Summary
CRISPR-Cas-teknologier har revolusjonert feltet genomredigering. Imidlertid er det fortsatt en stor flaskehals å finne og isolere ønsket kimlinjeredigering. Derfor beskriver denne protokollen en robust metode for raskt å screene F0 CRISPR-injisert sebrafisksæd for germline-redigeringer ved bruk av standard PCR, restriksjonsfordøyelse og gelelektroforeseteknikker.
Abstract
Ankomsten av målrettede CRISPR-Cas-nukleaseteknologier har revolusjonert evnen til å utføre presis genomredigering i både etablerte og nye modellsystemer. CRISPR-Cas-genomredigeringssystemer bruker et syntetisk guide-RNA (sgRNA) for å målrette en CRISPR-assosiert (Cas) endonuklease til spesifikk genomisk DNA loci, hvor Cas-endonukleasen genererer et dobbeltstrengbrudd. Reparasjon av dobbeltstrengsbrudd ved iboende feilutsatte mekanismer fører til innsettinger og/eller delesjoner, noe som forstyrrer locus. Alternativt kan inkluderingen av dobbeltstrengede DNA-donorer eller enkeltstrengede DNA-oligonukleotider i denne prosessen fremkalle inkluderingen av presise genomredigeringer som spenner fra enkeltnukleotidpolymorfismer til små immunologiske koder eller til og med store fluorescerende proteinkonstruksjoner. En stor flaskehals i denne prosedyren kan imidlertid være å finne og isolere ønsket redigering i kimlinjen. Denne protokollen skisserer en robust metode for screening og isolering av kimlinjemutasjoner på spesifikke steder i Danio rerio (sebrafisk); Imidlertid kan disse prinsippene være tilpasningsdyktige i enhver modell der in vivo sædinnsamling er mulig.
Introduction
CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas-systemet er et kraftig verktøy for å utføre loci-spesifikk mutagenese og presis genomredigering i Danio rerio (sebrafisk) modellsystem 1,2,3,4. Cas-ribonukleoprotein (RNP) består av to hovedkomponenter: en Cas-endonuklease (vanligvis Cas9 eller Cas12a) og et locus-spesifikt syntetisk guide-RNA (sgRNA)5. Sammen genererer Cas-RNP en dobbeltstrenget pause (DSB) i ønsket locus som kan repareres av en av to innebygde reparasjonsmekanismer. Den ikke-homologe endekoblingsmekanismen (NHEJ) er feilutsatt og resulterer ofte i en rekke innsettinger eller slettinger (indels) rundt DSB. Disse indels kan være skadelige hvis de introduserer en frameshift-mutasjon eller for tidlig stopp i den resulterende proteinsekvensen. Alternativt bruker den homologirettede reparasjonsmekanismen (HDR) en donormal med områder av homologi rundt DSB-området for å reparere skaden. Forskere kan dra nytte av HDR-systemet for å generere presise genomiske redigeringer. Spesielt kan de co-injisere en dobbeltstrenget DNA-donorkonstruksjon som inneholder de ønskede redigeringene, samt regioner av homologi som flankerer DSB-nettstedet i genomet. Den økte stordriftsfordelen for disse kommersielt produserte CRISPR-komponentene har i stor grad redusert barrierene for screening av flere steder og for å sette opp større innsats for presis genomredigering. I seksuelt reproduserende dyremodeller er imidlertid en stor flaskehals identifisering og isolering av kimlinjestabile mutante dyr.
Sebrafiskmodellsystemet viser flere viktige egenskaper som forbedrer bruken i omvendte genetiske studier. De er enkle å bake i stort antall med grunnleggende vannhusutstyr, og kvinner viser høy fecundity hele åretrundt 6. Dessuten gjør deres eksterne egglegging og befruktning dem mottagelige for mikroinjeksjon av CRISPR / Cas-komponenter. Cas-RNP injiseres vanligvis i encellestadiet sebrafiskembryoer for å generere DSB/reparasjon som i teorien arves av alle dattercellene. Diploide genomer krever imidlertid to DSB/reparasjonshendelser for å mutagenisere begge homologe kromosomer. Videre, selv om Cas-RNP injiseres på encellestadiet, kan DSB / reparasjon ikke skje før senere i utviklingen. Sammen bidrar disse faktorene til mosaikken til F0-injisert fisk. En vanlig praksis er å krysse ut F0-injisert fisk og screene F1-avkommet for indels / spesifikke redigeringer. Men siden ikke alle F0-injiserte fisk har kimlinjemutasjoner, resulterer denne praksisen i mange uproduktive kryss som ikke genererer ønsket redigering. Screening av F0-kimlinjen i stedet for F1 somatisk vev øker sannsynligheten for å isolere ønsket kimlinjeredigering og reduserer antall dyr som kreves i denne prosessen.
