Summary
Xenopus tropicalis é um modelo ideal para pesquisa regenerativa, pois muitos de seus órgãos possuem uma notável capacidade regenerativa. Apresentamos aqui um método para a construção de um modelo de lesão cardíaca em X. tropicalis via ressecção do ápice.
Abstract
Sabe-se que, em mamíferos adultos, o coração perdeu sua capacidade regenerativa, tornando a insuficiência cardíaca uma das principais causas de morte em todo o mundo. Pesquisas anteriores demonstraram a capacidade regenerativa do coração do adulto Xenopus tropicalis, um anfíbio anuro com genoma diploide e estreita relação evolutiva com mamíferos. Além disso, estudos têm demonstrado que, após a ressecção do ápice ventricular, o coração pode se regenerar sem cicatrizes em X. tropicalis. Consequentemente, esses resultados prévios sugerem que X. tropicalis é um modelo alternativo apropriado de vertebrados para o estudo da regeneração cardíaca de adultos. Um modelo cirúrgico de regeneração cardíaca no adulto X. tropicalis é apresentado neste artigo. Resumidamente, as rãs foram anestesiadas e fixadas; Em seguida, foi feita uma pequena incisão com tesoura de iridectomia, penetrando na pele e pericárdio. Suave pressão foi aplicada ao ventrículo, e o ápice do ventrículo foi então cortado com tesoura. A lesão cardíaca e a regeneração foram confirmadas pela histologia aos 7-30 dias pós-ressecção (dpr). Este protocolo estabeleceu um modelo de ressecção apical em X. tropicalis adulto, que pode ser empregado para elucidar os mecanismos de regeneração cardíaca do adulto.
Introduction
A insuficiência cardíaca tem sido uma das principais causas de mortalidade no mundo nos últimos anos. Desde 2000, o número de mortes por insuficiência cardíaca vem aumentando ao longo do tempo. Mais de 9 milhões de pessoas morreram de cardiomiopatia em 2019, o que representou 16% do número total de mortalidades em todo o mundo1. Devido à perda da capacidade regenerativa do coração em mamíferos adultos, em alguns casos, não há cardiomiócitos suficientes para manter as funções de contração no coração, o que afeta a função cardíaca e contribui para remodelamento ventricular anormal e insuficiênciacardíaca2,3,4. De fato, nos mamíferos, o coração tem a menor capacidade regenerativa em comparação com os outros órgãos, como fígado, pulmões, intestinos, bexiga, osso e pele. À medida que o envelhecimento da população mundial se torna uma megatendência mundial, os desafios que enfrentamos com as doenças cardíacas se intensificarão5.
A elucidação dos mecanismos de regeneração cardíaca pode ter implicações significativas para as terapias da cardiopatia isquêmica. Relatos revelaram que os corações de camundongos neonatais têm uma capacidade regenerativa após a ressecção do ápice6. No entanto, essa capacidade regenerativa é perdida após os 7 dias de idade7. Estudos têm demonstrado que corações adultos de mamíferos são incapazes de se regenerar porque sua capacidade de proliferação de cardiomiócitos tem diminuído 8,9. No entanto, os corações dos vertebrados inferiores possuem uma poderosa capacidade regenerativa após lesão. Por exemplo, zebrafish10, X. tropicalis11, Xenopus laevis12, newt 13 e axolotl14 são capazes de regeneração completa após ressecção do ápice. Além disso, as outras partes do corpo de alguns vertebrados inferiores também podem sofrer regeneração completa, como os membros dos tritões e as caudas, lentes e braços de rãs tropicais com garras 4,15,16.
O estabelecimento de modelos de lesão cardíaca é o primeiro passo para elucidar os mecanismos subjacentes à regeneração cardíaca e tem grande importância na pesquisa regenerativa. Pesquisadores desenvolveram vários métodos para construir modelos de lesão cardíaca, incluindo facada, contussão, ablação genética, criolesão e infarto 5,6.
