Summary
Las tecnologías CRISPR-Cas han revolucionado el campo de la edición del genoma. Sin embargo, encontrar y aislar la edición de la línea germinal deseada sigue siendo un cuello de botella importante. Por lo tanto, este protocolo describe un método robusto para examinar rápidamente el esperma de pez cebra inyectado con CRISPR F0 para ediciones de la línea germinal utilizando técnicas estándar de PCR, digestión de restricción y electroforesis en gel.
Abstract
El advenimiento de las tecnologías de nucleasa CRISPR-Cas dirigidas ha revolucionado la capacidad de realizar una edición precisa del genoma en sistemas modelo establecidos y emergentes. Los sistemas de edición del genoma CRISPR-Cas utilizan un ARN guía sintético (sgRNA) para dirigir una endonucleasa asociada a CRISPR (Cas) a loci de ADN genómico específico, donde la endonucleasa Cas genera una ruptura de doble cadena. La reparación de roturas de doble cadena mediante mecanismos intrínsecos propensos a errores conduce a inserciones y / o eliminaciones, interrumpiendo el locus. Alternativamente, la inclusión de donantes de ADN bicatenario u oligonucleótidos de ADN monocatenario en este proceso puede provocar la inclusión de ediciones precisas del genoma que van desde polimorfismos de un solo nucleótido hasta pequeñas etiquetas inmunológicas o incluso grandes construcciones de proteínas fluorescentes. Sin embargo, un cuello de botella importante en este procedimiento puede ser encontrar y aislar la edición deseada en la línea germinal. Este protocolo describe un método robusto para detectar y aislar mutaciones de la línea germinal en loci específicos en Danio rerio (pez cebra); Sin embargo, estos principios pueden ser adaptables en cualquier modelo donde sea posible la recolección de espermatozoides in vivo .
Introduction
El sistema CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas es una poderosa herramienta para realizar mutagénesis específica de loci y edición precisa del genoma en el sistema modelo Danio rerio (pez cebra) 1,2,3,4. La Cas-ribonucleoproteína (RNP) está compuesta por dos componentes principales: una endonucleasa Cas (comúnmente Cas9 o Cas12a) y un ARN guía sintético específico del locus (sgRNA)5. Juntos, el Cas-RNP genera una rotura de doble cadena (DSB) en el locus deseado que puede ser reparada por uno de los dos mecanismos de reparación intrínsecos. El mecanismo de reparación de unión de extremos no homólogos (NHEJ) es propenso a errores y a menudo resulta en una variedad de inserciones o eliminaciones (indeles) alrededor del DSB. Estos indeles pueden ser perjudiciales si introducen una mutación de cambio de marco o una parada prematura en la secuencia de proteínas resultante. Alternativamente, el mecanismo de reparación dirigida por homología (HDR) utiliza una plantilla de donante con regiones de homología que rodean el sitio DSB para reparar el daño. Los investigadores pueden aprovechar el sistema HDR para generar ediciones genómicas precisas. Específicamente, pueden coinyectar una construcción donante de ADN de doble cadena que contiene las ediciones deseadas, así como las regiones de homología que flanquean el sitio DSB en el genoma. El aumento de la economía de escala para estos componentes CRISPR producidos comercialmente ha reducido en gran medida las barreras para la detección de múltiples loci y para establecer esfuerzos a mayor escala para la edición precisa del genoma. Sin embargo, en modelos animales que se reproducen sexualmente, un cuello de botella importante es la identificación y el aislamiento de animales mutantes estables en la línea germinal.
El sistema modelo de pez cebra exhibe varias cualidades clave que mejoran su uso en estudios genéticos inversos. Son fáciles de criar en grandes cantidades con equipos básicos de alojamiento acuático, y las hembras exhiben una alta fecundidad durante todo el año6. Además, su puesta de huevos externa y fertilización los hacen susceptibles a la microinyección de componentes CRISPR / Cas. El Cas-RNP se inyecta comúnmente en embriones de pez cebra en etapa de una célula para generar DSB / reparación que, en teoría, es heredada por todas las células hijas. Sin embargo, los genomas diploides requieren dos eventos DSB/reparación para mutagenizar ambos cromosomas homólogos. Además, aunque Cas-RNP se inyecta en la etapa de una célula, el DSB/reparación puede no ocurrir hasta puntos posteriores en el desarrollo. Juntos, estos factores contribuyen a la naturaleza mosaica de los peces inyectados con F0. Una práctica común es cruzar peces inyectados con F0 y examinar a la progenie F1 en busca de indeles / ediciones específicas. Sin embargo, dado que no todos los peces inyectados con F0 poseen mutaciones de la línea germinal, esta práctica da como resultado muchos cruces improductivos que no generan la edición deseada. El cribado de la línea germinal F0 en lugar del tejido somático F1 aumenta la probabilidad de aislar la edición de la línea germinal deseada y reduce el número de animales requeridos en este proceso.