Sæd kan enkelt hentes fra F0-injisert sebrafisk uten behov for avlivning. Denne funksjonen muliggjør kryopreservering og rederivatering av frosne sædlagre7, men kan også utnyttes til raskt å screene, identifisere og isolere germlinebærerne av ønskede genomiske mutasjoner 8,9. Brocal et al. (2016) har tidligere beskrevet en sekvenseringsbasert metode for screening av germline-redigeringer i F0-injisert hannsebrafisk10. Selv om det er nyttig for å identifisere de muterte allelene som er tilstede i kimlinjen, kan denne tilnærmingen bli kostbar ved høy gjennomstrømning og er kanskje ikke tilgjengelig for alle laboratorier. I motsetning til dette tilbyr den nåværende protokollen en tilgjengelig og kostnadseffektiv elektroforesebasert strategi for å identifisere germline-redigeringer. Spesielt skisserer denne protokollen en robust metode for screening og isolering av kimlinjemutasjoner ved spesifikke steder ved bruk av høyoppløselig agarosegelelektroforese. I tillegg beskriver denne protokollen en lignende strategi for å identifisere vellykket integrering av en donorkonstruksjon som inneholder spesifikke redigeringer. Som alltid, hvis spesifikke redigeringer er ønsket, kan sekvenseringsbaserte strategier utføres sammen med protokollen beskrevet nedenfor. Selv om denne protokollen er spesifikk for sebrafiskmodellsystemet, bør disse prinsippene kunne tilpasses enhver modell der innsamling av sæd er en rutinemessig prosedyre. Sammen vil disse strategiene tillate identifisering av F0-injiserte hanner med kimlinjeindels / redigeringer som kan løses på en gel etter standard polymerasekjedereaksjon (PCR) og / eller restriksjonsfordøyelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne studien ble utført i tråd med retningslinjene i veiledningen for omsorg og bruk av forsøksdyr fra National Institutes of Health. Protokollen ble godkjent av University of Texas at Austin Animal Care and Use Committee (AUP-2021-00254).
1. Designe sgRNA for CRISPR-mutagenese
- Få eksonsekvensen som inneholder den målrettede loci.
- Design et syntetisk guide RNA (sgRNA) med et protospacer tilstøtende motiv (PAM) nettsted som er spesifikt for Cas endonuclease.
- Hvis du injiserer en donorkonstruksjon, design sgRNA for å ha et forventet kuttsted så nær de ønskede redigeringene som mulig.
MERK: APE er en gratis programvare med et verktøy for å finne Cas9 sgRNA-nettsteder11. Alternativt kan verktøy som CHOPCHOP brukes, som tilbyr et online grensesnitt for å designe sgRNA som vurderer de forskjellige PAM-stedene til Cas9 og andre Cas-endonukleaser12.
- Hvis du injiserer en donorkonstruksjon, design sgRNA for å ha et forventet kuttsted så nær de ønskede redigeringene som mulig.
- Design primere forover og bakover for å forsterke området rundt det designede CRISPR/Cas-kuttstedet. PCR-produktet bør være omtrent 200-400 basepar (bp) i lengde for å kunne løse små indels på en gel senere i protokollen.
MERK: CHOPCHOP11 designer automatisk primere for hvert sgRNA den sender ut. - Valgfritt: Design en DNA-donorkonstruksjon med ønsket redigering(er).
- Oppnå den genomiske sekvensen av eksonen som inneholder loci for den ønskede mutasjonen.
MERK: Introniske sekvenser kan variere mellom individer, så det er best å unngå inkludering av introniske sekvenser i donorkonstruksjonen, da dette kan forstyrre den homologiavhengige reparasjonsveien. - Hvis en spesifikk aminosyreendring er ønsket, endre det spesifikke kodonet tilsvarende.
MERK: Når du gjør disse endringene, vær oppmerksom på kodonfrekvensen. Hvis mulig, velg et kodon med høy bruk. - For å forhindre CRISPR / Cas-fordøyelse av donorkonstruksjonen, gjør ytterligere synonyme mutasjoner som (i) forstyrrer PAM og / eller (ii) forstyrrer sgRNA-sekvensen, med høyere preferanse for å gjøre ikke-synonyme endringer nærmere PAM-stedet.
- Bruk en restriksjonsnettstedsøker (APE11 har også denne funksjonen) for å finne unike restriksjonssteder (de som bare forekommer en gang) i det forutsagte PCR-produktet av villtypesekvensen.
- Gjenta denne prosessen for det forutsagte PCR-produktet som gjenspeiler vellykket integrering av donorkonstruksjonen.
- Sammenlign listen over restriksjonsområder mellom de villtype- og donorintegrerte sekvensene for å finne et begrensningsnettsted som bare finnes i den redigerte sekvensen.
- Hvis det ikke finnes noe unikt begrensningssted, fortsett å gjøre synonyme endringer i donorkonstruksjonen til dette er oppnådd.
MERK: Hvis mulig, fortsett å lage synonyme mutasjoner som vil forstyrre sgRNA-bindingen til donorkonstruksjonen.
- Trim donorsekvensen til en håndterbar størrelse (50-100 bp) med minst 20 bp homologi rundt det forventede CRISPR / Cas-kuttstedet og redigeringer, hvis mulig.
- Oppnå den genomiske sekvensen av eksonen som inneholder loci for den ønskede mutasjonen.
- Få de designede sgRNA- og / eller DNA-donoroligonukleotidene, samt eventuelle primere som kreves for genotyping.
MERK: For å forhindre fordøyelsen av DNA-donoroligonukleotidene ved nukleaser, anbefales det å modifisere de tre første fosfatbindingene på 5' og 3' endene av DNA-oligonukleotidene med fosforotioat. - Injiser 1 nL av injeksjonsblandingen i embryoer i encellestadiet. Vanligvis inneholder en standard injeksjonsblanding følgende:
1 μL av 25 μM locus-spesifikt sgRNA
1 μL av 25 μM Cas9 endonuklease
Valgfritt: 1 μL av 3 μM DNA-donorkonstruksjon- Bring totalvolumet til 5 μL med 0,1 M RNase-fri KCl.
