Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

En mikrofluidisk platform til at studere biotilstopning i porøse medier

Published: October 13, 2022 doi: 10.3791/64689
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1,2
1Department of Civil, Environmental and Geomatic Engineering, Institute of Environmental Engineering, ETH Zurich, 2Department Water Resources and Drinking Water, Swiss Federal Institute of Aquatic Science and Technology

Summary

Denne protokol beskriver en mikrofluidisk platform til at studere biofilmudvikling i kvasi-2D porøse medier ved at kombinere højopløsningsmikroskopibilleddannelse med samtidige trykforskelsmålinger. Platformen kvantificerer indflydelsen af porestørrelse og væskestrømningshastigheder i porøse medier på biotilstopning.

Abstract

Bakterielle biofilm findes i flere miljømæssige og industrielle porøse medier, herunder jord og filtreringsmembraner. Biofilm vokser under visse strømningsforhold og kan tilstoppe porerne og derved omdirigere den lokale væskestrøm. Biofilms evne til at tilstoppe porer, den såkaldte biotilstopning, kan have en enorm effekt på den lokale permeabilitet af det porøse medium, hvilket skaber en trykopbygning i systemet og påvirker massestrømmen gennem det. For at forstå samspillet mellem biofilmvækst og væskestrøm under forskellige fysiske forhold (f.eks. ved forskellige strømningshastigheder og porestørrelser) udvikles i dette studie en mikrofluidisk platform til at visualisere biofilmudvikling ved hjælp af et mikroskop under eksternt pålagte, kontrollerede fysiske forhold. Den biofilminducerede trykopbygning i det porøse medium kan måles samtidigt ved hjælp af tryksensorer og senere korreleres med biofilmens overfladedækning. Den præsenterede platform giver et udgangspunkt for en systematisk tilgang til at undersøge biotilstopning forårsaget af biofilm i porøse medier under flowforhold og kan tilpasses til at studere miljøisolater eller multispecies biofilm.

Introduction

Biofilm - bakteriekolonier indlejret i en selvudskilt matrix af ekstrapolymere stoffer (EPS) - er allestedsnærværende i naturlige porøse medier, såsom jord og akviferer1, og tekniske og medicinske anvendelser, som bioremediering2, vandfiltrering3 og medicinsk udstyr4. Biofilmmatrixen består af polysaccharider, proteinfibre og ekstracellulært DNA5,6 og afhænger stærkt af mikroorganismerne, tilgængeligheden af næringsstoffer samt miljøforholdene7. Alligevel er matrixens funktioner universelle; Det danner stilladset for biofilmstrukturen, beskytter det mikrobielle samfund mod mekaniske og kemiske belastninger og er i høj grad ansvarlig for biofilmenes rheologiske egenskaber5.

I porøse medier kan væksten af biofilm tilstoppe porerne og forårsage den såkaldte biotilstopning. Biofilmudvikling styres af væskestrømmen og porestørrelsen, defineret som afstanden, der adskiller to søjler, af det porøse medium 8,9,10. Både porestørrelsen og væskestrømmen styrer næringsstoftransporten og lokale forskydningskræfter. Til gengæld tilstopper den voksende biofilm porerne, hvilket påvirker hastighedsfordelingen af væsken 11,12,13, massetransporten og den hydrauliske ledningsevne af det porøse medium 14,15. Ændringerne i hydraulisk ledningsevne afspejles gennem øget tryk i lukkede systemer16,17,18,19. Aktuelle mikrofluidiske undersøgelser inden for biofilmudvikling og biotilstopning fokuserer på at studere virkningen af strømningshastigheder i homogene geometrier16,20 (dvs. med en entydig porestørrelse) eller heterogene porøse medier12,21,22. For at adskille virkningerne af strømningshastigheder og porestørrelse på biofilmudvikling og de deraf følgende trykændringer i det biotilstoppede porøse medium kræves der imidlertid en meget kontrollerbar og alsidig eksperimentel platform, der muliggør undersøgelse af forskellige porøse mediegeometrier og miljøforhold parallelt.