El esperma se puede recolectar fácilmente del pez cebra inyectado con F0 sin necesidad de eutanasia. Esta característica permite la criopreservación y rederivación de espermatozoides congelados7, pero también puede ser explotada para detectar, identificar y aislar rápidamente a los portadores de la línea germinal de las mutaciones genómicas deseadas 8,9. Brocal et al. (2016) describieron previamente un método basado en la secuenciación para detectar ediciones de la línea germinal en peces cebra machos inyectados con F010. Aunque es útil para identificar los alelos mutados presentes en la línea germinal, este enfoque puede llegar a ser costoso en alto rendimiento y puede no ser accesible para todos los laboratorios. En contraste, el protocolo actual ofrece una estrategia basada en electroforesis accesible y rentable para identificar ediciones de la línea germinal. Específicamente, este protocolo describe un método robusto para detectar y aislar mutaciones de la línea germinal en loci específicos utilizando electroforesis en gel de agarosa de alta resolución. Además, este protocolo describe una estrategia similar para identificar la integración exitosa de una construcción donante que contiene ediciones específicas. Como siempre, si se desean ediciones específicas, las estrategias basadas en secuenciación se pueden realizar en conjunto con el protocolo que se describe a continuación. Aunque este protocolo es específico del sistema modelo de pez cebra, estos principios deben ser adaptables a cualquier modelo en el que la recolección de esperma sea un procedimiento de rutina. Juntas, estas estrategias permitirán la identificación de machos inyectados con F0 con indeles/ediciones de la línea germinal que pueden resolverse en un gel después de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) estándar y / o la digestión de restricción.
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Protocol
Este estudio se llevó a cabo de acuerdo con las directrices de la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. El protocolo fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Texas en Austin (AUP-2021-00254).
1. Diseño del sgRNA para la mutagénesis CRISPR
- Obtenga la secuencia de exones que contiene los loci objetivo.
- Diseñar un ARN guía sintético (sgRNA) con un sitio de motivo adyacente protoespaciador (PAM) que sea específico para la endonucleasa Cas.
- Si se coinyecta una construcción donante, diseñe el sgRNA para que tenga un sitio de corte previsto lo más cerca posible de las ediciones deseadas.
NOTA: APE es un software gratuito con una herramienta para encontrar sitios Cas9 sgRNA11. Alternativamente, se pueden utilizar herramientas como CHOPCHOP, que ofrece una interfaz en línea para el diseño de sgRNAs que considera los diferentes sitios PAM de Cas9 y otras endonucleasas Cas12.
- Si se coinyecta una construcción donante, diseñe el sgRNA para que tenga un sitio de corte previsto lo más cerca posible de las ediciones deseadas.
- Diseñe imprimaciones hacia adelante y hacia atrás para amplificar la región que rodea el sitio de corte CRISPR / Cas diseñado. El producto de PCR debe tener aproximadamente 200-400 pares de bases (pb) de longitud para poder resolver pequeños indeles en un gel más adelante en el protocolo.
NOTA: CHOPCHOP11 diseña automáticamente cebadores para cada sgRNA que emite. - Opcional: Diseñe una construcción de donante de ADN con la(s) edición(es) deseada(s).
- Obtener la secuencia genómica del exón que contiene los loci de la mutación deseada.
NOTA: Las secuencias intrónicas pueden variar entre individuos, por lo que es mejor evitar la inclusión de secuencias intrónicas en la construcción del donante, ya que esto podría interferir con la vía de reparación dependiente de la homología. - Si se desea un cambio de aminoácido específico, modifique el codón específico en consecuencia.
NOTA: Al realizar estos cambios, tenga en cuenta la frecuencia del codón. Si es posible, elija un codón con alto uso. - Para evitar la digestión CRISPR/Cas de la construcción donante, realice mutaciones sinónimas adicionales que (i) interrumpan el PAM y/o (ii) interrumpan la secuencia de sgRNA, con mayor preferencia en hacer cambios no sinónimos más cerca del sitio PAM.
- Use un buscador de sitios de restricción (APE11 también tiene esta característica) para encontrar sitios de restricción únicos (aquellos que solo ocurren una vez) en el producto de PCR predicho de la secuencia de tipo salvaje.
- Repita este proceso para el producto de PCR previsto que refleja la integración exitosa de la construcción del donante.
- Compare la lista de sitios de restricción entre las secuencias de tipo salvaje e integradas por donantes para encontrar un sitio de restricción que solo esté presente en la secuencia editada.
- Si no se encuentra un sitio de restricción único, continúe haciendo cambios sinónimos dentro de la construcción del donante hasta que esto se logre.
NOTA: Si es posible, continúe haciendo mutaciones sinónimas que interrumpan la unión del sgRNA a la construcción del donante.
- Recorte la secuencia donante a un tamaño manejable (50-100 pb) con al menos 20 pb de homología que rodea el sitio de corte CRISPR/Cas previsto y edite, si es posible.
- Obtener la secuencia genómica del exón que contiene los loci de la mutación deseada.
- Obtener los oligonucleótidos donantes de ARNg y/o ADN diseñados, así como los cebadores necesarios para el genotipado.
