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Environment

छिद्रपूर्ण मीडिया में बायोक्लॉगिंग का अध्ययन करने के लिए एक माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफॉर्म

Published: October 13, 2022 doi: 10.3791/64689
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1,2
1Department of Civil, Environmental and Geomatic Engineering, Institute of Environmental Engineering, ETH Zurich, 2Department Water Resources and Drinking Water, Swiss Federal Institute of Aquatic Science and Technology

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल एक साथ दबाव अंतर माप के साथ उच्च-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के संयोजन से अर्ध-2 डी छिद्रपूर्ण मीडिया में बायोफिल्म विकास का अध्ययन करने के लिए एक माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफॉर्म का वर्णन करता है। मंच बायोक्लॉगिंग पर छिद्रपूर्ण मीडिया में छिद्र आकार और द्रव प्रवाह दर के प्रभाव को निर्धारित करता है।

Abstract

बैक्टीरियल बायोफिल्म मिट्टी और निस्पंदन झिल्ली सहित कई पर्यावरणीय और औद्योगिक छिद्रपूर्ण मीडिया में पाए जाते हैं। बायोफिल्म कुछ प्रवाह स्थितियों के तहत बढ़ते हैं और छिद्रों को बंद कर सकते हैं, जिससे स्थानीय द्रव प्रवाह को पुनर्निर्देशित किया जा सकता है। छिद्रों को बंद करने के लिए बायोफिल्म की क्षमता, तथाकथित बायोक्लॉगिंग, छिद्रपूर्ण माध्यम की स्थानीय पारगम्यता पर जबरदस्त प्रभाव डाल सकती है, सिस्टम में दबाव निर्माण कर सकती है, और इसके माध्यम से द्रव्यमान प्रवाह को प्रभावित कर सकती है। विभिन्न भौतिक परिस्थितियों (जैसे, विभिन्न प्रवाह वेगों और छिद्र आकारों पर) के तहत बायोफिल्म विकास और द्रव प्रवाह के बीच परस्पर क्रिया को समझने के लिए, वर्तमान अध्ययन में, बाहरी रूप से लगाए गए, नियंत्रित भौतिक परिस्थितियों के तहत माइक्रोस्कोप का उपयोग करके बायोफिल्म विकास की कल्पना करने के लिए एक माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफॉर्म विकसित किया गया है। छिद्रपूर्ण माध्यम में बायोफिल्म-प्रेरित दबाव बिल्डअप को दबाव सेंसर का उपयोग करके एक साथ मापा जा सकता है और बाद में, बायोफिल्म की सतह कवरेज के साथ सहसंबद्ध किया जा सकता है। प्रस्तुत मंच प्रवाह स्थितियों के तहत छिद्रपूर्ण मीडिया में बायोफिल्म के कारण बायोक्लॉगिंग के कारण होने वाली बायोक्लॉगिंग की जांच के लिए एक व्यवस्थित दृष्टिकोण के लिए एक आधार रेखा प्रदान करता है और इसे पर्यावरणीय आइसोलेट्स या बहु-प्रजाति बायोफिल्म का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

Introduction

बायोफिल्म - अतिरिक्त-बहुलक पदार्थों (ईपीएस) के स्व-स्रावित मैट्रिक्स में एम्बेडेड जीवाणु उपनिवेश - प्राकृतिक छिद्रपूर्ण मीडिया में सर्वव्यापी हैं, जैसे कि मिट्टी और जलभृत1, और तकनीकी और चिकित्सा अनुप्रयोग, जैसे बायोरेमेडिएशन2, जल निस्पंदन3 और चिकित्सा उपकरण4। बायोफिल्म मैट्रिक्स में पॉलीसेकेराइड, प्रोटीन फाइबर और बाह्य डीएनए 5,6 शामिल हैं, और दृढ़ता से सूक्ष्मजीवों, पोषक तत्वों की उपलब्धता, साथ ही पर्यावरणीय स्थितियों पर निर्भर करताहै। फिर भी, मैट्रिक्स के कार्य सार्वभौमिक हैं; यह बायोफिल्म संरचना का मचान बनाता है, माइक्रोबियल समुदाय को यांत्रिक और रासायनिक तनाव से बचाता है, और बायोफिल्म के रियोलॉजिकलगुणों के लिए काफी हद तक जिम्मेदार है।