A criolesão, o infarto do miocárdio (IM) e a ressecção do ápice são amplamente utilizados para induzir lesão cardíaca, e o tipo de lesão pode ter efeitos substanciais na regeneração subsequente dos cardiomiócitos6. Dependendo da técnica cirúrgica, a resposta do coração à regeneração pode variar. A criolesão causa morte celular maciça e produz cicatrizes fibróticas no coração do peixe-zebra17, criando um modelo que se assemelha ao infarto de mamíferos. A ressecção apical é realizada cortando-se uma parte dos tecidos ventriculares, o que tem sido feito em zebrafish10 e X. tropicalis11, sem causar cicatrizes permanentes. Este estudo realizou a ressecção apical, que é uma operação mais simples e requer menos instrumentais cirúrgicos do que a criolesão. Usando análise de traçado de linhagem, um estudo anterior demonstrou que a regeneração cardíaca está relacionada à proliferação de cardiomiócitos que preexistem nos corações de camundongos6 e zebrafish18, mas não há relatos para anfíbios. Assim, o modelo de ressecção de ápice em X. tropicalis desempenha um papel importante na elucidação dos mecanismos subjacentes às respostas regenerativas.
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Protocol
Todos os protocolos experimentais relacionados a X. tropicalis foram aprovados pelo Comitê de Cuidados com Animais da Universidade de Jinan.
1. Cirurgia
- Preparo pré-operatório: Manter prontas tesouras oftálmicas, pinças oftálmicas, pinças de agulha, bolas absorventes, papel filtro e suturas/agulhas cirúrgicas para ressecção do ápice no coração de X. tropicalis. Consulte a Tabela de Materiais para obter informações detalhadas. Antes do uso, esterilizar todos os instrumentais cirúrgicos por autoclavação e preparar uma quantidade adequada de gelo para uso futuro.
- Anestesiar um adulto de X. tropicalis com tricaína colocando-o em 500 mL de solução de tricaína (1 mg/mL) à temperatura ambiente por 4 min19 e, em seguida, colocá-lo em uma superfície de gelo na mesa cirúrgica para garantir que a rã não acorde durante o processo operacional.
CUIDADO: Todo o procedimento requer 5-10 min; o tempo de anestesia não deve ser muito longo, caso contrário, o X. tropicalis pode não ser capaz de acordar após a operação. - Toracotomia
- Coloque o abdômen de X. tropicalis anestesiado para cima e cubra o abdômen da rã com gaze pré-embebida em água destilada para evitar o ressecamento da pele do animal durante a operação.
- Pressione suavemente o peito com pinças, encontre o centro do tórax paralelo ao membro anterior inferior, levante a pele com tesoura oftálmica e faça suavemente uma pequena incisão de ~1 cm. Usando tesoura oftálmica, pegue a camada muscular sob a pele e crie uma ferida no músculo central do peito. Como o coração está localizado na posição superior do local da ferida, pressione suavemente o peito com a pinça oftálmica para espremer o coração para fora da ferida.
CUIDADO: Como a pele de X. tropicalis pode produzir peptídeos antimicrobianos, é desnecessário empregar procedimentos convencionais de desinfecção no sítio cirúrgico de X. tropicalis. Qualquer desinfetante danificará a pele do X. tropicalis.
- Ressecção do ápice ventricular
- Aperte suavemente o pericárdio com pinça e quebre-o suavemente usando tesoura oftálmica perto do ápice do coração. Aguarde a saída do pericárdio devido ao bombeamento de sangue sistólico (Figura 1A, B).
- Segure a ponta do coração com pinça na mão não dominante e levante o coração levemente de acordo com o ritmo de contração cardíaca. Quando o coração se contrai para recircular o sangue através dos vasos sanguíneos, corte rapidamente o ápice do coração (~14% do ventrículo) (Figura 1C).
- Para garantir que a quantidade de ressecção do ápice seja de aproximadamente 14% de todo o coração, analise o peso do coração (CH) e a área de superfície com ou sem ressecção20. Coloque o coração no peito usando pinça e uma bola absorvente.
