Summary
Xenopus tropicalis är en idealisk modell för regenerativ forskning eftersom många av dess organ har en anmärkningsvärd regenerativ kapacitet. Här presenterar vi en metod för att konstruera en hjärtskademodell i X. tropicalis via apex-resektion.
Abstract
Det är känt att hos vuxna däggdjur har hjärtat förlorat sin regenerativa kapacitet, vilket gör hjärtsvikt till en av de främsta dödsorsakerna över hela världen. Tidigare forskning har visat den regenerativa förmågan hos hjärtat hos den vuxna Xenopus tropicalis, en anuranamfibie med ett diploida genom och ett nära evolutionärt förhållande till däggdjur. Dessutom har studier visat att efter ventrikulär apex-resektion kan hjärtat regenerera utan ärrbildning i X. tropicalis. Följaktligen tyder dessa tidigare resultat på att X. tropicalis är en lämplig alternativ ryggradsdjurmodell för studier av vuxen hjärtregenerering. En kirurgisk modell av hjärtregenerering hos vuxna X. tropicalis presenteras häri. Kortfattat bedövades grodorna och fixerades; Därefter gjordes ett litet snitt med iridectomy sax, penetrerande huden och perikardiet. Mjukt tryck applicerades på ventrikeln, och ventrikelns topp skars sedan ut med sax. Hjärtskada och regenerering bekräftades av histologi 7-30 dagar efter resektion (dpr). Detta protokoll etablerade en apikal resektionsmodell hos vuxna X. tropicalis, som kan användas för att belysa mekanismerna för vuxen hjärtregenerering.
Introduction
Hjärtsvikt har varit en ledande dödsorsak över hela världen de senaste åren. Sedan år 2000 har antalet dödsfall på grund av hjärtsvikt ökat över tid. Mer än 9 miljoner människor dog av kardiomyopati 2019, vilket stod för 16% av det totala antalet dödsfall globalt1. På grund av förlusten av hjärtats regenerativa kapacitet hos vuxna däggdjur finns det i vissa fall inte tillräckligt med kardiomyocyter för att upprätthålla sammandragningsfunktionerna i hjärtat, vilket påverkar hjärtfunktionen och bidrar till onormal ventrikulär remodellering och hjärtsvikt 2,3,4. Faktum är att hos däggdjur har hjärtat den sämsta regenerativa kapaciteten jämfört med andra organ, såsom lever, lungor, tarmar, urinblåsa, ben och hud. När åldrandet av världens befolkning blir en global megatrend kommer de utmaningar vi står inför med hjärtsjukdomar att intensifieras5.
Att belysa mekanismerna för hjärtregenerering kan ha betydande konsekvenser för terapier för ischemisk hjärtsjukdom. Rapporter har visat att hjärtat hos neonatala möss har en regenerativ kapacitet efter toppresektion6. Ändå förloras denna regenerativa kapacitet efter 7 dagars ålder7. Studier har visat att vuxna däggdjurshjärtan inte kan regenerera eftersom deras kapacitet för kardiomyocytproliferation har minskat 8,9. Hjärtan hos lägre ryggradsdjur har emellertid en kraftfull regenerativ kapacitet efter skada. Till exempel kan zebrafisk10, X. tropicalis11, Xenopus laevis 12, newt13 och axolotl 14 slutföra regenerering efter toppresektion. Dessutom kan de andra delarna av kropparna hos vissa lägre ryggradsdjur också genomgå fullständig regenerering, såsom lemmarna på newts och svansar, linser och armar av tropiska klogrodor 4,15,16.
Att etablera hjärtskademodeller är det första steget för att belysa mekanismerna bakom hjärtregenerering och har stor betydelse inom regenerativ forskning. Forskare har utvecklat olika metoder för att bygga hjärtskademodeller, inklusive knivhuggning, kontusning, genetisk ablation, kryoskada och infarkt 5,6.
Kryoskada, hjärtinfarkt (MI) och apex-resektion används ofta för att inducera hjärtskada, och typen av skada kan ha betydande effekter på följande regenerering av kardiomyocyter6. Beroende på kirurgisk teknik kan hjärtats svar på regenerering variera. Kryoskada orsakar massiv celldöd och producerar fibrotiska ärr i hjärtat hos zebrafisk17, vilket skapar en modell som liknar däggdjursinfarkt. Apikal resektion utförs genom att skära bort en del av ventrikulära vävnader, vilket har gjorts i zebrafisk10 och X. tropicalis11, utan att orsaka permanenta ärr. Denna studie utförde apikal resektion, vilket är en enklare operation och kräver färre kirurgiska instrument än kryoskada. Med hjälp av härstamningsspårningsanalys visade en tidigare studie att hjärtregenerering är relaterad till spridningen av kardiomyocyter som redan finns i hjärtat hos mus6 och zebrafisk18, men inga rapporter finns för amfibier. Därför spelar modellen för apexresektion i X. tropicalis en viktig roll för att belysa mekanismerna bakom regenerativa svar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experimentella protokoll relaterade till X. tropicalis godkändes av Jinan University Animal Care Committee.
