Summary
Xenopus tropicalis er en ideel model for regenerativ forskning, da mange af dets organer besidder en bemærkelsesværdig regenerativ kapacitet. Her præsenterer vi en metode til at konstruere en hjerteskademodel i X. tropicalis via apex resektion.
Abstract
Det er kendt, at hjertet hos voksne pattedyr har mistet sin regenerative kapacitet, hvilket gør hjertesvigt til en af de største dødsårsager på verdensplan. Tidligere forskning har vist den regenerative evne af hjertet af den voksne Xenopus tropicalis, en anuran padde med et diploide genom og et tæt evolutionært forhold til pattedyr. Derudover har undersøgelser vist, at efter ventrikulær apex resektion, hjertet kan regenerere uden ardannelse i X. tropicalis. Derfor tyder disse tidligere resultater på, at X. tropicalis er en passende alternativ hvirveldyrmodel til undersøgelse af voksen hjerteregenerering. En kirurgisk model af hjerteregenerering hos voksne X. tropicalis er præsenteret heri. Kort fortalt blev frøerne bedøvet og fikset; Derefter blev der lavet et lille snit med iridectomy saks, der trængte ind i huden og perikardiet. Blidt tryk blev påført ventriklen, og toppen af ventriklen blev derefter skåret ud med en saks. Hjerteskade og regenerering blev bekræftet ved histologi 7-30 dage efter resektion (dpr). Denne protokol etablerede en apikal resektionsmodel hos voksne X. tropicalis, som kan anvendes til at belyse mekanismerne for voksen hjerteregenerering.
Introduction
Hjertesvigt har været en førende årsag til dødelighed på verdensplan i de senere år. Siden 2000 har antallet af dødsfald på grund af hjertesvigt været stigende over tid. Mere end 9 millioner mennesker døde af kardiomyopati i 2019, hvilket tegnede sig for 16% af det samlede antal dødsfald globalt1. På grund af tabet af hjertets regenerative kapacitet hos voksne pattedyr er der i nogle tilfælde ikke nok kardiomyocytter til at opretholde sammentrækningsfunktionerne i hjertet, hvilket påvirker hjertefunktionen og bidrager til unormal ventrikulær remodellering og hjertesvigt 2,3,4. Faktisk har hjertet hos pattedyr den dårligste regenerative kapacitet sammenlignet med de andre organer, såsom lever, lunger, tarme, blære, knogler og hud. Da aldringen af verdens befolkning bliver en global megatrend, vil de udfordringer, vi står over for med hjertesygdomme, intensiveres5.
Belysning af mekanismerne for hjerteregenerering kan have betydelige konsekvenser for behandlinger for iskæmisk hjertesygdom. Rapporter har afsløret, at hjerterne hos nyfødte mus har en regenerativ kapacitet efter apex resektion6. Ikke desto mindre går denne regenerative kapacitet tabt efter 7dage 7 år. Undersøgelser har vist, at voksne pattedyrs hjerter ikke er i stand til at regenerere, fordi deres kapacitet til kardiomyocytproliferation er faldet 8,9. Imidlertid har hjerterne hos lavere hvirveldyr en kraftig regenerativ kapacitet efter skade. For eksempel er zebrafisk10, X. tropicalis11, Xenopus laevis 12, newt13 og axolotl 14 i stand til fuldstændig regenerering efter apex-resektion. Derudover kan de andre dele af kroppen af nogle lavere hvirveldyr også gennemgå fuldstændig regenerering, såsom lemmerne af newts og haler, linser og arme af tropiske klofrøer 4,15,16.
Etablering af hjerteskademodeller er det første skridt til at belyse mekanismerne bag hjerteregenerering og har stor betydning i regenerativ forskning. Forskere har udviklet forskellige metoder til at opbygge hjerteskademodeller, herunder knivstik, kontusing, genetisk ablation, kryoskade og infarkt 5,6.
