks segmenteret struktur (figur 3D-F). I kontrolprøven havde cellerne i det maksillære segment en gennemsnitlig bredde på 4, 76 μm (SD = 1, 053 μm, n = 25; Figur 3D, F). I de udvidede prøver, der blev afbildet ved hjælp af det samme 40x mål og zoomfaktor (1x), havde cellerne i det maksillære segment en gennemsnitlig bredde på 19,10 μm (SD = 3,966 μm, n = 18; Figur 3E,F), der repræsenterer en 4,0 gange ekspansion. I overensstemmelse med tidligere rapporter11 var vi derfor i stand til at udvide helmonterede Drosophila-embryoner ca. fire gange i lineære dimensioner ved hjælp af ExM uden prøverivning eller åbenlyse forvrængninger i cellulær eller vævsmorfologi.
Figur 3: Firedobbelt udvidelse af Drosophila-embryoner. (A) Uudvidede og (B) udvidede Drosophila-embryoner afbildet ved hjælp af et 10x mål (0,3 NA) ved 1x zoom. Individuelle synsfelter (FOV) er angivet med stiplede linjer. Embryonerne udtrykte en GFP-mærket version af myosin lyskæde og blev farvet med et anti-GFP-antistof. (C) Kvantificering af embryolængden (langs hoved-til-hale-aksen) i tre hydrogeler pr. forsøg og fra tre separate ExM-forsøg sammenlignet med ikke-udvidede kontroller. (D,E) Maxillære segmenter fra (D) uudvidede og (E) udvidede fase 11 Drosophila-embryoner afbildet ved hjælp af et 40x mål (1,3 NA) ved 1x zoom. Cellekonturerne (adhærenskryds) blev påvist med et anti Par-3/Bazooka antistof (hvidt). (F) Kvantificering af cellebredden (den lange akse) fra ækvivalente grupper af celler fra (D) og (E). Boksplottene i (C) og (F) viser 25., 50. og 75. percentilintervaller; whiskers angiver minimums- og maksimumsværdierne; Symbolerne "+" angiver middelværdien. Klik her for at se en større version af denne figur.
For at demonstrere, at ExM kan bruges til at løse subcellulære detaljer under den typiske diffraktionsgrænse, blev actomyosincytoskelettet afbildet i uudvidet kontrol versus udvidede embryoner, der gennemgår konvergent forlængelse (trin 7). Vævsmodelleringshændelserne for gastrulation og konvergent forlængelse styres stort set af ændringer i lokaliseringen af motorproteinet myosin II24. I det tætpakkede søjleepitel i det tidlige Drosophila ectoderm er det imidlertid vanskeligt at observere mange fine detaljer i myosin II-lokaliseringsmønsteret, selv når det er afbildet ved 158x forstørrelse (63x mål med en 2,5x optisk zoom) - en typisk maksimal opløsningsevne for et laserscanningskonfokalmikroskop. For eksempel, fordi myosin II er et kortikalt protein (placeret direkte under plasmamembranen), var puljer af myosin II25 placeret på hver side af cellecellekontakter ikke opløselige i fase 7-embryoner, og de optrådte som en enkelt linje, hvor naboceller mødtes (figur 4A). I modsætning hertil kunne parallelle linjer af myosin II observeres i udvidede fase 7-embryoner ved celle-celle-kryds, der repræsenterer kortikale proteinpuljer i tilstødende celler (figur 4B). Afstanden mellem parallelle myosin II-linjer i udvidede prøver var 892, 7 nm (SD = 0, 171 nm, n = 12); når det divideres med fire, giver dette en forudsagt afstand på ~ 220 nm mellem myosinlinjerne i tilstødende celler i uudvidede embryoner, hvilket faktisk er lige under diffraktionsgrænsen for et signal detekteret med Alexa 488 (maksimal emission på ~ 520 nm / 2 = 260 nm).
Derudover testede vi også, om ExM kunne bruges til at løse mitokondrienetværksarkitekturen i tæt pakkede celler af gastrulaterende Drosophila-embryoner (trin 6). Mitokondriefunktionen er tæt knyttet til netværksstrukturen (dvs. smeltede vs. fragmenterede organeller), men detaljerne i mitokondrienetværksorganisation er svære at visualisere ved hjælp af konventionel konfokal mikroskopi i celletyper, der ikke er flade og / eller tynde. Mitokondrier er naturligt rige på biotinylerede molekyler, og mitokondrier kan således mærkes i det tidlige Drosophila-embryo ved hjælp af fluorescerende mærket streptavidin26. I de uudvidede fase 6-embryoner mærket med streptavidin-Alexa 488 fremstod signalet som cytoplasmatisk punkter, der ofte var overlappende og vanskelige at løse (figur 4C). I modsætning hertil var mange flere fine detaljer i mitokondrienetværket synlige i de udvidede fase 6-embryoner, og punktering var lettere at løse (figur 4D)26,27. Disse resultater indikerer, at ExM kan bruges til at studere mitokondriel netværksorganisation i celletyper, der ikke traditionelt er egnede til mitokondrieanalyse.