छिद्रपूर्ण मीडिया में, बायोफिल्म की वृद्धि छिद्रों को बंद कर सकती है, जिससे तथाकथित बायोक्लॉगिंग हो सकती है। बायोफिल्म विकास को द्रव प्रवाह और छिद्र आकार द्वारा नियंत्रित किया जाता है, जिसे छिद्रपूर्ण माध्यम 8,9,10 के दो स्तंभों को अलग करने वाली दूरी के रूप में परिभाषित किया गया है। छिद्र आकार और द्रव प्रवाह दोनों पोषक तत्व परिवहन और स्थानीय कतरनी बलों को नियंत्रित करते हैं। बदले में, बढ़ता बायोफिल्म छिद्रों को बंद कर देता है,द्रव 11,12,13 के वेग वितरण, बड़े पैमाने पर परिवहन और छिद्रपूर्ण माध्यम14,15 की हाइड्रोलिक चालकता को प्रभावित करता है। हाइड्रोलिक चालकता में परिवर्तन सीमित प्रणालियों16,17,18,19 में बढ़े हुए दबाव के माध्यम से परिलक्षित होते हैं। बायोफिल्म विकास और बायोक्लॉगिंग में वर्तमान माइक्रोफ्लुइडिक अध्ययन सजातीय ज्यामिति16,20 (यानी, एक विलक्षण छिद्र आकार के साथ) या विषम छिद्रपूर्ण मीडिया 12,21,22 में प्रवाहवेगों के प्रभाव का अध्ययन करने पर ध्यान केंद्रित करते हैं। हालांकि, बायोफिल्म विकास पर प्रवाह दर और छिद्र आकार के प्रभावों और बायोक्लॉग किए गए छिद्रपूर्ण माध्यम में परिणामी दबाव परिवर्तनों को अलग करने के लिए, एक अत्यधिक नियंत्रणीय और बहुमुखी प्रयोगात्मक मंच की आवश्यकता होती है जो समानांतर में विभिन्न छिद्रपूर्ण मीडिया ज्यामिति और पर्यावरणीय परिस्थितियों के अध्ययन की अनुमति देता है।

वर्तमान अध्ययन एक माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफॉर्म का परिचय देता है जो छिद्रपूर्ण माध्यम के भीतर विकसित बायोफिल्म की एक साथ इमेजिंग के साथ दबाव माप को जोड़ता है। चैनल ज्यामिति डिजाइन में इसकी गैस-पारगम्यता, जैव-संगतता और लचीलेपन के कारण, पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) से बना एक माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस छिद्रपूर्ण मीडिया में बायोफिल्म विकास का अध्ययन करने के लिए एक उपयुक्त उपकरण है। माइक्रोफ्लुइडिक्स माइक्रोबियल आवासों के पर्यावरण की नकल करने के लिए उच्च परिशुद्धता के साथ भौतिक और रासायनिक स्थितियों (जैसे, द्रव प्रवाह और पोषक तत्व एकाग्रता) के नियंत्रण की अनुमतिदेता है। इसके अलावा, माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों को ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके माइक्रोमेट्रिक रिज़ॉल्यूशन के साथ आसानी से चित्रित किया जा सकता है और ऑनलाइन माप (जैसे, स्थानीय दबाव) के साथ युग्मित किया जा सकता है।

इस काम में, प्रयोग नियंत्रित लगाए गए प्रवाह स्थितियों के तहत एक सजातीय छिद्रपूर्ण माध्यम एनालॉग में छिद्र आकार के प्रभाव का अध्ययन करने पर ध्यान केंद्रित करते हैं। एक संस्कृति माध्यम का प्रवाह एक सिरिंज पंप का उपयोग करके लगाया जाता है, और माइक्रोफ्लुइडिक चैनल के माध्यम से दबाव अंतर को दबाव सेंसर के साथ एक साथ मापा जाता है। बायोफिल्म विकास माइक्रोफ्लुइडिक चैनल में बेसिलस सब्टिलिस की एक प्लवक संस्कृति को सीड करके शुरू किया जाता है। विकसित बायोफिल्म और छवि विश्लेषण की नियमित इमेजिंग विभिन्न प्रयोगात्मक परिस्थितियों में सतह कवरेज पर छिद्र पैमाने पर हल की गई जानकारी प्राप्त करने की अनुमति देती है। दबाव परिवर्तन की सहसंबद्ध जानकारी और बायोक्लॉगिंग की सीमा बायोक्लॉगिंग छिद्रपूर्ण मीडिया के पारगम्यता अनुमानों के लिए महत्वपूर्ण इनपुट प्रदान करती है।