OBS: Não pressione o coração diretamente com a pinça; caso contrário, outras partes do coração serão perfuradas.
- Sutura da pele com fio cirúrgico não absorvente 4-0 e não seda (Figura 1D). Tenha cuidado para evitar sutura na camada muscular para evitar mortalidade pós-operatória. Espere que a ferida da pele cicatrize naturalmente dentro de 1 semana após a cirurgia.
- No grupo operação simulada, realizar a toracotomia, abrir o pericárdio e suturar, sem realizar a ressecção do ápice.
2. Recuperação cirúrgica
- Coloque o X. tropicalis pós-operatório com o abdômen voltado para cima em uma placa de Petri contendo uma pequena quantidade de água deionizada (não inunde completamente o animal). Espere o X. tropicalis acordar dentro de ~10 min.
- Ao recuperar a consciência, observe a mobilidade e a atividade do animal, bem como a sutura da ferida durante a atividade. Transfira as rãs que recuperaram o equilíbrio para um recipiente cheio de água pura para cultivo. Substitua a água por água pura todos os dias para evitar a infecção da ferida.
NOTA: Com essas medidas, a taxa de sobrevivência poderia chegar a ~90%. Um tempo prolongado de anestesia e sangramento excessivo durante a cirurgia levam à morte, que normalmente ocorre no dia da cirurgia.
3. Detecção da condição de reparo após lesão cardíaca
- Coletar os corações de X. tropicalis em vários pontos de tempo após a cirurgia.
- Depois de anestesiar o X. tropicalis com tricaína, abra o abdômen e use fórceps para remover os outros órgãos e tecidos internos para encontrar a localização do coração.
NOTA: Devido à ressecção do ápice, é provável que o coração se desenvolva ao lado de outros tecidos e órgãos durante o processo de reparo. Às vezes, ele adere à parede muscular e não é fácil de separar, por isso precisa ser manuseado com cuidado durante a coleta. - Depois de encontrar o coração, use pinças para arrancar suavemente os outros órgãos do coração. Descasque suavemente os outros tecidos ao redor do coração para expor o coração. Use pinças para levantar suavemente o coração e corte-o usando tesoura. Coloque o coração imediatamente em PBS para remover o sangue remanescente e fotografe-o com um estereoscópio para documentação (Figura 2).
- Depois de anestesiar o X. tropicalis com tricaína, abra o abdômen e use fórceps para remover os outros órgãos e tecidos internos para encontrar a localização do coração.
- Desidratação gradiente
- Limpe os corações com papel filtro para secar o excesso de resíduos de PBS e coloque-os em uma placa de cultura celular de 24 poços. Use 1-2 ml de paraformaldeído a 4% para fixar os tecidos cardíacos durante a noite. No dia seguinte, realizar a desidratação com etanol. Primeiro, use 70% de etanol durante a noite, seguido por 80% de etanol, 90% de etanol e 100% de etanol para desidratação do gradiente (1 h de cada vez). Repita o uso de etanol 100% três vezes.
- Incorporação de parafina
- Trate o tecido cardíaco desidratado com xileno por 6-8 min. Colocar o tecido tratado com xileno num recipiente de vidro preenchido com cera de parafina a 65 °C durante 2-3 horas.
NOTA: É essencial evitar bolhas de ar, pois elas afetam a seção durante o processo de incorporação.
- Trate o tecido cardíaco desidratado com xileno por 6-8 min. Colocar o tecido tratado com xileno num recipiente de vidro preenchido com cera de parafina a 65 °C durante 2-3 horas.
- Congelar o tecido incorporado a -20 °C durante 1 h e seccioná-lo.
- Após a secção do coração, realizar-se as técnicas padrão de hematoxilina e eosina (H&E) e tricrômico de Masson nos cortes11.
