Summary
Les technologies CRISPR-Cas ont révolutionné le domaine de l’édition du génome. Cependant, trouver et isoler la modification souhaitée de la lignée germinale reste un goulot d’étranglement majeur. Par conséquent, ce protocole décrit une méthode robuste pour dépister rapidement les spermatozoïdes de poisson-zèbre injectés par F0 CRISPR pour les modifications de la lignée germinale en utilisant des techniques standard de PCR, de digestion de restriction et d’électrophorèse sur gel.
Abstract
L’avènement des technologies de nucléase CRISPR-Cas ciblées a révolutionné la capacité d’effectuer une édition précise du génome dans les systèmes modèles établis et émergents. Les systèmes d’édition du génome CRISPR-Cas utilisent un ARN guide synthétique (sgRNA) pour cibler une endonucléase associée à CRISPR (Cas) sur des loci d’ADN génomique spécifiques, où l’endonucléase Cas génère une cassure double brin. La réparation des cassures double brin par des mécanismes intrinsèques sujets aux erreurs conduit à des insertions et/ou des délétions, perturbant le locus. Alternativement, l’inclusion de donneurs d’ADN double brin ou d’oligonucléotides d’ADN simple brin dans ce processus peut susciter l’inclusion de modifications précises du génome allant des polymorphismes mononucléotidiques aux petites étiquettes immunologiques ou même aux grandes constructions de protéines fluorescentes. Cependant, un goulot d’étranglement majeur dans cette procédure peut être de trouver et d’isoler la modification souhaitée dans la lignée germinale. Ce protocole décrit une méthode robuste pour le dépistage et l’isolement des mutations germinales à des loci spécifiques chez Danio rerio (poisson zèbre); Cependant, ces principes peuvent être adaptables dans n’importe quel modèle où la collecte de sperme in vivo est possible.
Introduction
Le système CRISPR (Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas est un outil puissant pour effectuer une mutagénèse spécifique aux loci et une édition précise du génome dans le système modèle Danio rerio (poisson zèbre) 1,2,3,4. La Cas-ribonucléoprotéine (RNP) est composée de deux composants principaux : une endonucléase Cas (communément Cas9 ou Cas12a) et un ARN guide synthétique spécifique au locus (ARNs)5. Ensemble, le Cas-RNP génère une rupture double brin (DSB) dans le locus désiré qui peut être réparée par l’un des deux mécanismes de réparation intrinsèques. Le mécanisme de réparation de l’assemblage d’extrémité non homologue (NHEJ) est sujet aux erreurs et entraîne souvent diverses insertions ou suppressions (indels) autour de l’ORD. Ces indels peuvent être délétères s’ils introduisent une mutation de décalage de trame ou un arrêt prématuré dans la séquence protéique résultante. Alternativement, le mécanisme de réparation dirigée par homologie (HDR) utilise un modèle de donneur avec des régions d’homologie entourant le site DSB pour réparer les dommages. Les chercheurs peuvent tirer parti du système HDR pour générer des modifications génomiques précises. Plus précisément, ils peuvent co-injecter une construction de donneur d’ADN double brin qui contient les modifications souhaitées ainsi que les régions d’homologie flanquant le site DSB dans le génome. L’économie d’échelle accrue pour ces composants CRISPR produits commercialement a considérablement réduit les obstacles au dépistage de plusieurs loci et à la mise en place d’efforts à plus grande échelle pour une édition précise du génome. Cependant, dans les modèles animaux à reproduction sexuée, un goulot d’étranglement majeur est l’identification et l’isolement des animaux mutants stables à la lignée germinale.
Le système modèle du poisson zèbre présente plusieurs qualités clés qui améliorent son utilisation dans les études génétiques inverses. Ils sont faciles à élever en grand nombre avec un équipement de base pour les logements aquatiques, et les femelles présentent une fécondité élevée toute l’année6. De plus, leur ponte externe et leur fécondation les rendent propices à la micro-injection de composants CRISPR/Cas. Le Cas-RNP est couramment injecté dans des embryons de poisson-zèbre au stade unicellulaire pour générer des DSB / réparation qui sont, en théorie, hérités par toutes les cellules filles. Cependant, les génomes diploïdes nécessitent deux événements DSB/réparation pour mutagène les deux chromosomes homologues. De plus, bien que le Cas-RNP soit injecté au stade monocellulaire, le DSB/réparation peut ne pas se produire avant des points ultérieurs du développement. Ensemble, ces facteurs contribuent à la nature mosaïque des poissons injectés de F0. Une pratique courante consiste à croiser les poissons injectés par F0 et à dépister la descendance F1 pour détecter les indels / modifications spécifiques. Cependant, comme tous les poissons injectés par F0 ne possèdent pas de mutations germinales, cette pratique entraîne de nombreux croisements improductifs qui ne génèrent pas la modification souhaitée. Le dépistage de la lignée germinale F0 plutôt que du tissu somatique F1 augmente la probabilité d’isoler la modification de la lignée germinale souhaitée et réduit le nombre d’animaux requis dans ce processus.