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Protocol

1. सिलिकॉन वेफर तैयारी

  1. कंप्यूटर-एडेड डिज़ाइन (सीएडी; सामग्री की तालिका देखें) सॉफ्टवेयर में माइक्रोफ्लुइडिक चैनल के ज्यामिति को डिजाइन करें और फोटोमास्क बनाने के लिए इसे एक पारदर्शी फिल्म पर प्रिंट करें (चित्रा 1 ए)।
  2. नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए नरम लिथोग्राफी (साफ कमरे की स्थिति के तहत) द्वारा मास्टर मोल्ड का निर्माण करें।
    1. सिलिकॉन वेफर को 2 घंटे के लिए 200 डिग्री सेल्सियस पर बेक करें।
    2. वेफर को स्पिन-कोटर के केंद्र में रखें और वेफर पर एसयू8 3050 फोटोरेसिस्ट ( सामग्री की तालिका देखें) डालें। 10 s/100 आरपीएम रैंप समय के साथ 40 सेकंड के लिए 1,700 आरपीएम पर स्पिन कोट।
      नोट: स्पिन-कोटिंग पैरामीटर एसयू 8 3050 के लिए 100 μm की लक्ष्य मोटाई प्राप्त करने के लिए सेट किए गए थे।
    3. स्पिन-कोटिंग प्रक्रिया के बाद, सिलिकॉन वेफर को 600 सेकंड के लिए 65 डिग्री सेल्सियस और 2,700 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर नरम बेक करें। वेफर को रात भर कमरे के तापमान पर ठंडा होने दें।
      नोट: रात भर ठंडा होने से एसयू 8 के वेफर में आसंजन बढ़ जाता है।
    4. फोटोमास्क (चरण 1.1) को वेफर पर रखें और इसे यूवी प्रकाश में उजागर करें, जिसमें 250 एमजे / सेमी2 की एक्सपोजर ऊर्जा और 350 एनएम की तरंग दैर्ध्य पर है।
    5. एक्सपोज़र के बाद, उजागर सब्सट्रेट को 60 सेकंड के लिए 65 डिग्री सेल्सियस और 300 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर बेक करें।
    6. mrDev600 डेवलपर से भरे बीकर में डुबोकर मास्टर मोल्ड प्राप्त करने के लिए सिलिकॉन वेफर विकसित करें ( सामग्री की तालिका देखें)। बिना पॉलिमराइज्ड प्रतिरोध को धोने के लिए धीरे से बीकर को 1,800 सेकंड तक हिलाएं। फिर, सिलिकॉन वेफर पर आइसोप्रोपेनॉल छिड़ककर धोएं और हवा को सूखा दें।
    7. सिलिकॉन वेफर को 1,800 सेकंड के लिए 200 डिग्री सेल्सियस पर बेक करें।
  3. 20 μL Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perflurooctyl) सिलेन ( सामग्री की तालिका देखें) के वाष्प जमाव के माध्यम से मास्टर मोल्ड को सिलनाइज़ करें, जिसे एक वैक्यूम डेसिकेटर में 40 मिनट के लिए मोल्ड के बगल में एक ग्लास स्लाइड पर रखा गया है, जिससे 100 mbar का गेज दबाव बनता है।

2. माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस का निर्माण

नोट: यहां वर्णित निर्माण प्रक्रिया एक माइक्रोफ्लुइडिक चैनल के साथ एक माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस के लिए है। हालांकि, समानांतर में कई माइक्रोफ्लुइडिक चैनलों के साथ एक माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस बनाने के लिए एक ही विधि लागू की जा सकती है।

  1. पीडीएमएस मिश्रण तैयार करने के लिए 10: 1 ( सामग्री की तालिका देखें) के अनुपात में इलास्टोमर को अपने क्रॉसलिंकर के साथ मिलाएं। मिश्रण को तब तक हिलाएं जब तक कि यह समान रूप से मिश्रित न हो जाए और संलग्न हवा के बुलबुले के कारण अपारदर्शी न हो जाए।
  2. मिश्रण को वैक्यूम डेसिकेटर में विभाजित करें, जिससे 100 मीटर का गेज दबाव बनता है जब तक कि संलग्न हवा के बुलबुले को हटा नहीं दिया जाता है और यह पारदर्शी दिखता है। डिगैसिंग के लिए आवश्यक समय आमतौर पर 30 मिनट है।
  3. सेल कल्चर डिश में मास्टर मोल्ड (चरण 1) रखें ( सामग्री की तालिका देखें)। 5 मिमी की अंतिम मोटाई वाले चैनलों का उत्पादन करने के लिए मास्टर मोल्ड पर पीडीएमएस मिश्रण का 20 ग्राम डालें।
  4. मास्टर मोल्ड को 2 घंटे के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर बेक करें।
  5. ब्लेड का उपयोग करके माइक्रोफ्लुइडिक चैनल (लगभग 3 मिमी की दूरी पर) के चारों ओर ठीक किए गए पीडीएमएस को काटें, और फिर मास्टर मोल्ड से पीडीएमएस माइक्रोफ्लुइडिक चैनल को छीलें।
  6. माइक्रोफ्लुइडिक चैनलों के इनलेट और आउटलेट बनाने के लिए, बायोप्सी पंच (1.5 मिमी का व्यास) के साथ छिद्रों को इसके छोरों पर (त्रिकोण के शीर्ष पर, चित्र 1 ए देखें)। बाद में दबाव सेंसर स्थापित करने के लिए इनलेट त्रिकोण के केंद्र में एक अतिरिक्त छेद पंच करें।
  7. एक ग्लास स्लाइड और माइक्रोफ्लुइडिक चैनल को व्यावसायिक रूप से उपलब्ध 1% डिटर्जेंट समाधान ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ 5 मिनट के लिए धोएं, फिर उन्हें विआयनीकृत पानी से धो लें। इसके बाद, पीडीएमएस माइक्रोफ्लुइडिक चैनल और ग्लास स्लाइड को आइसोप्रोपेनॉल के साथ धो लें। फिर, उन्हें फिर से विआयनीकृत पानी से धो लें। पीडीएमएस माइक्रोफ्लुइडिक चैनल और ग्लास स्लाइड को 1 मिनट के लिए 1 बार पर संपीड़ित हवा के साथ सुखाएं।
    नोट: बॉन्डिंग प्रभावी होने के लिए पीडीएमएस की छिद्रपूर्ण संरचना पूरी तरह से सूखी होनी चाहिए।
  8. ग्लास स्लाइड और माइक्रोफ्लुइडिक चैनल को प्लाज्मा क्लीनर में रखें ( सामग्री की तालिका देखें) और सुनिश्चित करें कि बंधी हुई सतहों का सामना किया जा रहा है। प्लाज्मा क्लीनर चालू करें और माइक्रोफ्लुइडिक चैनल और ग्लास स्लाइड को 1 मिनट के लिए 1 एसएल / घंटा (मानक लीटर प्रति घंटे) के एयरफ्लो पर एयर प्लाज्मा के साथ इलाज करें। माइक्रोफ्लुइडिक चैनल को एक दूसरे के संपर्क में डालकर क्लीनर से बाहर निकालने के तुरंत बाद ग्लास स्लाइड में बांध दें।
    नोट: सुनिश्चित करें कि उपचारित सतहों को स्पर्श न करें, क्योंकि यह संबंध को प्रभावित कर सकता है। कई माइक्रोफ्लुइडिक चैनलों के साथ एक माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस बनाते समय, माइक्रोफ्लुइडिक चैनलों को एक साथ उजागर करें और उन्हें एक ही चरण में बांधें।
  9. बंधुआ माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस को कम से कम 15 मिनट के लिए 80 डिग्री सेल्सियस हॉट प्लेट पर रखें।
  10. प्रयोग शुरू होने तक माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस को एक स्वच्छ सेल कल्चर डिश में स्टोर करें।

