Studerer tilvænning i Stentor coeruleus

Summary

Vi introducerer en metode til kvantificering af Stentor-tilvænning ved hjælp af et mikrocontroller-kortbundet apparat, der kan levere mekaniske impulser ved en bestemt kraft og frekvens. Vi inkluderer også metoder til samling af apparatet og opsætning af eksperimentet på en måde, der minimerer eksterne forstyrrelser.

Abstract

Læring er normalt forbundet med et komplekst nervesystem, men der er stigende tegn på, at livet på alle niveauer, ned til enkeltceller, kan vise intelligent adfærd. I både naturlige og kunstige systemer er læring den adaptive opdatering af systemparametre baseret på ny information, og intelligens er et mål for den beregningsproces, der letter læring. Stentor coeruleus er en encellet damboende organisme, der udviser habituation, en form for læring, hvor et adfærdsmæssigt respons falder efter en gentagen stimulus. Stentor kontraherer som reaktion på mekanisk stimulering, hvilket er en tilsyneladende flugtrespons fra akvatiske rovdyr. Imidlertid inducerer gentagne forstyrrelser med lav kraft tilvænning, demonstreret ved en progressiv reduktion i sammentrækningssandsynlighed. Her introducerer vi en metode til kvantificering af Stentor-tilvænning ved hjælp af et mikrocontroller-kortbundet apparat, der kan levere mekaniske impulser ved en bestemt kraft og frekvens, herunder metoder til opbygning af apparatet og opsætning af eksperimentet på en måde, der minimerer eksterne forstyrrelser. I modsætning til de tidligere beskrevne tilgange til mekanisk stimulering af Stentor tillader denne enhed, at stimuleringskraften varieres under computerstyring i løbet af et enkelt eksperiment, hvilket i høj grad øger de forskellige inputsekvenser, der kan anvendes. At forstå tilvænning på niveau med en enkelt celle vil hjælpe med at karakterisere læringsparadigmer, der er uafhængige af komplekse kredsløb.

Introduction

Læring er normalt forbundet med et komplekst nervesystem, men der er stigende tegn på, at livet på alle niveauer, ned til enkeltceller, kan vise intelligent adfærd. I både naturlige og kunstige systemer er læring den adaptive opdatering af systemparametre baseret på ny information¹, og intelligens er et mål for beregningsprocessen, der letter læring².

Stentor coeruleus er en encellet damboende organisme, der udviser habituation, en form for læring, hvor et adfærdsmæssigt respons falder efter en gentagen stimulus³. Stentor trækker sig sammen som reaktion på mekanisk stimulering³, som er en tilsyneladende flugtrespons fra akvatiske rovdyr. Imidlertid inducerer gentagne forstyrrelser med lav kraft tilvænning, demonstreret ved en progressiv reduktion i sammentrækningssandsynlighed³. Den vante Stentor trækker sig stadig sammen efter at have modtaget mekanisk stimulering^med høj kraft 4 eller fotisk stimulering⁵. Disse observationer, der stemmer overens med Thompson og Spencers klassiske kriterier for tilvænning hos dyr⁶, tyder stærkt på, at den oprindelige kontraktile responsforringelse skyldes læring snarere end træthed eller ATP-udtømning. Som en fritlevende celle kan Stentor studeres uden meget interferens fra omgivende celler, som det ville være tilfældet i et flercellet væv. Flere yderligere funktioner gør Stentor til et medgørligt system til at studere læring: dets store størrelse (1 mm), dets kvantificerbare tilvænningsrespons³, den lette injektion og mikromanipulation⁷, det fuldt sekventerede genom⁸ og tilgængeligheden af RNA-interferens (RNAi) værktøjer⁹. Brug af denne modelorganisme til at udforske celleindlæring uden hjerne eller nervesystem kræver en reproducerbar procedure til stimulering af Stentor-celler og måling af responsen.

