Summary
Xenopus tropicalis è un modello ideale per la ricerca rigenerativa in quanto molti dei suoi organi possiedono una notevole capacità rigenerativa. Qui, presentiamo un metodo per costruire un modello di lesione cardiaca in X. tropicalis tramite resezione dell'apice.
Abstract
È noto che nei mammiferi adulti, il cuore ha perso la sua capacità rigenerativa, rendendo l'insufficienza cardiaca una delle principali cause di morte in tutto il mondo. Ricerche precedenti hanno dimostrato la capacità rigenerativa del cuore dell'adulto Xenopus tropicalis, un anfibio anuro con un genoma diploide e una stretta relazione evolutiva con i mammiferi. Inoltre, gli studi hanno dimostrato che dopo la resezione dell'apice ventricolare, il cuore può rigenerarsi senza cicatrici in X. tropicalis. Di conseguenza, questi risultati precedenti suggeriscono che X. tropicalis è un modello di vertebrato alternativo appropriato per lo studio della rigenerazione cardiaca adulta. Un modello chirurgico di rigenerazione cardiaca nell'adulto X. tropicalis è presentato qui. In breve, le rane furono anestetizzate, fissate; Quindi, è stata praticata una piccola incisione con forbici per iridectomia, penetrando nella pelle e nel pericardio. Una leggera pressione è stata applicata al ventricolo e l'apice del ventricolo è stato quindi tagliato con le forbici. Il danno cardiaco e la rigenerazione sono stati confermati dall'istologia a 7-30 giorni dopo la resezione (dpr). Questo protocollo ha stabilito un modello di resezione apicale nell'adulto X. tropicalis, che può essere impiegato per chiarire i meccanismi della rigenerazione cardiaca adulta.
Introduction
L'insufficienza cardiaca è stata una delle principali cause di mortalità in tutto il mondo negli ultimi anni. Dal 2000, il numero di decessi dovuti a insufficienza cardiaca è aumentato nel tempo. Più di 9 milioni di persone sono morte per cardiomiopatia nel 2019, che ha rappresentato il 16% del numero totale di decessi a livello globale1. A causa della perdita della capacità rigenerativa del cuore nei mammiferi adulti, in alcuni casi, non ci sono abbastanza cardiomiociti per mantenere le funzioni di contrazione nel cuore, che influisce sulla funzione cardiaca e contribuisce al rimodellamento ventricolare anormale e all'insufficienza cardiaca 2,3,4. Infatti, nei mammiferi, il cuore ha la capacità rigenerativa più scarsa rispetto agli altri organi, come fegato, polmoni, intestino, vescica, ossa e pelle. Man mano che l'invecchiamento della popolazione mondiale diventa un megatrend globale, le sfide che affrontiamo con le malattie cardiache si intensificheranno5.
Chiarire i meccanismi della rigenerazione cardiaca può avere implicazioni significative per le terapie per la cardiopatia ischemica. I rapporti hanno rivelato che i cuori dei topi neonatali hanno una capacità rigenerativa dopo laresezione 6 dell'apice. Tuttavia, questa capacità rigenerativa viene persa dopo 7 giorni di età7. Gli studi hanno dimostrato che i cuori adulti dei mammiferi non sono in grado di rigenerarsi perché la loro capacità di proliferazione dei cardiomiociti è diminuitadell'8,9. Tuttavia, i cuori dei vertebrati inferiori possiedono una potente capacità rigenerativa dopo l'infortunio. Ad esempio, zebrafish10, X. tropicalis11, Xenopus laevis12, newt 13 e axolotl14 sono in grado di rigenerarsi completamente dopo la resezione dell'apice. Inoltre, anche le altre parti del corpo di alcuni vertebrati inferiori possono subire una completa rigenerazione, come gli arti dei tritoni e le code, le lenti e le braccia delle rane artigliate tropicali 4,15,16.
Stabilire modelli di lesioni cardiache è il primo passo per chiarire i meccanismi alla base della rigenerazione cardiaca e ha un grande significato nella ricerca rigenerativa. I ricercatori hanno sviluppato vari metodi per costruire modelli di lesioni cardiache, tra cui accoltellamento, contusing, ablazione genetica, criolesione e infarto 5,6.