3. बैक्टीरियल निलंबन की तैयारी

  1. प्रयोग की शुरुआत से पहले बेसिलस सब्टिलिस एनसीआईबी 3610 20 घंटे पहले 15 एमएल कल्चर ट्यूब में जमे हुए ग्लिसरॉल स्टॉक से सीधे 3 एमएल पोषक शोरबा नंबर 3 कल्चर माध्यम ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके विकसित करें। रात भर (16 घंटे के लिए) 30 डिग्री सेल्सियस और 200 आरपीएम पर एक हिलने वाले इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें।
  2. प्रयोग की शुरुआत से 4 घंटे पहले 15 एमएल कल्चर ट्यूब में 3 एमएल फ्रेश कल्चर मीडियम (1: 1,000 कमजोर पड़ने) में रात भर की संस्कृति के 3 μL जोड़कर एक उपसंस्कृति बनाएं। 0.1 के 600 एनएम (ओडी 600) पर ऑप्टिकल घनत्व प्राप्त करने के लिए 3.5-4 घंटे के लिए 200 आरपीएम पर 30 डिग्री सेल्सियस परएक हिलने वाले इनक्यूबेटर में उपसंस्कृति को इनक्यूबेट करें।

4. बायोफिल्म विकास प्रयोग

  1. 25 डिग्री सेल्सियस के स्थिर तापमान को सुनिश्चित करने के लिए प्रयोग से 3 घंटे पहले माइक्रोस्कोप के बॉक्स इनक्यूबेटर को चालू करें। सिरिंज पंप और दबाव सेंसर माउंट करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  2. इनलेट और आउटलेट टयूबिंग को माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस से कनेक्ट करें। ट्यूबिंग और सिरिंज के बीच संबंध को सुरक्षित करने के लिए सीधे इनलेट टयूबिंग में एक सुई (0.6 मिमी के बाहरी व्यास के साथ) डालें।
  3. माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस, 30 एमएल विआयनीकृत पानी, और 30 एमएल कल्चर माध्यम को वैक्यूम डेसिकेटर में रखें और उन्हें कम से कम 1 घंटे के लिए डिगैस करें। फिर, धीरे-धीरे संस्कृति माध्यम और विआयनीकृत पानी को दो अलग-अलग 30 एमएल सिरिंज में खींचें।
    नोट: संस्कृति माध्यम के साथ फ्लश करते समय चैनल में बुलबुला गठन को रोकने के लिए यह कदम महत्वपूर्ण है।
  4. माइक्रोस्कोप पर माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस को माउंट करें और आउटलेट ट्यूबिंग को एक अपशिष्ट कंटेनर में रखें।
    1. विआयनीकृत पानी से भरे सिरिंज को माइक्रोफ्लुइडिक ट्यूबिंग के माध्यम से माइक्रोफ्लुइडिक चैनल से कनेक्ट करें और धीरे-धीरे पानी को इंजेक्ट करें जब तक कि यह दबाव सेंसर आउटलेट से बाहर न निकल जाए। प्रेशर सेंसर को पानी से भरें और माइक्रोफ्लुइडिक चैनल और प्रेशर सेंसर को जोड़ने वाली ट्यूबिंग से सभी बुलबुले फ्लश करें। दबाव सेंसर के लिए समर्पित स्क्रू के साथ दबाव सेंसर के आउटलेट को बंद करें।
      नोट: वर्णित भरने की प्रक्रिया यह सुनिश्चित करती है कि माइक्रोफ्लुइडिक चैनलों के इनलेट पर दबाव परिवर्तन ठीक से दर्ज किए जाएंगे। कई माइक्रोफ्लुइडिक चैनलों के साथ एक प्रयोग चलाते समय, सभी चैनलों में समान प्रवाह की स्थिति सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक चैनल को एक अलग सिरिंज से कनेक्ट करें।
  5. शेष माइक्रोफ्लुइडिक चैनल को विआयनीकृत पानी से भरें।
  6. संस्कृति मीडिया सिरिंज पर एक 1.2 μm फ़िल्टर ( सामग्री की तालिका देखें) रखें। फिर, पानी की सिरिंज को हटा दें और संस्कृति मीडिया सिरिंज को इनलेट माइक्रोफ्लुइडिक टयूबिंग से सावधानीपूर्वक कनेक्ट करें। सिरिंज पंप पर सिरिंज को माउंट करें और 1 घंटे के लिए 2 एमएल / घंटा की प्रवाह दर पर संस्कृति माध्यम के साथ चैनल को फ्लश करें।