Denne undersøgelse introducerer en mikrofluidisk platform, der kombinerer trykmålinger med samtidig billeddannelse af den udviklende biofilm i det porøse medium. På grund af sin gasgennemtrængelighed, biokompatibilitet og fleksibilitet i kanalgeometridesignet er en mikrofluidisk enhed fremstillet af polydimethylsiloxan (PDMS) et egnet værktøj til at studere biofilmudvikling i porøse medier. Mikrofluidik gør det muligt at kontrollere fysiske og kemiske forhold (f.eks. væskestrøm og næringsstofkoncentration) med høj præcision for at efterligne miljøet i mikrobielle levesteder23. Desuden kan mikrofluidiske enheder let afbildes med mikrometrisk opløsning ved hjælp af et optisk mikroskop og kombineret med online målinger (f.eks. Det lokale tryk).

I dette arbejde fokuserer eksperimenterne på at studere virkningen af porestørrelse i en homogen porøs medieanalog under kontrollerede pålagte strømningsbetingelser. Strømmen af et dyrkningsmedium pålægges ved hjælp af en sprøjtepumpe, og trykforskellen gennem den mikrofluidiske kanal måles samtidigt med tryksensorer. Biofilmudvikling initieres ved såning af en planktonkultur af Bacillus subtilis i den mikrofluidiske kanal. Regelmæssig billeddannelse af den udviklende biofilm og billedanalyse gør det muligt at opnå poreskalaopløst information om overfladedækningen under forskellige eksperimentelle forhold. De korrelerede oplysninger om trykændring og omfanget af biotilstopning giver afgørende input til permeabilitetsestimater af biotilstoppede porøse medier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Forberedelse af siliciumskive

  1. Design geometrierne af den mikrofluidiske kanal i computerstøttet design (CAD; se materialetabel) software og udskriv den på en gennemsigtig film for at skabe fotomasken (figur 1A).
  2. Fabriker masterformen ved blød litografi (under renrumsforhold) ved at følge nedenstående trin.
    1. Bag siliciumskiven ved 200 °C i 2 timer.
    2. Placer waferen i midten af en spin-coater og hæld SU8 3050 fotoresist (se tabel over materialer) på waferen. Spin coat ved 1.700 o/min i 40 sek. med en rampetid på 10 s/100 o/min.
      BEMÆRK: Centrifugeringsparametrene blev indstillet til at opnå en måltykkelse på 100 μm for SU8 3050.
    3. Efter centrifugeringsprocessen bages siliciumskiven blødt ved 65 °C i 600 s og 95 °C i 2.700 s. Lad vaflen køle af ved stuetemperatur natten over.
      BEMÆRK: Kølingen natten over forbedrer vedhæftningen af SU8 til waferen.
    4. Fotomasken (trin 1.1) anbringes på waferen, og den udsættes for UV-lys med en eksponeringsenergi på 250 mJ/cm2 og en bølgelængde på 350 nm.
    5. Efter eksponering bages det eksponerede substrat ved 65 °C i 60 s og 95 °C i 300 s.
    6. Udvikl siliciumskiven for at opnå masterformen ved at nedsænke den i et bægerglas fyldt med mrDev600-udvikler (se materialetabel). Bægerglasset rystes forsigtigt i 1.800 s for at vaske den upolymeriserede modstand ud. Derefter stænk vask ved at sprøjte isopropanol på siliciumskiven og lufttørre.
    7. Hårdt bages siliciumskiven ved 200 °C i 1.800 s.
  3. Silanisere masterformen gennem dampaflejring af 20 μL Trichlor (1H, 1H, 2H, 2H-perfluoroctyl) silan (se materialetabel) placeret på et glasglas ved siden af formen i 40 minutter i en vakuumekssikkator, hvilket skaber et måletryk på 100 mbar.

2. Fremstilling af den mikrofluidiske enhed

BEMÆRK: Fremstillingsproceduren beskrevet her er for en mikrofluidisk enhed med en mikrofluidisk kanal. Imidlertid kan den samme metode anvendes til at fremstille en mikrofluidisk enhed med flere mikrofluidiske kanaler parallelt.

