Summary
Xenopus tropicalis является идеальной моделью для регенеративных исследований, поскольку многие из его органов обладают замечательной регенеративной способностью. Здесь мы представляем метод построения модели повреждения сердца у X. tropicalis с помощью резекции вершины.
Abstract
Известно, что у взрослых млекопитающих сердце утратило свою регенеративную способность, что делает сердечную недостаточность одной из основных причин смерти во всем мире. Предыдущие исследования продемонстрировали регенеративную способность сердца взрослого Xenopus tropicalis, беснулевой амфибии с диплоидным геномом и тесной эволюционной связью с млекопитающими. Кроме того, исследования показали, что после резекции верхушки желудочка сердце может регенерировать без рубцевания у X. tropicalis. Следовательно, эти предыдущие результаты свидетельствуют о том, что X. tropicalis является подходящей альтернативной моделью позвоночных для изучения регенерации сердца у взрослых. Здесь представлена хирургическая модель регенерации сердца у взрослой особи X. tropicalis. Вкратце, лягушки были обезболены и зафиксированы; Затем был сделан небольшой разрез ножницами для иридэктомии, проникающий в кожу и перикард. На желудочек оказывалось легкое давление, а затем ножницами вырезали верхушку желудочка. Повреждение сердца и регенерация были подтверждены гистологией через 7-30 дней после резекции (ДПР). Этот протокол установил модель апикальной резекции у взрослых X. tropicalis, которая может быть использована для выяснения механизмов регенерации сердца у взрослых.
Introduction
Сердечная недостаточность является основной причиной смертности во всем мире в последние годы. С 2000 года число смертей от сердечной недостаточности со временем увеличивается. В 2019 году от кардиомиопатии умерло более 9 миллионов человек, что составило 16% от общего числа смертей во всеммире1. Из-за потери регенеративной способности сердца у взрослых млекопитающих в некоторых случаях не хватает кардиомиоцитов для поддержания сократительных функций в сердце, что влияет на функцию сердца и способствует аномальному ремоделированию желудочков и сердечной недостаточности 2,3,4. Действительно, у млекопитающих сердце имеет самую низкую регенеративную способность по сравнению с другими органами, такими как печень, легкие, кишечник, мочевой пузырь, кости и кожа. По мере того, как старение населения мира становится глобальной мегатенденцией, проблемы, с которыми мы сталкиваемся в связи с сердечно-сосудистыми заболеваниями, будут усиливаться5.
Выяснение механизмов регенерации сердца может иметь значительные последствия для терапии ишемической болезни сердца. Отчеты показали, что сердца новорожденных мышей обладают регенеративной способностью после резекциивершины 6. Тем не менее, эта регенеративная способность теряется после 7 дней в возрасте7 лет. Исследования показали, что сердца взрослых млекопитающих не могут регенерировать, потому что их способность к пролиферации кардиомиоцитов уменьшилась 8,9. Однако сердца низших позвоночных обладают мощной регенеративной способностью после травмы. Например, рыбки данио-рерио 10, X. tropicalis11, Xenopus laevis12, тритон13 и аксолотль14 способны к полной регенерации после резекции вершины. Кроме того, другие части тела некоторых низших позвоночных также могут подвергаться полной регенерации, такие как конечности тритонов и хвосты, хрусталики и руки тропических когтистых лягушек 4,15,16.
Создание моделей сердечных повреждений является первым шагом к выяснению механизмов, лежащих в основе регенерации сердца, и имеет большое значение в регенеративных исследованиях. Исследователи разработали различные методы построения моделей сердечных травм, включая колющие ранения, ушибы, генетическую абляцию, криотравму и инфаркт 5,6.