Her introducerer vi en metode til kvantificering af Stentor-tilvænning ved hjælp af et mikrocontroller-kortbundet apparat, der kan levere mekaniske impulser ved en bestemt kraft og frekvens, herunder metoder til opbygning af apparatet og opsætning af eksperimentet på en måde, der minimerer eksterne forstyrrelser (figur 1). At forstå tilvænning på niveau med en enkelt celle vil hjælpe med at karakterisere læringsparadigmer, der er uafhængige af komplekse kredsløb.

Figur 1: Opsætning af tilvænningseksperiment. Petri-pladen, der indeholder Stentor , placeres oven på tilvænningsanordningens fleksible metallineal. Tilvænningsanordningens anker rammer derefter metallinealen med en bestemt kraft og frekvens, hvilket producerer en stimulusbølge over cellefeltet. USB-mikroskopkameraet registrerer Stentors reaktioner på stimuleringen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2: Oversigt over arbejdsgangen for tilvænningseksperimentet. Figuren viser de grundlæggende trin, der er involveret i at studere Stentor ved hjælp af tilvænningsenheden. Figuren blev skabt med BioRender.com. Tilpasset fra "Process Flowchart", af BioRender.com (2022). Hentet fra https://app.biorender.com/biorender-templates. Klik her for at se en større version af denne figur.

Protocol

BEMÆRK: En oversigt over arbejdsgangen for tilvænningseksperimentet er vist i figur 2.

1. Montering af tilvænningsanordningen

1. Hæng motordriveren til motoren (se figur 3).
   1. Tilslut de to ledninger mærket A fra førerkortet til de blå og røde ledninger på motoren. Tilslut de to ledninger mærket B fra førerkortet til de grønne og sorte ledninger på motoren.
      BEMÆRK: Når man ser ned på førerkortet ovenfra med motorledningerne øverst, skal de fire indgangsledninger forbindes til motorledningerne i denne rækkefølge: blå, rød, sort og grøn.
2. Byg breadboard-kredsløbet vist i figur 4, med særlig omhu for at forbinde lysdioderne i den korrekte polaritet.
3. Tilslut Vcc (+5 V) fra førerkortet til den øverste skinne på det hvide brødbræt og Gnd fra førerkortet til brødbrættets nederste skinne.
4. Tilslut brødbrættets jord til mikrocontrollerkortets grundstift. Tilslut henholdsvis den grønne LED, røde LED, switch og knapledninger til mikrocontrollerkortets digitale ben 8, 9, 10 og 11.
5. Tilslut mikrocontrollerkortets digitale ben 2 og 3 til førerkortets ledninger Trin og Dir.
6. Tilslut mikrocontrollerkortets digitale ben 4, 5, 6 og 7 til driverkortets ledninger.
   1. Tilslut Pin 4 til MS1, tilslut Pin 5 til MS2, tilslut Pin 6 til MS3, og tilslut Pin 7 til Enable.
7. Strømforsyn førerkortet med en 12 V strømforsyning. Sæt 12 V-forsyningen i det sorte/grønne adapterstik, der er fastgjort med to røde ledninger til motorens førerkort.
   BEMÆRK: Sæt ikke 12 V-forsyningen i mikrocontrollerkortet.
8. Download kontrolprogrammet (https://github.com/WallaceMarshallUCSF/StentorHabituation/blob/main/stentor_habituator_stepper_v7.ino) på mikrocontrollerkortet.
9. Brug et USB-kabel til at fastgøre mikrocontrollerkortet til en computer, som også fungerer som strømkilde til mikrocontrollerkortet.
10. Kontroller, at brugerkontrollerne fungerer.
    1. Bekræft, at glidekontakten tænder og slukker for den automatiske tilstand. I automatisk tilstand tager systemet et skridt med jævne mellemrum angivet af brugeren (se nedenfor).
    2. Kontroller, at den grønne LED tændes, når den automatiske tilstand er tændt.
    3. Kontroller, at den røde LED blinker 1 s, før motoren aktiverer en puls. Den røde LED er en advarselslampe, der angiver, hvornår systemet er ved at levere en mekanisk puls.
    4. Test den røde knap, som udløser et 1/16 mikrotrin, hver gang der trykkes på knappen, uanset om systemet er i automatisk tilstand.