Le sperme peut facilement être recueilli à partir de poisson-zèbre injecté par F0 sans avoir besoin d’euthanasie. Cette caractéristique permet la cryoconservation et la redérivation de stocks de spermatozoïdes congelés7 mais peut également être exploitée pour dépister, identifier et isoler rapidement les porteurs germinales des mutations génomiques souhaitées 8,9. Brocal et al. (2016) ont précédemment décrit une méthode basée sur le séquençage pour le dépistage des modifications de la lignée germinale chez le poisson-zèbre mâleinjecté F0 10. Bien qu’utile pour identifier les allèles mutés présents dans la lignée germinale, cette approche peut devenir coûteuse à haut débit et peut ne pas être accessible à tous les laboratoires. En revanche, le protocole actuel offre une stratégie accessible et rentable basée sur l’électrophorèse pour identifier les modifications de la lignée germinale. Plus précisément, ce protocole décrit une méthode robuste pour le dépistage et l’isolement des mutations germinales à des loci spécifiques en utilisant l’électrophorèse sur gel d’agarose à haute résolution. En outre, ce protocole décrit une stratégie similaire pour identifier l’intégration réussie d’un concept de donneur contenant des modifications spécifiques. Comme toujours, si des modifications spécifiques sont souhaitées, les stratégies basées sur le séquençage peuvent être exécutées en tandem avec le protocole décrit ci-dessous. Bien que ce protocole soit spécifique au système modèle du poisson zèbre, ces principes devraient être adaptables à tout modèle dans lequel la collecte de spermatozoïdes est une procédure de routine. Ensemble, ces stratégies permettront d’identifier les mâles injectés de F0 avec des indels / modifications germinales qui peuvent être résolus sur un gel après une réaction en chaîne de la polymérase (PCR) standard et / ou un digestion de restriction.
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Protocol
Cette étude a été réalisée conformément aux directives du Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire des National Institutes of Health. Le protocole a été approuvé par le comité de soin et d’utilisation des animaux de l’Université du Texas à Austin (AUP-2021-00254).
1. Conception de l’ARNg pour la mutagénèse CRISPR
- Obtenir la séquence d’exons contenant les loci ciblés.
- Concevoir un ARN guide synthétique (ARNg) avec un site de motif adjacent protospacer (PAM) spécifique à l’endonucléase Cas.
- Si vous co-injectez une construction donneuse, concevez l’ARNg de manière à ce qu’un site de coupe prévu soit aussi proche que possible des modifications souhaitées.
REMARQUE: APE est un logiciel gratuit avec un outil pour trouver des sites Cas9 sgRNA11. Alternativement, des outils tels que CHOPCHOP peuvent être utilisés, qui offre une interface en ligne pour la conception de sgRNAs qui considère les différents sites PAM de Cas9 et d’autres endonucléases Cas12.
- Si vous co-injectez une construction donneuse, concevez l’ARNg de manière à ce qu’un site de coupe prévu soit aussi proche que possible des modifications souhaitées.
- Concevez des amorces avant et arrière pour amplifier la région entourant le site de coupe CRISPR/Cas conçu. Le produit PCR doit avoir une longueur d’environ 200 à 400 paires de bases (pb) pour pouvoir résoudre les petits indels sur un gel plus tard dans le protocole.
REMARQUE: CHOPCHOP11 conçoit automatiquement des amorces pour chaque sgRNA qu’il produit. - Facultatif : Concevez une construction de donneur d’ADN avec la ou les modifications souhaitées.
- Obtenir la séquence génomique de l’exon contenant les loci de la mutation désirée.
REMARQUE: Les séquences introniques peuvent varier d’un individu à l’autre, il est donc préférable d’éviter l’inclusion de séquences introniques dans la construction donneuse, car cela pourrait interférer avec la voie de réparation dépendante de l’homologie. - Si un changement d’acide aminé spécifique est souhaité, modifiez le codon spécifique en conséquence.
REMARQUE: Lorsque vous effectuez ces modifications, tenez compte de la fréquence du codon. Si possible, choisissez un codon avec une utilisation élevée. - Pour empêcher la digestion CRISPR/Cas de la construction du donneur, faites des mutations synonymes supplémentaires qui (i) perturbent le PAM et/ou (ii) perturbent la séquence de l’ARNg, la préférence étant plus élevée accordée aux modifications non synonymes plus près du site PAM.
- Utilisez un outil de recherche de sites de restriction (APE11 a également cette fonctionnalité) pour trouver des sites de restriction uniques (ceux qui ne se produisent qu’une seule fois) dans le produit PCR prédit de la séquence de type sauvage.
- Répétez ce processus pour le produit PCR prévu qui reflète l’intégration réussie du concept du donneur.
- Comparez la liste des sites de restriction entre les séquences de type sauvage et les séquences intégrées au donneur pour trouver un site de restriction présent uniquement dans la séquence modifiée.
- Si aucun site de restriction unique n’est trouvé, continuez à apporter des modifications synonymes dans la construction du donneur jusqu’à ce que cela soit réalisé.
REMARQUE: Si possible, continuez à faire des mutations synonymes qui perturberaient la liaison de l’ARNg à la construction du donneur.
- Coupez la séquence donneuse à une taille gérable (50-100 pb) avec au moins 20 pb d’homologie entourant le site de coupe CRISPR/Cas prévu et les modifications, si possible.
- Obtenir la séquence génomique de l’exon contenant les loci de la mutation désirée.
- Obtenir les oligonucléotides d’ARNg et/ou de donneurs d’ADN conçus, ainsi que toutes les amorces requises pour le génotypage.
NOTE: Pour empêcher la digestion des oligonucléotides donneurs d’ADN par les nucléases, il est recommandé de modifier les trois premières liaisons phosphate aux extrémités 5' et 3' des oligonucléotides d’ADN avec du phosphorothioate. - Injecter 1 nL du mélange d’injection dans des embryons au stade unicellulaire. En règle générale, un mélange d’injection standard contient les éléments suivants:
1 μL d’ARNg spécifique du locus 25 μM
1 μL d’endonucléase Cas9 25 μM
Facultatif : 1 μL de construction donneuse d’ADN 3 μM- Porter le volume total à 5 μL avec 0,1 M de KCl sans RNase.