Криотравма, инфаркт миокарда (ИМ) и резекция верхушки широко используются для индукции сердечной травмы, и тип травмы может оказывать существенное влияние на последующую регенерацию кардиомиоцитов6. В зависимости от хирургической техники реакция сердца на регенерацию может варьироваться. Криотравма вызывает массовую гибель клеток и вызывает фиброзные рубцы в сердцах рыбокданио-17, создавая таким образом модель, напоминающую инфаркт млекопитающих. Апикальная резекция выполняется путем отсечения части тканей желудочков, что было сделано у рыбок данио-рерио10 и X. tropicalis11, не вызывая постоянных рубцов. В этом исследовании была выполнена апикальная резекция, которая является более простой операцией и требует меньшего количества хирургических инструментов, чем криотравма. Используя анализ отслеживания происхождения, предыдущее исследование показало, что регенерация сердца связана с пролиферацией кардиомиоцитов, которые ранее существуют в сердцах мышей6 и рыбок данио-рерио18, но нет никаких сообщений о земноводных. Следовательно, модель резекции вершины у X. tropicalis играет важную роль в выяснении механизмов, лежащих в основе регенеративных реакций.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все экспериментальные протоколы, связанные с X. tropicalis , были одобрены Комитетом по уходу за животными Цзинаньского университета.
1. Хирургия
- Предоперационная подготовка: Держите наготове офтальмологические ножницы, офтальмологические щипцы, игольчатые щипцы, абсорбирующие шарики, фильтровальную бумагу и хирургические швы/иглы для резекции вершины сердца X. tropicalis. Подробную информацию см. в Таблице материалов . Перед использованием стерилизуйте все хирургические инструменты путем автоклавирования и подготовьте достаточное количество льда для будущего использования.
- Обезболите взрослую X. tropicalis трикаином, поместив его в 500 мл раствора трикаина (1 мг / мл) при комнатной температуре на 4 мин19, а затем положите его на поверхность льда на операционном столе, чтобы лягушка не проснулась во время операционного процесса.
ВНИМАНИЕ: Вся процедура занимает 5-10 минут; время анестезии не должно быть слишком большим, иначе X. tropicalis может не проснуться после операции. - Торакотомии
- Поместите анестезированную кожу X. tropicalis брюшком вверх и накройте брюшко лягушки марлей, предварительно смоченной в дистиллированной воде, чтобы избежать высыхания кожи животного во время операции.
- Аккуратно надавите щипцами на грудную клетку, найдите центр грудной клетки параллельно нижней передней конечности, поднимите кожу глазными ножницами и аккуратно сделайте небольшой разрез ~1 см. С помощью офтальмологических ножниц подцепите мышечный слой под кожей и создайте рану в центральной мышце грудной клетки. Поскольку сердце расположено в верхнем положении места раны, осторожно надавите на грудную клетку глазными щипцами, чтобы выдавить сердце из раны.
ВНИМАНИЕ: Поскольку кожа X. tropicalis может продуцировать антимикробные пептиды, нет необходимости использовать обычные процедуры дезинфекции на месте хирургического вмешательства X. tropicalis. Любое дезинфицирующее средство повредит кожу X. tropicalis.
- Резекция верхушки желудочка
- Аккуратно зажмите перикард щипцами, а аккуратно разломайте его с помощью офтальмологических ножниц возле верхушки сердца. Дождитесь отрыва перикарда из-за систолической перекачки крови (рис. 1А, Б).
- Держите кончик сердца щипцами в недоминантной руке и слегка приподнимите сердце в соответствии с ритмом сердечного сокращения. Когда сердце сокращается, чтобы рециркулировать кровь по кровеносным сосудам, быстро отрежьте верхушку сердца (~ 14% желудочка) (рис. 1C).
- Чтобы убедиться, что объем резекции вершины составляет примерно 14% от всего сердца, проанализируйте вес сердца (HW) и площадь поверхности с резекцией20 или без нее. Поместите сердце в грудную клетку с помощью щипцов и абсорбирующего шарика.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не нажимайте на сердце непосредственно щипцами; В противном случае будут проколоты другие части сердца.