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Representative Results
Os corações foram coletados a 0 dpr, 7 dpr, 14 dpr e 30 dpr. A análise morfológica revelou que o coágulo sanguíneo causado pela lesão cardíaca desapareceu aos 30 dpr (Figura 2). Ao mesmo tempo, a aparência dos corações a 30 dpr no grupo de ressecção foi semelhante à dos corações no grupo de operação simulada; não havia ferimentos evidentes (Figura 2). Após a ressecção apical, um coágulo sanguíneo se formou e selou a ferida no ventrículo, como observado por H&E (Figura 3) e coloração tricrômico de Masson (Figura 4). Dentro de 14 dpr, o coágulo desapareceu gradualmente e foi substituído por fibrina (Figura 4). De 14 dpr a 30 dpr, o miocárdio substituiu incrementalmente a fibrina e reparou o ápice ventrículo lesado (Figura 4). A análise histológica não mostrou diferença entre os corações sham e ressecados aos 30 dpr (Figura 3 e Figura 4). Esta análise morfológica e histológica revelou que adultos de X. tropicalis foram capazes de reparar e regenerar o ápice ventricular lesado em 30 dpr.
Figura 1: Procedimento cirúrgico . (A) Imagem representativa de um coração exposto coberto pelo pericárdio. (B) Imagem representativa de um coração na fase sistólica, durante a qual o pericárdio foi descascado; A linha tracejada indica o local da ressecção apical do coração. (C) Imagem representativa da ressecção do ápice do coração. (D) Imagem representativa da sutura da pele após a cirurgia. Barras de escala = 1 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Análise morfológica dos corações de X. tropicalis de 0 dpr a 30 dpr. (A) Imagens representativas dos corações dos grupos sham (esquerda) e ressecção apical (direita) a 0 dpr, com o ápice do coração significativamente ausente no grupo de ressecção. (B,C) Imagens representativas de corações do grupo sham (esquerda) versus grupos de ressecção (direita) em 7-14 dpr, com muitos coágulos de sangue aparecendo nos corações do grupo de ressecção em 7 dpr. Aos 14 dpr, observa-se regeneração significativa no local da ressecção apical, mas as bordas do ápice do coração não são uniformes. (D) Imagem representativa de corações do sham (esquerda) versus grupos de ressecção (direita) a 30 dpr; O ápice do coração ressecado se regenerou quase totalmente. Barras de escala = 1 mm. Abreviação: dpr = dias pós-ressecção. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Análise histológica de corações de Xenopus tropicalis de 0 dpr a 30 dpr. Imagens representativas da coloração de H&E usando corações dos grupos sham e ressecção em 0 dpr a 30 dpr. (A) Imagem representativa da coloração de H&E usando corações do grupo simulado, com linhas tracejadas indicando os planos de amputação aproximados. (B) Imagem representativa da coloração de H&E utilizando corações do grupo de ressecção a 0 dpr. (C-E) Imagens representativas da coloração de H&E usando corações do grupo de ressecção a 7-30 dpr, com grande quantidade de hemácias acumuladas no interior da ferida a 7 dpr (setas). Uma massa de fibrina apareceu no local da ressecção a 14 dpr (cabeças de setas). Os corações se regeneraram completamente sem cicatrizes a 30 dpr. Barra de escala = 500 μm. Abreviação: dpr = dias pós-ressecção. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Análise da fibrose miocárdica de corações de X. tropicalis de 0 dpr a 30 dpr. Imagens representativas da coloração de Masson de corações dos grupos de simulação e ressecção em 0 dpr a 30 dpr. (A) Imagem representativa da coloração de corações de Masson do grupo simulado, com linhas tracejadas indicando os planos de amputação aproximados. (B) Imagem representativa da coloração de Masson dos corações do grupo de ressecção a 0 dpr. (C-E) Imagens representativas da coloração de Masson dos corações do grupo de ressecção a 7-30 dpr, com grande quantidade de hemácias acumuladas no interior da ferida a 7 dpr (setas). Uma massa de fibrina apareceu no local da ressecção a 14 dpr (cabeças de setas). Os corações se regeneraram completamente sem cicatrizes a 30 dpr. Barra de escala = 500 μm. Abreviação: dpr = dias pós-ressecção. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A ressecção apical, que envolve a amputação cirúrgica do ápice do coração, tem sido descrita em peixes-zebra e camundongos 6,18; no entanto, isso não foi descrito em X. tropicalis. Este relato descreve um modelo crível de lesão cardíaca e demonstra que o coração de adultos X. tropicalis pode se regenerar completamente após ressecção apical sem cicatrizes. No entanto, algumas deficiências precisam ser melhoradas, e certos detalhes precisam de atenção.