- Permettre aux individus injectés de F0 de devenir des adultes sexuellement matures. Le protocole restant se concentre sur le dépistage des mâles injectés F0 pour les modifications de la lignée germinale.
2. Mise en place des bassins d’élevage
- Prime F0 mâles pour l’accouplement en installant des bassins de reproduction avec des séparateurs entre les mâles F0 et les femelles.
- Pour minimiser le nombre de bassins de reproduction requis, installez trois mâles en face de deux femelles dans chaque bassin.
- Mettez en place autant de mâles F0 que possible peuvent être efficacement dépistés et logés en tant qu’individus après la collecte du sperme. Le génotype des femelles n’est pas important puisque leurs gamètes ne seront pas collectés au cours de cette procédure.
- Installez un bassin de reproduction de mâles de type sauvage en face des femelles. Les spermatozoïdes de type sauvage serviront de contrôle pour l’interprétation des résultats plus tard dans la procédure.
- Pour minimiser le nombre de bassins de reproduction requis, installez trois mâles en face de deux femelles dans chaque bassin.
- Incuber les bassins de reproduction préparés pendant la nuit.
3. Préparation du matériel pour la procédure de collecte de sperme
- Préparez suffisamment de solution anesthésiante (0,016% de tricaïne-HCl dans l’eau de poisson) pour remplir un petit bol en verre.
- Distribuer 40 μL de NaOH 50 mM dans des tubes PCR de 0,2 mL. Préparez un tube pour chaque échantillon de sperme qui sera prélevé. Entreposer sur de la glace.
- Préparez des réservoirs individuels de 0,8 L pour chaque poisson qui sera échantillonné au cours de la procédure. Ces bassins abriteront les poissons échantillonnés jusqu’à ce que le génotypage soit terminé.
REMARQUE : Il s’agit du principal facteur qui limite le nombre de poissons pouvant faire l’objet d’un dépistage efficace dans le cadre de ce protocole. Prévoir un espace suffisant pour loger les personnes échantillonnées jusqu’à ce que le génotypage soit terminé. - Humidifiez une éponge de 1 pouce x 1 pouce (coupée avec un divot ovale peu profond pour maintenir le côté ventral d’un poisson zèbre mâle vers le haut pendant la procédure) dans de l’eau de poisson et pressez l’excès de liquide.
- Placez l’éponge dans le champ de vision d’un stéréomicroscope à faible grossissement (Figure 1A).
- Positionnez l’éclairage au plafond oblique pour une visualisation optimale.
4. Anesthésier le poisson mâle et recueillir le sperme
- Préparez un tube capillaire propre.
- Secouez doucement le récipient tubulaire pour libérer un seul tube capillaire.
- Placez le tube capillaire dans l’ampoule fournie et mettez-le de côté.
- Transférer un poisson mâle dans la solution anesthésiante préparée (0,016% de tricaïne-HCl dans l’eau de poisson).
- Remuez doucement la solution avec une cuillère à fente pour accélérer le processus d’anesthésie.
- Une fois que le mouvement de l’opercule (branchies) ralentit (environ 1-2 min), procédez à la collecte de sperme.
- Utilisez la cuillère à fente pour transférer le poisson sur une pile propre de serviettes en papier.
- Utilisez la cuillère fendue pour rouler doucement le poisson afin d’éliminer l’excès d’eau.
- Épongez doucement le poisson avec du papier de soie propre et plié pour éliminer l’eau restante.
- Utilisez la cuillère fendue pour transférer le poisson dans l’éponge préparée (figure 1B).
- Placez le côté ventral du poisson vers le haut avec sa tête la plus proche de la main dominante de la personne effectuant la procédure.
- Épongez doucement la zone autour des nageoires anales avec du papier de soie propre et plié.
- Recueillir le sperme.
- À l’aide de l’extrémité du tube capillaire, éloignez doucement les nageoires pelviennes latéralement de la ligne médiane pour exposer le cloaque (Figure 1C).
- Placez l’extrémité du tube capillaire près du cloaque.
- À l’aide de la pince, pressez doucement les flancs du poisson en commençant juste en dessous des branchies et en terminant au cloaque (figure 1C').
- Recueillir le sperme dans le tube capillaire par capillarité. Environ 1 μL est suffisant pour cette procédure (figure 1D).
REMARQUE: Certains laboratoires signalent utiliser des pointes de pipettes p10 au lieu de tubes capillaires pour la collecte de sperme. - Si le sperme n’est pas libéré avec une légère pression, remettez le poisson dans l’eau du système.
- Surveillez la récupération de l’anesthésie.
- Ne pressez pas le poisson fort pour expulser le sperme, car cela pourrait blesser le poisson.
- Reposez le poisson pendant 2 semaines avant d’essayer de recueillir à nouveau du sperme.
- Après la collecte, placez le poisson dans un réservoir d’isolement propre avec de l’eau du système pour le logement individuel.
- Surveillez le poisson pour la récupération de l’anesthésie.
- Reposez le poisson pendant 2 semaines avant d’essayer de recueillir à nouveau du sperme.
- Placez le tube capillaire avec le sperme recueilli dans le tube PCR préparé (avec 40 μL de NaOH 50 mM).
- Pressez l’ampoule en caoutchouc pour expulser l’échantillon recueilli.
- Jetez le tube capillaire usagé dans un conteneur à déchets en verre approuvé.
- Incuber les échantillons sur de la glace jusqu’à ce que tous les mâles aient été pressés.
- Répétez les étapes 4.1 à 4.5 pour chaque homme.
- Étiquetez les réservoirs d’isolement et les échantillons de sperme de manière à ce que les résultats finaux du génotypage des spermatozoïdes puissent être retracés jusqu’à l’individu correspondant présentant des mutations putatives.