- Наложите на кожу невпитывающий хирургический шов из нешелковой нити 4-0 (рис. 1D). Будьте осторожны, чтобы избежать наложения швов на мышечный слой, чтобы предотвратить послеоперационную смертность. Подождите, пока кожная рана естественным образом заживет в течение 1 недели после операции.
- В группе фиктивных операций выполняют торакотомию, вскрывают перикард и накладывают швы, не выполняя резекцию верхушки.
2. Хирургическое восстановление
- Поместите послеоперационного X. tropicalis брюшком вверх в чашку Петри, содержащую небольшое количество деионизированной воды (не заливайте животное полностью). Подождите, пока X. tropicalis проснется в течение ~ 10 минут.
- Придя в сознание, понаблюдайте за подвижностью и активностью животного, а также за раневым швом во время активности. Перенесите лягушек, которые восстановили равновесие, в емкость, наполненную чистой водой для выращивания. Заменяйте воду чистой водой каждый день, чтобы избежать раневой инфекции.
ПРИМЕЧАНИЕ: При таких мерах выживаемость может достигать ~ 90%. Длительное время анестезии и чрезмерное кровотечение во время операции приводят к смерти, которая обычно наступает в день операции.
3. Определение состояния восстановления после сердечной травмы
- Собирайте сердца X. tropicalis в несколько моментов времени после операции.
- После обезболивания X. tropicalis трикаином вскройте брюшную полость и используйте щипцы, чтобы удалить другие внутренние органы и ткани, чтобы найти местоположение сердца.
ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за резекции верхушки сердце, вероятно, будет развиваться вместе с другими тканями и органами в процессе восстановления. Иногда он прилипает к мышечной стенке и его нелегко отделить, поэтому с ним нужно обращаться осторожно во время сбора. - Найдя сердце, используйте щипцы, чтобы аккуратно оторвать другие органы от сердца. Аккуратно очистите другие ткани, окружающие сердце, чтобы обнажить сердце. Используйте щипцы, чтобы аккуратно приподнять сердце, и вырежьте его ножницами. Немедленно поместите сердце в PBS, чтобы удалить оставшуюся кровь, и сфотографируйте его с помощью стереоскопа для документирования (рисунок 2).
- После обезболивания X. tropicalis трикаином вскройте брюшную полость и используйте щипцы, чтобы удалить другие внутренние органы и ткани, чтобы найти местоположение сердца.
- Градиентное обезвоживание
- Промокните сердечки фильтровальной бумагой, чтобы высушить излишки остатков PBS, и поместите их в 24-луночную чашку для культивирования клеток. Используйте 1-2 мл 4% параформальдегида, чтобы закрепить ткани сердца на ночь. На следующий день выполните обезвоживание этанола. Сначала используйте 70% этанола на ночь, затем 80% этанола, 90% этанола и 100% этанола для градиентного обезвоживания (1 час каждый раз). Повторите использование 100% этанола три раза.
- Заделка парафина
- Обработайте обезвоженную сердечную ткань ксилолом в течение 6-8 минут. Обработанную ксилолом ткань поместить в стеклянную емкость, наполненную парафином, при температуре 65 °C на 2-3 часа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно избегать пузырьков воздуха, так как они влияют на секцию в процессе встраивания.
- Обработайте обезвоженную сердечную ткань ксилолом в течение 6-8 минут. Обработанную ксилолом ткань поместить в стеклянную емкость, наполненную парафином, при температуре 65 °C на 2-3 часа.
- Заморозьте застрявшую ткань при температуре -20 °C в течение 1 часа и разделите ее.