- La F0-injiserte individer utvikle seg til seksuelt modne voksne. Den gjenværende protokollen fokuserer på screening av F0-injiserte menn for germline-redigeringer.
2. Sette opp avlstankene
- Prime F0-hanner for parring ved å sette opp avlstanker med skillevegger mellom F0-hannene og hunnene.
- For å minimere antall avlstanker som kreves, sett opp tre hanner overfor to hunner i hver tank.
- Sett opp så mange F0-hanner som effektivt kan screenes og plasseres som individer etter sædinnsamling. Genotypen til hunnene er ikke viktig siden kjønnscellene deres ikke vil bli samlet inn under denne prosedyren.
- Sett opp en avlstank av villtype hanner overfor hunner. Wild-type sperm vil tjene som en kontroll for tolkningen av resultatene senere i prosedyren.
- For å minimere antall avlstanker som kreves, sett opp tre hanner overfor to hunner i hver tank.
- Inkuber de forberedte avlstankene over natten.
3. Klargjøre materialene for sædoppsamlingsprosedyren
- Forbered nok bedøvelsesløsning (0,016% tricain-HCl i fiskevann) for å fylle en liten glassbolle.
- Dispenser 40 μL på 50 mM NaOH i 0,2 ml PCR-rør. Forbered ett rør for hver sædprøve som skal samles inn. Oppbevares på is.
- Forbered individuelle 0,8 L tanker for hver fisk som vil bli samplet under prosedyren. Disse tankene vil huse prøvefisken til genotypingen er fullført.
MERK: Dette er den primære faktoren som begrenser antall fisk som effektivt kan screenes i denne protokollen. Sørg for tilstrekkelig plass til å huse de prøvede individene til genotypingen er fullført. - Fukt en 1-tommers x 1-tommers svamp (kuttet med en grunne, ovalformet divot for å holde en mannlig sebrafisk ventral side opp under prosedyren) i fiskevann og klem ut overflødig væske.
- Plasser svampen i synsfeltet til et stereomikroskop ved lav forstørrelse (figur 1A).
- Plasser skrå overheadbelysning for optimal visning.
4. Bedøve hannfisken og samle sæden
- Forbered et rent kapillærrør.
- Rist forsiktig rørbeholderen for å frigjøre et enkelt kapillærrør.
- Plasser kapillærrøret i den medfølgende pæren, og sett den til side.
- Overfør en hannfisk til den tilberedte bedøvelsesløsningen (0,016% tricain-HCl i fiskevann).
- Rør forsiktig løsningen med en spalte skje for å fremskynde anestesiprosessen.
- Når operculum (gjelle) bevegelsen bremser ned (ca. 1-2 min), fortsett med sperm samlingen.
- Bruk den slissede skjeen til å overføre fisken til en ren bunke med tørkepapir.
- Bruk den slissede skjeen til å rulle fisken forsiktig for å fjerne overflødig vann.
- Blett fisken forsiktig med rent, brettet silkepapir for å fjerne gjenværende vann.
- Bruk den slissede skjeen til å overføre fisken til den tilberedte svampen (figur 1B).
- Plasser fiskens ventrale side opp med hodet nærmest den dominerende hånden til personen som utfører prosedyren.
- Blett forsiktig området rundt gattfinnene med rent, brettet silkepapir.
- Samle sæden.
- Bruk enden av kapillærrøret, beveg forsiktig bekkenfinnene sideveis bort fra midtlinjen for å eksponere cloaca (figur 1C).
- Plasser enden av kapillærrøret nær cloaca.
- Bruk tangen til å klemme forsiktig på sidene av fisken, begynn like under gjellene og avslutt ved cloaca (figur 1C').
- Samle sæd inn i kapillærrøret ved kapillærvirkning. Omtrent 1 μL er tilstrekkelig for denne prosedyren (figur 1D).
MERK: Noen laboratorier rapporterer å bruke p10 pipetspisser i stedet for kapillærrør for sædoppsamling. - Hvis sæd ikke slippes ut med forsiktig trykk, returner fisken til systemvannet.
- Monitor for utvinning fra anestesi.
- Ikke klem fisken hardt for å utvise sæd, da dette kan skade fisken.
- Hvil fisken i 2 uker før du forsøker å samle sæd igjen.
- Etter oppsamling, legg fisken i en ren isolasjonstank med systemvann for individuelle hus.
- Overvåk fisken for utvinning fra anestesi.
- Hvil fisken i 2 uker før du forsøker å samle sæd igjen.
- Plasser kapillærrøret med den oppsamlede sæden i det forberedte PCR-røret (med 40 μL på 50 mM NaOH).
- Klem gummipæren for å utvise den oppsamlede prøven.
- Kast det brukte kapillærrøret i en godkjent glassbeholder.
- Inkuber prøvene på is til alle hannene er presset.
- Gjenta trinn 4.1-4.5 for hver enkelt mann.
- Merk isolasjonstankene og sædprøvene slik at de endelige sædgenotypingsresultatene kan spores tilbake til det tilsvarende individet med antatte mutasjoner.
- Overvåk alle individene, og sørg for at de er oppreist og utforsker tankene sine før du setter tankene tilbake på systemet.
- Sett hunnene som brukes til priming tilbake i sine respektive tanker på systemet.