Figur 4: Detaljer om actomyosin cytoskelet og mitokondrier afsløret ved ekspansionsmikroskopi. (A,B) Myosin II-lokalisering i neuroektoderm (germband) celler afbildet med et 63x mål (1,4 NA) ved 2,5x zoom i trin 7 (A) uudvidede og (B) udvidede embryoner. Myosin II blev påvist i embryonerne, der udtrykte en transgen GFP-mærket version af myosin II-regulatoriske lyskæde (sqh-GFP), som blev påvist med et anti-GFP-antistof (rødt). Forskellige puljer af kortikal myosin placeret i tilstødende celler kan løses i det udvidede embryo (hvide pile). (C,D) Mitokondrienetværk i neuroektodermceller afbildet med et 63× mål (1,4 NA) ved 2,5x zoom i trin 6 uudvidede (C) og udvidede (D) embryoner. Mitokondrierne blev påvist med streptavidin-Alexa 488 (grøn), og cellekonturerne blev detekteret med et anti-Par-3/Bazooka-antistof (magenta). Eksperimenterne blev udført med et laserscanningskonfokalmikroskop. Klik her for at se en større version af denne figur.
Tabel 1: Løsningsopskrifter. Sammensætning af de opløsninger, der anvendes i denne protokol, i rækkefølge efter udseende. Alle lagre er likvide, medmindre andet er angivet. Kemikalierne blev resuspenderet eller fortyndet i autoklaveret filtreret vand, medmindre andet er angivet. Klik her for at downloade denne tabel.
Discussion
Manuel devitellinisering
De fleste Drosophila embryofikseringsprotokoller involverer fjernelse af vitellinmembranen ved at ryste faste embryoner i en emulsion af methanol og heptan, hvilket får membranerne til at sprænge via osmotisk brud26. Mens methanolbaseret devitellinisering (methanolpopping) er effektiv og passende til mange applikationer, giver manuel devitellinisering (håndskrælning) nogle væsentlige fordele. For det første giver håndskrælning mulighed for at vælge præcist iscenesatte embryoner til at afvige og indsamle, hvilket i høj grad øger sandsynligheden for at opnå udvidede embryoner i en brugbar orientering ved eksperimentets afslutning. Denne berigelse er kritisk, når man studerer specifikke aspekter af hurtige udviklingsprocesser (f.eks. Mesoderm invagination eller konvergent forlængelse), for hvilke passende iscenesatte embryoner kun kan repræsentere nogle få procent af alle embryoner, selv inden for et stramt timet indsamlingsvindue. Selvfølgelig vil den mere traditionelle bulk-methanolpopping af embryoner fra et tidsindstillet opsamlingsvindue være tilstrækkelig til mange applikationer, og håndskrælning er muligvis ikke den ekstra indsats værd. For det andet påvirkes bindingen af visse primære antistoffer og farvestoffer negativt af prøvens tidligere eksponering for methanol. Af denne grund kan håndskrælning give betydelige stigninger i immunofluorescenssignalkvaliteten sammenlignet med methanol-poppede prøver, hvilket gør det til en nyttig generel teknik for Drosophila-udviklingsbiologer .
Konfokalmikroskopi med høj opløsning i udvidede helmonterede Drosophila-embryoner
Mens udførelse af konfokalmikroskopi med høj opløsning på udvidede prøver konceptuelt er det samme som på uudvidede prøver, introducerer ExM nogle tekniske forhindringer. Især embryoorientering, som er tilfældig, bliver endnu vigtigere, efterhånden som prøvestørrelsen øges, fordi høje forstørrelsesmål med høj NA kun er i stand til at fokusere lys fra prøveområder, der er meget tæt på dæksel27. Derfor er det normalt kun muligt at fokusere på cellerne på eller nær overfladen af embryoet, der endte ved siden af dæksedlen, da gelen blev dannet. Den bedste måde at sikre, at der er prøver med den korrekte retning i slutningen, er at starte ExM-protokollen med en tæt iscenesat samling af faste embryoner (f.eks. ved hjælp af håndskrælning) og at frø mange embryoner i hver brønd (>10). For at visualisere celler dybt inde i embryoet kan det være nødvendigt at bruge mere specialiserede billeddannelsesopsætninger, såsom lysarkmikroskopi28. Derudover finder vi, at billedkvaliteten kan forbedres ved at åbne det konfokale pinhole til en størrelse større end en luftig enhed. Selvfølgelig vil en øget pinhole størrelse komme på bekostning af nedsat maksimal opløsning, men i praksis kan selv små stigninger i pinhole størrelse øge signalintensiteten betydeligt (data ikke vist). Fremtidige undersøgelser bør systematisk behandle pinhole størrelse og effektiv opløsning i ExM-prøver.