- После разреза сердца выполните стандартные методы окрашивания гематоксилином и эозином (H & E) и трихромного окрашивания Массона на срезах11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Сердечки были собраны в 0 днр, 7 днр, 14 днр и 30 днр. Морфологический анализ показал, что сгусток крови, вызванный повреждением сердца, исчез через 30 дней (рис. 2). При этом появление сердец на 30 дпр в группе резекции было аналогично появлению сердец в бутафорской оперативной группе; явных ран не было (рис. 2). После апикальной резекции образовался сгусток крови, который запечатал рану в желудочке, как это наблюдалось с помощью H&E (рис. 3) и трихромного окрашивания Массона (рис. 4). В течение 14 дней сгусток постепенно исчез и был заменен фибрином (рис. 4). С 14 по 30 дпр миокард постепенно заменял фибрин и восстанавливал поврежденную верхушку желудочка (рис. 4). Гистологический анализ не показал различий между фиктивным и резецированным сердцем через 30 дней (рис. 3 и рис. 4). Этот морфологический и гистологический анализ показал, что взрослая особь X. tropicalis может восстанавливать и регенерировать поврежденную верхушку желудочка к 30 дням.
Рисунок 1: Хирургическое вмешательство . (A) Репрезентативное изображение обнаженного сердца, покрытого перикардом. (B) Репрезентативное изображение сердца в систолической фазе, во время которого перикард был отслаен; Пунктирной линией обозначено место апикальной резекции сердца. (C) Репрезентативное изображение верхушки резекции сердца. (D) Репрезентативное изображение кожного шва после операции. Масштабные линейки = 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Морфологический анализ сердец X. tropicalis от 0 до 30 dpr. (A) Репрезентативные изображения сердец из фиктивной (слева) и апикальной резекционной групп (справа) при 0 dpr, при этом вершина сердца значительно отсутствует в группе резекции. (В,В) Репрезентативные изображения сердец из фиктивных (слева) по сравнению с группами резекции (справа) в 7-14 dpr, с большим количеством сгустков крови, появляющимися в сердцах группы резекции в 7 dpr. В 14 dpr в месте апикальной резекции видна значительная регенерация, но края верхушки сердца не ровные. (D) Репрезентативное изображение сердец из фиктивных (слева) по сравнению с группами резекции (справа) в 30 dpr; Верхушка резецированного сердца почти полностью регенерировала. Масштабные линейки = 1 мм. Аббревиатура: dpr = дни после резекции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Гистологический анализ сердец Xenopus tropicalis от 0 до 30 dpr. Репрезентативные изображения окрашивания H&E с использованием сердец из фиктивной и резекционной групп в диапазоне от 0 до 30 dpr. (A) Репрезентативное изображение окрашивания H&E с использованием сердец из фиктивной группы, с пунктирными линиями, указывающими приблизительные плоскости ампутации. (B) Репрезентативное изображение окрашивания H&E с использованием сердец из группы резекции при 0 dpr. (С-Е) Репрезентативные изображения окрашивания H&E с использованием сердец из группы резекции на 7-30 dpr, с большим количеством эритроцитов, накопленных в ране на 7 dpr (стрелки). В месте резекции на 14 дпр появилась масса фибрина (наконечники стрел). Сердца полностью восстановились без шрамов в 30 дпр. Масштабная линейка = 500 мкм. Аббревиатура: dpr = дни после резекции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Анализ фиброза миокарда сердец X. tropicalis от 0 до 30 dpr. Репрезентативные изображения окрашивания сердец Массоном из фиктивных и резекционных групп от 0 до 30 dpr. (A) Репрезентативное изображение окрашивания сердец Массоном из фиктивной группы с пунктирными линиями, указывающими приблизительные плоскости ампутации. (B) Репрезентативное изображение окрашивания сердец Массоном из группы резекции на 0 dpr. (С-Е) Репрезентативные изображения окрашивания сердца Массоном из группы резекции на 7-30 dpr, с большим количеством эритроцитов, накопленных в ране на 7 dpr (стрелки). В месте резекции на 14 дпр появилась масса фибрина (наконечники стрел). Сердца полностью восстановились без шрамов в 30 дпр. Масштабная линейка = 500 мкм. Аббревиатура: dpr = дни после резекции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Апикальная резекция, которая включает хирургическую ампутацию верхушки сердца, была описана у рыбок данио-рерио и мышей 6,18; однако это не было описано в X. tropicalis. В этом отчете описывается достоверная модель сердечной травмы и демонстрируется, что сердце взрослого X. tropicalis может полностью регенерировать после апикальной резекции без рубцевания. Однако некоторые недостатки нуждаются в улучшении, а некоторые детали требуют внимания.