- Hvis noen fisk ikke gjenoppretter fra anestesien etter 10 minutter, følg eutanasiprosedyren godkjent av institusjonen tilknyttet laboratoriet.
- Eksempel: Rask nedkjøling av individet i et isbad med fiskevann som er 2-4 °C.
- Kast den avlivede fisken i en egnet avfallsbeholder for dyreskrott i henhold til prosedyren godkjent av institusjonen tilknyttet laboratoriet.
5. Ekstrahering av DNA fra sædprøvene
- Spinn kort ned alle sædprøvene i en minisentrifuge, og plasser PCR-rør i en termisk syklist.
- Lukk lokket på den termiske syklisten.
- Kjør følgende innstillinger i termisk syklist:
- Varm opp prøvene i 40 min ved 95 °C.
- Avkjøl prøvene til 25 °C.
- Fjern prøvene fra termosyklisten.
- Nøytraliser pH med en ren pipettespiss for hver prøve ved å tilsette 10 μL av 1 M Tris-HCl (bufret til pH 8).
- Bland godt ved å pipettere opp og ned.
- Spinn kort ned prøvene i en minisentrifuge.
- Genomiske DNA-prøver kan lagres i flere dager ved 4 °C eller plasseres ved -20 °C i opptil 6 måneder.
6. PCR-amplifikasjon (og/eller restriksjonsfordøyelse) av ønsket locus
- Forsterk ønsket locus ved hjelp av en standard PCR-protokoll.
- Forvarm den termiske syklisten til den opprinnelige denatureringstemperaturen i PCR-reaksjonen nedenfor.
- Forbered en 25 μL reaksjonsblanding for hver sædprøve i PCR-rør:
12,5 μL 2x Taq Polymerase Master Mix
1,5 μL 10 μM fremovergrunning
1,5 μL med 10 μM omvendt primer
4,5 μl nukleasefritt vann
5 μL nøytralisert sæd-DNA-prøve - Bland godt ved å pipettere opp og ned.
- Spinn kort ned prøvene i en minisentrifuge.
- Plasser prøvene i den forvarmede termiske syklisten med følgende innstillinger:
Initial denaturering: 95 °C i 3 minutter
35 sykluser med denaturering (95 °C i 30 s), glødning (55 °C i 30 s) og forlengelse (72 °C i 30 s)
Endelig forlengelse: 72 °C i 5 min
MERK: Det kan være nødvendig å justere forlengelsestemperaturen og/eller tiden avhengig av den spesifikke Taq-polymerasen og den forventede lengden på PCR-amplifikasjonsproduktet. - Fjern PCR-prøvene fra den termiske syklisten.
- Valgfritt: Utfør den donorspesifikke restriksjonsfordøyelsen på et lite volum av PCR-produktet, og etterlater minst 5-10 μL ufordøyd PCR-produkt for gelelektroforese.
- Forbered en 30 μL-reaksjon i 0,2 ml PCR-rør:
10 μL urenset PCR-produkt
15 μL nukleasefritt vann
3 μL med 10x restriksjonsenzymbuffer
2 μL restriksjonsenzym (BstNI brukes i representative resultater for analyse av dnah10 innbankingsallelet)
MERK: Mange restriksjonsenzymer er fortsatt aktive i en typisk PCR-reaksjonsbuffer; Tillegg av restriksjonsfordøyebuffer kan imidlertid bidra til å forbedre resultatene. Se spesifikke produsentinstruksjoner for feilsøking hvis det oppstår problemer. - Bland godt ved å pipettere opp og ned.
- Spinn kort ned prøvene i en minisentrifuge.
- Plasser prøvene i en termisk syklist med følgende innstillinger:
- Klipp PCR-amplikonen ved 60 °C i 1 time.
MERK: Kutttemperaturen og inkubasjonstiden må kanskje justeres for det spesifikke restriksjonsenzymet som brukes. - Deaktiver restriksjonsenzymet med ønsket temperatur og inkubasjonstid, hvis angitt av produsenten.
MERK: BstNI-enzymet krever ikke varmeinaktivering.
- Klipp PCR-amplikonen ved 60 °C i 1 time.
- Forbered en 30 μL-reaksjon i 0,2 ml PCR-rør:
7. Utføre gelelektroforese for å skille PCR-amplicons av varierende størrelse
- Forbered 500 ml 0,5x TBE løpende buffer: tilsett 50 ml 10x TBE bufferkonsentrat til 450 ml avionisert vann.
- Forbered 100 ml 4% agarosegel i 0,5x TBE løpende buffer: tilsett 4 g agarose med 10 μL 10,000x gelflekk til 100 ml 0,5x TBE løpende buffer. Mikrobølgeovn til agarosepulveret er fullstendig oppløst.
- Hell geloppløsningen i en passende størrelse gelstøperamme, og sett kammen på den ene siden av gelen.
MERK: En større gelstørrelse (anbefalt: 15 cm x 15 cm) er fordelaktig for denne prosedyren, da det gir forsterkerne mer plass til å løse på gelen.- Hvis et restriksjonsfordøyeprodukt skal analyseres, er det best å kjøre det på samme gel som PCR-produktet slik at resultatene kan sammenlignes. Juster kambrønnstørrelsen etter behov for å passe alle prøvene på gelen.
- La gelen stå i romtemperatur til den stivner. Fjern kammen forsiktig. Fjern forsiktig gelen fra støperammen.