Variationer på grundlæggende ExM
Protokollen beskrevet her er et relativt simpelt eksempel på ExM, der skal fungere til mange applikationer og være let at implementere i de fleste udviklingsbiologiske laboratorier. Der er dog adskillige variationer af det grundlæggende koncept for ExM 4,5,7, der kan bruges til at øge signalintensiteten, opnå endnu flere grader af ekspansion og detektere nukleinsyremolekyler såvel som proteiner. I denne protokol inkuberes embryonerne med antistoffer før gelering og ekspansion. Alternativt kan prøverne behandles med antistoffer, efter at de er udvidet 6,30, hvilket kan øge signalintensiteten på grund af øget epitoptilgængelighed og nedsat tab af bundne antistoffer under ekspansionstrinnene. Derudover kan specifikke tværbindingsmolekyler anvendes til at binde RNA-molekyler til hydrogelen for at tillade påvisning af RNA i ekspanderede geler ved anvendelse af hybridiseringskædereaktionsmetode30. Endelig kan prøverne udsættes for flere ekspansionsrunder, som i iterativ ekspansionsmikroskopi (iExM)31, pan-ExM32 og ekspansionsafslørende (ExR)31, for at opnå endnu højere grader af øget opløsning.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at erklære.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Dr. Jennifer Zallen for at levere marsvinets anti-Par-3 primære antistof. Dette arbejde blev støttet af generøs finansiering (1R15GM143729-01 og 1P20GM139768-01 5743) fra National Institute of General Medical Science (NIGMS), et af medlemmerne af National Institutes of Health (NIH), samt Arkansas Biosciences Institute (ABI), som gav delvis finansiering til køb af vores konfokale mikroskop.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| acrylamide | Milipore Sigma | 1490-100ML | |
| ammonium persulfate | VWR | BDH9214-500G | |
| anti-GFP rabbit polyclonal antibody | Torrey Pines BioLabs | TP-401 | |
| anti-guinea pig IgG goat polyclonal antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-11075 | |
| anti-rabbit IgG goat polyclonal antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | |
| bisacrylamide | Research Products International | A11275 | |
| bovine serum albumin (30% solution) | Millipore Sigma | A7284 | |
| conical tubes, 50 mL | fisherscientific | 21008-940 | |
| coverlip glass, square 22 mm | VWR | 48366-227 | |
| coverslip glass, rectangular 40 mm x 24 mm | VWR | 48393-230 | |
| glass capillaries for pulling needles | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
| glass microinjection needles (pre-pulled) | World Precision Instruments | TIP10LT | |
| guanidine HCl | VWR | 101970-606 | |
| heptane | VWR | EM-HX0078-1 | |
| latex pipet bulbs | VWR | 82024-554 | |
| methanol | VWR | BDH1135-4LP | |
| methylacylic acid N-hydroxysuccinimidyl ester | VWR | 730300-1G | |
| microfuge tube, 1.5 mL | VWR | 20170-038 | |
| multi-well plate, 6-well | Genesee | 25-100 | |
| paraformaldehyde (16%, EM-grade, methanol-free) | Electron Microscopy Sciences | 509804487 (Fisher) | |
| Pasteur pipet (2 mL, short tip) | VWR | 14673-010 | |
| PDMS kit (Sylgard 184 Kit, base and curing agent) | VWR | 102092-312 | |
| Petri plates | Genesee | 32-107 | |
| phosphate-buffered saline (10x solution) | VWR | 97063-660 | |
| Poly-L-lysine solution (0.1% solution) | VWR | P8920-1ooML | |
| Proteinase K | Thermo Fisher Scientific | E00491 | |
| scintillation vials (30 mL) | VWR | 66022-128 | |
| sodium acrylate | VWR | 101181-226 | |
| sodium azide (powder) | Millipore Sigma | 71289 | make a 1% w/v working stock; acute POISON at this concentration! |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | S32354 | |
| TAE (50x) | VWR | 97063-692 | |
| tape (double-sided, 1 inch wide) | Scotch 3M | 665 Scotch double sided 1inch/1296 inches Boxed | |
| TEMED | Thermo Fisher Scientific | PI17919 | |
| TEMPO | VWR | EM8.14681.0005 | catalytic oxidant |
| Tween-20 | VWR | 97063-872 | extremely viscous when pure; make a 10% working stock with water |
| Zeiss LSM 900 | Zeiss | Laser scanning microscope used without AiryScan |
References
- Klar, T. A., Jakobs, S., Dyba, M., Egner, A., Hell, S. W. Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (15), 8206-8210 (2000).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
- Betzig, E. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Wassie, A. T., Zhao, Y., Boyden, E. S. Expansion microscopy: principles and uses in biological research. Nature Methods. 16 (1), 33-41 (2019).
- Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S.
- Chen, F., et al. Nanoscale imaging of RNA with expansion microscopy. Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).
- Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).
- Chang, J. -B.
- Cahoon, C. K., et al. Superresolution expansion microscopy reveals the three-dimensional organization of the Drosophila synaptonemal complex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (33), 6857-6866 (2017).
- Mosca, T. J., Luginbuhl, D. J., Wang, I. E., Luo, L. Presynaptic LRP4 promotes synapse number and function of excitatory CNS neurons. eLife. 6, e27347 (2017).
- Jiang, N., et al. Superresolution imaging of Drosophila tissues using expansion microscopy. Molecular Biology of the Cell. 29 (12), 1413-1421 (2018).
- Yu, C. -C. J., et al.
- Freifeld, L., et al. Expansion microscopy of zebrafish for neuroscience and developmental biology studies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (50), E10799-E10808 (2017).
- Tanaka, T., et al.
- Hausen, P., Dreyer, C. The use of polyacrylamide as an embedding medium for immunohistochemical studies of embryonic tissues. Stain Technology. 56 (5), 287-293 (1981).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. The Embryonic Development of Drosophila melanogaster. , Springer Berlin Heidelberg. Berlin, Germany. (2013).
- Chozinski, T. J., et al. Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins. Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).
- Miller, D. F. B., Holtzman, S. L., Kaufman, T. C. Customized microinjection glass capillary needles for P-element transformations in Drosophila melanogaster. BioTechniques. 33 (2), 366-367 (2002).
- Rothwell, W. F., Sullivan, W.
- Cold Spring Harbor Protocols. Drosophila apple juice-agar plates. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2011).
- de Matos Simões, S., et al. Rho-kinase directs bazooka/Par-3 planar polarity during drosophila axis elongation. Developmental Cell. 19 (3), 377-388 (2010).
- Gambarotto, D., et al. Imaging cellular ultrastructures using expansion microscopy (U-ExM). Nature Methods. 16 (1), 71-74 (2019).
- Paddock, S. W., Fellers, T. J., Davidson, M. W. Specimen Preparation and Imaging. Nikon MicroscopyU. , Available from: http://www.microscopyu.com/techniques/confocal/specimen-preparation-and-imaging (2022).
- Paré, A. C., Zallen, J. A. Cellular, molecular, and biophysical control of epithelial cell intercalation. Current Topics in Developmental Biology. 136, 167-193 (2020).
- Royou, A., Field, C., Sisson, J. C., Sullivan, W., Karess, R. Reassessing the role and dynamics of nonmuscle myosin II during furrow formation in early Drosophila embryos. Molecular Biology of the Cell. 15 (2), 838-850 (2004).
- Chowdhary, S., Tomer, D., Dubal, D., Sambre, D., Rikhy, R. Analysis of mitochondrial organization and function in the Drosophila blastoderm embryo. Scientific Reports. 7 (1), 5502 (2017).
- Chowdhary, S., Madan, S., Tomer, D., Mavrakis, M., Rikhy, R. Mitochondrial morphology and activity regulate furrow ingression and contractile ring dynamics in Drosophila cellularization. Molecular Biology of the Cell. 31 (21), 2331-2347 (2020).
- Stelzer, E. H. K., et al.
- Ku, T., et al. Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues. Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).
- Wen, G., et al. A Universal labeling strategy for nucleic acids in expansion microscopy. Journal of the American Chemical Society. 143 (34), 13782-13789 (2021).
- M'Saad, O., Bewersdorf, J. Light microscopy of proteins in their ultrastructural context. Nature Communications. 11 (1), 3850 (2020).
- Sarkar, D. Expansion revealing: Decrowding proteins to unmask invisible brain nanostructures. bioRxiv. , (2020).