La criolesione, l'infarto miocardico (IM) e la resezione all'apice sono ampiamente utilizzati per indurre lesioni cardiache e il tipo di lesione può avere effetti sostanziali sulla successiva rigenerazione dei cardiomiociti6. A seconda della tecnica chirurgica, la risposta del cuore alla rigenerazione potrebbe variare. La criolesione provoca una massiccia morte cellulare e produce cicatrici fibrotiche nel cuore del pesce zebra17, creando così un modello che assomiglia all'infarto dei mammiferi. La resezione apicale viene eseguita tagliando via una parte dei tessuti ventricolari, che è stata fatta in zebrafish10 e X. tropicalis11, senza causare cicatrici permanenti. Questo studio ha eseguito la resezione apicale, che è un'operazione più semplice e richiede meno strumenti chirurgici rispetto alla criolesione. Utilizzando l'analisi del lineage-tracing, uno studio precedente ha dimostrato che la rigenerazione cardiaca è correlata alla proliferazione di cardiomiociti che preesistono nei cuori del topo6 e del pesce zebra18, ma non esistono segnalazioni per gli anfibi. Quindi, il modello di resezione dell'apice in X. tropicalis gioca un ruolo importante nel chiarire i meccanismi alla base delle risposte rigenerative.
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Protocol
Tutti i protocolli sperimentali relativi a X. tropicalis sono stati approvati dal Jinan University Animal Care Committee.
1. Chirurgia
- Preparazione preoperatoria: tenere pronte forbici oftalmiche, pinze oftalmiche, pinze per aghi, sfere assorbenti, carta da filtro e suture chirurgiche / aghi per la resezione dell'apice nel cuore di X. tropicalis. Fare riferimento alla tabella dei materiali per informazioni dettagliate. Prima dell'uso, sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici in autoclave e preparare una quantità adeguata di ghiaccio per un uso futuro.
- Anestetizzare un adulto X. tropicalis con tricaina mettendolo in 500 ml di soluzione di tricaina (1 mg/ml) a temperatura ambiente per 4 min19, quindi metterlo su una superficie di ghiaccio sul tavolo operatorio per assicurarsi che la rana non si svegli durante il processo operativo.
ATTENZIONE: L'intera procedura richiede 5-10 min; il tempo di anestesia non dovrebbe essere troppo lungo, altrimenti X. tropicalis potrebbe non essere in grado di svegliarsi dopo l'operazione. - Thoracotomy
- Posizionare l'addome di X. tropicalis anestetizzato verso l'alto e coprire l'addome della rana con una garza imbevuta di acqua distillata per evitare l'essiccazione della pelle dell'animale durante l'operazione.
- Premere delicatamente il torace con una pinza, trovare il centro del torace parallelo all'arto anteriore inferiore, sollevare la pelle con le forbici oftalmiche e praticare delicatamente una piccola incisione di ~ 1 cm. Usando le forbici oftalmiche, raccogli lo strato muscolare sotto la pelle e crea una ferita nel muscolo toracico centrale. Poiché il cuore si trova nella posizione superiore del sito della ferita, premere delicatamente il torace con la pinza oftalmica per spremere il cuore dalla ferita.
ATTENZIONE: Poiché la pelle di X. tropicalis può produrre peptidi antimicrobici, non è necessario impiegare procedure di disinfezione convenzionali sul sito chirurgico di X. tropicalis. Qualsiasi disinfettante danneggerà la pelle di X. tropicalis.
- Resezione dell'apice ventricolare
- Bloccare delicatamente il pericardio con una pinza e romperlo delicatamente usando le forbici oftalmiche vicino all'apice del cuore. Attendere che il pericardio si stacchi a causa del pompaggio del sangue sistolico (Figura 1A, B).
- Tenere la punta del cuore con una pinza nella mano non dominante e sollevare leggermente il cuore in base al ritmo di contrazione cardiaca. Quando il cuore si contrae per ricircolare il sangue attraverso i vasi sanguigni, tagliare rapidamente l'apice del cuore (~ 14% del ventricolo) (Figura 1C).
- Per garantire che la quantità di resezione dell'apice sia circa il 14% dell'intero cuore, analizzare il peso cardiaco (HW) e l'area superficiale con o senza resezione20. Metti il cuore nel petto usando una pinza e una palla assorbente.
NOTA: Non premere il cuore direttamente con la pinza; Altrimenti, altre parti del cuore saranno perforate.
- Suturare la pelle con una sutura chirurgica del filo chirurgico non di seta non assorbente 4-0 (Figura 1D). Fare attenzione a evitare di suturare nello strato muscolare per prevenire la mortalità postoperatoria. Attendere che la ferita cutanea guarisca naturalmente entro 1 settimana dopo l'intervento chirurgico.