  1. Elastomeren blandes med dens tværbinding i forholdet 10:1 (se materialetabellen) for at fremstille en PDMS-blanding. Rør blandingen, indtil den bliver ensartet blandet og bliver uigennemsigtig på grund af de lukkede luftbobler.
  2. Afgas blandingen i en vakuumekssikkator, hvilket skaber et måletryk på 100 mbar, indtil de indesluttede luftbobler fjernes, og det ser gennemsigtigt ud. Den tid, der kræves til afgasning, er typisk 30 min.
  3. Anbring masterformen (trin 1) i en cellekulturskål (se materialetabel). Hæld 20 g PDMS-blandingen på masterformen for at producere kanaler med en endelig tykkelse på 5 mm.
  4. Bag masterformen ved 70 °C i 2 timer.
  5. Skær den hærdede PDMS omkring den mikrofluidiske kanal (i en afstand af ca. 3 mm) ved hjælp af et blad, og skræl derefter PDMS mikrofluidisk kanal af masterformen.
  6. For at skabe de mikrofluidiske kanalers indløb og udløb skal du slå huller med en biopsistans (diameter på 1,5 mm) i ekstremiteterne (øverst i trekanterne, se figur 1A). Stans et ekstra hul i midten af indløbstrekanten for at installere tryksensoren senere.
  7. Vask et glasglas og den mikrofluidiske kanal med en kommercielt tilgængelig 1% vaskemiddelopløsning (se materialetabel) i 5 minutter, skyl dem derefter med deioniseret vand. Derefter vaskes PDMS mikrofluidisk kanal og glasobjektglasset med isopropanol. Skyl dem derefter igen med deioniseret vand. Tør PDMS mikrofluidisk kanal og glasset glide med trykluft ved 1 bar i 1 min.
    BEMÆRK: PDMS's porøse struktur skal være helt tør, for at bindingen skal være effektiv.
  8. Anbring glasglasset og den mikrofluidiske kanal i en plasmarenser (se materialetabellen), og sørg for, at overfladerne, der skal limes, vender opad. Tænd plasmarenseren, og behandl den mikrofluidiske kanal og glasglasset med luftplasma ved en luftstrøm på 1 SL/h (standardliter pr. time) i 1 min. Bind den mikrofluidiske kanal til glasglasset umiddelbart efter at have taget dem ud af rengøringsmidlet ved at sætte dem i kontakt med hinanden.
    BEMÆRK: Sørg for ikke at berøre de behandlede overflader, da dette kan påvirke limningen. Når du fremstiller en mikrofluidisk enhed med flere mikrofluidiske kanaler, skal du udsætte de mikrofluidiske kanaler samtidigt og binde dem i et enkelt trin.
  9. Den bundne mikrofluidiske anordning anbringes på en 80 °C kogeplade i mindst 15 min.
  10. Opbevar den mikrofluidiske enhed i en ren cellekulturskål, indtil eksperimentet starter.

3. Fremstilling af bakteriesuspensionen

  1. Dyrk en population af Bacillus subtilis NCIB 3610 20 timer før forsøgets start ved direkte podning af 3 ml næringsbouillon nr. 3 dyrkningsmedium (se materialetabel) fra en frossen glycerolbestand i et 15 ml kulturrør. Der inkuberes i en rysteinkubator ved 30 °C og 200 o/min natten over (i 16 timer).
  2. Der laves en subkultur fra natkulturen 4 timer før forsøgets start ved at tilsætte 3 μL af natkulturen i 3 ml frisk dyrkningsmedium (1:1.000 fortynding) i et 15 ml kulturrør. Subkulturen inkuberes i en rysteinkubator ved 30 °C ved 200 omdr./min. i 3,5-4 timer for at opnå en optisk densitet ved 600 nm (OD600) på 0,1.