    नोट: फ़िल्टर लोडिंग के दौरान बैक्टीरिया कोशिकाओं को सिरिंज में प्रवेश करने से रोकता है। संस्कृति मीडिया के साथ माइक्रोफ्लुइडिक चैनल को फ्लश करने से छिद्रपूर्ण संरचना में शेष बुलबुले हटा दिए जाएंगे।
  7. प्रयोग के दौरान वांछित प्रवाह दर (यहां 1 एमएल / घंटा) पर सिरिंज पंप सेट करें और दबाव सेंसर के दबाव रीडिंग को शून्य पर सेट करें।
    नोट: प्रारंभिक दबाव रीडिंग को शून्य पर सेट करके, प्रयोग के दौरान बायोफिल्म विकास के कारण केवल दबाव अंतर मापा जाएगा।
  8. 1.5 एमएल सेंट्रीफ्यूज शीशी में 0.1 के ओडी600 पर बैक्टीरियल कल्चर का पिपेट 1 एमएल। आउटलेट ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज शीशी में रखकर माइक्रोफ्लुइडिक चैनल में बैक्टीरियल कल्चर लोड करें। ट्यूबों के आउटलेट से किसी भी संभावित हवा के बुलबुले को हटाने के लिए 5 मिनट तक इंतजार करने के बाद, 1 एमएल / घंटा की प्रवाह दर पर 150 μL जीवाणु समाधान वापस लें, जब तक कि माइक्रोफ्लुइडिक चैनल जीवाणु संस्कृति से भर न जाए।
  9. संस्कृति मीडिया सिरिंज फ़िल्टर को ध्यान से हटा दें और आउटलेट को अपशिष्ट कंटेनर में रखें। बैक्टीरिया कोशिकाओं को 3 घंटे के लिए माइक्रोफ्लुइडिक चैनल में शून्य-प्रवाह की स्थिति में छोड़ दें ताकि छिद्रपूर्ण माध्यम में उनकी सतह लगाव की अनुमति मिल सके।
    नोट: 3 घंटे के लिए शून्य-प्रवाह की स्थिति में जीवाणु कोशिकाओं को छोड़ना एक अच्छी तरह से ऑक्सीजन युक्त जीवाणु संस्कृति का आश्वासन देते हुए उपयोग किए जाने वाले जीवाणु तनाव के लगाव के लिए अनुकूलित किया गया था। अन्य जीवाणु उपभेदों को अधिक या कम समय की आवश्यकता हो सकती है।
  10. प्रयोग शुरू करने के लिए, सिरिंज पंप को वांछित प्रवाह दर (यहां 1 एमएल / एच) पर सेट करके प्रवाह शुरू करें और 1 हर्ट्ज पर दबाव रीडिंग शुरू करें।
  11. वांछित समय अंतराल, ऑप्टिकल कॉन्फ़िगरेशन और आवर्धन पर बढ़ते बायोफिल्म की छवियां प्राप्त करें।
    नोट: वर्तमान अध्ययन में, छिद्रपूर्ण माध्यम के पूरे डोमेन में फैले 18 पदों में उज्ज्वल-क्षेत्र मोड में 4x आवर्धन पर छवियों को 24 घंटे के लिए हर 6 मिनट में प्राप्त किया गया था।

5. छवि विश्लेषण

  1. छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर ( सामग्री की तालिका देखें) और एक सिलाई एल्गोरिथ्म24 का उपयोग करके 18 पदों से छवियों को सिलाई करके दर्ज छवि अनुक्रमों से पूरे छिद्रपूर्ण माध्यम का पुनर्निर्माण करें।
  2. सिले हुए छवि अनुक्रमों को एकवचन छवियों के अनुक्रम के रूप में सहेजें।
    नोट: यदि फाइलें बहुत बड़ी हैं, तो इस बिंदु पर, छवियों को आगे की प्रक्रिया के लिए उचित आकार में पुन: स्केल और बिन किया जा सकता है।
  3. विश्लेषण से उन्हें हटाने के लिए छिद्रपूर्ण माध्यम के स्तंभों का एक मुखौटा बनाएं।
  4. छवियों की पृष्ठभूमि को उनकी पृष्ठभूमि से t = 0 h (चित्रा 2A) पर ली गई छवि के साथ विभाजित करके हटा दें और बायोफिल्म (चित्रा 2 बी) को विभाजित करने के लिए उपयुक्त सीमा पर छवियों को बिनाराइज करें।
  5. छिद्रपूर्ण डोमेन के शून्य क्षेत्र की तुलना में बायोफिल्म (बायोफिल्म के लिए जिम्मेदार पिक्सेल की संख्या) द्वारा कवर किए गए क्षेत्र की गणना करके बायोफिल्म की संतृप्ति की गणना करें (चित्रा 3)।