Хотя апикальная резекция может установить модель повреждения сердца, обеспечение одинаковой степени иссечения сердца является сложной задачей из-за разнообразия лягушек, которые имеют разные размеры сердца. Чтобы гарантировать, что сердца с вершинами одинакового размера будут резецированы, необходимо выбрать лягушек одинакового размера, и оператор должен тщательно потренироваться перед экспериментом.
Во-вторых, способность точно и быстро найти и обнажить сердце имеет решающее значение для успеха процедуры, так как процесс поиска сердца может привести к проколу соседних кровеносных сосудов и вызвать кровотечение, тем самым препятствуя прогрессу процедуры или даже вызывая неудачу. Продолжительность анестезии не должна быть слишком короткой или слишком длинной. Если он слишком короткий, лягушка может проснуться до завершения операции, а если этот процесс будет слишком долгим, он, скорее всего, приведет к гибели лягушки. Как упоминалось в разделах 2-5 протокола, наложение швов должно производиться осторожно. Чтобы убедиться в том, что соотношение количества резекции верхушки по сравнению со всем сердцем примерно одинаково у всех лягушек, вес сердца (HW) и площадь поверхности с резекцией или без нее анализируют20, и резецируют небольшую часть верхушки сердца для обеспечения воздействия на камеру6.
Криотравма, инфаркт миокарда и апикальная резекция являются тремя наиболее широко используемыми методами индукции повреждения сердца у рыбок данио-рерио и мышей 6,18,21. Ограничением этой статьи является то, что использовался только третий метод, а это означает, что эта работа не дает никакой информации о различных регенеративных реакциях после травмы с двумя другими методами6. Криотравма приводит к гибели большого количества клеток в ~20% стенки желудочка, подобно инфарктам млекопитающих21. Инфаркт миокарда, который также называют окклюзией коронарной артерии, имеет более высокие показатели выживаемости у X. tropicalis по сравнению с апикальной резекцией у мышей6, но его труднее достичь у X. tropicalis, потому что сердца тропических когтистых лягушек меньше, чем у мышей. Метод апикальной резекции X. tropicalis, установленный в этом исследовании, проще в выполнении и имеет высокую послеоперационную выживаемость.
Апикальная резекция, разработанная в этом отчете, станет важным методом для исследования молекулярных механизмов регенерации в сердцах X. tropicalis. Предыдущее исследование также показало, что Fosl1 необходим для регенерации сердца у X. tropicalis после апикальной резекции20. Эта модель апикальной резекции повреждения сердца у X. tropicalis может быть использована для изучения молекулярных механизмов, лежащих в основе регенерации сердца, чтобы способствовать изучению генов и молекулярных механизмов, связанных с регенерацией сердца человека.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликтов интересов, о которых можно было бы заявить.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантами Национальной программы ключевых исследований и разработок Китая (2016YFE0204700), Национального фонда естественных наук Китая (82070257, 81770240) и исследовательским грантом Ключевой лаборатории регенеративной медицины Министерства образования Цзинаньского университета (ZSYXM202004 и ZSYXM202104), Китай.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | GHTECH | 64-19-7-500ml | |
| Acid Alcohol Fast Differentiation Solution | Beyotime | C0163M | |
| Acid Fuchsin | aladdin | A104916 | |
| Alcohol Soluble Eosin Y Stainin Solution | Servicebio | G1001-500ML | |
| BioReagent | Beyotime | ST2600-100g | |
| Ethanol absolute | Guangzhou Chemical Reagent Factory | HB15-GR-0.5L | |
| Hematoxylin Stain Solution | Servicebio | G1004-500ML | |
| Neutral balsam | Solarbio | G8590 | |
| Operating Scissors | Prosperich | HC-JZ-YK-Z-10cm | |
| Paraffins | Leica | 39601095 | |
| Para-formaldehyde Fixative | Servicebio | G1101-500ML | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) powder | Servicebio | G0002-2L | |
| Phosphomolybdic acid hydrate | Macklin | P815551 | |
| Stereo microscope | Leica | ||
| surgical forceps | ChangZhou | zfq-11-btjw | |
| Surgical Suture | HUAYON | 18-5140 | |
| Tricaine | Macklin | ||
| Xylene | Guangzhou Chemical Reagent Factory | IC02-AR-0.5L |
References
- Thiara, B.