- Surveillez tous les individus et assurez-vous qu’ils sont debout et explorent leurs chars avant de remettre les chars sur le système.
- Remettez les femelles utilisées pour l’amorçage dans leurs réservoirs respectifs sur le système.
- Si un poisson ne se remet pas de l’anesthésie après 10 minutes, suivez la procédure d’euthanasie approuvée par l’établissement associé au laboratoire.
- Exemple : Refroidir rapidement la personne dans un bain de glace avec de l’eau de poisson de 2 à 4 °C.
- Éliminer le poisson euthanasié dans un contenant approprié de déchets de carcasses d’animaux conformément à la procédure approuvée par l’établissement associé au laboratoire.
5. Extraction de l’ADN des échantillons de sperme
- Faites tourner brièvement tous les échantillons de sperme dans une minicentrifugeuse et placez les tubes PCR dans un cycleur thermique.
- Fermez le couvercle du cycleur thermique.
- Exécutez les paramètres suivants dans le cycleur thermique :
- Chauffer les échantillons pendant 40 min à 95 °C.
- Refroidir les échantillons à 25 °C.
- Retirez les échantillons du cycleur thermique.
- Avec une pointe de pipette propre pour chaque échantillon, neutraliser le pH en ajoutant 10 μL de Tris-HCl 1 M (tamponné à pH 8).
- Bien mélanger en pipetant de haut en bas.
- Faites tourner brièvement les échantillons dans une minicentrifugeuse.
- Les échantillons d’ADN génomique peuvent être conservés pendant plusieurs jours à 4 °C ou placés à -20 °C pendant 6 mois.
6. Amplification par PCR (et/ou digestion de restriction) du locus désiré
- Amplifiez le locus souhaité à l’aide d’un protocole PCR standard.
- Préchauffez le thermocycleur à la température de dénaturation initiale dans la réaction PCR ci-dessous.
- Préparer un mélange réactionnel de 25 μL pour chaque échantillon de sperme dans des tubes de PCR:
12,5 μL de 2x Taq Polymerase Master Mix
1,5 μL d’amorce directe de 10 μM
1,5 μL d’amorce inverse 10 μM
4,5 μL d’eau exempte de nucléases
5 μL d’échantillon d’ADN de sperme neutralisé - Bien mélanger en pipetant de haut en bas.
- Faites tourner brièvement les échantillons dans une minicentrifugeuse.
- Placez les échantillons dans le thermocycleur préchauffé avec les réglages suivants:
Dénaturation initiale : 95 °C pendant 3 min
35 cycles de dénaturation (95 °C pendant 30 s), de recuit (55 °C pendant 30 s) et d’extension (72 °C pendant 30 s)
Extension finale : 72 °C pendant 5 min
REMARQUE: Il peut être nécessaire d’ajuster la température et/ou le temps d’extension en fonction de la Taq polymérase spécifique et de la longueur prévue du produit d’amplification PCR. - Retirez les échantillons PCR du cycleur thermique.
- Facultatif : Effectuer le condensé de restriction spécifique au donneur sur un petit volume du produit PCR, en laissant au moins 5 à 10 μL de produit de PCR non digéré pour l’électrophorèse sur gel.
- Préparer une réaction de 30 μL dans des tubes de PCR de 0,2 mL :
10 μL de produit PCR non purifié
15 μL d’eau sans nucléase
3 μL de tampon enzymatique de restriction 10x
2 μL d’enzyme de restriction (BstNI est utilisé dans les résultats représentatifs pour l’analyse de l’allèle knock-in dnah10 )
REMARQUE: De nombreuses enzymes de restriction sont encore actives dans un tampon de réaction PCR typique; Cependant, l’ajout d’un tampon de digestion de restriction peut aider à améliorer les résultats. Reportez-vous aux instructions spécifiques du fabricant pour le dépannage en cas de problème. - Bien mélanger en pipetant de haut en bas.
- Faites tourner brièvement les échantillons dans une minicentrifugeuse.
- Placez les échantillons dans un thermocycleur avec les réglages suivants :
- Couper l’amplicon PCR à 60 °C pendant 1 h.
REMARQUE : Il peut être nécessaire d’ajuster la température de coupe et le temps d’incubation en fonction de l’enzyme de restriction spécifique utilisée. - Inactiver l’enzyme de restriction avec la température et le temps d’incubation requis, si le fabricant l’indique.
REMARQUE: L’enzyme BstNI ne nécessite pas d’inactivation thermique.
- Couper l’amplicon PCR à 60 °C pendant 1 h.
- Préparer une réaction de 30 μL dans des tubes de PCR de 0,2 mL :
7. Effectuer une électrophorèse sur gel pour séparer les amplicons PCR de différentes tailles
- Préparer 500 mL de tampon courant 0,5x TBE : ajouter 50 mL de 10x concentré tampon TBE à 450 mL d’eau désionisée.
- Préparer 100 mL de gel d’agarose à 4 % dans 0,5x TBE running buffer : ajouter 4 g d’agarose avec 10 μL de 10 000x gel colorant à 100 mL de 0,5x TBE running buffer. Cuire au micro-ondes jusqu’à ce que la poudre d’agarose soit complètement dissoute.
- Versez la solution de gel dans un cadre de coulée de gel de taille appropriée et insérez le peigne sur un côté du gel.
REMARQUE: Une taille de gel plus grande (recommandée: 15 cm x 15 cm) est avantageuse pour cette procédure, car elle fournit aux amplicons plus d’espace pour se résoudre sur le gel.- Si un produit de digestion de restriction doit être analysé, il est préférable de l’exécuter sur le même gel que le produit PCR afin que les résultats puissent être comparés. Ajustez la taille du peigne si nécessaire pour adapter tous les échantillons sur le gel.