- Hell geloppløsningen i en passende størrelse gelstøperamme, og sett kammen på den ene siden av gelen.
- Sett opp gelelektroforeseriggen.
- Plasser gelen i elektroforeseriggen slik at brønnene er nærmest den negative elektroden. Hell 0,5x TBE løpende buffer i elektroforeseriggen til brønnene er helt nedsenket.
- Legg i gelen.
- Last 5 μL DNA-stige inn i den første brønnen (velg en DNA-stige som inneholder DNA-fragmenter som er like store som PCR-amplikonen).
- Bruk en ny pipettespiss for hver prøve (inkludert villtypekontrollprøven), og last 5-10 μL av PCR-produktet inn i de gjenværende brønnene.
- Valgfritt: Hvis et restriksjonsfordøyningsprodukt skal analyseres, legg også disse prøvene på gelen.
MERK: Det er best å laste like mengder DNA mellom PCR og restriksjonsfordøyeproduktet. For eksempel, i 30 μL restriksjonsfordelingsreaksjonsblandingen ble 10 μL PCR-produkt tilsatt. Derfor var DNA-konsentrasjonen av 15 μL fordøyelsesprodukt sammenlignbar med 5 μL av urenset PCR-produkt.
- Kjør gelen.
- Koble elektrodene til gelelektroforeseriggen, og påfør 150 V i minst 1 time for å sikre tilstrekkelig separasjon av forsterkerne.
- Bilde gelen for å se DNA-båndene.
MERK: Sterkt mutageniserte CRISPR-målrettede loci vil kjøre som flere båndstørrelser som representerer en kombinasjon av innsettings-/delesjonsalleler med wild-type forsterkere.- Hvis gelbåndene ikke er løst etter 1 time, påfør 150 V på gelen i 15 minutters intervaller til båndene er tilstrekkelig separert på gelen.
- Valgfritt: Hvis du ser etter innsetting av en presis redigering, for eksempel en SNP, epitopkode eller fluorescerende tag, må du screene sæd-DNA-et med PCR-metoder som er spesifikke for ønsket redigering. For eksempel, når du identifiserer et donorspesifikt restriksjonssted, vil et ekstra bånd være tilstede i restriksjonsfordøyeproduktet sammenlignet med PCR-produktet av sædprøven.
8. Isolering av germline stabile alleler
- Etter 2 ukers hvile fra sædklemmeprosedyren, kryss ut F0-individene hvis sædgenomiske DNA inneholdt de ønskede redigeringene.
MERK: Spermgenerering fra individuelle spermatogoni-kloner kan være syklisk hos sebrafisk; Dermed kan det ønskede allelet ikke produsere sæd på tidspunktet for utparringen. Av denne grunn kan det være nødvendig å utføre ytterligere kryssing mer enn én gang for å isolere allelen som var involvert i den første screeningen. - Når F1-utparret fisk er seksuelt moden, fortsett med standard genotypingsmetoder (for eksempel fin-clip DNA) ved å bruke samme PCR- og gelelektroforeseprotokoll utført under screening av sædgenomisk DNA.
- Sanger-sekvensen PCR-produktene for å identifisere F1-individene med samme ønskede redigering.
- Valgfritt: Hvis ønsket redigering introduserer eller forstyrrer et begrensningsnettsted, screener du med en passende begrensningssammendragsprotokoll.
- In-cross F1 heterozygoter med samme ønskede redigering.
- Screene F2-avkommet for forventet fenotype og/eller genomiske redigeringer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De eksperimentelle tilnærmingene beskrevet i denne protokollen tillater raskere identifisering av genomredigeringer eller antatte skadelige alleler ved å fokusere på analysen av tusenvis av genomer avledet fra samlingen av F0-injisert mannlig sæd. Figur 2 viser hvordan man tolker resultatene oppnådd ved hjelp av denne protokollen.
For å generere mutasjoner i p2ry12-lokuset ble encellede sebrafiskembryoer injisert med Cas9-endonuklease og et p2ry12-spesifikt sgRNA (figur 2B, grått utheving). F0-injisert fisk ble satt i system til kjønnsmodenhet, og sæd ble samlet inn fra seks individuelle hanner. DNA ble ekstrahert fra sædprøvene ved hjelp av høy varme og grunnleggende forhold (HotSHOT DNA-ekstraksjon) og nøytralisert før PCR-amplifiseringen av p2ry12-lokuset. PCR-produktene ble separert på en høy prosentandel (4%) agarosegel i 1,5 timer ved høy spenning (150 V). I dette eksemplet kjørte villtypeamplikonen som et enkelt lyst bånd på rundt 250 basepar i lengde (figur 2C; WT). I kontrast kjørte de F0-injiserte mannlige forsterkerne som inneholdt indels på gelen som flere bånd (figur 2C; baner # 1-2, # 5-8). Alternativt kan de muterte F0-injiserte mannlige forsterkerne kjøre som et enkelt bånd med endret gelmobilitet (ikke vist i p2ry12-eksemplet, men tydelig i PCR-produktet av dnah10 F0-male #2; Figur 2E). Det var mindre klart på p2ry12-eksempelgelen om prøve #3 og prøve #4 inneholdt indels i forhold til villtypebåndet, så disse personene er kanskje ikke de beste grunnleggerkandidatene. Isoleringen av alleler fra F0-hanner med mer karakteristiske ampliconendringer er best for å forplante stabile germlinebærere, da de lett blir skåret på 4% agarosegel. For eksempel syntes sædprøven F0-mann #6 å inneholde en stor delesjon i en av allelene (figur 2C; bane 6; lyst bånd med økt gelmobilitet). Hvis dette store delesjonsallelet ble valgt for i F1-generasjonen, ville det lett kunne skilles fra WT-allelet på en 4% agarosegel. Alternativt, hvis en samling av forskjellige alleler er ønsket, kan F0-male #7 være en effektiv grunnleggerkandidat siden PCR-produktet syntes å inneholde flere diskrete alleler av forskjellige mobiliteter. Når en grunnleggerhann er valgt, kan det ønskede allelet isoleres ved å krysse individet tilbake til den opprinnelige villtypestammen som ble brukt til injeksjoner.