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Representative Results

वर्तमान अध्ययन के लिए, छिद्रपूर्ण मीडिया में बायोफिल्म गठन का व्यवस्थित रूप से अध्ययन करने के लिए विभिन्न छिद्र आकारों के साथ तीन समानांतर माइक्रोफ्लुइडिक चैनलों के साथ एक माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस का उपयोग किया गया था (चित्रा 1)। बायोफिल्म निर्माण प्रक्रिया को उज्ज्वल-क्षेत्र माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके कल्पना की गई थी। जीवाणु कोशिकाएं और बायोफिल्म छवियों में गहरे पिक्सेल (चित्रा 2) के रूप में दिखाई दिए। इसके अलावा, एक क्रमिक क्लॉगिंग प्रक्रिया देखी गई; 24 घंटे के प्रयोग के दौरान, शुरू में बेतरतीब ढंग से बढ़ने वाले बायोफिल्म ने लगभग पूरे छिद्रपूर्ण माध्यम को उपनिवेशित किया।

Q = 1 mL/h की प्रवाह दर पर उगाए गए समय में बायोफिल्म की सतह कवरेज, जो 0.96 मिमी / सेकंड के औसत प्रारंभिक द्रव प्रवाह वेग से मेल खाती है, को तीन अलग-अलग छिद्र आकारों (75 μm, 150 μm, और 300 μm) के लिए परिमाणित किया गया था (चित्रा 3, काली रेखाएं)। यह पाया गया कि सतह कवरेज, जिसे बायोक्लॉगिंग डिग्री के लिए प्रॉक्सी के रूप में उपयोग किया गया था, टी = 20 घंटे पर सतह कवरेज की तुलना करते समय सबसे बड़े छिद्र आकार (300 μm) की तुलना में 75 μm के सबसे छोटे छिद्र आकार पर 10% तेजी से हुआ। फिर, सतह कवरेज बायोफिल्म (चित्रा 3, नीली रेखाओं) के कारण दबाव बिल्डअप से संबंधित था। छोटे छिद्र आकार के माइक्रोफ्लुइडिक चैनल में क्लॉगिंग ने बड़े छिद्र आकार के माइक्रोफ्लुइडिक चैनलों की तुलना में इनलेट और आउटलेट के बीच उच्च दबाव अंतर पैदा किया, यह दर्शाता है कि छोटे आकार के छिद्रपूर्ण मीडिया बायोक्लॉगिंग के अधीन होने पर उच्च दबाव बिल्डअप विकसित करेंगे।

Figure 1
चित्र 1: माइक्रोफ्लुइडिक चैनल डिजाइन और प्रायोगिक सेटअप। (A) विभिन्न छिद्र आकारों (75 μm, 150 μm, और 300 μm) के साथ माइक्रोफ्लुइडिक चैनलों का फोटोमास्क छिद्रपूर्ण मीडिया एनालॉग के रूप में उपयोग किया जाता है और स्तंभों की व्यवस्था (नीचे पंक्ति) के ज़ूम-इन दृश्य के रूप में उपयोग किया जाता है। मंडलियां स्तंभों (अभेद्य बाधाओं) के स्थान को दिखाती हैं, जो छिद्रपूर्ण मीडिया के ठोस चरण का प्रतिनिधित्व करती हैं। (बी) प्रायोगिक सेटअप का योजनाबद्ध जिसमें सिरिंज, दबाव सेंसर, माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस (एकल माइक्रोफ्लुइडिक चैनल के साथ), और उद्देश्य (यानी माइक्रोस्कोप) के साथ डिजिटल कैमरा सेटअप दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: छिद्रपूर्ण माध्यम में बायोफिल्म विकास का विज़ुअलाइज़ेशन और परिमाणीकरण। (A) Q = 1 mL/h की अधिरोपित प्रवाह दर पर बायोफिल्म विकास का प्रतिनिधि छवि अनुक्रम (0.96 मिमी/सेकंड के औसत प्रारंभिक द्रव प्रवाह वेग से मेल खाता है) और प्रयोगात्मक समय बिंदु t = 5 h के लिए दिखाए गए d = 300 μm का छिद्र आकार, t = 10 h, t = 15 h, और t = 20 h उज्ज्वल-क्षेत्र छवियों को सिला गया था, और पृष्ठभूमि को हटा दिया गया था। (ख) इन छवियों के बिनाराइजेशन और बायोफिल्म (डार्क पिक्सल) द्वारा कब्जा किए गए क्षेत्र का परिमाणीकरण करने से चित्र 3 में सतह कवरेज का परिमाणीकरण हुआ। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: बायोफिल्म कवरेज का अस्थायी विकास और दबाव पर प्रभाव। चित्रा 2 के समान प्रयोगात्मक स्थितियों में तीन छिद्र आकारों (300 μm, 150 μm, और 75 μm) के लिए एक साथ दबाव रीडिंग के साथ बायोफिल्म कवरेज। छिद्रपूर्ण मध्यम माइक्रोफ्लुइडिक चैनल में बायोफिल्म के कारण दबाव का अंतर, Y-अक्ष पर दिखाया गयाहै, (नीली रेखाएं), बायोफिल्म (काली रेखाओं) की बढ़ी हुई सतह कवरेज के साथ बढ़ता है। हरे मार्कर चित्रा 2 में दिखाए गए चित्रों के डेटा बिंदुओं के अनुरूप हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