1. Kirurgi
- Preoperativ förberedelse: Håll redo oftalmisk sax, oftalmisk pincett, nålpincett, absorberande bollar, filterpapper och kirurgiska suturer / nålar för toppresektion i hjärtat av X. tropicalis. Se materialförteckningen för detaljerad information. Före användning, sterilisera alla kirurgiska instrument genom autoklavering och förbered en tillräcklig mängd is för framtida användning.
- Bedöva en vuxen X. tropicalis med tricaine genom att placera den i 500 ml trikainlösning (1 mg / ml) vid rumstemperatur i 4 min19 och lägg den sedan på en isyta på operationsbordet för att säkerställa att grodan inte vaknar under driftsprocessen.
VARNING: Hela proceduren kräver 5-10 minuter; anestesitiden bör inte vara för lång, annars kan X. tropicalis inte kunna vakna efter operationen. - Torakotomi
- Placera den bedövade X. tropicalis buken uppåt och täck grodans buk med gasväv fördränkt i destillerat vatten för att undvika torkning av djurets hud under operationen.
- Tryck försiktigt på bröstet med pincett, hitta mitten av bröstet parallellt med den nedre frambenet, lyft huden med oftalmisk sax och gör försiktigt ett litet snitt på ~ 1 cm. Använd oftalmisk sax, plocka upp muskelskiktet under huden och skapa ett sår i centrala bröstmuskeln. Eftersom hjärtat ligger i sårställets övre läge, tryck försiktigt på bröstet med oftalmiska pincett för att pressa ut hjärtat från såret.
VARNING: Eftersom huden på X. tropicalis kan producera antimikrobiella peptider är det onödigt att använda konventionella desinfektionsförfaranden på operationsområdet för X. tropicalis. Eventuellt desinfektionsmedel kommer att skada huden på X. tropicalis.
- Ventrikulär apex resektion
- Kläm försiktigt perikardiet med pincett och bryt det försiktigt med oftalmisk sax nära hjärtans topp. Vänta tills perikardiet lossnar på grund av systolisk blodpumpning (figur 1A, B).
- Håll hjärtspetsen med pincett i den icke-dominerande handen och lyft hjärtat något enligt hjärtkontraktionsrytmen. När hjärtat kontraherar för att återcirkulera blod genom blodkärlen, skär snabbt av hjärtans topp (~ 14% av ventrikeln) (figur 1C).
- För att säkerställa att mängden toppresektion är cirka 14% av hela hjärtat, analysera hjärtvikten (HW) och ytan med eller utan resektion20. Placera hjärtat i bröstet med pincett och en absorberande boll.
OBS: Tryck inte på hjärtat direkt med pincetten; Annars kommer andra delar av hjärtat att punkteras.
- Suturera huden med en 4-0 icke-absorberande icke-silke kirurgisk trådsutur (figur 1D). Var försiktig så att du inte suturerar in i muskelskiktet för att förhindra postoperativ dödlighet. Vänta tills hudsåret läker naturligt inom 1 vecka efter operationen.
- I skenoperationsgruppen, utför thorakotomi, öppna perikardiet och suturen utan att utföra toppresektionen.
2. Kirurgisk återhämtning
- Placera den postoperativa X. tropicalis med buken uppåt i en petriskål som innehåller en liten mängd avjoniserat vatten (översvämma inte djuret helt). Vänta tills X. tropicalis vaknar inom ~ 10 min.
- Vid återfående medvetande, observera djurets rörlighet och aktivitet, liksom sårsuturen under aktivitet. Överför grodorna som har återfått balansen till en behållare fylld med rent vatten för odling. Byt ut vattnet med rent vatten varje dag för att undvika sårinfektion.
OBS: Med dessa åtgärder kan överlevnadsgraden nå ~ 90%. En långvarig tid av anestesi och överdriven blödning under operationen leder båda till döden, vilket vanligtvis inträffar på operationsdagen.
3. Detektion av reparationstillståndet efter hjärtskada
- Samla hjärtan av X. tropicalis vid flera tidpunkter efter operationen.
- Efter bedövande X. tropicalis med tricaine, öppna buken, och använda pincett för att ta bort de andra inre organ och vävnader för att hitta platsen för hjärtat.
OBS: På grund av toppresektion kommer hjärtat sannolikt att utvecklas tillsammans med andra vävnader och organ under reparationsprocessen. Ibland fastnar den på muskelväggen och är inte lätt att separera, så den måste hanteras försiktigt under insamling. - Efter att ha hittat hjärtat, använd pincett för att försiktigt riva de andra organen från hjärtat. Dra försiktigt bort de andra vävnaderna som omger hjärtat för att exponera hjärtat. Använd pincett för att försiktigt lyfta hjärtat och klipp ut det med sax. Placera hjärtat omedelbart i PBS för att ta bort eventuellt kvarvarande blod och fotografera det med ett stereoskop för dokumentation (figur 2).