NOTA: Para evitar la digestión de los oligonucleótidos donantes de ADN por nucleasas, se recomienda modificar los tres primeros enlaces fosfato en los extremos 5' y 3' de los oligonucleótidos de ADN con fosforotioato. - Inyecte 1 nL de la mezcla de inyección en embriones en etapa unicelular. Normalmente, una mezcla de inyección estándar contiene lo siguiente:
1 μL de sgRNA específico del locus de 25 μM
1 μL de 25 μM Cas9 endonucleasa
Opcional: 1 μL de 3 μM de construcción de donante de ADN- Llevar el volumen total a 5 μL con 0,1 M de KCl libre de RNasa.
- Permita que los individuos inyectados con F0 se conviertan en adultos sexualmente maduros. El protocolo restante se centra en la detección de los machos inyectados con F0 para las ediciones de la línea germinal.
2. Instalación de los tanques de cría
- Principales machos F0 para aparearse mediante la creación de tanques de cría con divisores entre los machos y hembras F0.
- Para minimizar el número de tanques de reproducción requeridos, coloque tres machos frente a dos hembras en cada tanque.
- Configure tantos machos F0 como puedan ser efectivamente examinados y alojados como individuos después de la recolección de esperma. El genotipo de las hembras no es importante ya que sus gametos no se recogerán durante este procedimiento.
- Establezca un tanque de cría de machos de tipo salvaje frente a las hembras. Los espermatozoides de tipo salvaje servirán como control para la interpretación de los resultados más adelante en el procedimiento.
- Para minimizar el número de tanques de reproducción requeridos, coloque tres machos frente a dos hembras en cada tanque.
- Incubar los tanques de cría preparados durante la noche.
3. Preparación de los materiales para el procedimiento de recolección de esperma
- Prepare suficiente solución anestésica (0.016% tricaína-HCl en agua de pescado) para llenar un tazón de vidrio pequeño.
- Dispensar 40 μL de NaOH de 50 mM en tubos de PCR de 0,2 ml. Prepare un tubo para cada muestra de esperma que se recolectará. Almacenar en hielo.
- Prepare tanques individuales de 0.8 L para cada pez que se muestreará durante el procedimiento. Estos tanques albergarán los peces muestreados hasta que se complete el genotipado.
NOTA: Este es el factor principal que limita el número de peces que pueden ser examinados eficazmente en este protocolo. Asegurar un espacio adecuado para alojar a los individuos muestreados hasta que se complete el genotipado. - Humedezca una esponja de 1 pulgada x 1 pulgada (cortada con un divot poco profundo de forma ovalada para sostener un lado ventral del pez cebra macho hacia arriba durante el procedimiento) en agua de pescado y exprima el exceso de líquido.
- Coloque la esponja en el campo de visión de un microscopio estereoscópico a baja ampliación (Figura 1A).
- Coloque la iluminación superior oblicua para una visualización óptima.
4. Anestesiar al pez macho y recoger el esperma
- Prepare un tubo capilar limpio.
- Agite suavemente el recipiente del tubo para liberar un solo tubo capilar.
- Coloque el tubo capilar en la bombilla provista y déjelo a un lado.
- Transfiera un pez macho a la solución anestésica preparada (0.016% tricaine-HCl en agua de pescado).
- Revuelva suavemente la solución con una cuchara ranurada para acelerar el proceso de anestesia.
- Una vez que el movimiento del opérculo (branquia) se ralentice (aproximadamente 1-2 min), proceda con la recolección de esperma.
- Use la cuchara ranurada para transferir el pescado a una pila limpia de toallas de papel.
- Use la cuchara ranurada para enrollar suavemente el pescado para eliminar el exceso de agua.
- Seque suavemente el pescado con papel de seda limpio y doblado para eliminar el agua restante.
- Use la cuchara ranurada para transferir el pescado a la esponja preparada (Figura 1B).
- Coloque el pez con el lado ventral hacia arriba con la cabeza más cerca de la mano dominante de la persona que realiza el procedimiento.
- Seque suavemente el área alrededor de las aletas anales con papel de seda limpio y doblado.
- Recoge los espermatozoides.
- Usando el extremo del tubo capilar, mueva suavemente las aletas pélvicas lateralmente lejos de la línea media para exponer la cloaca (Figura 1C).
- Coloque el extremo del tubo capilar cerca de la cloaca.
- Usando las pinzas, apriete suavemente los lados del pez comenzando justo debajo de las branquias y terminando en la cloaca (Figura 1C').
- Recoger los espermatozoides en el tubo capilar por acción capilar. Aproximadamente 1 μL es suficiente para este procedimiento (Figura 1D).
NOTA: Algunos laboratorios informan el uso de puntas de pipeta p10 en lugar de tubos capilares para la recolección de esperma. - Si los espermatozoides no se liberan con una presión suave, devuelva los peces al agua del sistema.
- Monitoree la recuperación de la anestesia.
- No apriete al pez con fuerza para expulsar el esperma, ya que esto puede dañar a los peces.
- Descanse el pez durante 2 semanas antes de intentar recolectar esperma nuevamente.