For å generere en spesifikk knock-in-mutasjon i dnah10-genet, ble encellede sebrafiskembryoer injisert med Cas9-endonuklease, et dnah10-spesifikt sgRNA (figur 2D; grått utheving) og et DNA-donoroligonukleotid som inneholdt ønsket redigering (figur 2D; rød) og et donorspesifikt BstNI-restriksjonssted (figur 2D , parenteser). Denne utformingen muliggjør enkel identifisering av donorintegrasjon med en restriksjonsfordøyelse etter PCR. Videre, ved å endre basepar i sgRNA-gjenkjenningsstedet (figur 2D; grå utheving), forhindrer dette designet Cas9-fordøyelsen av donorsekvensen. Når F0-injisert fisk nådde seksuell modenhet, ble sæd samlet, og DNA ble ekstrahert ved hjelp av hot shot-metoden. Fra disse prøvene ble dnah10-lokuset forsterket ved bruk av PCR, og produktene ble separert på en høy prosentandel (4%) agarosegel i 1 time ved høy spenning (150 V). I dette eksemplet kjørte villtypeamplikonen som et enkelt lyst bånd på rundt 400 basepar i lengde (figur 2E; topppanel: WT). I kontrast løp de F0-injiserte mannlige forsterkerne som inneholdt indels som flere bånd (figur 2E; topppanel: baner #1, #4 og #5) eller som et enkeltbånd med redusert gelmobilitet (figur 2E; topppanel: bane #2). For å avgjøre om noen av sædprøvene inneholdt donorintegrerte alleler, ble PCR-produktene fordøyd med BstNI-restriksjonsenzymet i 1 time, og produktet ble kjørt på en 4% agarosegel i 1 time ved høy spenning (150 V). Sammenligning av det ufordøyde PCR-produktet (figur 2D; topppanel) med det fordøyde produktet (figur 2D; bunnpaneler) avslører prøver med sannsynlig integrasjon av donorkonstruksjonen. I dette eksemplet hadde den F0-injiserte hannen #1 et ekstra bånd i det fordøyde produktet som ikke var tilstede i PCR-produktet (figur 2D; nederste panel: bane #1, sirklet). Derfor representerer denne hannen den beste grunnleggerkandidaten for å etablere en mutantlinje med ønsket innslag.
Når den antatte F0-bærerhannen er utparret, må allelen sekvensverifiseres i F1-avkommet. Det foreslås å direkte Sanger-sekvensere amplicons avledet fra F1 heterozygot fisk etterfulgt av å utføre heterozygote allelanalysemetoder som Poly Peak Parser13 eller ved hjelp av en rekke neste generasjons sekvenseringsbaserte metoder som MiSeq 14 eller Hi-Tom15 sekvensering. Dette er en nødvendig og komplementær tilnærming for å sikre at den nøyaktige redigeringen eller den skadelige indelmutasjonen faktisk går kimline og ikke bare er en artefakt av gelelektroforeseanalysen. Faktisk kan bruken av neste generasjons sekvenseringsmetoder for å sekvensere sæd-DNA fra F0-bærere lett brukes i stedet for gelelektroforeseanalysen beskrevet i denne protokollen. Å ha en lett skårbar agarosegelgenotypingsmetode er imidlertid en mer økonomisk og egalitær tilnærming for det globale samfunnet av sebrafiskforskere.