Figur 3: Komponenter i tilvænningsanordningen. Al mærket elektronik er påkrævet for at samle maskinen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 4: Elektronik skematisk. Dette er kredsløbet på brødbrættet. Ledningerne, der forbinder til mikrocontrollerkortet, er nummereret som beskrevet i protokollen. D1 og D2 er henholdsvis de røde og grønne lysdioder og er forbundet til jorden gennem 330 Ω modstande. De to kontakter trækkes op med 10 KΩ modstande. Klik her for at se en større version af denne figur.

2. Opsætning af tilvænningseksperimentet

1. Få Stentor.
2. Overtræk en 35 mm plade med 0,01% poly-ornithinopløsning.
   1. Tilsæt 3 ml af 0,01% polyornithinopløsningen til pladen og lad den stå natten over.
   2. Vask pladen to gange med ultrarent vand og en gang med pasteuriseret kildevand (PSW) (Materialebord).
3. Der tilsættes 3,5 ml PSW til 35 mm-pladen.
4. Vask Stentoren i en 6-brønds plade (Materialebord).
   1. Tilføj 3 ml PSW til den første brønd og 5 ml PSW til den anden og tredje brønd. Brug en P1.000-pipette til at tilføje 2 ml Stentor fra en kulturskål til den første brønd på 6-brøndspladen.
   2. Identificer individuel Stentor med et stereomikroskop (materialetabel), og brug derefter en P20-pipette til at overføre 100 Stentor fra den første brønd til den anden brønd.
   3. Identificer individuelle Stentor med et stereomikroskop, og brug derefter en P20-pipette til at overføre 100 Stentor fra den anden brønd til den tredje brønd.
5. Brug en P200-pipette til at overføre 100 Stentor i et samlet volumen på 500 μL fra den tredje brønd på 6-brøndspladen til 35 mm-pladen, således at det endelige volumen i 35 mm-pladen er 4 ml.
6. Tape et stykke (7 cm x 7 cm) hvidt papir til metallinealen på tilvænningsanordningen. Sørg for, at papirets venstre kant er 2 cm fra enden af linealen tættest på ankeret.
7. Brug dobbeltsidet tape til at klæbe bunden af 35 mm-pladen til midten af 2 in x 2 i papir oven på linealen på tilvænningsanordningen.
8. Lad 35 mm pladen stå på tilvænningsanordningen i mindst 2 timer (dette kan forlænges til natten over) med låget lukket. I hele denne akklimatiseringsperiode skal pladen holdes under omgivende lysforhold, der matcher de eksperimentelle lysforhold (dvs. udsætter ikke cellerne for lys / mørke udsving). Sørg desuden for, at pladen ikke oplever mekaniske forstyrrelser fra utilsigtet stød.
9. Centrer USB-mikroskopkameraet (Table of Materials) direkte over Stentors 35 mm plade. Placer om nødvendigt en prop, f.eks. en pipettespidsboks, under USB-mikroskopkameraet (universal serial bus) for at justere højden. Alternativt kan et ringstativ bruges til at justere højden.
10. Installer Webcam-optagerapplikationen på en bærbar computer (Table of Materials), og brug den til at visualisere cellerne via mikroskopindgangen.
    1. Åbn Webcam-optagerappen, og vælg USB-mikroskopet i rullemenuen. Juster fokus på USB-mikroskopkameraet, så cellerne er tydeligt synlige.
    2. Juster placeringen af USB-mikroskopkameraet for at maksimere antallet af celler i synsfeltet.
11. Åbn mikrocontrollerkortets serielle skærm: Vælg Ingen linjeafslutning , og indstil den til 9,600 baud.
12. Brug kommandoen l på mikrocontrollerkortprogrammet til at sænke ankeret, indtil det næsten ikke rører linealen. Brug kommandoen r til at løfte armen, hvis det er nødvendigt for at justere den nøjagtige position.
    BEMÆRK: Hvis ankeret er en betydelig afstand fra linealen, skal du indtaste d-kommandoen for at deaktivere motorspolestrømmen, så armen kan flyttes manuelt mod linealen. Når du har flyttet armen manuelt, skal du bruge kommandoen e til at aktivere motorspolestrømmen og holde armen låst på plads. Når den sænkes korrekt inden starten af et eksperiment, skal ankerets nederste spids være 1 cm væk fra linealens venstre kant. Armaturet leverer den mekaniske puls ved at ramme linealen.
13. Brug kommandoen i til at initialisere den automatiske tilstand på tilvænningsenheden.
14. Indtast trinstørrelsen i kommandolinjen. Niveau 5 er det mindste trin, og niveau 1 er det største trin. Niveau 4 er den trinstørrelse, der bruges til baseline habituationseksperimenter.
    BEMÆRK: En niveau 5-stimulus resulterer i en nedadgående forskydning af linealen med ~ 0,5 mm; Niveau 4 resulterer i nedadgående forskydning med ~ 1 mm; Niveau 3 resulterer i nedadgående forskydning med ~ 2 mm; Niveau 2 resulterer i nedadgående forskydning med ~ 3-4 mm; og niveau 1 resulterer i nedadgående forskydning med ~ 8 mm. En niveau 5 stimulus resulterer i en nedadgående spidskraft af ankeret mod herskeren på ~ 0,122 N; Niveau 4 resulterer i en nedadgående topkraft på ~0,288 N; og niveau 3 resulterer i en nedadgående topkraft på ~0,557 N. De nedadgående kræfter, der genereres af niveau 1 og niveau 2, er vanskeligere at empirisk kvantificere med et dynamometer på grund af de betydelige linealoscillationer, der opstår, efter at ankeret har fået kontakt.
15. Indtast tiden mellem pulser i minutter. Intervallet, der anvendes til baseline habituationseksperimenter, er 1 min.
16. Begynd at tage en video ved hjælp af Webcam-optagerappen ved at trykke på den røde optageknap. Drej derefter kontakten på tilvænningsapparatet for at starte eksperimentet med den første automatiserede mekaniske pulslevering.

3. Analyse af eksperimentvideoen

1. Umiddelbart før den første mekaniske puls vises på videoen, skal du pause og tælle antallet af Stentor , der både er forankret til bunden af 35 mm-pladen og forlænget i en langstrakt, trompetlignende form (figur 5A, video 1).
2. Umiddelbart efter den første puls tælles antallet af Stentor , der både er forankret til bunden af pladen og kontraheret i en kuglelignende form (figur 5B, video 1).
   BEMÆRK: Kontraherede celler kan let skelnes fra aflange celler, fordi Stentor forkorter deres kropslængde med over 50% inden for 10 ms under en sammentrækningshændelse³.
3. Divider den anden tælling med den første tælling for at bestemme den brøkdel af Stentor , der trak sig sammen som reaktion på den mekaniske stimulus.
4. Gentag trin 3.1-3.3 for alle de mekaniske impulser i eksperimentvideoen.

Figur 5: Stentor trækker sig sammen efter at have modtaget en mekanisk stimulus . (A) Stentoren er i deres aflange tilstand og forankret til bunden af Petri-pladen. (B) Stentoren har trukket sig sammen efter at have modtaget en mekanisk stimulering på niveau 4 fra tilvænningsanordningen. Billederne blev taget med et USB-mikroskop. Klik her for at se en større version af denne figur.

Video 1: Video af Stentor-kontrakt. Stentoren modtager en mekanisk stimulus på niveau 4 fra tilvænningsenheden hvert minut. Disse celler har endnu ikke vænnet sig til, så de trækker sig sammen efter at have modtaget pulsen. Cellerne er i Petri-pladen placeret oven på tilvænningsanordningen. Klik her for at downloade denne video.

Representative Results

Den ovenfor beskrevne metode, hvor den mekaniske impuls på niveau 4 anvendes med en frekvens på 1 hane/min, bør resultere i en progressiv reduktion i sammentrækningssandsynligheden for Stentor inden for 1 time. Dette er tegn på tilvænning (se figur 6, video 2).

Figur 6: Grundlæggende tilvænning. Sammentrækningssandsynligheden for Stentor falder gradvist i løbet af 1 time efter at have modtaget mekaniske impulser på niveau 4 med en frekvens på 1 tryk/min (n = 22-27). Klik her for at se en større version af denne figur.

Video 2. Video af vant Stentor. Cellerne modtager en mekanisk stimulus på niveau 4 efter 1 time efter at have modtaget mekaniske impulser med samme kraft med en frekvens på 1 tryk / min. De fleste af cellerne har vænnet sig til stimuli i løbet af timen og trækker sig derfor ikke sammen. Klik her for at downloade denne video.

Ændring af kraften og / eller frekvensen af den mekaniske pulslevering kan ændre Stentor-tilvænningsdynamikken. F.eks. udelukker brug af niveau 2-pulsen ved en frekvens på 1 tryk/min tilvænning i løbet af 1 time (se figur 7). En niveau 5 puls skal fremkalde sammentrækninger i få til nul Stentor.

Figur 7: Manglende tilvænning inden for 1 time for stærkere kræfter. Sammentrækningssandsynligheden for Stentor falder ikke mærkbart i løbet af 1 time efter at have modtaget mekaniske impulser på niveau 2 med en frekvens på 1 tryk/min (n = 7-33). Klik her for at se en større version af denne figur.

Discussion

De mest kritiske trin i protokollen vedrører at sikre, at Stentor forbliver under optimale betingelser for sammentrækninger. Sammentrækningsresponsen i tilvænningsanalysen kræver, at Stentors er forankret til en overflade ved hjælp af deres klæbrige holdfast, da de sjældent trækker sig sammen, når de svømmer frit. Bundfladen på den 35 mm Petri-plade, der anvendes til tilvænningsforsøg, er imidlertid typisk ikke befordrende for forankring, medmindre den er belagt med polyornithin. Desuden kan Stentor ikke udsættes for mekanisk forstyrrelse i mindst 2 timer før starten af tilvænningseksperimentet, fordi Stentor-glemselstidsskalaen er 2-6 h³. Hvis Stentor modtager mekanisk stimulering inden for 2 timer efter tilvænningseksperimentets starttidspunkt, er der en mulighed for, at denne forudgående stimulering vil fremkalde et lille niveau af tilvænning forud for eksperimentet og derved reducere sammentrækningssandsynligheden, efter at tilvænningsanordningen leverer den første mekaniske puls. Endelig er det i analysefasen vigtigt kun at tælle antallet af Stentor, der trækker sig sammen efter en puls - snarere end tilfældige spontane sammentrækninger, der opstår før pulsleveringen - for at opnå en nøjagtig aflæsning af den brøkdel af celler, der kontraherede som reaktion på den mekaniske stimulering.

Protokollen kan let ændres til at studere forskellige typer tilvænningsdynamikker ved at ændre kraften og frekvensen af de mekaniske impulser, der leveres af tilvænningsanordningen. Dette giver også mulighed for at udforske andre former for læring, såsom sensibilisering, der kan forekomme i Stentor. Selve mikrocontrollerkortets programkode kan også justeres for at levere forskellige mønstre af mekaniske vandhaner til Stentor.

Et potentielt problem at fejlfinde med denne protokol er den lave frekvens af Stentor-forankring, hvilket kan begrænse antallet af Stentor, der kan observeres i tilvænningseksperimentet. Forankringsfrekvensen reduceres undertiden i Stentor-kulturer, der ikke for nylig er blevet fodret eller er forurenet. For at løse dette problem skal man vaske et nyt parti Stentor for at starte en ny kultur og fodre dem regelmæssigt i henhold til protokollen beskrevet i Lin et ^al.10.

Denne protokol er begrænset, idet kun en enkelt plade Stentor kan testes ad gangen, hvilket resulterer i målinger med relativt lav kapacitet. Desuden tillader den nuværende software ikke automatisering af enkeltcellebilledanalyse. De fleste data, der er indsamlet, er derfor på befolkningsniveau. Fremtidige modeller af tilvænningsenheden og billedanalyseværktøjer kan lette enkeltcelleeksperimenter med høj kapacitet.

Tilvænning i Stentor er tidligere blevet undersøgt ved hjælp af metoder beskrevet af Wood³, men denne nye protokol gør det muligt at automatisere eksperimenter. Automatisering giver ikke kun forskeren mulighed for reproducerbart at levere mekaniske impulser med en bestemt kraft og frekvens, men letter også langsigtede tilvænningseksperimenter, da enheden kan lades køre uden tilsyn i dagevis. Desuden reducerer brugen af en stepmotor i stedet for solenoiden, der anvendes i Woods eksperimenter³ , risikoen for afmagnetisering over tid og tillader også styrken af stimulus at blive varieret i løbet af et enkelt eksperiment.

At studere cellulær tilvænning kan afsløre klinisk indsigt i tilstande som opmærksomhedsunderskud / hyperaktivitetsforstyrrelse (ADHD) og Tourettes syndrom, hvor tilvænning er nedsat¹¹. Stentor tilvænningsmekanismer kan også afsløre nye ikke-synaptiske læringsparadigmer uafhængigt af komplekse cellulære kredsløb. Endelig kan indsigt i enkeltcelleindlæring inspirere til metoder til omprogrammering af celler i flercellet væv - en anden potentiel vej til bekæmpelse af sygdom.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.01% Poly-ornithine	Millipore Sigma	P4957	Used to coat Petri plate
35-mm Petri plate	Benz Microscope Optics Center Inc.	L331	Contains Stentor during experiments
6-well plate	StemCell Technologies	38016	Used to wash Stentor
Aluminum breadboard, 4" x 24" x 1/2" (x1)	Thorlabs	MB424	Used to construct habituation device
Big easy driver stepper motor driver board (x1)	Sparkfun	ROB-12859	Used to construct habituation device
Construction rail, 1" x 5'' (x2)	Newport	Newport CR-1	Used to construct habituation device
Laptop	Apple Store	https://www.apple.com/macbook-air-m1/	Connect laptop to USB microscope to visualize experiments
Large right-angle bracket (x1)	Thorlabs	AP90RL	Used to construct habituation device
Microcontroller board	Arduino	A000066	Used to control habituation device
Nema 17 Stepper Motor Bipolar 59Ncm 2A 84oz.in 48mm 4-Lead	Stepperonline.com	5-17HS19-2004S1	Used to construct habituation device
Pasteurized spring water	Carolina	132458	Media for Stentor experiments
Right-angle bracket (x3)	Thorlabs	AP90	Used to construct habituation device
Stemi 2000 stereo microscope	Zeiss		Used to visualize Stentor during wash steps
Stentor coeruleus	Carolina	131598	These are the cells used for habituation experiments
USB microscope	Celestron	44308	Used to visualize and record experiments
Webcam recorder	Apple Store	https://apps.apple.com/us/app/webcam-recorder/id1508067444?mt=12	Install this application to take videos of experiments