दबाव सेंसर के साथ युग्मित माइक्रोफ्लुइडिक छिद्रपूर्ण मीडिया एनालॉग छिद्रपूर्ण मीडिया में बायोफिल्म विकास का अध्ययन करने के लिए एक उपयुक्त उपकरण प्रदान करते हैं। माइक्रोफ्लुइडिक छिद्रपूर्ण माध्यम के डिजाइन में बहुमुखी प्रतिभा, विशेष रूप से स्तंभों की व्यवस्था, जिसमें व्यास, अनियमित आकार और छिद्र आकार शामिल हैं, कई ज्यामिति की जांच की अनुमति देता है। ये ज्यामिति एकल छिद्रों से लेकर अत्यधिक जटिल, अनियमित रूप से व्यवस्थित बाधाओं तक विभिन्न प्राकृतिक (जैसे, मिट्टी) और औद्योगिक (जैसे, झिल्ली और फिल्टर) छिद्रपूर्ण मीडिया की नकल करती हैं। वर्तमान माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफॉर्म में, नियमित रूप से व्यवस्थित बेलनाकार स्तंभों (छिद्र आकार: 75 μm, 150 μm, और 300 μm) के साथ तीन छिद्रपूर्ण मीडिया ज्यामिति बनाई गई थी, जहां द्रव प्रवाह दर प्रति प्रयोग चुना जा सकता था। प्रस्तुत मंच को आसानी से लगाए गए द्रव प्रवाह दर के बजाय एक निश्चित दबाव सिर के साथ बायोक्लॉगिंग का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। इस मामले में, प्रवाह नियंत्रण उपकरण एक सिरिंज पंप के बजाय एक संस्कृति मध्यम जलाशय के साथ एक दबाव नियंत्रक होना चाहिए। बायोक्लॉगिंग के कारण प्रवाह दर में परिणामी परिवर्तनों को प्रवाह दर सेंसर का उपयोग करके समय के साथ बहिर्वाह को मापकर निगरानी की जा सकती है।

बायोफिल्म विकास के साथ एक सफल माइक्रोफ्लुइडिक प्रयोग चलाने के लिए कई महत्वपूर्ण बिंदुओं पर विचार किया जाना चाहिए। प्रयोग के दौरान माइक्रोफ्लुइडिक चैनल में एयर बबल गठन से बचने के लिए, माइक्रोफ्लुइडिक चैनल और संस्कृति माध्यम को डिगैस किया गया (चरण 4.3)। इसके बाद, किसी भी हवा के बुलबुले के बिना पूरी तरह से संतृप्त चैनल प्राप्त करने के लिए माइक्रोफ्लुइडिक चैनल को डिगैस्ड कल्चर माध्यम के साथ भरना तेजी से लेकिन सावधानीपूर्वक आयोजित किया जाना चाहिए। यदि हवा के बुलबुले छिद्रपूर्ण माध्यम में फंस जाते हैं, तो उच्च प्रवाह दर पर माइक्रोफ्लुइडिक चैनल को फ्लश करने से थोड़े समय के बाद बुलबुले को हटाया जा सकता है। दूसरा महत्वपूर्ण कदम बायोफिल्म विकास को लगातार पुन: उत्पन्न करने के लिए एक निरंतर तापमान वातावरण सुनिश्चित करना है। सूक्ष्मजीवों की वृद्धि तापमान25 के साथ भिन्न होती है, जिससे प्रयोग के दौरान तापमान स्थिर नहीं रखने पर गैर-प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम हो सकते हैं (इस मामले में, 24 घंटे)। वर्तमान मंच के लिए, माइक्रोस्कोप के चारों ओर एक बॉक्स इनक्यूबेटर का उपयोग किया गया था, हालांकि माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस के लिए एक छोटा तापमान-स्थिर आवरण भी पर्याप्त होगा। अंत में, छवि अधिग्रहण के दौरान, सिलाई एल्गोरिदम24 के लिए पर्याप्त ओवरलैप प्राप्त करने के लिए व्यक्तिगत छवियों की स्थिति को कम से कम 15% के ओवरलैप के साथ चुना जाना चाहिए।

वर्तमान माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफॉर्म दो-आयामी अवलोकन तक सीमित है, जबकि मिट्टी या झिल्ली जैसे छिद्रपूर्ण मीडिया अनुप्रयोगों में तीन आयामी संरचना होती है। हालांकि, बायोक्लॉगिंग का अध्ययन करने के लिए 3 डी छिद्रपूर्ण मीडिया प्लेटफार्मों की तुलना में अर्ध-2 डी माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफॉर्म के फायदे पूर्ण ऑप्टिकल एक्सेस और उच्च समय रिज़ॉल्यूशन हैं, क्योंकि 3 डी प्लेटफॉर्म आमतौर पर एंडपॉइंट इमेजिंग26,27 करते हैं। इसके अलावा, यह उम्मीद की जाती है कि बायोक्लॉगिंग प्रक्रिया (यानी, सतह कवरेज का समय विकास) 3 डी सिस्टम26,27 में बनी रहती है, क्योंकि यह छिद्रपूर्ण मीडिया 28 के भीतर एक अपरिवर्तनीय चरण के क्लस्टर आकार वितरण के लिए भी होता है, जो2 डी और 3 डी सिस्टम में समान स्केलिंग प्रस्तुत करता है।

यह विधि उच्च लौकिक और स्थानिक रिज़ॉल्यूशन और विभिन्न छिद्र आकारों पर इसके स्थानिक-अस्थायी विकास का अध्ययन करते हुए छिद्रपूर्ण मीडिया में बायोफिल्म विकास के लिए दबाव प्रतिक्रिया को मापने की अनुमति देती है। इस तरह के मापों से प्राप्त डेटा सेट बायोफिल्म-छिद्रपूर्ण माध्यम प्रणाली के दबाव प्रतिक्रियाओं के साथ छिद्र-पैमाने पर बायोफिल्म विकास के सहसंबंध में अंतर्दृष्टि लाते हैं, और बायोफिल्म के संख्यात्मक मॉडलिंग के लिए एक बेंचमार्क प्रदान कर सकते हैं। ये मॉडलिंग प्रयास विशेष रूप से स्थितियों की सीमा (जैसे, छिद्र आकार, प्रवाह वेग, और अन्य प्रजातियों या बहु-प्रजाति बायोफिल्म के लिए बायोफिल्म गुण) का विस्तार करने के लिए प्रासंगिक हैं जो प्रयोगात्मक क्षमताओं से अधिक हैं। उत्तरार्द्ध कुओं, बायोरेमेडिएशन अनुप्रयोगों और बायोमिनरलाइजेशन 29,30,31 के आसपास के क्षेत्र में बायोक्लॉगिंग के तंत्रको समझने के लिए अत्यधिक प्रासंगिक है। कुल मिलाकर, इस विधि को आसानी से बायोमिनरलाइजेशन का अध्ययन करने या छिद्रपूर्ण मीडिया में बायोफिल्म द्वारा दूषित पदार्थों के बायोट्रांसफॉर्म को ट्रैक करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखक ों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

लेखक एसएनएसएफ प्राइमा अनुदान 179834 (ई.एस.), ईटीएच (आरएस को), ईटीएच ज्यूरिख रिसर्च ग्रांट (आरएस और जेजेएम को) से विवेकाधीन वित्त पोषण और ईवाग (जेजेएम के लिए) से विवेकाधीन वित्त पोषण से समर्थन स्वीकार करते हैं। लेखक चित्र 1 बी में प्रयोगात्मक सेटअप को चित्रित करने के लिए रॉबर्टो पियोली और सिलिकॉन वेफर तैयारी के लिए इला बर्मिस्टर को धन्यवाद देना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acrodisc 25 mm Syringe Filter, 1.2 µm Versapor Membrane Pall Corporation PN4190 1.2 µm filters
BD 10 mL Syringe (Luer-Lock) BD 300912 used to fill the channel with deionised water
Box Incubator Life Imaging Services used to have a stable temperature during the biofilm growth experiment
Cell density meter CO8000 WPA biowave OD meter
Centrifuge vial Eppendorf 30120086 1.5 mL
CETONI Base 120 CETONI GmbH syringe pump
CorelCAD CorelDRAW software used to design the microfluidic channel geometries
Culture tubes (14 mL, sterile) greiner bio-one Culture tubes
Drying oven, VENTI-Line VWR Oven to cure the PDMS
Handy Migros Detergent solution
Hot plate with temperature control VRW to cure the PDMS-glass bonding after plasma treatment
ImageJ FIJI  Image analysis software
Innova 42 Inc Shaker (New Brunswick) Eppendorf Incubator
Isopropanol (> 99.8%) Sigma Aldrich 67-63-0
Masterflex transfer tubing Masterflex HV-06419-05 0.020'' ID, 0.06'' OD
Micro Slides, Plain, 75 x 60 mm Corning 2947-75X50 Glass slides
Microfluidic pressure sensor (1 bar) Elveflow Pressure sensors
Miltex Biopsy puncher, diameter 1.5 mm Integra Puncher to make the inlet and outlet holes of the microfluidic channel
mrDev600 developer Microresist
Nikon Eclipse Ti2 Nikon Instruments Microscope
Nutrient broth n°3 Sigma Aldrich
Omnifix Syringe with Luer-Lock B.Braun syringes of different volume
Plasma chamber Zepto Diener Electronic ZEPTO-1  used to plasma bond the PDMS and the glass slide
Precision wipes (Kimtech Science) Kimberly Clark KCP-7552 to dry the glass slide
Scale VWR-CH 611-2605 used to weigh the elastomer to crosslinking agent ratio
Silicon wafer (10 cm) Silicon Materials Inc.  N//Phos <100> 1-10 Ω cm
Spincoater, Spin module SM150 Sawatec
SU8 3050 Photoresist Kayakuam
Süss MA6 Mask aligner SUSS MicroTec Group used to align the chrome-glass mask
Sylgard 184 Dow Corning silicone elastomer kit; curing agent
Techni Etch Cr01 Technic Technic
Tissue culture dish 150 TPP 93150
Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H perfluorooctyl) silane Sigma Aldrich Sigma Aldrich used to silanize the silicane wafer
Veeco Dektak 6 M Veeco Profilometer

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Kurz, D. L., Secchi, E., Stocker, R., Jimenez-Martinez, J. A Microfluidic Platform to Study Bioclogging in Porous Media. J. Vis. Exp. (188), e64689, doi:10.3791/64689 (2022).

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