Figur 1: Oppsett for sædklemmeprosedyren . (A) Svampen er plassert under et stereomikroskop ved lav forstørrelse med overliggende belysning. (B) Den fuktede 1 i x 1 i svamp, kuttet med en oval divot (stiplet linje), brukes til å holde den bedøvede hannfisken ventral side opp under prosedyren. (C) Anatomi av den ventrale siden av den bedøvede hannfisken som viser analfinnene (af, rosa), bekkenfinner (pf, blå) og cloaca (pil), hvor sæd vil bli utvist under prosedyren. (C') Filtertang brukes til å forsiktig klemme den bedøvede hannfisken fra gjellene til cloaca, mens den utviste sæden trekkes inn i en glasspipette ved kapillærvirkning (hvit pil). (D) Et kapillærrør som inneholder tilstrekkelig utvist sæd (ugjennomsiktig væske, svart brakett) for nedstrøms DNA-ekstraksjon og analyse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Arbeidsflyt og representative resultater . (A) Generell arbeidsflyt for protokollen. (B) Representativ utforming av p2ry12 sgRNA-nettstedet (grå utheving) med et Cas9-spesifikt PAM-nettsted (understreket). (C) Representative resultater av 4% gelelektroforese etter 1,5 timer ved 150 V. Wild-type (WT) kontroll og F0-p2ry12 CRISPR-injiserte mannlige sædprøver (1-8) etter PCR-amplifikasjon. (D) Representativ utforming av dnah10 sgRNA-stedet (grå utheving) med et Cas9-spesifikt PAM-sted (understreket) nær det målrettede kodonet (fet). DNA-donorsekvens med ønsket kodonredigering (rød fet) og BstNI restriksjonssted (parentes med apostrof som markerer kuttstedet). (E) Representative resultater av 4% gelelektroforese etter 1 time ved 150 V. Topp: PCR-produkt av villtype (WT) og F0 dnah10 CRISPR-injiserte mannlige sædprøver (1-5). Nederst: BstNI restriksjonsfordøyningsprodukt av prøvene ovenfor. Prøve 1 demonstrerer vellykket integrering av donorkonstruksjonen basert på tilleggsbåndet etter fordøyelsen (rød sirkel). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen beskriver en metode for raskt å karakterisere antatte genomredigeringer eller målrettede mutasjoner ved bruk av CRISPR-Cas-teknologi ved fokusert analyse på F0 mannlige sædgenomer. Denne protokollen bør være egnet til andre dyremodeller der sæd er lett tilgjengelig for prøvetaking uten avlivning. Denne metoden vil øke gjennomstrømningen av screening for ønskede redigeringer og er spesielt nyttig for å identifisere sjeldne HDR-medierte innbankingshendelser. Denne tilnærmingen tjener også til å redusere antall eksperimentelle dyr som brukes til å finne en stabil germline-redigering ved å legge til rette for rask screening av potensielt tusenvis av genomer i en sædprøve fra en antatt F0-bærer, noe som er i motsetning til mer tradisjonelle tilnærminger som kan kreve screening av hundrevis av embryoer avledet fra kryss av antatte F0-bærere.
Denne protokollen bygger på etablerte protokoller for sædinnsamling i sebrafisk 7,10,14,16,17,18 ved å inkludere en reproduserbar teknikk for å identifisere germlineredigeringer ved bruk av høyoppløselig gelelektroforese. Denne tilnærmingen kan enkelt innlemmes i enhver standard CRISPR/Cas-arbeidsflyt for å øke gjennomstrømningen for screening og isolering av målgenomredigeringer. I tillegg er denne protokollen egnet for laboratorier bemannet med personell med en rekke opplæring og erfaring, samt undervisningslaboratorier. Imidlertid er vår metode for sædinnsamling ikke tilstrekkelig for kryopreservering, som har blitt fagmessig beskrevet i tidligere publikasjoner10,17.
Denne protokollen bruker en høyoppløselig agarosegelelektroforese for å identifisere antatte mannlige bærere av ønskede indel og presise genomiske mutasjoner. Imidlertid er spermgenomisk DNA mottagelig for en myriade av andre tilnærminger, inkludert fluorescerende fragmentanalyse eller strekkodet sekvensering14, høyoppløselig smelteanalyse18 eller enkel amplikondeteksjon av fluorescerende koder eller epitoper ved bruk av standard gelelektroforese-tilnærminger. Nedstrøms validering av alle alleler ved hjelp av tilnærminger som Sanger-basert eller neste generasjons sekvensering må gjøres før man starter eksperimentelt arbeid på antatte alleler. Faktisk kan eksisterende metoder for screening for mutasjoner i embryoer ved bruk av neste generasjons sekvenseringstilnærming14 omgå behovet for analyse på agarosegeler, som er beskrevet i denne protokollen. Å ha en gel-scorable genotypingsmetode er imidlertid en mer kostnadseffektiv og egalitær tilnærming å vurdere, gitt at ikke alle laboratorier har lett tilgang til billige neste generasjons sekvenseringsmetoder under isolasjons- og eksperimentelle faser av arbeid med hver mutant stamme.