- Laisser le gel à température ambiante jusqu’à solidification. Retirez délicatement le peigne. Retirez délicatement le gel du cadre de coulée.
- Versez la solution de gel dans un cadre de coulée de gel de taille appropriée et insérez le peigne sur un côté du gel.
- Installez la plate-forme d’électrophorèse sur gel.
- Placez le gel dans l’appareil d’électrophorèse de telle sorte que les puits soient les plus proches de l’électrode négative. Versez 0,5x TBE dans la plate-forme d’électrophorèse jusqu’à ce que les puits soient complètement submergés.
- Chargez le gel.
- Chargez 5 μL d’échelle d’ADN dans le premier puits (choisissez une échelle d’ADN qui contient des fragments d’ADN de taille similaire à l’amplicon PCR).
- À l’aide d’une nouvelle pointe de pipette pour chaque échantillon (y compris l’échantillon témoin de type sauvage), chargez 5 à 10 μL du produit de PCR dans les puits restants.
- Facultatif : Si un produit de digestion de restriction doit être analysé, chargez également ces échantillons sur le gel.
REMARQUE: Il est préférable de charger des quantités égales d’ADN entre la PCR et le produit de digestion de restriction. Par exemple, dans le mélange de réaction digestive de restriction de 30 μL, 10 μL de produit PCR ont été ajoutés. Par conséquent, la concentration d’ADN des 15 μL de produit de digestion était comparable à celle de 5 μL de produit de PCR non purifié.
- Exécutez le gel.
- Connectez les électrodes à l’appareil d’électrophorèse sur gel et appliquez 150 V pendant au moins 1 h pour assurer une séparation adéquate des amplicons.
- Imagez le gel pour voir les bandes d’ADN.
REMARQUE: Les loci fortement mutagènes ciblant CRISPR fonctionneront comme plusieurs tailles de bande représentant une combinaison d’allèles d’insertion/délétion avec les amplicons de type sauvage.- Si les bandes de gel ne sont pas résolues après 1 h, appliquer 150 V au gel pendant des intervalles de 15 minutes jusqu’à ce que les bandes soient suffisamment séparées sur le gel.
- Facultatif : Si vous recherchez l’insertion d’une modification précise telle qu’un SNP, une étiquette d’épitope ou une étiquette fluorescente, examinez l’ADN des spermatozoïdes avec des méthodes de PCR spécifiques à la modification souhaitée. Par exemple, lors de l’identification d’un site de restriction spécifique au donneur, une bande supplémentaire sera présente dans le produit de digestion de restriction par rapport au produit PCR de l’échantillon de sperme.
8. Isoler les allèles stables de la lignée germinale
- Après 2 semaines de repos de la procédure de compression du sperme, croisez les individus F0 dont l’ADN génomique du sperme contenait les modifications souhaitées.
NOTE: La génération de spermatozoïdes à partir de clones individuels de spermatogonies peut être cyclique chez le poisson zèbre; Ainsi, l’allèle désiré pourrait ne pas produire de spermatozoïdes au moment de l’outcross. Pour cette raison, il peut être nécessaire d’effectuer un croisement supplémentaire plus d’une fois pour isoler l’allèle impliqué par le dépistage initial. - Une fois que les poissons croisés F1 sont sexuellement matures, procéder à des méthodes de génotypage standard (par exemple, ADN à nageoire) en utilisant le même protocole de PCR et d’électrophorèse sur gel effectué lors du criblage de l’ADN génomique du sperme.
- Sanger séquence les produits PCR pour identifier les individus F1 avec la même modification souhaitée.
- Facultatif : Si la modification souhaitée introduit ou perturbe un site de restriction, filtrez avec un protocole de résumé de restriction approprié.
- Hétérozygotes F1 croisés avec la même modification souhaitée.
- Examiner la descendance F2 pour le phénotype et/ou les modifications génomiques attendues.
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Representative Results
Les approches expérimentales décrites dans ce protocole permettent l’identification plus rapide des modifications du génome ou des allèles délétères putatifs en se concentrant sur l’analyse de milliers de génomes dérivés de la collecte de spermatozoïdes masculins injectés F0. La figure 2 montre comment interpréter les résultats obtenus à l’aide de ce protocole.