- Nel gruppo di operazioni fittizie, eseguire la toracotomia, aprire il pericardio e la sutura, senza eseguire la resezione dell'apice.
2. Recupero chirurgico
- Posizionare il postoperatorio X. tropicalis con l'addome rivolto verso l'alto in una capsula di Petri contenente una piccola quantità di acqua deionizzata (non inondare completamente l'animale). Attendi che X. tropicalis si svegli entro ~ 10 minuti.
- Dopo aver ripreso conoscenza, osservare la mobilità e l'attività dell'animale, nonché la sutura della ferita durante l'attività. Trasferire le rane che hanno ritrovato il loro equilibrio in un contenitore pieno di acqua pura per la coltivazione. Sostituire l'acqua con acqua pura ogni giorno per evitare l'infezione della ferita.
NOTA: Con queste misure, il tasso di sopravvivenza potrebbe raggiungere ~ 90%. Un tempo prolungato di anestesia e sanguinamento eccessivo durante l'intervento chirurgico portano entrambi alla morte, che in genere si verifica il giorno dell'intervento.
3. Rilevamento della condizione di riparazione dopo lesione cardiaca
- Raccogli i cuori di X. tropicalis in più punti temporali dopo l'intervento chirurgico.
- Dopo aver anestetizzato X. tropicalis con tricaina, aprire l'addome e utilizzare una pinza per rimuovere gli altri organi interni e tessuti per trovare la posizione del cuore.
NOTA: A causa della resezione dell'apice, è probabile che il cuore si sviluppi insieme ad altri tessuti e organi durante il processo di riparazione. A volte, si attacca alla parete muscolare e non è facile da separare, quindi deve essere maneggiato con cura durante la raccolta. - Dopo aver trovato il cuore, usa una pinza per strappare delicatamente gli altri organi dal cuore. Rimuovere delicatamente gli altri tessuti che circondano il cuore per esporre il cuore. Usa una pinza per sollevare delicatamente il cuore e taglialo usando le forbici. Posizionare immediatamente il cuore in PBS per rimuovere il sangue residuo e fotografarlo con uno stereoscopio per la documentazione (Figura 2).
- Dopo aver anestetizzato X. tropicalis con tricaina, aprire l'addome e utilizzare una pinza per rimuovere gli altri organi interni e tessuti per trovare la posizione del cuore.
- Disidratazione gradiente
- Tamponare i cuori con carta da filtro per asciugare i residui di PBS in eccesso e metterli in un piatto di coltura cellulare a 24 pozzetti. Utilizzare 1-2 ml di paraformaldeide al 4% per fissare i tessuti cardiaci durante la notte. Il giorno seguente, eseguire la disidratazione dell'etanolo. In primo luogo, utilizzare il 70% di etanolo durante la notte, seguito da 80% di etanolo, 90% di etanolo e 100% di etanolo per la disidratazione del gradiente (1 ora ogni volta). Ripetere l'uso di etanolo al 100% tre volte.
- Incorporazione di paraffina
- Trattare il tessuto cardiaco disidratato con xilene per 6-8 minuti. Porre il tessuto trattato con xilene in un contenitore di vetro riempito con cera di paraffina a 65 °C per 2-3 ore.
NOTA: è essenziale evitare bolle d'aria in quanto influenzano la sezione durante il processo di incorporamento.
- Trattare il tessuto cardiaco disidratato con xilene per 6-8 minuti. Porre il tessuto trattato con xilene in un contenitore di vetro riempito con cera di paraffina a 65 °C per 2-3 ore.
- Congelare il tessuto incorporato a -20 °C per 1 ora e sezionarlo.
- Dopo aver sezionato il cuore, eseguire le tecniche standard di ematossilina ed eosina (H & E) e le tecniche di colorazione tricromatica di Masson sulle sezioni11.
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Representative Results
I cuori sono stati raccolti a 0 dpr, 7 dpr, 14 dpr e 30 dpr. L'analisi morfologica ha rivelato che il coagulo di sangue causato dalla lesione cardiaca è scomparso a 30 dpr (Figura 2). Allo stesso tempo, l'aspetto dei cuori a 30 dpr nel gruppo di resezione era simile a quello dei cuori nel gruppo di operazione fittizia; non c'erano ferite evidenti (Figura 2). Dopo la resezione apicale, un coagulo di sangue si è formato e ha sigillato la ferita nel ventricolo, come osservato da H & E (Figura 3) e dalla colorazione tricromatica di Masson (Figura 4). Entro 14 dpr, il coagulo è gradualmente scomparso ed è stato sostituito dalla fibrina (Figura 4). Da 14 dpr a 30 dpr, il miocardio ha sostituito in modo incrementale la fibrina e riparato l'apice del ventricolo danneggiato (Figura 4). L'analisi istologica non ha mostrato alcuna differenza tra i cuori finti e resecati a 30 dpr (Figura 3 e Figura 4). Questa analisi morfologica e istologica ha rivelato che X. tropicalis adulto potrebbe riparare e rigenerare l'apice ventricolare danneggiato di 30 dpr.