- Después de la recolección, coloque los peces en un tanque de aislamiento limpio con agua del sistema para alojamiento individual.
- Controle a los peces para la recuperación de la anestesia.
- Descanse el pez durante 2 semanas antes de intentar recolectar esperma nuevamente.
- Coloque el tubo capilar con los espermatozoides recolectados en el tubo de PCR preparado (con 40 μL de NaOH de 50 mM).
- Apriete el bulbo de goma para expulsar la muestra recolectada.
- Deseche el tubo capilar usado en un contenedor de residuos de vidrio aprobado.
- Incubar las muestras en hielo hasta que todos los machos hayan sido exprimidos.
- Repita los pasos 4.1-4.5 para cada macho individual.
- Etiquete los tanques de aislamiento y las muestras de esperma de modo que los resultados finales del genotipado de espermatozoides puedan rastrearse hasta el individuo correspondiente con mutaciones putativas.
- Monitoree a todos los individuos y asegúrese de que estén en posición vertical y exploren sus tanques antes de volver a colocar los tanques en el sistema.
- Coloque a las hembras utilizadas para cebar de nuevo en sus respectivos tanques en el sistema.
- Si algún pez no se recupera de la anestesia después de 10 minutos, siga el procedimiento de eutanasia aprobado por la institución asociada con el laboratorio.
- Ejemplo: Enfríe rápidamente al individuo en un baño de hielo con agua de pescado que está a 2-4 ° C.
- Deseche los peces sacrificados en un contenedor apropiado de residuos de cadáveres de animales de acuerdo con el procedimiento aprobado por la institución asociada al laboratorio.
5. Extracción de ADN de las muestras de esperma
- Haga girar brevemente todas las muestras de esperma en una minicentrífuga y coloque los tubos de PCR en un termociclador.
- Cierre la tapa del termociclador.
- Ejecute los siguientes ajustes en el termociclador:
- Calentar las muestras durante 40 min a 95 °C.
- Enfriar las muestras a 25 °C.
- Retire las muestras del termociclador.
- Con una punta de pipeta limpia para cada muestra, neutralizar el pH añadiendo 10 μL de Tris-HCl 1 M (tamponado a pH 8).
- Mezclar bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
- Gire brevemente las muestras en una minicentrífuga.
- Las muestras de ADN genómico pueden almacenarse durante varios días a 4 °C o colocarse a -20 °C durante un máximo de 6 meses.
6. Amplificación por PCR (y/o digestión de restricción) del locus deseado
- Amplíe el locus deseado utilizando un protocolo de PCR estándar.
- Precaliente el termociclador a la temperatura de desnaturalización inicial en la reacción de PCR que se muestra a continuación.
- Preparar una mezcla de reacción de 25 μL para cada muestra de esperma en tubos de PCR:
12.5 μL de 2x Taq Polymerase Master Mix
1,5 μL de imprimación directa de 10 μM
1,5 μL de cebador inverso de 10 μM
4,5 μL de agua libre de nucleasas
5 μL de muestra de ADN de esperma neutralizado - Mezclar bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
- Gire brevemente las muestras en una minicentrífuga.
- Coloque las muestras en el termociclador precalentado con los siguientes ajustes:
Desnaturalización inicial: 95 °C durante 3 min
35 ciclos de desnaturalización (95 °C durante 30 s), recocido (55 °C durante 30 s) y extensión (72 °C durante 30 s)
Extensión final: 72 °C durante 5 min
NOTA: Puede ser necesario ajustar la temperatura y/o el tiempo de extensión dependiendo de la polimerasa Taq específica y la longitud esperada del producto de amplificación por PCR. - Retire las muestras de PCR del termociclador.
- Opcional: Realice el resumen de restricción específico del donante en un pequeño volumen del producto de PCR, dejando al menos 5-10 μL de producto de PCR no digerido para electroforesis en gel.
- Preparar una reacción de 30 μL en tubos de PCR de 0,2 ml:
10 μL de producto de PCR no purificado
15 μL de agua libre de nucleasas
3 μL de tampón enzimático de restricción 10x
2 μL de enzima de restricción (BstNI se utiliza en los resultados representativos para analizar el alelo knock-in dnah10 )
NOTA: Muchas enzimas de restricción todavía están activas en un tampón de reacción de PCR típico; Sin embargo, la adición de un búfer de resumen de restricción puede ayudar a mejorar los resultados. Consulte las instrucciones específicas del fabricante para solucionar problemas si se produce algún problema. - Mezclar bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
- Gire brevemente las muestras en una minicentrífuga.
- Coloque las muestras en un termociclador con los siguientes ajustes:
- Cortar el amplicón de PCR a 60 °C durante 1 h.
NOTA: Es posible que sea necesario ajustar la temperatura de corte y el tiempo de incubación para la enzima de restricción específica que se utiliza. - Inactive la enzima de restricción con la temperatura y el tiempo de incubación requeridos, si así lo indica el fabricante.
NOTA: La enzima BstNI no requiere inactivación por calor.
- Cortar el amplicón de PCR a 60 °C durante 1 h.
- Preparar una reacción de 30 μL en tubos de PCR de 0,2 ml:
7. Realización de electroforesis en gel para separar amplicones de PCR de diferentes tamaños
- Prepare 500 ml de tampón de funcionamiento 0.5x TBE: agregue 50 ml de concentrado tampón 10x TBE a 450 ml de agua desionizada.
- Prepare 100 ml de gel de agarosa al 4% en tampón de ejecución TBE 0.5x: agregue 4 g de agarosa con 10 μL de tinción de gel 10,000x a 100 ml de tampón de ejecución TBE 0.5x. Microondas hasta que el polvo de agarosa esté completamente disuelto.
- Vierta la solución de gel en un marco de fundición de gel del tamaño adecuado e inserte el peine en un lado del gel.
NOTA: Un tamaño de gel más grande (recomendado: 15 cm x 15 cm) es ventajoso para este procedimiento, ya que proporciona a los amplicones más espacio para resolver el gel.- Si se va a analizar un producto de digestión de restricción, es mejor ejecutarlo en el mismo gel que el producto de PCR para que se puedan comparar los resultados. Ajuste el tamaño del peine según sea necesario para que quepan todas las muestras en el gel.
- Deje el gel a temperatura ambiente hasta que se solidifique. Retire con cuidado el peine. Retire con cuidado el gel del marco de fundición.
- Vierta la solución de gel en un marco de fundición de gel del tamaño adecuado e inserte el peine en un lado del gel.
- Configure el equipo de electroforesis en gel.
- Coloque el gel en el equipo de electroforesis de tal manera que los pocillos estén más cerca del electrodo negativo. Vierta el tampón de ejecución 0.5x TBE en la plataforma de electroforesis hasta que los pozos estén completamente sumergidos.
- Cargue el gel.
- Cargue 5 μL de escalera de ADN en el primer pocillo (elija una escalera de ADN que contenga fragmentos de ADN que sean similares en tamaño al amplicón de PCR).
- Utilizando una nueva punta de pipeta para cada muestra (incluida la muestra de control de tipo salvaje), cargue 5-10 μL del producto de PCR en los pocillos restantes.
- Opcional: Si se va a analizar un producto de digestión de restricción, cargue también estas muestras en el gel.
NOTA: Es mejor cargar cantidades iguales de ADN entre la PCR y el producto de digestión de restricción. Por ejemplo, en la mezcla de reacción de digestión de restricción de 30 μL, se agregaron 10 μL de producto de PCR. Por lo tanto, la concentración de ADN de los 15 μL de producto digerido fue comparable a los 5 μL del producto de PCR no purificado.
- Ejecute el gel.
- Conecte los electrodos al equipo de electroforesis en gel y aplique 150 V durante al menos 1 h para garantizar una separación adecuada de los amplicones.
- Imagen del gel para ver las bandas de ADN.
NOTA: Los loci fuertemente mutagenizados dirigidos a CRISPR se ejecutarán como múltiples tamaños de banda que representan una combinación de alelos de inserción/deleción con los amplicones de tipo salvaje.- Si las bandas de gel no se resuelven después de 1 h, aplicar 150 V al gel durante intervalos de 15 minutos hasta que las bandas estén suficientemente separadas en el gel.
- Opcional: Si se busca la inserción de una edición precisa, como un SNP, una etiqueta de epítopo o una etiqueta fluorescente, examine el ADN del esperma con métodos de PCR específicos para la edición deseada. Por ejemplo, al identificar un sitio de restricción específico del donante, una banda adicional estará presente en el producto de digestión de restricción en comparación con el producto de PCR de la muestra de esperma.
8. Aislar alelos estables de la línea germinal
- Después de 2 semanas de descanso del procedimiento de compresión de espermatozoides, cruce a los individuos F0 cuyo ADN genómico de esperma contenía las ediciones deseadas.
NOTA: La generación de espermatozoides a partir de clones individuales de espermatogonias puede ser cíclica en el pez cebra; Por lo tanto, el alelo deseado podría no estar produciendo espermatozoides en el momento del cruce. Por esta razón, es posible que se deba realizar un cruce adicional más de una vez para aislar el alelo implicado por el cribado inicial. - Una vez que los peces cruzados F1 estén sexualmente maduros, proceda con métodos de genotipado estándar (por ejemplo, ADN de clip de aleta) utilizando el mismo protocolo de PCR y electroforesis en gel realizado durante la detección del ADN genómico del esperma.
- Sanger secuencia los productos de PCR para identificar a los individuos F1 con la misma edición deseada.
- Opcional: Si la edición deseada introduce o interrumpe un sitio de restricción, filtre con un protocolo de resumen de restricción adecuado.
- Heterocigotos F1 cruzados con la misma edición deseada.
- Examine la progenie F2 para el fenotipo esperado y / o ediciones genómicas.