4. Biofilm vækst eksperiment

  1. Tænd mikroskopets kasseinkubator 3 timer før eksperimentet for at sikre en stabil temperatur på 25 °C. Monter sprøjtepumpen og tryksensorerne (se Materialetabel).
  2. Tilslut indløbs- og udløbsslangen til den mikrofluidiske enhed. Indsæt en nål (med en ydre diameter på 0,6 mm) direkte i indløbsslangen for at sikre forbindelsen mellem slangen og sprøjten.
  3. Den mikrofluidiske anordning, 30 ml deioniseret vand og 30 ml dyrkningsmedium anbringes i en vakuumekssikkator og afgasses i mindst 1 time. Træk derefter langsomt dyrkningsmediet og det deioniserede vand i to separate 30 ml sprøjter.
    BEMÆRK: Dette trin er afgørende for at forhindre bobledannelse i kanalen, mens du skyller med kulturmediet.
  4. Monter den mikrofluidiske enhed på mikroskopet, og læg udløbsslangen i en affaldsbeholder.
    1. Tilslut sprøjten fyldt med deioniseret vand til den mikrofluidiske kanal gennem den mikrofluidiske slange, og injicer langsomt vandet, indtil det kommer ud af tryksensorens udløb. Fyld tryksensoren med vand, og skyl alle boblerne fra slangen, der forbinder den mikrofluidiske kanal og tryksensoren. Luk tryksensorens udløb med skruerne dedikeret til tryksensoren.
      BEMÆRK: Den beskrevne påfyldningsprocedure sikrer, at trykændringerne ved de mikrofluidiske kanalers indløb registreres nøjagtigt. Når du kører et eksperiment med flere mikrofluidiske kanaler, skal du forbinde hver kanal til en separat sprøjte for at sikre lige strømningsforhold i alle kanaler.
  5. Fyld resten af den mikrofluidiske kanal med det deioniserede vand.
  6. Anbring et 1,2 μm filter (se materialetabel) på sprøjten til kulturmedier. Fjern derefter vandsprøjten, og tilslut forsigtigt kulturmediesprøjten til indløbets mikrofluidiske slange. Monter sprøjten på sprøjtepumpen, og skyl kanalen med dyrkningsmediet med en strømningshastighed på 2 ml/t i 1 time.
    BEMÆRK: Filteret forhindrer bakterieceller i at trænge ind i sprøjten under påfyldning. Skylning af den mikrofluidiske kanal med kulturmediet fjerner de resterende bobler i den porøse struktur.
  7. Indstil sprøjtepumpen til den ønskede strømningshastighed (her 1 ml/time) under forsøget, og indstil tryksensorernes trykaflæsning til nul.
    BEMÆRK: Ved at indstille den indledende trykaflæsning til nul måles kun trykforskellen forårsaget af biofilmudvikling under eksperimentet.
  8. Afpipette 1 ml bakteriekultur ved en OD600 på 0,1 i et 1,5 ml centrifugehætteglas. Læg bakteriekulturen i den mikrofluidiske kanal ved at placere udløbsrøret i centrifugehætteglasset. Efter at have ventet i 5 minutter på at fjerne eventuelle luftbobler fra rørenes udløb, trækkes 150 μL bakterieopløsning ud med en strømningshastighed på 1 ml/time, indtil den mikrofluidiske kanal er fyldt med bakteriekulturen.
  9. Fjern forsigtigt sprøjtefilteret til kulturmediet, og anbring udløbet i affaldsbeholderen. Lad bakteriecellerne stå ved nulstrømningsbetingelser i den mikrofluidiske kanal i 3 timer for at tillade deres overfladefastgørelse i det porøse medium.
    BEMÆRK: At efterlade bakteriecellerne ved nul-flow-betingelser i 3 timer blev optimeret til fastgørelse af den anvendte bakteriestamme, samtidig med at der sikres en godt iltet bakteriekultur. Andre bakteriestammer kan kræve mere eller mindre tid.
  10. For at starte forsøget skal du starte flowet ved at indstille sprøjtepumpen til den ønskede flowhastighed (her 1 ml/time) og starte trykaflæsningen ved 1 Hz.
  11. Få billeder af den voksende biofilm med det ønskede tidsinterval, optisk konfiguration og forstørrelse.
    BEMÆRK: I denne undersøgelse blev billeder ved 4x forstørrelse i lysfelttilstand i 18 positioner, der spænder over hele domænet af det porøse medium, erhvervet hvert 6. minut i 24 timer.

5. Billedanalyse

  1. Rekonstruer hele det porøse medium ud fra de billedsekvenser, der er optaget, ved at sy billederne fra de 18 positioner ved hjælp af billedanalysesoftware (se materialetabel) og en syningsalgoritme24.
  2. Gem de syede billedsekvenser som en sekvens af enkeltbilleder.
    BEMÆRK: Hvis filerne er for store, kan billederne på dette tidspunkt skaleres og binned til en rimelig størrelse til videre behandling.
  3. Opret en maske af søjlerne i det porøse medium for at fjerne dem fra analysen.
  4. Billedernes baggrund fjernes ved at dividere dem med deres baggrund med billedet taget ved t = 0 h (figur 2A), og binarisere billederne ved en tærskel, der er egnet til at segmentere biofilmen (figur 2B).
  5. Biofilmens mætning beregnes ved at beregne det areal, der er dækket af biofilmen (antal pixels, der tilskrives biofilmen) sammenlignet med det porøse domænes tomrumsareal (figur 3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Til denne undersøgelse blev en mikrofluidisk enhed med tre parallelle mikrofluidiske kanaler med forskellige porestørrelser anvendt (figur 1) til systematisk at studere biofilmdannelse i porøse medier. Biofilmdannelsesprocessen blev visualiseret ved hjælp af lysfeltmikroskopi. Bakteriecellerne og biofilmen optrådte i billederne som mørkere pixels (figur 2). Derudover blev der observeret en gradvis tilstopningsproces; Under et 24 timers eksperiment koloniserede den oprindeligt tilfældigt voksende biofilm næsten hele det porøse medium.