Figura 1: Procedura chirurgica . (A) Immagine rappresentativa di un cuore esposto coperto dal pericardio. (B) Immagine rappresentativa di un cuore nella fase sistolica, durante la quale il pericardio è stato staccato; La linea tratteggiata indica il sito della resezione apicale del cuore. (C) Immagine rappresentativa della resezione apicale del cuore. (D) Immagine rappresentativa della sutura cutanea dopo l'intervento chirurgico. Barre della scala = 1 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Analisi morfologica dei cuori di X. tropicalis da 0 dpr a 30 dpr. (A) Immagini rappresentative dei cuori dei gruppi sham (a sinistra) e di resezione apicale (a destra) a 0 dpr, con l'apice del cuore significativamente assente nel gruppo di resezione. (B,C) Immagini rappresentative di cuori dai gruppi sham (a sinistra) contro i gruppi di resezione (a destra) a 7-14 dpr, con molti coaguli di sangue che appaiono nei cuori del gruppo di resezione a 7 dpr. A 14 dpr, si osserva una rigenerazione significativa nel sito di resezione apicale, ma i bordi dell'apice del cuore non sono uniformi. (D) Immagine rappresentativa dei cuori dei gruppi sham (a sinistra) rispetto ai gruppi di resezione (a destra) a 30 dpr; L'apice del cuore resecato si è quasi interamente rigenerato. Barre della scala = 1 mm. Abbreviazione: dpr = giorni dopo la resezione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Analisi istologica dei cuori di Xenopus tropicalis da 0 dpr a 30 dpr. Immagini rappresentative della colorazione H&E utilizzando cuori dei gruppi sham e resection da 0 dpr a 30 dpr. (A) Immagine rappresentativa della colorazione H&E usando cuori del gruppo fittizio, con linee tratteggiate che indicano i piani approssimativi di amputazione. (B) Immagine rappresentativa della colorazione H&E usando i cuori del gruppo di resezione a 0 dpr. (C-E) Immagini rappresentative della colorazione H & E usando cuori del gruppo di resezione a 7-30 dpr, con grandi quantità di globuli rossi accumulati all'interno della ferita a 7 dpr (frecce). Una massa di fibrina è apparsa nel sito di resezione a 14 dpr (punte di freccia). I cuori si sono rigenerati completamente senza cicatrici a 30 dpr. Barra della scala = 500 μm. Abbreviazione: dpr = giorni dopo la resezione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Analisi della fibrosi miocardica dei cuori di X. tropicalis da 0 dpr a 30 dpr. Immagini rappresentative della colorazione dei cuori di Masson dai gruppi sham e resection da 0 dpr a 30 dpr. (A) Immagine rappresentativa della colorazione dei cuori di Masson dal gruppo fittizio, con linee tratteggiate che indicano i piani approssimativi di amputazione. (B) Immagine rappresentativa della colorazione dei cuori di Masson dal gruppo di resezione a 0 dpr. (C-E) Immagini rappresentative della colorazione dei cuori di Masson dal gruppo di resezione a 7-30 dpr, con grandi quantità di globuli rossi accumulati all'interno della ferita a 7 dpr (frecce). Una massa di fibrina è apparsa nel sito di resezione a 14 dpr (punte di freccia). I cuori si sono rigenerati completamente senza cicatrici a 30 dpr. Barra della scala = 500 μm. Abbreviazione: dpr = giorni dopo la resezione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
La resezione apicale, che comporta l'amputazione chirurgica dell'apice del cuore, è stata descritta in zebrafish e topi 6,18; tuttavia, questo non è stato descritto in X. tropicalis. Questo rapporto descrive un modello credibile di danno cardiaco e dimostra che il cuore di X. tropicalis adulto può rigenerarsi completamente dopo la resezione apicale senza cicatrici. Tuttavia, alcune carenze devono essere migliorate e alcuni dettagli richiedono attenzione.