Kryoskade, myokardieinfarkt (MI) og apex-resektion anvendes i vid udstrækning til at fremkalde hjerteskade, og typen af skade kan have betydelige virkninger på følgende regenerering af kardiomyocytter6. Afhængigt af den kirurgiske teknik kan hjertets reaktion på regenerering variere. Kryoskade forårsager massiv celledød og producerer fibrotiske ar i zebrafiskens hjerter17, hvilket skaber en model, der ligner pattedyrinfarkt. Apikal resektion udføres ved at skære en del af ventrikelvævet væk, hvilket er gjort i zebrafisk10 og X. tropicalis11, uden at forårsage permanente ar. Denne undersøgelse udførte apikal resektion, hvilket er en enklere operation og kræver færre kirurgiske instrumenter end kryoskade. Ved hjælp af afstamningssporingsanalyse viste en tidligere undersøgelse, at hjerteregenerering er relateret til spredning af kardiomyocytter, der allerede findes i muse6 og zebrafisk18, men der findes ingen rapporter for padder. Derfor spiller modellen for apex resektion i X. tropicalis en vigtig rolle i belysning af mekanismerne bag regenerative reaktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøgsprotokoller relateret til X. tropicalis blev godkendt af Jinan University Animal Care Committee.
1. Kirurgi
- Præoperativ forberedelse: Hold klar oftalmisk saks, oftalmisk tang, nåletang, absorberende kugler, filterpapir og kirurgiske suturer / nåle til apex resektion i hjerterne af X. tropicalis. Se materialefortegnelsen for detaljerede oplysninger. Før brug steriliseres alle kirurgiske instrumenter ved autoklavering, og der fremstilles en passende mængde is til fremtidig brug.
- Bedøv en voksen X. tropicalis med tricain ved at placere den i 500 ml tricainopløsning (1 mg / ml) ved stuetemperatur i 4 min19, og læg den derefter på en isoverflade på operationsbordet for at sikre, at frøen ikke vågner op under driftsprocessen.
FORSIGTIG: Hele proceduren kræver 5-10 min; anæstesitiden bør ikke være for lang, ellers kan X. tropicalis muligvis ikke vågne op efter operationen. - Thoracotomi
- Placer den bedøvede X. tropicalis mave op, og dæk frøens underliv med gasbind forudindtaget i destilleret vand for at undgå tørring af dyrets hud under operationen.
- Tryk forsigtigt på brystet med tang, find midten af brystet parallelt med det nederste forben, løft huden med oftalmisk saks og lav forsigtigt et lille snit på ~ 1 cm. Brug oftalmisk saks til at samle muskellaget under huden og skabe et sår i den centrale brystmuskel. Da hjertet er placeret i den øverste position af sårstedet, skal du forsigtigt trykke brystet med den oftalmiske tang for at presse hjertet ud af såret.
FORSIGTIG: Da huden på X. tropicalis kan producere antimikrobielle peptider, er det unødvendigt at anvende konventionelle desinfektionsprocedurer på det kirurgiske sted for X. tropicalis. Ethvert desinfektionsmiddel vil beskadige huden på X. tropicalis.
- Ventrikulær apex resektion
- Klem forsigtigt perikardiet med tang, og bryd det forsigtigt ved hjælp af oftalmisk saks nær hjertets spids. Vent på, at perikardiet kommer ud på grund af systolisk blodpumpning (figur 1A, B).
- Hold spidsen af hjertet med tang i den ikke-dominerende hånd, og løft hjertet lidt i henhold til hjertekontraktionsrytmen. Når hjertet trækker sig sammen for at recirkulere blod gennem blodkarrene, skal du hurtigt afskære hjertets spids (~ 14% af ventriklen) (figur 1C).
- For at sikre, at mængden af apex-resektion er ca. 14% af hele hjertet, skal du analysere hjertevægten (HW) og overfladearealet med eller uden resektion20. Placer hjertet i brystet ved hjælp af tang og en absorberende kugle.
BEMÆRK: Tryk ikke hjertet direkte med pincetten; Ellers vil andre dele af hjertet blive punkteret.
- Sutur huden med en 4-0 ikke-absorberende ikke-silke kirurgisk trådsutur (figur 1D). Vær forsigtig med at undgå at sy ind i muskellaget for at forhindre postoperativ dødelighed. Vent på, at hudsåret heler naturligt inden for 1 uge efter operationen.
- I shamoperationsgruppen skal du udføre thoracotomi, åbne perikardiet og suturen uden at udføre apex-resektionen.
2. Kirurgisk opsving
- Placer den postoperative X. tropicalis med maven opad i en petriskål, der indeholder en lille mængde deioniseret vand (oversvømme ikke dyret helt). Vent på, at X. tropicalis vågner inden for ~ 10 minutter.
- Når du genvinder bevidstheden, skal du observere dyrets mobilitet og aktivitet samt sårsuturen under aktivitet. Overfør frøerne, der har genvundet deres balance, til en beholder fyldt med rent vand til dyrkning. Udskift vandet med rent vand hver dag for at undgå sårinfektion.
BEMÆRK: Med disse foranstaltninger kan overlevelsesraten nå ~ 90%. En længere tid med anæstesi og overdreven blødning under operationen fører begge til døden, som typisk opstår på operationsdagen.
3. Påvisning af reparationstilstanden efter hjerteskade
- Saml hjerterne af X. tropicalis på flere tidspunkter efter operationen.
- Efter bedøvelse af X. tropicalis med tricain, åbne maven, og bruge tang til at fjerne de andre indre organer og væv for at finde placeringen af hjertet.
BEMÆRK: På grund af apex-resektionen vil hjertet sandsynligvis udvikle sig sammen med andre væv og organer under reparationsprocessen. Nogle gange klæber det til muskelvæggen og er ikke let at adskille, så det skal håndteres forsigtigt under indsamling. - Når du har fundet hjertet, skal du bruge tang til forsigtigt at rive de andre organer fra hjertet. Skræl forsigtigt de andre væv omkring hjertet for at udsætte hjertet. Brug tang til forsigtigt at løfte hjertet, og skær det ud ved hjælp af en saks. Placer straks hjertet i PBS for at fjerne eventuelt resterende blod, og fotografer det med et stereoskop til dokumentation (figur 2).
- Efter bedøvelse af X. tropicalis med tricain, åbne maven, og bruge tang til at fjerne de andre indre organer og væv for at finde placeringen af hjertet.
- Gradient dehydrering
- Blot hjerterne med filterpapir for at tørre de overskydende PBS-rester, og læg dem i en 24-brønds cellekulturskål. Brug 1-2 ml 4% paraformaldehyd til at fikse hjertevævene natten over. Den følgende dag udføres ethanoldehydrering. Brug først 70% ethanol natten over, efterfulgt af 80% ethanol, 90% ethanol og 100% ethanol til gradientdehydrering (1 time hver gang). Gentag brugen af 100% ethanol tre gange.
- Indlejring af paraffin
- Behandl det dehydrerede hjertevæv med xylen i 6-8 min. Det xylenbehandlede væv anbringes i en glasbeholder fyldt med paraffinvoks ved 65 °C i 2-3 timer.
BEMÆRK: Det er vigtigt at undgå luftbobler, da de påvirker sektionen under indlejringsprocessen.
- Behandl det dehydrerede hjertevæv med xylen i 6-8 min. Det xylenbehandlede væv anbringes i en glasbeholder fyldt med paraffinvoks ved 65 °C i 2-3 timer.
- Det indlejrede væv fryses ved -20 °C i 1 time, og skær det i stykker.
- Efter sektionering af hjertet skal du udføre standard hæmatoxylin og eosin (H & E) og Massons trikrome farvningsteknikker på sektionerne11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hjerterne blev indsamlet til 0 dpr, 7 dpr, 14 dpr og 30 dpr. Den morfologiske analyse afslørede, at blodproppen forårsaget af hjerteskaden forsvandt ved 30 dpr (figur 2). Samtidig lignede udseendet af hjerterne ved 30 dpr i resektionsgruppen det samme som hjerterne i skinoperationsgruppen; der var ingen tydelige sår (figur 2). Efter apikal resektion dannede og forseglede en blodprop såret i ventriklen, som observeret af H &E (figur 3) og Massons trikrome farvning (figur 4). Inden for 14 dpr forsvandt blodproppen gradvist og blev erstattet af fibrin (figur 4). Fra 14 dpr til 30 dpr erstattede myokardiet gradvist fibrinet og reparerede den beskadigede ventrikelspids (figur 4). Den histologiske analyse viste ingen forskel mellem de falske og resekterede hjerter ved 30 dpr (figur 3 og figur 4). Denne morfologiske og histologiske analyse afslørede, at voksen X. tropicalis kunne reparere og regenerere den skadede ventrikulære spids med 30 dpr.
Figur 1: Kirurgisk indgreb . (A) Repræsentativt billede af et eksponeret hjerte, der er dækket af hjertesækken. (B) Repræsentativt billede af et hjerte i den systoliske fase, hvor perikardiet blev skrællet af; Den stiplede linje angiver stedet for den apikale resektion af hjertet. (C) Repræsentativt billede af hjertets apex resektion. (D) Repræsentativt billede af hudsuturen efter operationen. Vægtstænger = 1 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Morfologisk analyse af X. tropicalis-hjerter fra 0 dpr til 30 dpr. (A) Repræsentative billeder af hjerter fra humbug (venstre) og apikale resektionsgrupper (højre) ved 0 dpr, med hjertets spids signifikant fraværende i resektionsgruppen. (B,C) Repræsentative billeder af hjerter fra humbug (venstre) versus resektionsgrupper (højre) ved 7-14 dpr, med mange blodpropper i resektionsgruppens hjerter ved 7 dpr. Ved 14 dpr ses signifikant regenerering på det apikale resektionssted, men kanterne af hjertets spids er ikke jævne. (D) Repræsentativt billede af hjerter fra humbug (venstre) versus resektionsgrupper (højre) ved 30 dpr; Toppen af det resekterede hjerte er næsten fuldstændig regenereret. Skalastænger = 1 mm. Forkortelse: dpr = dage efter resektion. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Histologisk analyse af Xenopus tropicalis hjerter fra 0 dpr til 30 dpr. Repræsentative billeder af H&E-farvning ved hjælp af hjerter fra skin- og resektionsgrupperne ved 0 dpr til 30 dpr. (A) Repræsentativt billede af H&E-farvning ved hjælp af hjerter fra skingruppen med stiplede linjer, der angiver de omtrentlige amputationsplaner. (B) Repræsentativt billede af H&E-farvning ved hjælp af hjerter fra resektionsgruppen ved 0 dpr. (C-E) Repræsentative billeder af H&E-farvning ved hjælp af hjerter fra resektionsgruppen ved 7-30 dpr, med store mængder røde blodlegemer akkumuleret i såret ved 7 dpr (pile). En masse fibrin er dukket op på resektionsstedet ved 14 dpr (pilespidser). Hjerterne er regenereret helt uden ar ved 30 dpr. Skalabjælke = 500 μm. Forkortelse: dpr = dage efter resektion. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Myokardiefibrose analyse af X. tropicalis hjerter fra 0 dpr til 30 dpr. Repræsentative billeder af Massons farvning af hjerter fra humbug- og resektionsgrupperne ved 0 dpr til 30 dpr. (A) Repræsentativt billede af Massons farvning af hjerter fra den falske gruppe med stiplede linjer, der angiver de omtrentlige amputationsplaner. (B) Repræsentativt billede af Massons farvning af hjerter fra resektionsgruppen ved 0 dpr. (C-E) Repræsentative billeder af Massons farvning af hjerter fra resektionsgruppen ved 7-30 dpr, med store mængder røde blodlegemer akkumuleret i såret ved 7 dpr (pile). En masse fibrin er dukket op på resektionsstedet ved 14 dpr (pilespidser). Hjerterne er regenereret helt uden ar ved 30 dpr. Skalabjælke = 500 μm. Forkortelse: dpr = dage efter resektion. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Apikal resektion, som involverer kirurgisk amputation af hjertets spids, er blevet beskrevet hos zebrafisk og mus 6,18; Dette er dog ikke beskrevet i X. tropicalis. Denne rapport beskriver en troværdig model for hjerteskade og viser, at hjertet hos voksne X. tropicalis fuldt ud kan regenerere efter apikal resektion uden ardannelse. Der er dog nogle mangler, der skal forbedres, og visse detaljer kræver opmærksomhed.