Biofilmens overfladedækning i tid dyrket med en strømningshastighed på Q = 1 ml/h, hvilket svarer til en gennemsnitlig indledende væskestrømningshastighed på 0,96 mm/s, blev kvantificeret for tre forskellige porestørrelser (75 μm, 150 μm og 300 μm) (figur 3, sorte linjer). Det blev konstateret, at overfladedækningen, der blev brugt som proxy for biotilstopningsgraden, forekom 10% hurtigere ved den mindste porestørrelse på 75 μm end ved den største porestørrelse (300 μm), når overfladedækningen ved t = 20 timer sammenlignes. Derefter blev overfladedækningen korreleret med trykopbygningen forårsaget af biofilmen (figur 3, blå linjer). Tilstopningen i den mindre porestørrelse mikrofluidiske kanal førte til en højere trykforskel mellem indløbet og udløbet end i de større porestørrelse mikrofluidiske kanaler, hvilket indikerer, at mindre porøse medier vil udvikle højere trykopbygning, når de udsættes for biotilstopning.

Figure 1
Figur 1: Design af mikrofluidiske kanaler og eksperimentel opsætning. (A) Fotomaske af mikrofluidiske kanaler med forskellige porestørrelser (75 μm, 150 μm og 300 μm) anvendt som porøse medieanaloger og et zoomet billede af søjlernes arrangement (nederste række). Cirklerne viser placeringen af søjlerne (uigennemtrængelige forhindringer), der repræsenterer det porøse medies faste fase. (B) Skematisk oversigt over forsøgsopstillingen, der viser sprøjten, tryksensoren, den mikrofluidiske anordning (med en enkelt mikrofluidisk kanal) og digitalkameraets opsætning med målet (dvs. mikroskopet). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Visualisering og kvantificering af biofilmudvikling i det porøse medium. (A) Repræsentativ billedsekvens af biofilmens udvikling ved den pålagte strømningshastighed på Q = 1 ml/h (svarer til en gennemsnitlig indledende væskestrømningshastighed på 0,96 mm/s) og en porestørrelse på d = 300 μm vist for forsøgstiderne t = 5 h, t = 10 h, t = 15 h og t = 20 h . Lysfeltbillederne blev syet, og baggrunden blev fjernet. (B) Binariseringen af disse billeder og kvantificeringen af det område, der er optaget af biofilm (mørke pixels), førte til kvantificering af overfladedækning i figur 3. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Tidsmæssig udvikling af biofilmdækning og indvirkning på tryk. Biofilmdækning med samtidig trykaflæsning for de tre porestørrelser (300 μm, 150 μm og 75 μm) under samme forsøgsbetingelser som figur 2. Trykforskellen forårsaget af biofilmen i den porøse medium mikrofluidiske kanal, Δp, (blå linjer) vist på højre y-akse, øges med en øget overfladedækning af biofilmen (sorte linjer). De grønne markører svarer til datapunkterne på billederne vist i figur 2. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mikrofluidiske porøse medieanaloger kombineret med tryksensorer giver et passende værktøj til at studere biofilmudvikling i porøse medier. Alsidigheden i designet af det mikrofluidiske porøse medium, specifikt arrangementet af søjlerne, herunder diameter, uregelmæssige former og porestørrelse, tillader undersøgelse af mange geometrier. Disse geometrier spænder fra enkelte porer til meget komplekse, uregelmæssigt arrangerede forhindringer, der efterligner forskellige naturlige (f.eks. Jord) og industrielle (f.eks. Membraner og filtre) porøse medier. I den nuværende mikrofluidiske platform blev der skabt tre porøse mediegeometrier med regelmæssigt arrangerede cylindriske søjler (porestørrelser: 75 μm, 150 μm og 300 μm), hvor væskestrømningshastigheden kunne vælges pr. Eksperiment. Den præsenterede platform kan let tilpasses til at studere biotilstopning med et fast trykhoved snarere end en pålagt væskestrømningshastighed. I dette tilfælde skal strømningsreguleringsanordningen være en trykregulator med et dyrkningsmediumreservoir i stedet for en sprøjtepumpe. De resulterende ændringer i strømningshastighed på grund af biotilstopning kunne overvåges ved at måle udstrømningen over tid ved hjælp af en strømningshastighedssensor.