Sebbene la resezione apicale possa stabilire un modello di lesione cardiaca, garantire la stessa estensione di escissione del cuore è difficile a causa della diversità delle rane, che hanno dimensioni cardiache diverse. Per garantire che i cuori con apici delle stesse dimensioni vengano resecati, è necessario selezionare rane della stessa dimensione e l'operatore deve esercitarsi ampiamente prima dell'esperimento.
In secondo luogo, la capacità di localizzare ed esporre il cuore in modo accurato e rapido è fondamentale per il successo della procedura, poiché il processo di ricerca del cuore può provocare la puntura dei vasi sanguigni adiacenti e causare sanguinamento, impedendo così il progresso della procedura o addirittura causando il fallimento. La durata dell'anestesia non dovrebbe essere troppo breve o troppo lunga. Se è troppo corto, la rana può svegliarsi prima che l'operazione sia completa, e se questo processo è troppo lungo, è probabile che porti alla morte della rana. Come menzionato nelle sezioni 2-5 del protocollo, la sutura deve essere eseguita con cautela. Per garantire che il rapporto tra la quantità di resezione dell'apice rispetto all'intero cuore sia circa lo stesso tra le rane, il peso cardiaco (HW) e l'area superficiale con o senza resezione vengono analizzati20 e una piccola porzione dell'apice cardiaco viene resecata per garantire l'esposizione della camera6.
Criolesione, IM e resezione apicale sono i tre metodi più utilizzati per indurre lesioni cardiache in zebrafish e topi 6,18,21. Il limite di questo articolo è che è stato utilizzato solo il terzo metodo, il che significa che questo lavoro non fornisce alcuna informazione sulle diverse risposte rigenerative dopo la lesione con gli altri due metodi6. La criolesione provoca la morte di un gran numero di cellule in ~ 20% della parete ventricolare, simile agli infarti dei mammiferi21. L'infarto miocardico, che è anche chiamato occlusione coronarica, ha tassi di sopravvivenza più elevati in X. tropicalis rispetto alla resezione apicale nei topi6, ma è più difficile da raggiungere in X. tropicalis perché i cuori delle rane artigliate tropicali sono più piccoli di quelli dei topi. Il metodo di resezione apicale di X. tropicalis stabilito in questo studio è più semplice da eseguire e ha un alto tasso di sopravvivenza postoperatoria.
La resezione apicale sviluppata in questo rapporto sarà un metodo significativo per studiare i meccanismi molecolari di rigenerazione nel cuore di X. tropicalis. Uno studio precedente ha anche dimostrato che Fosl1 è indispensabile per la rigenerazione cardiaca in X. tropicalis dopo resezione apicale20. Questo modello di cardiolesione della resezione apicale in X. tropicalis può essere utilizzato per saperne di più sui meccanismi molecolari alla base della rigenerazione cardiaca per promuovere lo studio dei geni e dei meccanismi molecolari correlati alla rigenerazione cardiaca umana.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni del National Key R&D Program of China (2016YFE0204700), della National Natural Science Foundation of China (82070257, 81770240) e della Research Grant of Key Laboratory of Regenerative Medicine, Ministero della Pubblica Istruzione, Jinan University (ZSYXM202004 e ZSYXM202104), Cina.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | GHTECH | 64-19-7-500ml | |
| Acid Alcohol Fast Differentiation Solution | Beyotime | C0163M | |
| Acid Fuchsin | aladdin | A104916 | |
| Alcohol Soluble Eosin Y Stainin Solution | Servicebio | G1001-500ML | |
| BioReagent | Beyotime | ST2600-100g | |
| Ethanol absolute | Guangzhou Chemical Reagent Factory | HB15-GR-0.5L | |
| Hematoxylin Stain Solution | Servicebio | G1004-500ML | |
| Neutral balsam | Solarbio | G8590 | |
| Operating Scissors | Prosperich | HC-JZ-YK-Z-10cm | |
| Paraffins | Leica | 39601095 | |
| Para-formaldehyde Fixative | Servicebio | G1101-500ML | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) powder | Servicebio | G0002-2L | |
| Phosphomolybdic acid hydrate | Macklin | P815551 | |
| Stereo microscope | Leica | ||
| surgical forceps | ChangZhou | zfq-11-btjw | |
| Surgical Suture | HUAYON | 18-5140 | |
| Tricaine | Macklin | ||
| Xylene | Guangzhou Chemical Reagent Factory | IC02-AR-0.5L |
References
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