Embora a ressecção apical possa estabelecer um modelo de lesão cardíaca, garantir a mesma extensão de excisão do coração é um desafio devido à diversidade das rãs, que têm diferentes tamanhos de coração. Para garantir que corações com ápices do mesmo tamanho sejam ressecados, é necessário selecionar rãs do mesmo tamanho, e o operador deve praticar extensivamente antes do experimento.
Em segundo lugar, a capacidade de localizar e expor o coração com precisão e rapidez é fundamental para o sucesso do procedimento, pois o processo de encontrar o coração pode resultar na punção dos vasos sanguíneos adjacentes e causar sangramento, impedindo o progresso do procedimento ou mesmo causando falha. A duração da anestesia não deve ser muito curta ou muito longa. Se for muito curto, a rã pode acordar antes que a operação seja concluída e, se esse processo for muito longo, é provável que leve à morte da rã. Como mencionado nas seções do protocolo 2-5, a sutura deve ser feita com cautela. Para garantir que a proporção da quantidade de ressecção do ápice em relação ao coração inteiro seja aproximadamente a mesma entre as rãs, o peso do coração (CH) e a área de superfície com ou sem ressecção são analisados20, e uma pequena porção do ápice cardíaco é ressecada para garantir a exposição da câmara6.
Criolesão, IM e ressecção apical são os três métodos mais utilizados para induzir lesão cardíaca em peixes-zebra e camundongos 6,18,21. A limitação deste artigo é que apenas o terceiro método foi utilizado, ou seja, este trabalho não fornece nenhuma informação sobre as diferentes respostas regenerativas após lesão com os outros doismétodos6. A criolesão resulta na morte de um grande número de células em ~20% da parede ventricular, semelhante aos infartos de mamíferos21. O IM, que também é chamado de oclusão da artéria coronária, tem taxas de sobrevida mais altas em X. tropicalis em comparação com a ressecção apical em camundongos6, mas é mais difícil de alcançar em X. tropicalis porque os corações de rãs tropicais com garras são menores do que os de camundongos. O método de ressecção apical de X. tropicalis estabelecido neste estudo é mais simples de ser realizado e apresenta alta sobrevida pós-operatória.
A ressecção apical desenvolvida neste relato será um método significativo para investigar os mecanismos moleculares de regeneração no coração de X. tropicalis. Estudo prévio também demonstrou que o Fosl1 é indispensável para a regeneração cardíaca em X. tropicalis após ressecçãoapical20. Este modelo de lesão cardíaca de ressecção apical em X. tropicalis pode ser usado para aprender mais sobre os mecanismos moleculares subjacentes à regeneração cardíaca para promover o estudo dos genes e mecanismos moleculares relacionados à regeneração cardíaca humana.