Flere kritiske punkter skal overvejes for at køre et vellykket mikrofluidisk eksperiment med biofilmvækst. For at undgå dannelse af luftbobler i den mikrofluidiske kanal under eksperimentet blev den mikrofluidiske kanal og dyrkningsmediet afgasset (trin 4.3). Dernæst skal påfyldning af den mikrofluidiske kanal med det afgassede dyrkningsmedium udføres hurtigt, men omhyggeligt for at opnå en fuldt mættet kanal uden luftbobler. Hvis luftbobler er fanget i det porøse medium, kan skylning af den mikrofluidiske kanal med en højere strømningshastighed fjerne boblerne efter kort tid. Det andet afgørende skridt er at sikre et konstant temperaturmiljø for at reproducere biofilmvækst konsekvent. Væksten af mikroorganismer varierer med temperatur 25, hvilket kan føre til ikke-reproducerbare resultater, når temperaturen ikke holdes stabil under eksperimentet (i dette tilfælde24 timer). Til den nuværende platform blev en boksinkubator brugt omkring mikroskopet, selvom et mindre temperaturstabilt hus til den mikrofluidiske enhed sandsynligvis også ville være tilstrækkelig. Endelig skal positionerne for de enkelte billeder under billedoptagelsen vælges med en overlapning på mindst 15% for at opnå tilstrækkelig overlapning til syningsalgoritmen24.

Den nuværende mikrofluidiske platform er begrænset til todimensionel observation, mens porøse medieapplikationer som jord eller membraner har en tredimensionel struktur. Fordelene ved den kvasi-2D mikrofluidiske platform sammenlignet med 3D-porøse medieplatforme til at studere biotilstopning er imidlertid den fulde optiske adgang og den høje tidsopløsning, da 3D-platforme normalt udfører slutpunktsbilleddannelse26,27. Derudover forventes det, at biotilstopningsprocessen (dvs. tidsudviklingen af overfladedækning) fortsætter i 3D-systemer 26,27, da den også forekommer for klyngestørrelsesfordelingen af en ublandbar fase inden for porøse medier28, som præsenterer den samme skalering i2D- og 3D-systemer.

Denne metode gør det muligt at måle trykresponsen på biofilmvækst i porøse medier, mens man studerer dens rumlige-tidsmæssige udvikling ved høj tidsmæssig og rumlig opløsning og forskellige porestørrelser. De datasæt, der opnås fra sådanne målinger, giver indsigt i sammenhængen mellem poreskala biofilmudvikling og trykresponser i det biofilmporøse mediesystem og kan give et benchmark for numerisk modellering af biofilm. Disse modelleringsbestræbelser er især relevante for at udvide rækkevidden af betingelser (f.eks. Porestørrelser, strømningshastigheder og biofilmegenskaber for andre arter eller multispecies biofilm), der overstiger eksperimentel kapacitet. Sidstnævnte er yderst relevant for at forstå mekanismerne for biotilstopning i nærheden af brønde, bioremedieringsapplikationer og biomineralisering 29,30,31. Samlet set kunne denne metode let tilpasses til at studere biomineralisering eller spore biotransformation af forurenende stoffer af biofilm i porøse medier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.