Selvom apikal resektion kan etablere en hjerteskademodel, er det udfordrende at sikre det samme omfang af udskæring af hjertet på grund af frøernes mangfoldighed, som har forskellige hjertestørrelser. For at sikre, at hjerter med spidser af samme størrelse resekteres, er det nødvendigt at vælge frøer af samme størrelse, og operatøren skal øve sig grundigt forud for forsøget.
For det andet er evnen til nøjagtigt og hurtigt at lokalisere og udsætte hjertet afgørende for procedurens succes, da processen med at finde hjertet kan resultere i punktering af de tilstødende blodkar og forårsage blødning, hvilket hindrer procedurens fremskridt eller endda forårsager fiasko. Anæstesiens varighed bør ikke være for kort eller for lang. Hvis den er for kort, kan frøen vågne op, før operationen er afsluttet, og hvis denne proces er for lang, vil det sandsynligvis føre til frøens død. Som nævnt i protokolafsnit 2-5 skal sutureringen udføres forsigtigt. For at sikre, at forholdet mellem mængden af apex-resektion sammenlignet med hele hjertet er omtrent det samme på tværs af frøer, analyseres hjertevægten (HW) og overfladearealet med eller uden resektion20, og en lille del af hjertespidsen resekteres for at sikre kammereksponering6.
Kryoskade, MI og apikal resektion er de tre mest anvendte metoder til at fremkalde hjerteskade hos zebrafisk og mus 6,18,21. Begrænsningen i denne artikel er, at kun den tredje metode blev brugt, hvilket betyder, at dette arbejde ikke giver nogen information om de forskellige regenerative reaktioner efter skade med de to andre metoder6. Kryoskade resulterer i død af et stort antal celler i ~ 20% af ventrikelvæggen, svarende til pattedyrinfarkter21. MI, som også kaldes koronararterieokklusion, har højere overlevelsesrater i X. tropicalis sammenlignet med apikal resektion hos mus6, men er vanskeligere at opnå i X. tropicalis, fordi hjerterne hos tropiske klofrøer er mindre end hos mus. X. tropicalis apikale resektionsmetode etableret i denne undersøgelse er enklere at udføre og har en høj postoperativ overlevelsesrate.
Den apikale resektion, der er udviklet i denne rapport, vil være en væsentlig metode til at undersøge de molekylære regenereringsmekanismer i hjerterne hos X. tropicalis. En tidligere undersøgelse viste også, at Fosl1 er uundværlig for hjerteregenerering i X. tropicalis efter apikal resektion20. Denne model af apikal resektion hjerteskade i X. tropicalis kan bruges til at lære mere om de molekylære mekanismer, der ligger til grund for hjerteregenerering for at fremme undersøgelsen af gener og molekylære mekanismer relateret til menneskelig hjerteregenerering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at erklære.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Key R&D Program of China (2016YFE0204700), National Natural Science Foundation of China (82070257, 81770240) og Research Grant of Key Laboratory of Regenerative Medicine, Undervisningsministeriet, Jinan University (ZSYXM202004 og ZSYXM202104), Kina.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | GHTECH | 64-19-7-500ml | |
| Acid Alcohol Fast Differentiation Solution | Beyotime | C0163M | |
| Acid Fuchsin | aladdin | A104916 | |
| Alcohol Soluble Eosin Y Stainin Solution | Servicebio | G1001-500ML | |
| BioReagent | Beyotime | ST2600-100g | |
| Ethanol absolute | Guangzhou Chemical Reagent Factory | HB15-GR-0.5L | |
| Hematoxylin Stain Solution | Servicebio | G1004-500ML | |
| Neutral balsam | Solarbio | G8590 | |
| Operating Scissors | Prosperich | HC-JZ-YK-Z-10cm | |
| Paraffins | Leica | 39601095 | |
| Para-formaldehyde Fixative | Servicebio | G1101-500ML | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) powder | Servicebio | G0002-2L | |
| Phosphomolybdic acid hydrate | Macklin | P815551 | |
| Stereo microscope | Leica | ||
| surgical forceps | ChangZhou | zfq-11-btjw | |
| Surgical Suture | HUAYON | 18-5140 | |
| Tricaine | Macklin | ||
| Xylene | Guangzhou Chemical Reagent Factory | IC02-AR-0.5L |
References
- Thiara, B.
- van Amerongen, M. J., Engel, F. B. Features of cardiomyocyte proliferation and its potential for cardiac regeneration. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 12 (6), 2233-2244 (2008).
- Burke, A. P., Virmani, R.
- Sessions, S. K., Bryant, S. V. Evidence that regenerative ability is an intrinsic property of limb cells in Xenopus. Journal of Experimental Zoology. 247 (1), 39-44 (1988).
- Laflamme, M. A.
- Mahmoud, A. I., Porrello, E. R., Kimura, W., Olson, E. N., Sadek, H. A. Surgical models for cardiac regeneration in neonatal mice. Nature Protocols. 9 (2), 305-311 (2014).
- Tzahor, E., Poss, K. D. Cardiac regeneration strategies: Staying young at heart. Science. 356 (6342), 1035-1039 (2017).
- Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).
- Porrello, E. R., et al. Regulation of neonatal and adult mammalian heart regeneration by the miR-15 family. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (1), 187-192 (2013).
- Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T.
- Liao, S., et al. Heart regeneration in adult Xenopus tropicalis after apical resection. Cell & Bioscience. 7, 70 (2017).
- Marshall, L. N., et al. Stage-dependent cardiac regeneration in Xenopus is regulated by thyroid hormone availability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3614-3623 (2019).
- Witman, N., Murtuza, B., Davis, B., Arner, A., Morrison, J. I. Recapitulation of developmental cardiogenesis governs the morphological and functional regeneration of adult newt hearts following injury. Developmental Biology. 354 (1), 67-76 (2011).
- Cano-Martinez, A., et al. Functional and structural regeneration in the axolotl heart (Ambystoma mexicanum) after partial ventricular amputation. Archivos de Cardiología de México. 80 (2), 79-86 (2010).
- Kragl, M., et al. Cells keep a memory of their tissue origin during axolotl limb regeneration. Nature. 460 (7251), 60-65 (2009).
- Oberpriller, J. O., Oberpriller, J. C. Response of the adult newt ventricle to injury. Journal of Experimental Zoology. 187 (2), 249-253 (1974).
- Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish. Development. 138 (9), 1663-1674 (2011).
- Ellman, D. G., et al. Apex resection in zebrafish (Danio rerio) as a model of heart regeneration: A video-assisted guide. International Journal of Molecular Sciences. 22 (11), 5865 (2021).
- Lee-Liu, D., et al. Genome-wide expression profile of the response to spinal cord injury in Xenopus laevis reveals extensive differences between regenerative and non-regenerative stages. Neural Development. 9, 12 (2014).
- Wu, H. Y., et al. Fosl1 is vital to heart regeneration upon apex resection in adult Xenopus tropicalis. npj Regenerative Medicine. 6 (1), 36 (2021).
- Chablais, F., Jazwinska, A. Induction of myocardial infarction in adult zebrafish using cryoinjury. Journal of Visualized Experiments. (62), e3666 (2012).