Pour générer des mutations dans le locus p2ry12, des embryons de poisson-zèbre au stade unicellulaire ont été injectés avec de l’endonucléase Cas9 et un ARNg spécifique de p2ry12 (Figure 2B, surbrillance grise). Les poissons injectés de F0 ont été mis dans le système jusqu’à maturité sexuelle, et le sperme a été recueilli sur six mâles individuels. L’ADN a été extrait des échantillons de sperme en utilisant une chaleur élevée et des conditions de base (extraction d’ADN HotSHOT) et neutralisé avant l’amplification PCR du locus p2ry12. Les produits PCR ont été séparés sur un gel d’agarose à pourcentage élevé (4%) pendant 1,5 h à haute tension (150 V). Dans cet exemple, l’amplicon de type sauvage fonctionnait comme une seule bande lumineuse d’environ 250 paires de bases de longueur (Figure 2C ; WT). En revanche, les amplicons mâles injectés F0 contenant des indels fonctionnaient sur le gel en bandes multiples (Figure 2C; voies #1-2, #5-8). Alternativement, les amplicons mâles injectés F0 mutés pourraient fonctionner comme une seule bande avec une mobilité de gel altérée (non montré dans l’exemple p2ry12, mais évident dans le produit PCR du dnah10 F0-mâle #2; Figure 2E). Il était moins clair sur l’exemple de gel p2ry12 si l’échantillon #3 et l’échantillon #4 contenaient des indels par rapport à la bande de type sauvage, de sorte que ces individus ne sont peut-être pas les meilleurs candidats fondateurs. L’isolement des allèles des mâles F0 avec des altérations d’amplicon plus distinctives est préférable pour la propagation des porteurs stables de la lignée germinale car ils sont facilement notés sur du gel d’agarose à 4%. Par exemple, l’échantillon de sperme F0-male #6 semblait contenir une grande délétion dans l’un des allèles (Figure 2C; voie 6; bande brillante avec mobilité accrue du gel). Si ce grand allèle de délétion était sélectionné pour la génération F1, il serait facilement distinguable de l’allèle WT sur un gel d’agarose à 4%. Alternativement, si une collection d’allèles différents est souhaitée, le F0-male #7 pourrait être un candidat fondateur efficace puisque son produit PCR semblait contenir plusieurs allèles discrets de diverses mobilités. Une fois qu’un mâle fondateur est sélectionné, l’allèle désiré peut être isolé en croisant l’individu vers la souche originale de type sauvage utilisée pour les injections.
Pour générer une mutation knock-in spécifique dans le gène dnah10, des embryons de poisson-zèbre au stade unicellulaire ont été injectés avec de l’endonucléase Cas9, un ARNg spécifique de dnah10 (Figure 2D ; surbrillance grise) et un oligonucléotide donneur d’ADN contenant la modification souhaitée (Figure 2D ; rouge) et un site de restriction BstNI spécifique au donneur (Figure 2D parenthèses). Cette conception permet d’identifier facilement l’intégration du donneur avec un condensé de restriction après PCR. De plus, en modifiant les paires de bases dans le site de reconnaissance de l’ARNg (Figure 2D ; surbrillance grise), cette conception empêche la digestion Cas9 de la séquence donneuse. Une fois que le poisson injecté par F0 a atteint sa maturité sexuelle, le sperme a été recueilli et l’ADN a été extrait à l’aide de la méthode du tir à chaud. À partir de ces échantillons, le locus dnah10 a été amplifié par PCR, et les produits ont été séparés sur un gel d’agarose à pourcentage élevé (4%) pendant 1 h à haute tension (150 V). Dans cet exemple, l’amplicon de type sauvage fonctionnait comme une seule bande lumineuse d’environ 400 paires de bases de longueur (Figure 2E ; panneau supérieur : WT). En revanche, les amplicons mâles injectés F0 contenant des indels fonctionnaient en bandes multiples (Figure 2E; panneau supérieur: voies #1, #4 et #5) ou en bande unique avec une mobilité réduite du gel (Figure 2E; panneau supérieur: voie #2). Pour déterminer si l’un des échantillons de sperme contenait des allèles intégrés au donneur, les produits PCR ont été digérés avec l’enzyme de restriction BstNI pendant 1 h, et le produit a été administré sur un gel d’agarose à 4% pendant 1 h à haute tension (150 V). La comparaison du produit de PCR non digéré (Figure 2D; panneau supérieur) au produit digéré (Figure 2D; panneaux inférieurs) révèle des échantillons avec une intégration probable de la construction du donneur. Dans cet exemple, le mâle #1 injecté de F0 avait une bande supplémentaire dans le produit digéré qui n’était pas présente dans le produit de PCR (Figure 2D; panneau inférieur : voie #1, encerclée). Par conséquent, ce mâle représente le meilleur candidat fondateur pour établir une lignée mutante avec le knock-in souhaité.
Une fois que le mâle porteur F0 putatif est croisé, la séquence de l’allèle doit être vérifiée dans la descendance F1. Il est suggéré de séquencer directement les amplicons dérivés du poisson hétérozygote F1, puis d’effectuer des méthodes d’analyse des allèles hétérozygotes telles que Poly Peak Parser13 ou d’utiliser une variété de méthodes de séquençage de nouvelle génération telles que le séquençage MiSeq 14 ou Hi-Tom15. Il s’agit d’une approche nécessaire et complémentaire pour s’assurer que la modification précise ou la mutation délétère d’indel est réellement en train de devenir germinale et n’est pas seulement un artefact de l’analyse de l’électrophorèse sur gel. En effet, l’utilisation d’approches de séquençage de nouvelle génération pour séquencer l’ADN des spermatozoïdes à partir de porteurs F0 peut facilement être utilisée à la place de l’analyse par électrophorèse sur gel décrite dans ce protocole. Cependant, avoir une méthode de génotypage sur gel d’agarose facilement notable est une approche plus économique et égalitaire pour la communauté mondiale des chercheurs sur le poisson zèbre.