Acknowledgments

Forfatterne anerkender støtte fra SNSF PRIMA-tilskud 179834 (til ES), skønsmæssig finansiering fra ETH (til RS), ETH Zürich Research Grant (til RS og JHM) og skønsmæssig finansiering fra Eawag (til JHM). Forfatterne vil gerne takke Roberto Pioli for at illustrere den eksperimentelle opsætning i figur 1B og Ela Burmeister for forberedelsen af siliciumskiven.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acrodisc 25 mm Syringe Filter, 1.2 µm Versapor Membrane Pall Corporation PN4190 1.2 µm filters
BD 10 mL Syringe (Luer-Lock) BD 300912 used to fill the channel with deionised water
Box Incubator Life Imaging Services used to have a stable temperature during the biofilm growth experiment
Cell density meter CO8000 WPA biowave OD meter
Centrifuge vial Eppendorf 30120086 1.5 mL
CETONI Base 120 CETONI GmbH syringe pump
CorelCAD CorelDRAW software used to design the microfluidic channel geometries
Culture tubes (14 mL, sterile) greiner bio-one Culture tubes
Drying oven, VENTI-Line VWR Oven to cure the PDMS
Handy Migros Detergent solution
Hot plate with temperature control VRW to cure the PDMS-glass bonding after plasma treatment
ImageJ FIJI  Image analysis software
Innova 42 Inc Shaker (New Brunswick) Eppendorf Incubator
Isopropanol (> 99.8%) Sigma Aldrich 67-63-0
Masterflex transfer tubing Masterflex HV-06419-05 0.020'' ID, 0.06'' OD
Micro Slides, Plain, 75 x 60 mm Corning 2947-75X50 Glass slides
Microfluidic pressure sensor (1 bar) Elveflow Pressure sensors
Miltex Biopsy puncher, diameter 1.5 mm Integra Puncher to make the inlet and outlet holes of the microfluidic channel
mrDev600 developer Microresist
Nikon Eclipse Ti2 Nikon Instruments Microscope
Nutrient broth n°3 Sigma Aldrich
Omnifix Syringe with Luer-Lock B.Braun syringes of different volume
Plasma chamber Zepto Diener Electronic ZEPTO-1  used to plasma bond the PDMS and the glass slide
Precision wipes (Kimtech Science) Kimberly Clark KCP-7552 to dry the glass slide
Scale VWR-CH 611-2605 used to weigh the elastomer to crosslinking agent ratio
Silicon wafer (10 cm) Silicon Materials Inc.  N//Phos <100> 1-10 Ω cm
Spincoater, Spin module SM150 Sawatec
SU8 3050 Photoresist Kayakuam
Süss MA6 Mask aligner SUSS MicroTec Group used to align the chrome-glass mask
Sylgard 184 Dow Corning silicone elastomer kit; curing agent
Techni Etch Cr01 Technic Technic
Tissue culture dish 150 TPP 93150
Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H perfluorooctyl) silane Sigma Aldrich Sigma Aldrich used to silanize the silicane wafer
Veeco Dektak 6 M Veeco Profilometer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Flemming, H. C., Wuertz, S. Bacteria and archaea on Earth and their abundance in biofilms. Nature Reviews Microbiology. 17 (4), 247-260 (2019).
  2. Cunningham, A. B., Sharp, R. R., Hiebert, R., James, G. Subsurface biofilm barriers for the containment and remediation of contaminated groundwater. Bioremediation Journal. 7 (3-4), 151-164 (2003).
  3. Pronk, W., et al. Gravity-driven membrane filtration for water and wastewater treatment: A review. Water Research. 149, 553-565 (2019).
  4. Caldara, M., Belgiovine, C., Secchi, E., Rusconi, R. Environmental, microbiological, and immunological features of bacterial biofilms associated with implanted medical devices. Clinical Microbiology and Infection. 35 (2), 00221 (2022).
  5. Flemming, H. C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nature Reviews Microbiology. 8 (9), 623-633 (2010).
  6. Davey, M. E., O'Toole, G. A. Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64 (4), 847-867 (2000).
  7. Stoodley, P., Dodds, I., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. Influence of hydrodynamics and nutrients on biofilm structure. Journal of Applied Microbiology. 85 (1), 19-28 (1998).
  8. Thomen, P., et al. Bacterial biofilm under flow: First a physical struggle to stay, then a matter of breathing. PLoS ONE. 12 (4), 0175197 (2017).
  9. Horn, H., Reiff, H., Morgenroth, E. Simulation of growth and detachment in biofilm systems under defined hydrodynamic conditions. Biotechnology and Bioengineering. 81 (5), 607-617 (2003).
  10. Thullner, M., Mauclaire, L., Schroth, M. H., Kinzelbach, W., Zeyer, J. Interaction between water flow and spatial distribution of microbial growth in a two-dimensional flow field in saturated porous media. Journal of Contaminant Hydrology. 58 (3-4), 169-189 (2002).