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Representative Results
Los enfoques experimentales descritos en este protocolo permiten la identificación más rápida de ediciones del genoma o alelos deletéreos putativos al centrarse en el análisis de miles de genomas derivados de la colección de espermatozoides masculinos inyectados con F0. La figura 2 destaca cómo interpretar los resultados obtenidos utilizando este protocolo.
Para generar mutaciones en el locus p2ry12, se inyectaron embriones de pez cebra en etapa unicelular con endonucleasa Cas9 y un sgRNA específico de p2ry12 (Figura 2B, resaltado gris). Los peces inyectados con F0 se colocaron en el sistema hasta la madurez sexual, y se recolectó esperma de seis machos individuales. El ADN se extrajo de las muestras de esperma utilizando altas temperaturas y condiciones básicas (extracción de ADN HotSHOT) y se neutralizó antes de la amplificación por PCR del locus p2ry12. Los productos de PCR se separaron en un gel de agarosa de alto porcentaje (4%) durante 1,5 h a un alto voltaje (150 V). En este ejemplo, el amplicón de tipo salvaje corrió como una sola banda brillante de alrededor de 250 pares de bases de longitud (Figura 2C; WT). En contraste, los amplicones masculinos inyectados con F0 que contenían indeles corrían sobre el gel como múltiples bandas (Figura 2C; carriles #1-2, #5-8). Alternativamente, los amplicones masculinos inyectados en F0 mutados podrían funcionar como una sola banda con movilidad de gel alterada (no se muestra en el ejemplo de p2ry12, pero evidente en el producto de PCR del dnah10 F0-macho #2; Figura 2E). Fue menos claro en el gel de ejemplo p2ry12 si la muestra # 3 y la muestra # 4 contenían indeles en comparación con la banda de tipo salvaje, por lo que estos individuos pueden no ser los mejores candidatos fundadores. El aislamiento de alelos de machos F0 con alteraciones de amplicón más distintivas es mejor para propagar portadores estables de la línea germinal, ya que se puntúan fácilmente en gel de agarosa al 4%. Por ejemplo, la muestra de esperma F0-male #6 parecía contener una gran deleción en uno de los alelos (Figura 2C; carril 6; banda brillante con mayor movilidad del gel). Si se seleccionara este alelo de deleción grande en la generación F1, sería fácilmente distinguible del alelo WT en un gel de agarosa al 4%. Alternativamente, si se desea una colección de alelos diferentes, el F0-macho #7 podría ser un candidato fundador efectivo ya que su producto de PCR parecía contener varios alelos discretos de varias movilidades. Una vez que se selecciona un macho fundador, el alelo deseado se puede aislar cruzando al individuo de vuelta a la cepa original de tipo salvaje utilizada para las inyecciones.
Para generar una mutación knock-in específica en el gen dnah10, se inyectaron embriones de pez cebra en estadio unicelular con endonucleasa Cas9, un sgRNA específico de dnah10 (Figura 2D; resaltado gris) y un oligonucleótido donante de ADN que contenía la edición deseada (Figura 2D; rojo) y un sitio de restricción BstNI específico del donante (Figura 2D , corchetes). Este diseño permite la fácil identificación de la integración del donante con un resumen de restricción después de la PCR. Además, al alterar los pares de bases dentro del sitio de reconocimiento de sgRNA (Figura 2D; resaltado gris), este diseño evita la digestión Cas9 de la secuencia donante. Una vez que el pez inyectado con F0 alcanzó la madurez sexual, se recolectó esperma y se extrajo ADN utilizando el método de inyección caliente. A partir de estas muestras, el locus dnah10 se amplificó mediante PCR, y los productos se separaron en un gel de agarosa de alto porcentaje (4%) durante 1 h a un alto voltaje (150 V). En este ejemplo, el amplicón de tipo comodín corrió como una sola banda brillante de alrededor de 400 pares de bases de longitud (Figura 2E; panel superior: WT). En contraste, los amplicones masculinos inyectados con F0 que contenían indeles corrieron como múltiples bandas (Figura 2E; panel superior: carriles # 1, # 4 y # 5) o como una sola banda con movilidad de gel disminuida (Figura 2E; panel superior: carril # 2). Para determinar si alguna de las muestras de semen contenía alelos integrados por donantes, los productos de PCR se digirieron con la enzima de restricción BstNI durante 1 h, y el producto se ejecutó con un gel de agarosa al 4% durante 1 h a alto voltaje (150 V). La comparación del producto de PCR no digerido (Figura 2D; panel superior) con el producto digerido (Figura 2D; paneles inferiores) revela muestras con probable integración de la construcción del donante. En este ejemplo, el macho #1 inyectado con F0 tenía una banda adicional en el producto digerido que no estaba presente en el producto de PCR (Figura 2D; panel inferior: carril #1, en un círculo). Por lo tanto, este macho representa el mejor candidato fundador para establecer una línea mutante con el golpe deseado.
Una vez que el macho portador F0 putativo está cruzado, el alelo debe ser verificado por secuencia en la progenie F1. Se sugiere secuenciar directamente los amplicones derivados del pez heterocigoto F1 seguido de la realización de métodos de análisis de alelos heterocigotos como Poly Peak Parser13 o utilizando una variedad de métodos basados en secuenciación de próxima generación como MiSeq 14 o secuenciación Hi-Tom15. Este es un enfoque necesario y complementario para garantizar que la edición precisa o la mutación indel perjudicial realmente vaya a la línea germinal y no sea solo un artefacto del análisis de electroforesis en gel. De hecho, el uso de enfoques de secuenciación de próxima generación para secuenciar el ADN de los espermatozoides de los portadores F0 se puede utilizar fácilmente en lugar del análisis de electroforesis en gel descrito en este protocolo. Sin embargo, tener un método de genotipado de gel de agarosa fácilmente puntuable es un enfoque más económico e igualitario para la comunidad global de investigadores de pez cebra.
Figura 1: Configuración para el procedimiento de compresión de espermatozoides . (A) La esponja se coloca debajo de un microscopio estereoscópico a bajo aumento con iluminación superior. (B) La esponja humedecida 1 en x 1 en, cortada con un divot ovalado (línea discontinua), se usa para mantener el lado ventral del pez macho anestesiado hacia arriba durante el procedimiento. (C) Anatomía del lado ventral del pez macho anestesiado que representa las aletas anales (af, rosa), las aletas pélvicas (pf, azul) y la cloaca (flecha), donde se expulsará el esperma durante el procedimiento. (C') Las pinzas de filtro se utilizan para apretar suavemente el pez macho anestesiado desde las branquias hasta la cloaca, mientras que el esperma expulsado se introduce en una pipeta de vidrio por acción capilar (flecha blanca). (D) Un tubo capilar que contiene suficientes espermatozoides expulsados (líquido opaco; soporte negro) para la extracción y análisis de ADN aguas abajo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Flujo de trabajo y resultados representativos . (A) Flujo de trabajo general del protocolo. (B) Diseño representativo del sitio sgRNA p2ry12 (resaltado gris) con un sitio PAM específico de Cas9 (subrayado). (C) Resultados representativos de la electroforesis en gel al 4% después de 1,5 h a 150 V. Control de tipo salvaje (WT) y muestras de esperma masculino inyectadas con CRISPR F0-p2ry12 (1-8) después de la amplificación por PCR. (D) Diseño representativo del sitio sgRNA dnah10 (resaltado gris) con un sitio PAM específico de Cas9 (subrayado) cerca del codón objetivo (negrita). Secuencia donante de ADN con la edición de codón deseada (negrita roja) y el sitio de restricción BstNI (corchetes con apóstrofe que marcan el sitio de corte). (E) Resultados representativos de la electroforesis en gel al 4% después de 1 h a 150 V. Arriba: producto de PCR de muestras de semen masculino inyectado con CRISPR de tipo salvaje (WT) y F0 dnah10 (1-5). Abajo: Producto de digestión de restricción BstNI de las muestras anteriores. La muestra 1 demuestra la integración exitosa de la construcción donante basada en la banda adicional después de la digestión (círculo rojo). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este protocolo describe un método para caracterizar rápidamente ediciones putativas del genoma o mutaciones dirigidas utilizando la tecnología CRISPR-Cas mediante un análisis centrado en los genomas de espermatozoides masculinos F0. Este protocolo debe ser susceptible a otros modelos animales donde el esperma esté fácilmente disponible para el muestreo sin eutanasia. Este método aumentará el rendimiento de la detección de las ediciones deseadas y es especialmente útil para identificar eventos aleatorios raros mediados por HDR. Este enfoque también sirve para reducir el número de animales experimentales utilizados para encontrar una edición estable de la línea germinal al facilitar la detección rápida de potencialmente miles de genomas en una muestra de esperma de un portador F0 putativo, lo que contrasta con los enfoques más tradicionales que pueden requerir el cribado de cientos de embriones derivados de cruces de portadores F0 putativos.
Este protocolo se basa en protocolos establecidos para la recolección de espermatozoides en pez cebra 7,10,14,16,17,18 al incluir una técnica reproducible para identificar ediciones de la línea germinal mediante electroforesis en gel de alta resolución. Este enfoque se puede incorporar fácilmente en cualquier flujo de trabajo estándar de CRISPR / Cas para aumentar el rendimiento para la detección y el aislamiento de las ediciones del genoma objetivo. Además, este protocolo es apropiado para laboratorios con personal con una amplia gama de capacitación y experiencia, así como para laboratorios de enseñanza. Sin embargo, nuestro método de recolección de espermatozoides no es suficiente para la criopreservación, que ha sido descrita por expertos en publicaciones anteriores10,17.
Este protocolo utiliza una electroforesis en gel de agarosa de alta resolución para identificar supuestos portadores masculinos de mutaciones genómicas precisas e indel deseadas. Sin embargo, el ADN genómico del esperma es susceptible a una miríada de otros enfoques, incluido el análisis de fragmentos fluorescentes o la secuenciación de códigos de barras14, el análisis de fusión de alta resolución18 o la detección simple de amplicones de etiquetas fluorescentes o epítopos utilizando enfoques estándar de electroforesis en gel. La validación posterior de todos los alelos utilizando enfoques como la secuenciación basada en Sanger o de próxima generación debe realizarse antes de comenzar el trabajo experimental sobre alelos putativos. De hecho, los métodos existentes para el cribado de mutaciones en embriones utilizando el enfoque de secuenciación de próxima generación14 podrían eludir la necesidad de análisis en geles de agarosa, que se describe en este protocolo. Sin embargo, tener un método de genotipado con puntuación de gel es un enfoque más rentable e igualitario a considerar, dado que no todos los laboratorios tienen fácil acceso a métodos de secuenciación baratos de próxima generación durante las fases de aislamiento y experimentación de trabajo con cada cepa mutante.
En resumen, este protocolo proporciona instrucciones paso a paso para la detección reproducible de genomas de espermatozoides de hombres editados por CRISPR / Cas, de modo que se necesitan menos cruces y menos exámenes de PCR de embriones para detectar las ediciones deseadas. La aplicación de este método disminuirá el número de peces que deben crearse y analizarse para identificar con éxito los alelos de interés editados, lo que también reduce el tiempo y el costo del personal para generar líneas estables.
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Disclosures
Ninguno.
Acknowledgments
Nos gustaría agradecer a Anna Hindes de la Facultad de Medicina de la Universidad de Washington por sus esfuerzos iniciales para obtener ADN genómico de esperma de buena calidad utilizando el método de inyección caliente. Este trabajo fue financiado por el Instituto Nacional de Artritis y Enfermedades Musculoesqueléticas y de la Piel de los Institutos Nacionales de Salud bajo Premio (R01AR072009 a R.S.G.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose powder | Fisher BioReagents | BP1356-100 | |
| Breeding tanks | Carolina Biological | 161937 | |
| BstNI Restriction Enzyme | NEB | R0168S | |
| Cas9 Endonuclease | IDT | 1081060 | |
| DNA Ladder, 100 bp | Thermo Scientific | FERSM0241 | |
| dnah10 donor construct | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry. Phosphorothioate bond on the donor at the first three phosphate bonds on both the 5’ and 3’ ends (5'-CCTCTCTCCCTTTCAGAAGCTTC TGCTCATCCGCTGCTTCTGCCT GGACCGAGTGTACCGTGCCGTC AGTGATTACGTCACGC-3') |
|
| dnah10 forward primer | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry (5'-CATGGAACTCTTTCCTAATGAGT TTGGC-3') |
|
| dnah10 reverse primer | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry ('5-AGTAGAGATCACACATCAACAGA ATACAGC-3') |
|
| dnah10 synthetic sgRNA | Synthego | Synthetic sgRNA, target sequence: 5'-GCTCATCCGCTGCTTCAGGC-3' | |
| Electrophoresis power supply | Thermo Scientific | 105ECA-115 | |
| Filter forceps | Millipore | XX6200006P | |
| Fish (system) water | Generic | n/a | |
| Gel electrophoresis system (including casting frame, comb, and electrophoresis chamber) | Thermo Scientific | B2 | |
| Gel imaging light box | Azure Biosystems | AZI200-01 | |
| Gel stain, 10000X | Invitrogen | S33102 | |
| Glass bowl, 250 mL | Generic | n/a | |
| Isolation tanks, 0.8 L | Aquaneering | ZT080 | |
| Microcap capillary tube with bulb, 20 µL | Drummond | 1-000-0020/CA | |
| Minicentrifuge | Bio-Rad | 12011919EDU | |
| Micropipettes, various with appropriate tips | Generic | n/a | |
| Microwave | Generic | n/a | |
| Nuclease free water | Promega | P119-C | |
| Paper towels | Generic | n/a | |
| PCR tubes, 0.2 mL | Bioexpress | T-3196-1 | |
| Plastic spoon, with drilled holes/slots | Generic | n/a | |
| KCl solution, 0.2 M RNAse Free | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| p2ry12 forward primer | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry (5'-CCCAAATGTAATCCTGACCAGT -3') |
|
| p2ry12 reverse primer | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry (5'-CCAGGAACACATTAACCTGGAT -3') |
|
| p2ry12 synthetic sgRNA | Synthego | Synthetic sgRNA, target sequence: 5'-GGCCGCACGAGGTCTCCGCG-3' | |
| Restriction Enzyme 10X Buffer | NEB | B6003SVIAL | |
| NaOH solution, 50 mM | Thermo Scientific | S318; 424330010 | |
| Sponge, 1-inch x 1-inch cut with small oval divot | Generic | n/a | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi 508 | |
| Taq polymerase master mix, 2X | Promega | M7122 | |
| TBE Buffer Concentrate, 10X | VWR | E442 | |
| Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| Tissue paper | Fisher Scientific | 06-666 | |
| Tricaine-methanesulfonate solution (Syncaine, MS-222), 0.016% in fish water (pH 7.0±0.2) | Syndel | 200-266 | |
| Tris Base, 1M (Buffered with HCl to ph 8.0) | Promega | H5131 |
References
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