Figure 1: Configuration de la procédure de compression des spermatozoïdes . (A) L’éponge est positionnée sous un stéréomicroscope à faible grossissement avec éclairage au plafond. (B) L’éponge humidifiée de 1 po x 1, coupée avec un divot ovale (ligne pointillée), est utilisée pour maintenir le côté ventral du poisson mâle anesthésié vers le haut pendant la procédure. (C) Anatomie de la face ventrale du poisson mâle anesthésié représentant les nageoires anales (af, rose), les nageoires pelviennes (pf, bleu) et le cloaque (flèche), où les spermatozoïdes seront expulsés pendant la procédure. (C') Des pinces filtrantes sont utilisées pour presser doucement le poisson mâle anesthésié des branchies au cloaque, tandis que le sperme expulsé est aspiré dans une pipette en verre par capillarité (flèche blanche). (D) Un tube capillaire contenant suffisamment de spermatozoïdes expulsés (liquide opaque; crochet noir) pour l’extraction et l’analyse de l’ADN en aval. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Flux de travail et résultats représentatifs. (A) Déroulement général du protocole. (B) Conception représentative du site sgRNA p2ry12 (surbrillance grise) avec un site PAM spécifique à Cas9 (souligné). (C) Résultats représentatifs de l’électrophorèse sur gel à 4% après 1,5 h à 150 V. Témoins de type sauvage (WT) et échantillons de sperme masculin injectés par F0-p2ry12 CRISPR (1-8) après amplification par PCR. (D) Conception représentative du site dnah10 sgRNA (surbrillance grise) avec un site PAM spécifique à Cas9 (souligné) près du codon ciblé (gras). Séquence donneuse d’ADN avec l’édition de codon souhaitée (en gras rouge) et le site de restriction BstNI (parenthèses avec apostrophe marquant le site de coupe). (E) Résultats représentatifs de l’électrophorèse sur gel à 4 % après 1 h à 150 V. En haut : produit PCR de type sauvage (WT) et F0 dnah10 échantillons de sperme masculin injectés par CRISPR (1-5). En bas: produit de digestion de restriction BstNI des échantillons ci-dessus. L’échantillon 1 démontre l’intégration réussie de la construction donneuse basée sur la bande supplémentaire après digestion (cercle rouge). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Ce protocole décrit une méthode pour caractériser rapidement des modifications présumées du génome ou des mutations ciblées à l’aide de la technologie CRISPR-Cas par analyse ciblée sur les génomes des spermatozoïdes masculins F0. Ce protocole devrait se prêter à d’autres modèles animaux où le sperme est facilement disponible pour l’échantillonnage sans euthanasie. Cette méthode augmentera le débit de criblage pour les modifications souhaitées et est particulièrement utile pour identifier les rares événements de knock-in médiés par HDR. Cette approche sert également à réduire le nombre d’animaux de laboratoire utilisés pour trouver une modification stable de la lignée germinale en facilitant le criblage rapide de milliers de génomes potentiels dans un échantillon de sperme d’un porteur F0 putatif, ce qui contraste avec les approches plus traditionnelles qui peuvent nécessiter le criblage de centaines d’embryons dérivés de croisements de porteurs F0 putatifs.
Ce protocole s’appuie sur les protocoles établis pour la collecte de sperme chez le poisson zèbre 7,10,14,16,17,18 en incluant une technique reproductible pour identifier les modifications de la lignée germinale à l’aide de l’électrophorèse sur gel à haute résolution. Cette approche peut facilement être intégrée dans n’importe quel flux de travail CRISPR/Cas standard afin d’augmenter le débit pour le criblage et l’isolement des modifications du génome cible. De plus, ce protocole convient aux laboratoires dotés de personnel ayant une formation et une expérience variées, ainsi qu’aux laboratoires d’enseignement. Cependant, notre méthode de collecte de sperme n’est pas suffisante pour la cryoconservation, qui a été décrite de manière experte dans des publications précédentes10,17.
Ce protocole utilise une électrophorèse sur gel d’agarose à haute résolution pour identifier les porteurs mâles putatifs de l’indel désiré et des mutations génomiques précises. Cependant, l’ADN génomique des spermatozoïdes se prête à une myriade d’autres approches, y compris l’analyse de fragments fluorescents ou le séquençage à code-barres14, l’analyse de fusion à haute résolution18 ou la simple détection par amplicon de marqueurs fluorescents ou d’épitopes à l’aide d’approches standard d’électrophorèse sur gel. La validation en aval de tous les allèles à l’aide d’approches telles que le séquençage basé sur Sanger ou la prochaine génération doit être effectuée avant de commencer les travaux expérimentaux sur les allèles putatifs. En effet, les méthodes existantes de dépistage des mutations chez les embryons utilisant l’approche de séquençage de nouvelle génération14 pourraient contourner la nécessité d’une analyse sur les gels d’agarose, qui est décrite dans ce protocole. Cependant, avoir une méthode de génotypage gélule est une approche plus rentable et égalitaire à considérer étant donné que tous les laboratoires n’ont pas facilement accès à des méthodes de séquençage de nouvelle génération bon marché pendant les phases d’isolement et expérimentales de travail avec chaque souche mutante.
En résumé, ce protocole fournit des instructions étape par étape pour le dépistage reproductible des génomes de spermatozoïdes à partir de mâles édités par CRISPR / Cas, de sorte que moins de croisements et moins de criblage PCR des embryons sont nécessaires pour dépister les modifications souhaitées. L’application de cette méthode réduira le nombre de poissons qui doivent être créés et analysés pour identifier avec succès les allèles édités d’intérêt, ce qui réduit également le temps et le coût du personnel pour générer des lignées stables.