  11. Bottero, S., et al. Biofilm development and the dynamics of preferential flow paths in porous media. Biofouling. 29 (9), 1069-1086 (2013).
  12. Durham, W. M., Tranzer, O., Leombruni, A., Stocker, R. Division by fluid incision: Biofilm patch development in porous media. Physics of Fluids. 24 (9), 091107 (2012).
  13. Coyte, K. Z., Tabuteau, H., Gaffney, E. A., Foster, K. R., Durham, W. M. Microbial competition in porous environments can select against rapid biofilm growth. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (2), 161-170 (2017).
  14. Taylor, S. W., Jaffé, P. R. Biofilm growth and the related changes in the physical properties of a porous medium: 1. Experimental investigation. Water Resources Research. 26 (9), 2153-2159 (1990).
  15. Cunningham, A. B., Characklls, W. G., Abedeen, F., Crawford, D. Influence of biofilm accumulation on porous media hydrodynamics. Environmental Science and Technology. 25 (7), 1305-1311 (1991).
  16. Valiei, A., Kumar, A., Mukherjee, P. P., Liu, Y., Thundat, T. A web of streamers: Biofilm formation in a porous microfluidic device. Lab on a Chip. 12 (24), 5133-5137 (2012).
  17. Biswas, I., Sadrzadeh, M., Kumar, A. Impact of bacterial streamers on biofouling of microfluidic filtration systems. Biomicrofluidics. 12 (4), 044116 (2018).
  18. Hassanpourfard, M., Ghosh, R., Thundat, T., Kumar, A. Dynamics of bacterial streamers induced clogging in microfluidic devices. Lab on a Chip. 16 (21), 4091-4096 (2016).
  19. Stewart, T. L., Scott Fogler, H. Pore-scale investigation of biomass plug development and propagation in porous media. Biotechnology and Bioengineering. 77 (5), 577-588 (2002).
  20. Hassanpourfard, M., Ghosh, R., Thundat, T., Kumar, A. Dynamics of bacterial streamers induced clogging in microfluidic devices. Lab on a Chip. 16 (21), 4091-4096 (2016).
  21. Aufrecht, J. A., et al. Pore-scale hydrodynamics influence the spatial evolution of bacterial biofilms in a microfluidic porous network. PLoS ONE. 14 (6), 0218316 (2019).
  22. Karimifard, S., Li, X., Elowsky, C., Li, Y. Modeling the impact of evolving biofilms on flow in porous media inside a microfluidic channel. Water Research. 188, 116536 (2021).
  23. Yawata, Y., Nguyen, J., Stocker, R., Rusconi, R. Microfluidic studies of biofilm formation in dynamic environments. Journal of Bacteriology. 198 (19), 2589-2595 (2016).
  24. Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions. Bioinformatics. 25 (11), 1463-1465 (2009).
  25. Ratkowsky, D. A., Olley, J., McMeekin, T. A., Ball, A. Relationship between temperature and growth rate of bacterial cultures. Journal of Bacteriology. 149 (1), 1-5 (1982).
  26. Ostvar, S., et al. Investigating the influence of flow rate on biofilm growth in three dimensions using microimaging. Advances in Water Resources. 117, 1-13 (2018).
  27. Carrel, M., et al. Biofilms in 3D porous media: Delineating the influence of the pore network geometry, flow and mass transfer on biofilm development. Water Research. 134, 280-291 (2018).
  28. Iglauer, S., Favretto, S., Spinelli, G., Schena, G., Blunt, M. J. X-ray tomography measurements of power-law cluster size distributions for the nonwetting phase in sandstones. Physical Review E. 82 (5), 10-12 (2010).
  29. Wu, C., Chu, J., Wu, S., Cheng, L., van Paassen, L. A. Microbially induced calcite precipitation along a circular flow channel under a constant flow condition. Acta Geotechnica. 14 (3), 673-683 (2019).
  30. Nassar, M. K., et al. Large-scale experiments in microbially induced calcite precipitation (MICP): reactive transport model development and prediction. Water Resources Research. 54 (1), 480-500 (2018).
  31. Jimenez-Martinez, J., Nguyen, J., Or, D. Controlling pore-scale processes to tame subsurface biomineralization. Reviews in Environmental Science and Biotechnology. 21 (1), 27-52 (2022).

Tags

Tilbagetrækning nr. 188
En mikrofluidisk platform til at studere biotilstopning i porøse medier
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kurz, D. L., Secchi, E., Stocker,… More

Kurz, D. L., Secchi, E., Stocker, R., Jimenez-Martinez, J. A Microfluidic Platform to Study Bioclogging in Porous Media. J. Vis. Exp. (188), e64689, doi:10.3791/64689 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter