Summary
アフリカツメガ エルは、その臓器の多くが驚くべき再生能力を持っているため、再生研究の理想的なモデルです。ここでは、X . tropicalis における心損傷モデルを頂点切除により構築する方法を提示する。
Abstract
成体哺乳類では、心臓が再生能力を失い、心不全が世界の主要な死因の1つになっていることが知られています。これまでの研究では、二倍体ゲノムと哺乳類との密接な進化関係を持つ無尾類両生類である成体 アフリカツメガエルの心臓の再生能力が実証されています。さらに、研究によると、心室頂点切除後、 心臓はX.トロピカリスで瘢痕化することなく再生できることが示されています。したがって、これらの以前の結果は、 X. tropicalis が成人の心臓再生の研究に適した代替脊椎動物モデルであることを示唆しています。成人 X.トロピカリス における心臓再生の手術モデルを本明細書に提示する。簡単に言えば、カエルは麻酔をかけられて固定されました。次に、虹彩切除術のハサミで小さな切開を行い、皮膚と心膜を貫通しました。心室に穏やかな圧力をかけ、心室の頂点をハサミで切り取りました。心臓損傷および再生は、切除後7〜30日(dpr)に組織学によって確認されました。このプロトコルは、成人の X. tropicalis の頂端切除モデルを確立し、成人の心臓再生のメカニズムを解明するために使用できます。
Introduction
心不全は、近年、世界中の主要な死亡原因となっています。2000年以降、心不全による死亡者数は時間とともに増加しています。2019年には900万人以上が心筋症で死亡し、これは世界の総死亡率の16%を占めました1。成体哺乳類では心臓の再生能力が失われるため、場合によっては、心臓の収縮機能を維持するのに十分な心筋細胞がなく、心臓機能に影響を及ぼし、異常な心室リモデリングおよび心不全の一因となります2,3,4。実際、哺乳類では、心臓は肝臓、肺、腸、膀胱、骨、皮膚などの他の臓器と比較して再生能力が最も低いです。世界人口の高齢化が世界的なメガトレンドになるにつれて、私たちが心臓病で直面する課題は激化するでしょう5。
心臓再生のメカニズムを解明することは、虚血性心疾患の治療に大きな意味を持つ可能性があります。報告によると、新生児マウスの心臓は、頂点切除6後に再生能力を有することが明らかになりました。それにもかかわらず、この再生能力は7歳の7日後に失われます。研究によると、成体の哺乳類の心臓は、心筋細胞の増殖能力が低下しているため、再生できません8,9。しかし、下等脊椎動物の心臓は、損傷後の強力な再生能力を持っています。例えば、ゼブラフィッシュ10、X. tropicalis11、アフリカツメガエル12、イモリ13、およびアホロートル14は、頂点切除後に完全に再生することができます。さらに、イモリの手足や熱帯のツメガエルの尾、レンズ、腕など、一部の下等脊椎動物の体の他の部分も完全に再生する可能性があります4,15,16。
心損傷モデルの確立は、心臓再生のメカニズムを解明するための第一歩であり、再生研究において大きな意義があります。研究者は、刺し傷、挫傷、遺伝子アブレーション、凍結損傷、梗塞など、心臓損傷モデルを構築するためのさまざまな方法を開発しました5,6。
凍結損傷、心筋梗塞(MI)、および心尖切除は、心臓損傷の誘発に広く使用されており、損傷の種類は、心筋細胞の次の再生に大きな影響を与える可能性があります6。外科的技術に応じて、再生に対する心臓の反応は異なる場合があります。凍結損傷は大量の細胞死を引き起こし、ゼブラフィッシュの心臓に線維性瘢痕を生成し17、哺乳類の梗塞に似たモデルを作成します。根尖切除は、ゼブラフィッシュ10 と X.トロピカリス11で行われてきた心室組織の一部を永久的な瘢痕を引き起こさずに切除することによって行われます。本研究では、凍結損傷よりも手術が簡単で必要な手術器具が少ない根尖切除術を実施しました。系統追跡解析を用いて、心臓再生がマウス6 とゼブラフィッシュ18の心臓にすでに存在する心筋細胞の増殖に関連していることが以前の研究で示されましたが、両生類についての報告はありません。したがって、 X. tropicalis の頂点切除モデルは、再生応答の根底にあるメカニズムを解明する上で重要な役割を果たしています。
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Protocol
X. tropicalisに関連するすべての実験プロトコルは、済南大学動物管理委員会によって承認されました。
1.手術
- 術前の準備: X.トロピカリスの心臓の頂点切除のために、眼用ハサミ、眼科用鉗子、針鉗子、吸収性ボール、ろ紙、および外科用縫合糸/針を準備しておいてください。詳細については、 材料の表 を参照してください。使用前に、すべての手術器具をオートクレーブ滅菌し、将来の使用に備えて十分な量の氷を準備してください。