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Disclosures
Aucun.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier Anna Hindes de la faculté de médecine de l’Université de Washington pour ses efforts initiaux dans l’obtention d’ADN génomique de sperme de bonne qualité en utilisant la méthode du coup chaud. Ce travail a été financé par l’Institut national de l’arthrite et des maladies musculo-squelettiques et cutanées des National Institutes of Health sous attribution (R01AR072009 à R.S.G.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose powder | Fisher BioReagents | BP1356-100 | |
| Breeding tanks | Carolina Biological | 161937 | |
| BstNI Restriction Enzyme | NEB | R0168S | |
| Cas9 Endonuclease | IDT | 1081060 | |
| DNA Ladder, 100 bp | Thermo Scientific | FERSM0241 | |
| dnah10 donor construct | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry. Phosphorothioate bond on the donor at the first three phosphate bonds on both the 5’ and 3’ ends (5'-CCTCTCTCCCTTTCAGAAGCTTC TGCTCATCCGCTGCTTCTGCCT GGACCGAGTGTACCGTGCCGTC AGTGATTACGTCACGC-3') |
|
| dnah10 forward primer | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry (5'-CATGGAACTCTTTCCTAATGAGT TTGGC-3') |
|
| dnah10 reverse primer | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry ('5-AGTAGAGATCACACATCAACAGA ATACAGC-3') |
|
| dnah10 synthetic sgRNA | Synthego | Synthetic sgRNA, target sequence: 5'-GCTCATCCGCTGCTTCAGGC-3' | |
| Electrophoresis power supply | Thermo Scientific | 105ECA-115 | |
| Filter forceps | Millipore | XX6200006P | |
| Fish (system) water | Generic | n/a | |
| Gel electrophoresis system (including casting frame, comb, and electrophoresis chamber) | Thermo Scientific | B2 | |
| Gel imaging light box | Azure Biosystems | AZI200-01 | |
| Gel stain, 10000X | Invitrogen | S33102 | |
| Glass bowl, 250 mL | Generic | n/a | |
| Isolation tanks, 0.8 L | Aquaneering | ZT080 | |
| Microcap capillary tube with bulb, 20 µL | Drummond | 1-000-0020/CA | |
| Minicentrifuge | Bio-Rad | 12011919EDU | |
| Micropipettes, various with appropriate tips | Generic | n/a | |
| Microwave | Generic | n/a | |
| Nuclease free water | Promega | P119-C | |
| Paper towels | Generic | n/a | |
| PCR tubes, 0.2 mL | Bioexpress | T-3196-1 | |
| Plastic spoon, with drilled holes/slots | Generic | n/a | |
| KCl solution, 0.2 M RNAse Free | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| p2ry12 forward primer | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry (5'-CCCAAATGTAATCCTGACCAGT -3') |
|
| p2ry12 reverse primer | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry (5'-CCAGGAACACATTAACCTGGAT -3') |
|
| p2ry12 synthetic sgRNA | Synthego | Synthetic sgRNA, target sequence: 5'-GGCCGCACGAGGTCTCCGCG-3' | |
| Restriction Enzyme 10X Buffer | NEB | B6003SVIAL | |
| NaOH solution, 50 mM | Thermo Scientific | S318; 424330010 | |
| Sponge, 1-inch x 1-inch cut with small oval divot | Generic | n/a | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi 508 | |
| Taq polymerase master mix, 2X | Promega | M7122 | |
| TBE Buffer Concentrate, 10X | VWR | E442 | |
| Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| Tissue paper | Fisher Scientific | 06-666 | |
| Tricaine-methanesulfonate solution (Syncaine, MS-222), 0.016% in fish water (pH 7.0±0.2) | Syndel | 200-266 | |
| Tris Base, 1M (Buffered with HCl to ph 8.0) | Promega | H5131 |
References
- Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome Research. 24 (1), 142-153 (2014).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nature Biotechnology. 31 (3), 227-229 (2013).
- Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (34), 13904-13909 (2013).
- Troutwine, B. R., et al. The Reissner fiber is highly dynamic in vivo and controls morphogenesis of the spine. Current Biology. 30 (12), 2353-2362 (2020).
- Xu, Y., Li, Z. CRISPR-Cas systems: Overview, innovations and applications in human disease research and gene therapy. Computational and Structural Biotechnology Journal. 18, 2401-2415 (2020).
- Creaser, C. W. The technic of handling the zebrafish (Brachydanio rerio) for the production of eggs which are favorable for embryological research and are available at any specified time throughout the year. Copeia. 1930 (4), 159-161 (1934).
- Carmichael, C., Westerfiel, M., Varga, Z. M. Cryopreservatin and in vitro fertilization at the zebrafish international resource center. Methods in Molecular Biology. 546, 45-65 (2009).
- Wang, Y., Troutwine, B. R., Zhang, H., Gray, R. S. The axonemal dynein heavy chain 10 gene is essential for monocilia motility and spine alignment in zebrafish. Developmental Biology. 482, 82-90 (2021).
- Gray, R. S., et al. Postembryonic screen for mutations affecting spine development in zebrafish. Developmental Biology. 471, 18-33 (2021).
- Brocal, I., et al. Efficient identification of CRISPR/Cas9-induced insertions/deletions by direct germline screening in zebrafish. BMC Genomics. 17, 259 (2016).
- Davis, M. W., Jorgensen, E. M. ApE, A Plasmid Editor: A freely available DNA manipulation and visualization program. Frontiers in Bioinformatics. 2, 816619 (2022).
- Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: Expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47, 171-174 (2019).
- Hill, J. T., et al. Poly Peak Parser: Method and software for identification of unknown indels using sanger sequencing of polymerase chain reaction products. Developmental Dynamics. 243 (12), 1632-1636 (2014).
- Varshney, G. K., et al. High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9. Genome Research. 25 (7), 1030-1042 (2015).
- Liu, Q., et al. Hi-TOM: A platform for high-throughput tracking of mutations induced by CRISPR/Cas systems. Science China. Life Sciences. 62 (1), 1-7 (2019).
- Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. Efficient production and identification of CRISPR/Cas9-generated gene knockouts in the model system Danio rerio. Journal of Visualized Experiments. (138), e56969 (2018).
- Draper, B. W., Moens, C. B. A high-throughput method for zebrafish sperm cryopreservation and in vitro fertilization. Journal of Visualized Experiments. (29), e1395 (2009).
- Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants. Developmental Dynamics. 238 (12), 3168-3174 (2009).