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Disclosures
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por subsídios do Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento da China (2016YFE0204700), da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82070257, 81770240), e da Bolsa de Pesquisa do Laboratório Chave de Medicina Regenerativa, Ministério da Educação, Universidade de Jinan (ZSYXM202004 e ZSYXM202104), China.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | GHTECH | 64-19-7-500ml | |
| Acid Alcohol Fast Differentiation Solution | Beyotime | C0163M | |
| Acid Fuchsin | aladdin | A104916 | |
| Alcohol Soluble Eosin Y Stainin Solution | Servicebio | G1001-500ML | |
| BioReagent | Beyotime | ST2600-100g | |
| Ethanol absolute | Guangzhou Chemical Reagent Factory | HB15-GR-0.5L | |
| Hematoxylin Stain Solution | Servicebio | G1004-500ML | |
| Neutral balsam | Solarbio | G8590 | |
| Operating Scissors | Prosperich | HC-JZ-YK-Z-10cm | |
| Paraffins | Leica | 39601095 | |
| Para-formaldehyde Fixative | Servicebio | G1101-500ML | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) powder | Servicebio | G0002-2L | |
| Phosphomolybdic acid hydrate | Macklin | P815551 | |
| Stereo microscope | Leica | ||
| surgical forceps | ChangZhou | zfq-11-btjw | |
| Surgical Suture | HUAYON | 18-5140 | |
| Tricaine | Macklin | ||
| Xylene | Guangzhou Chemical Reagent Factory | IC02-AR-0.5L |
References
- Thiara, B.
- van Amerongen, M. J., Engel, F. B. Features of cardiomyocyte proliferation and its potential for cardiac regeneration. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 12 (6), 2233-2244 (2008).
- Burke, A. P., Virmani, R.
- Sessions, S. K., Bryant, S. V. Evidence that regenerative ability is an intrinsic property of limb cells in Xenopus. Journal of Experimental Zoology. 247 (1), 39-44 (1988).
- Laflamme, M. A.
- Mahmoud, A. I., Porrello, E. R., Kimura, W., Olson, E. N., Sadek, H. A. Surgical models for cardiac regeneration in neonatal mice. Nature Protocols. 9 (2), 305-311 (2014).
- Tzahor, E., Poss, K. D. Cardiac regeneration strategies: Staying young at heart. Science. 356 (6342), 1035-1039 (2017).
- Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).
- Porrello, E. R., et al. Regulation of neonatal and adult mammalian heart regeneration by the miR-15 family. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (1), 187-192 (2013).
- Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T.
- Liao, S., et al. Heart regeneration in adult Xenopus tropicalis after apical resection. Cell & Bioscience. 7, 70 (2017).
- Marshall, L. N., et al. Stage-dependent cardiac regeneration in Xenopus is regulated by thyroid hormone availability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3614-3623 (2019).
- Witman, N., Murtuza, B., Davis, B., Arner, A., Morrison, J. I. Recapitulation of developmental cardiogenesis governs the morphological and functional regeneration of adult newt hearts following injury. Developmental Biology. 354 (1), 67-76 (2011).
- Cano-Martinez, A., et al. Functional and structural regeneration in the axolotl heart (Ambystoma mexicanum) after partial ventricular amputation. Archivos de Cardiología de México. 80 (2), 79-86 (2010).
- Kragl, M., et al. Cells keep a memory of their tissue origin during axolotl limb regeneration. Nature. 460 (7251), 60-65 (2009).
- Oberpriller, J. O., Oberpriller, J. C. Response of the adult newt ventricle to injury. Journal of Experimental Zoology. 187 (2), 249-253 (1974).
- Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish. Development. 138 (9), 1663-1674 (2011).
- Ellman, D. G., et al. Apex resection in zebrafish (Danio rerio) as a model of heart regeneration: A video-assisted guide. International Journal of Molecular Sciences. 22 (11), 5865 (2021).
- Lee-Liu, D., et al. Genome-wide expression profile of the response to spinal cord injury in Xenopus laevis reveals extensive differences between regenerative and non-regenerative stages. Neural Development. 9, 12 (2014).
- Wu, H. Y., et al. Fosl1 is vital to heart regeneration upon apex resection in adult Xenopus tropicalis. npj Regenerative Medicine. 6 (1), 36 (2021).
- Chablais, F., Jazwinska, A. Induction of myocardial infarction in adult zebrafish using cryoinjury. Journal of Visualized Experiments. (62), e3666 (2012).