- 成体の X.トロピカリス を500 mLのトリカイン溶液(1 mg / mL)に室温で4分間入れてトリカインで麻酔し19、手術台の氷の表面に置き、手術中にカエルが目覚めないようにします。
注意: 手順全体には5〜10分かかります。麻酔の時間は長すぎてはいけません、そうでなければ X.トロピカリスは 手術後に目を覚ますことができないかもしれません。 - 開 胸
- 麻酔をかけた X. tropicalis の腹部を上に置き、手術中の動物の皮膚の乾燥を避けるために、蒸留水にあらかじめ浸したガーゼでカエルの腹部を覆います。
- 鉗子で胸をそっと押し、胸の中心を下前肢と平行に見つけ、眼用ハサミで皮膚を持ち上げ、~1cmの小さな切開をそっと行います。眼科用ハサミを使用して、皮膚の下の筋肉層を拾い上げ、中央胸筋に傷を作ります。心臓は創傷部位の上部に位置するので、眼科用鉗子で胸部をそっと押して、創傷から心臓を絞り出します。
注意:X.トロピカリスの皮膚は抗菌ペプチドを産生することができるため、X.トロピカリスの手術部位で従来の消毒手順を使用する必要はありません。消毒剤はX.トロピカリスの皮膚を傷つけます。
- 心室尖端切除術
- 心膜を鉗子でやさしく固定し、心臓の頂点近くで眼用ハサミを使って静かに壊します。収縮期血液ポンプにより心膜が外れるのを待ちます(図1A、B)。
- 利き手でない手に鉗子で心臓の先端を持ち、心臓の収縮リズムに合わせて心臓を少し持ち上げます。心臓が収縮して血管を通って血液を再循環させたら、心臓の頂点(心室の~14%)を素早く切断します(図1C)。
- 頂点切除の量が心臓全体の約14%であることを確認するには、切除の有無にかかわらず心臓重量(HW)と表面積を分析します20。鉗子と吸収性ボールを使用して心臓を胸部に置きます。
注意: 鉗子で心臓を直接押さないでください。そうしないと、心臓の他の部分が穴を開けます。
- 4-0非吸収性非絹外科用糸縫合糸で皮膚を縫合する(図1D)。術後の死亡を防ぐために、筋肉層に縫合しないように注意してください。手術後1週間以内に皮膚の傷が自然に治癒するのを待ちます。
- 偽手術群では、胸腔切開を行い、心膜を開き、縫合し、頂端切除は行わない。
2.外科的回復
- 腹部を上に向けて術後の X.トロピカリス を少量の脱イオン水を入れたペトリ皿に入れます(動物を完全に浸水させないでください)。 X. tropicalis が~10分以内に目を覚ますのを待ちます。
- 意識を取り戻したら、動物の可動性と活動、および活動中の創傷縫合を観察します。バランスを取り戻したカエルを純水を入れた容器に移して栽培します。創傷感染を避けるために、毎日水を純水に交換してください。
注:これらの対策により、生存率は~90%に達する可能性があります。長時間の麻酔と手術中の過度の出血はどちらも死に至り、これは通常手術の日に起こります。
3.心損傷後の修復状態の検出
- X.トロピカリスの心臓を手術後の複数の時点で収集します。
- X. tropicalisをトリカインで麻酔した後、腹部を開き、鉗子を使用して他の内臓や組織を取り除き、心臓の位置を見つけます。
注:尖端切除のため、修復プロセス中に心臓が他の組織や臓器と一緒に発達する可能性があります。時々、それは筋肉壁に付着し、分離しにくいので、収集中は慎重に扱う必要があります。 - 心臓を見つけたら、鉗子を使用して心臓から他の臓器をそっと引き裂きます。心臓を囲む他の組織をそっと剥がして、心臓を露出させます。鉗子を使って心臓をそっと持ち上げ、ハサミで切り取ります。心臓をすぐにPBSに入れて残りの血液を取り除き、記録のためにステレオスコープで写真を撮ります(図2)。
- X. tropicalisをトリカインで麻酔した後、腹部を開き、鉗子を使用して他の内臓や組織を取り除き、心臓の位置を見つけます。
- 勾配脱水
- 心臓をろ紙で拭き取り、余分なPBS残留物を乾燥させ、24ウェル細胞培養皿に入れます。1〜2 mlの4%パラホルムアルデヒドを使用して、心臓組織を一晩固定します。翌日、エタノール脱水を行う。まず、70%エタノールを一晩使用し、続いて80%エタノール、90%エタノール、および100%エタノールを勾配脱水に使用します(各回1時間)。100%エタノールの使用を3回繰り返します。
- パラフィン包埋
- 脱水した心臓組織をキシレンで6〜8分間処理します。キシレン処理した組織をパラフィンワックスを充填したガラス容器に入れ、65°Cで2〜3時間放置する。
注意: 気泡は埋め込みプロセス中にセクションに影響を与えるため、避けることが不可欠です。
- 脱水した心臓組織をキシレンで6〜8分間処理します。キシレン処理した組織をパラフィンワックスを充填したガラス容器に入れ、65°Cで2〜3時間放置する。
- 包埋組織を-20°Cで1時間凍結し、切片化します。
- 心臓を切片化した後、標準的なヘマトキシリンとエオシン(H&E)およびマッソンのトリクローム染色法を切片11で実行します。
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Representative Results
心臓は0 dpr、7 dpr、14 dpr、および30 dprで収集されました。形態学的解析の結果、心臓損傷による血栓は30dprで消失することが明らかになりました(図2)。同時に、切除群の30dprでの心臓の外観は、偽手術群の心臓の外観と同様でした。明らかな傷はありませんでした(図2)。頂端切除後、H&E(図3)およびマッソンのトリクローム染色(図4)によって観察されるように、血栓が形成され、心室の創傷を密封した。14 dpr以内に、血餅は徐々に消失し、フィブリンに置き換えられました(図4)。14 dprから30 dprまで、心筋は徐々にフィブリンに置き換わり、損傷した心室頂点を修復しました(図4)。組織学的解析では、30 dprで偽心臓と切除心臓の間に差は見られませんでした(図3 および 図4)。この形態学的および組織学的解析により、成虫 X. tropicalisは 損傷した心室尖端を30dprで修復および再生できることが明らかになりました。
図1:外科的処置 。 (A)心膜で覆われた露出した心臓の代表的な画像。(B)心膜が剥離した収縮期における心臓の代表的な画像。破線は心臓の頂端切除部位を示す。(C)心臓の頂点切除術の代表像。(D)手術後の皮膚縫合糸の代表画像。スケールバー= 1 mm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:X. tropicalis心臓の0dprから30dprまでの形態学的解析。 (A)0dprでの偽切除群(左)と頂端切除群(右)の心臓の代表的な画像で、切除群では心臓の頂点が有意に存在しない。(B,C)7〜14 dprでの偽(左)と切除群(右)の心臓の代表的な画像で、7 dprの切除群の心臓に多くの血栓が現れました。14 dprでは、根尖切除部位で有意な再生が見られますが、心臓の頂点の端は均一ではありません。(D)30dprでの偽(左)対切除群(右)の心臓の代表的な画像。切除された心臓の頂点はほぼ完全に再生しています。スケールバー= 1 mm。略語:dpr =切除後の日数。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:アフリカツメガエルの心臓の組織学的分析(0 dprから30 dpr)。0 dpr〜30 dprでの偽および切除群の心臓を使用したH&E染色の代表的な画像。(A)偽群の心臓を用いたH&E染色の代表的な画像で、破線はおおよその切断面を示す。(B)0dprでの切除群の心臓を用いたH&E染色の代表像。(C-E)7-30 dprで切除群の心臓を用いたH&E染色の代表的な画像で、7 dprで創傷内に大量の赤血球が蓄積した(矢印)。フィブリンの塊が14dpr(矢じり)で切除部位に現れました。心臓は30dprで傷跡なしで完全に再生しました。スケールバー= 500μm。略語:dpr =切除後の日数。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:X.トロピカリス心臓の0dprから30dprまでの心筋線維症分析。 0 dprから30 dprでの偽および切除群からの心臓のマッソン染色の代表的な画像。(A)偽グループからのマッソンの心臓の染色の代表的な画像、おおよその切断面を示す破線。(B)0dprでの切除群からの心臓のマッソン染色の代表的な画像。(C-E)7〜30dprでの切除群からの心臓のマッソン染色の代表的な画像、7dprで創傷内に大量の赤血球が蓄積した(矢印)。フィブリンの塊が14dpr(矢じり)で切除部位に現れました。心臓は30dprで傷跡なしで完全に再生しました。スケールバー= 500μm。略語:dpr =切除後の日数。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
心臓の頂点の外科的切断を伴う頂端切除術は、ゼブラフィッシュおよびマウスに記載されている6,18;ただし、これはX.トロピカリスには記載されていません。この報告は、心臓損傷の信頼できるモデルを説明し、成人の心臓が瘢痕化することなく根尖切除後に完全に再生できることを示しています。ただし、いくつかの欠点を改善する必要があり、特定の詳細に注意する必要があります。
根尖切除術は心臓損傷モデルを確立することができますが、心臓のサイズが異なるカエルの多様性のために、心臓の切除の同じ程度を確保することは困難です。同じ大きさの頂点を持つ心臓を確実に切除するためには、同じ大きさのカエルを選ぶ必要があり、オペレーターは実験の前に広範囲に練習しなければなりません。
第二に、心臓を見つけるプロセスは隣接する血管の穿刺を引き起こし、出血を引き起こし、手順の進行を妨げたり、失敗を引き起こしたりする可能性があるため、心臓を正確かつ迅速に見つけて露出させる能力は手順の成功に不可欠です。麻酔の持続時間は短すぎたり長すぎたりしてはいけません。短すぎると手術が完了する前にカエルが目を覚ます可能性があり、このプロセスが長すぎるとカエルの死につながる可能性があります。プロトコルセクション2〜5で述べたように、縫合は慎重に行う必要があります。心臓全体と比較した頂点切除量の比率がカエル間でほぼ同じであることを確認するために、切除の有無にかかわらず心臓重量(HW)と表面積が分析され20、心臓頂点のごく一部が切除されてチャンバー露出が確実にされます6。
凍結損傷、MI、および頂端切除は、ゼブラフィッシュおよびマウスの心臓損傷を誘発するために最も広く使用されている3つの方法です6、18、21。この記事の制限は、3番目の方法のみが使用されたことであり、この作業では、他の2つの方法による損傷後の異なる再生応答に関する情報が提供されていないことを意味します6。凍結損傷は、哺乳類の梗塞と同様に、心室壁の~20%の多数の細胞の死をもたらします21。冠動脈閉塞とも呼ばれるMIは、X. tropicalisではマウスの頂端切除と比較して生存率が高い6が、熱帯のツメガエルの心臓はマウスの心臓よりも小さいため、X. tropicalisでは達成が困難です。本研究で確立したX. tropicalis頂端切除法は、より簡便で術後生存率が高い。
本報告で開発された頂端切除術は、X. tropicalisの心臓における再生の分子メカニズムを調べるための重要な方法となるでしょう。以前の研究では、Fosl1が根尖切除20後のX.トロピカリスの心臓再生に不可欠であることも示されました。X. tropicalisにおける根尖切除心損傷のこのモデルは、心臓再生の根底にある分子メカニズムについてさらに学び、ヒトの心臓再生に関連する遺伝子と分子メカニズムの研究を促進するために使用できます。
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Disclosures
著者は宣言する利益相反はありません。
Acknowledgments
この研究は、中国国家重点研究開発プログラム(2016YFE0204700)、中国国家自然科学基金会(82070257、81770240)、および中国の済南大学教育部再生医療重点研究所の研究助成金(ZSYXM202004およびZSYXM202104)からの助成金によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | GHTECH | 64-19-7-500ml | |
| Acid Alcohol Fast Differentiation Solution | Beyotime | C0163M | |
| Acid Fuchsin | aladdin | A104916 | |
| Alcohol Soluble Eosin Y Stainin Solution | Servicebio | G1001-500ML | |
| BioReagent | Beyotime | ST2600-100g | |
| Ethanol absolute | Guangzhou Chemical Reagent Factory | HB15-GR-0.5L | |
| Hematoxylin Stain Solution | Servicebio | G1004-500ML | |
| Neutral balsam | Solarbio | G8590 | |
| Operating Scissors | Prosperich | HC-JZ-YK-Z-10cm | |
| Paraffins | Leica | 39601095 | |
| Para-formaldehyde Fixative | Servicebio | G1101-500ML | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) powder | Servicebio | G0002-2L | |
| Phosphomolybdic acid hydrate | Macklin | P815551 | |
| Stereo microscope | Leica | ||
| surgical forceps | ChangZhou | zfq-11-btjw | |
| Surgical Suture | HUAYON | 18-5140 | |
| Tricaine | Macklin | ||
| Xylene | Guangzhou Chemical Reagent Factory | IC02-AR-0.5L |
References
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