Oppsummert gir denne protokollen trinnvise instruksjoner for reproduserbar screening av sædgenomer fra CRISPR / Cas-redigerte menn, slik at færre kryss og mindre PCR-screening av embryoer er nødvendig for å skjerme for ønskede redigeringer. Anvendelsen av denne metoden vil redusere antall fisk som må opprettes og analyseres for å kunne identifisere de redigerte allelene av interesse, noe som også reduserer tid og kostnader for personell for å generere stabile linjer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke Anna Hindes ved Washington University School of Medicine for hennes første innsats for å skaffe sædgenomisk DNA av god kvalitet ved hjelp av hot shot-metoden. Dette arbeidet ble finansiert av National Institute of leddgikt og muskuloskeletale og hudsykdommer ved National Institutes of Health under Award (R01AR072009 til RSG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose powder | Fisher BioReagents | BP1356-100 | |
| Breeding tanks | Carolina Biological | 161937 | |
| BstNI Restriction Enzyme | NEB | R0168S | |
| Cas9 Endonuclease | IDT | 1081060 | |
| DNA Ladder, 100 bp | Thermo Scientific | FERSM0241 | |
| dnah10 donor construct | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry. Phosphorothioate bond on the donor at the first three phosphate bonds on both the 5’ and 3’ ends (5'-CCTCTCTCCCTTTCAGAAGCTTC TGCTCATCCGCTGCTTCTGCCT GGACCGAGTGTACCGTGCCGTC AGTGATTACGTCACGC-3') |
|
| dnah10 forward primer | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry (5'-CATGGAACTCTTTCCTAATGAGT TTGGC-3') |
|
| dnah10 reverse primer | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry ('5-AGTAGAGATCACACATCAACAGA ATACAGC-3') |
|
| dnah10 synthetic sgRNA | Synthego | Synthetic sgRNA, target sequence: 5'-GCTCATCCGCTGCTTCAGGC-3' | |
| Electrophoresis power supply | Thermo Scientific | 105ECA-115 | |
| Filter forceps | Millipore | XX6200006P | |
| Fish (system) water | Generic | n/a | |
| Gel electrophoresis system (including casting frame, comb, and electrophoresis chamber) | Thermo Scientific | B2 | |
| Gel imaging light box | Azure Biosystems | AZI200-01 | |
| Gel stain, 10000X | Invitrogen | S33102 | |
| Glass bowl, 250 mL | Generic | n/a | |
| Isolation tanks, 0.8 L | Aquaneering | ZT080 | |
| Microcap capillary tube with bulb, 20 µL | Drummond | 1-000-0020/CA | |
| Minicentrifuge | Bio-Rad | 12011919EDU | |
| Micropipettes, various with appropriate tips | Generic | n/a | |
| Microwave | Generic | n/a | |
| Nuclease free water | Promega | P119-C | |
| Paper towels | Generic | n/a | |
| PCR tubes, 0.2 mL | Bioexpress | T-3196-1 | |
| Plastic spoon, with drilled holes/slots | Generic | n/a | |
| KCl solution, 0.2 M RNAse Free | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| p2ry12 forward primer | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry (5'-CCCAAATGTAATCCTGACCAGT -3') |
|
| p2ry12 reverse primer | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry (5'-CCAGGAACACATTAACCTGGAT -3') |
|
| p2ry12 synthetic sgRNA | Synthego | Synthetic sgRNA, target sequence: 5'-GGCCGCACGAGGTCTCCGCG-3' | |
| Restriction Enzyme 10X Buffer | NEB | B6003SVIAL | |
| NaOH solution, 50 mM | Thermo Scientific | S318; 424330010 | |
| Sponge, 1-inch x 1-inch cut with small oval divot | Generic | n/a | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi 508 | |
| Taq polymerase master mix, 2X | Promega | M7122 | |
| TBE Buffer Concentrate, 10X | VWR | E442 | |
| Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| Tissue paper | Fisher Scientific | 06-666 | |
| Tricaine-methanesulfonate solution (Syncaine, MS-222), 0.016% in fish water (pH 7.0±0.2) | Syndel | 200-266 | |
| Tris Base, 1M (Buffered with HCl to ph 8.0) | Promega | H5131 |
References
- Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome Research. 24 (1), 142-153 (2014).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nature Biotechnology. 31 (3), 227-229 (2013).
- Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (34), 13904-13909 (2013).
- Troutwine, B. R., et al. The Reissner fiber is highly dynamic in vivo and controls morphogenesis of the spine. Current Biology. 30 (12), 2353-2362 (2020).
- Xu, Y., Li, Z. CRISPR-Cas systems: Overview, innovations and applications in human disease research and gene therapy. Computational and Structural Biotechnology Journal. 18, 2401-2415 (2020).
- Creaser, C. W. The technic of handling the zebrafish (Brachydanio rerio) for the production of eggs which are favorable for embryological research and are available at any specified time throughout the year. Copeia. 1930 (4), 159-161 (1934).
- Carmichael, C., Westerfiel, M., Varga, Z. M. Cryopreservatin and in vitro fertilization at the zebrafish international resource center. Methods in Molecular Biology. 546, 45-65 (2009).
- Wang, Y., Troutwine, B. R., Zhang, H., Gray, R. S. The axonemal dynein heavy chain 10 gene is essential for monocilia motility and spine alignment in zebrafish. Developmental Biology. 482, 82-90 (2021).
- Gray, R. S., et al. Postembryonic screen for mutations affecting spine development in zebrafish. Developmental Biology. 471, 18-33 (2021).
- Brocal, I., et al. Efficient identification of CRISPR/Cas9-induced insertions/deletions by direct germline screening in zebrafish. BMC Genomics. 17, 259 (2016).
- Davis, M. W., Jorgensen, E. M. ApE, A Plasmid Editor: A freely available DNA manipulation and visualization program. Frontiers in Bioinformatics. 2, 816619 (2022).
- Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: Expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47, 171-174 (2019).
- Hill, J. T., et al. Poly Peak Parser: Method and software for identification of unknown indels using sanger sequencing of polymerase chain reaction products. Developmental Dynamics. 243 (12), 1632-1636 (2014).
- Varshney, G. K., et al. High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9. Genome Research. 25 (7), 1030-1042 (2015).
- Liu, Q., et al. Hi-TOM: A platform for high-throughput tracking of mutations induced by CRISPR/Cas systems. Science China. Life Sciences. 62 (1), 1-7 (2019).
- Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. Efficient production and identification of CRISPR/Cas9-generated gene knockouts in the model system Danio rerio. Journal of Visualized Experiments. (138), e56969 (2018).
- Draper, B. W., Moens, C. B. A high-throughput method for zebrafish sperm cryopreservation and in vitro fertilization. Journal of Visualized Experiments. (29), e1395 (2009).
- Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants. Developmental Dynamics. 238 (12), 3168-3174 (2009).