- van Amerongen, M. J., Engel, F. B. Features of cardiomyocyte proliferation and its potential for cardiac regeneration. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 12 (6), 2233-2244 (2008).
- Burke, A. P., Virmani, R.
- Sessions, S. K., Bryant, S. V. Evidence that regenerative ability is an intrinsic property of limb cells in Xenopus. Journal of Experimental Zoology. 247 (1), 39-44 (1988).
- Laflamme, M. A.
- Mahmoud, A. I., Porrello, E. R., Kimura, W., Olson, E. N., Sadek, H. A. Surgical models for cardiac regeneration in neonatal mice. Nature Protocols. 9 (2), 305-311 (2014).
- Tzahor, E., Poss, K. D. Cardiac regeneration strategies: Staying young at heart. Science. 356 (6342), 1035-1039 (2017).
- Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).
- Porrello, E. R., et al. Regulation of neonatal and adult mammalian heart regeneration by the miR-15 family. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (1), 187-192 (2013).
- Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T.
- Liao, S., et al. Heart regeneration in adult Xenopus tropicalis after apical resection. Cell & Bioscience. 7, 70 (2017).
- Marshall, L. N., et al. Stage-dependent cardiac regeneration in Xenopus is regulated by thyroid hormone availability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3614-3623 (2019).
- Witman, N., Murtuza, B., Davis, B., Arner, A., Morrison, J. I. Recapitulation of developmental cardiogenesis governs the morphological and functional regeneration of adult newt hearts following injury. Developmental Biology. 354 (1), 67-76 (2011).
- Cano-Martinez, A., et al. Functional and structural regeneration in the axolotl heart (Ambystoma mexicanum) after partial ventricular amputation. Archivos de Cardiología de México. 80 (2), 79-86 (2010).
- Kragl, M., et al. Cells keep a memory of their tissue origin during axolotl limb regeneration. Nature. 460 (7251), 60-65 (2009).
- Oberpriller, J. O., Oberpriller, J. C. Response of the adult newt ventricle to injury. Journal of Experimental Zoology. 187 (2), 249-253 (1974).
- Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish. Development. 138 (9), 1663-1674 (2011).
- Ellman, D. G., et al. Apex resection in zebrafish (Danio rerio) as a model of heart regeneration: A video-assisted guide. International Journal of Molecular Sciences. 22 (11), 5865 (2021).
- Lee-Liu, D., et al. Genome-wide expression profile of the response to spinal cord injury in Xenopus laevis reveals extensive differences between regenerative and non-regenerative stages. Neural Development. 9, 12 (2014).
- Wu, H. Y., et al. Fosl1 is vital to heart regeneration upon apex resection in adult Xenopus tropicalis. npj Regenerative Medicine. 6 (1), 36 (2021).
- Chablais, F., Jazwinska, A. Induction of myocardial infarction in adult zebrafish using cryoinjury. Journal of Visualized Experiments. (62), e3666 (2012).