- Efter bedövande X. tropicalis med tricaine, öppna buken, och använda pincett för att ta bort de andra inre organ och vävnader för att hitta platsen för hjärtat.
- Gradient uttorkning
- Torka hjärtan med filterpapper för att torka överflödiga PBS-rester och lägg dem i en 24-brunns cellodlingsskål. Använd 1-2 ml 4% paraformaldehyd för att fixera hjärtvävnaderna över natten. Följande dag, utför etanoluttorkning. Använd först 70% etanol över natten, följt av 80% etanol, 90% etanol och 100% etanol för gradientuttorkning (1 h varje gång). Upprepa användningen av 100% etanol tre gånger.
- Inbäddning av paraffin
- Behandla den uttorkade hjärtvävnaden med xylen i 6-8 min. Placera den xylenbehandlade vävnaden i en glasbehållare fylld med paraffinvax vid 65 °C i 2–3 timmar.
OBS: Det är viktigt att undvika luftbubblor eftersom de påverkar sektionen under inbäddningsprocessen.
- Behandla den uttorkade hjärtvävnaden med xylen i 6-8 min. Placera den xylenbehandlade vävnaden i en glasbehållare fylld med paraffinvax vid 65 °C i 2–3 timmar.
- Frys den inbäddade vävnaden vid -20 ° C i 1 h och dela den.
- Efter sektionering av hjärtat, utför standard hematoxylin och eosin (H &E) och Massons trikromfärgningstekniker på sektionerna11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hjärtan samlades in vid 0 dpr, 7 dpr, 14 dpr och 30 dpr. Den morfologiska analysen visade att blodproppen orsakad av hjärtskadan försvann vid 30 dpr (figur 2). Samtidigt liknade hjärtans utseende vid 30 dpr i resektionsgruppen det för hjärtan i skenoperationsgruppen; det fanns inga uppenbara sår (figur 2). Efter apikal resektion bildades en blodpropp och förseglade såret i ventrikeln, vilket observerades av H&E (figur 3) och Massons trikromfärgning (figur 4). Inom 14 dpr försvann blodproppen gradvis och ersattes av fibrin (figur 4). Från 14 dpr till 30 dpr ersatte myokardiet stegvis fibrinet och reparerade den skadade ventrikeltoppen (figur 4). Den histologiska analysen visade ingen skillnad mellan skenhjärtan och resekterade hjärtan vid 30 dpr (figur 3 och figur 4). Denna morfologiska och histologiska analys avslöjade att vuxen X. tropicalis kunde reparera och regenerera den skadade ventrikulära toppen med 30 dpr.
Figur 1: Kirurgiskt ingrepp . a) Representativ bild av ett exponerat hjärta täckt av hjärtsäcken. (B) Representativ bild av ett hjärta i systolisk fas, under vilken perikardiet skalades av; Den streckade linjen indikerar platsen för hjärtans apikala resektion. (C) Representativ bild av hjärtats toppresektion. d) Representativ bild av hudsuturen efter operationen. Skalstänger = 1 mm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Morfologisk analys av X. tropicalis hjärtan från 0 dpr till 30 dpr. (A) Representativa bilder av hjärtan från sham (vänster) och apikala resektionsgrupper (höger) vid 0 dpr, med hjärtats topp signifikant frånvarande i resektionsgruppen. (B,C) Representativa bilder av hjärtan från sham (vänster) kontra resektionsgrupper (höger) vid 7-14 dpr, med många blodproppar som uppträder i hjärtat hos resektionsgruppen vid 7 dpr. Vid 14 dpr ses signifikant regenerering vid apikal resektionsplats, men kanterna på hjärtans topp är inte jämna. (D) Representativ bild av hjärtan från bluffgrupperna (vänster) kontra resektionsgrupper (höger) vid 30 dpr; Toppen av det resekterade hjärtat har nästan helt regenererat. Skalstänger = 1 mm. Förkortning: dpr = dagar efter resektion. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Histologisk analys av Xenopus tropicalis hjärtan från 0 dpr till 30 dpr. Representativa bilder av H&E-färgning med hjärtan från skam- och resektionsgrupperna vid 0 dpr till 30 dpr. (A) Representativ bild av H&E-färgning med hjärtan från skengruppen, med streckade linjer som anger de ungefärliga amputationsplanen. (B) Representativ bild av H&E-färgning med hjärtan från resektionsgruppen vid 0 dpr. (C–E) Representativa bilder av H&E-färgning med hjärtan från resektionsgruppen vid 7-30 dpr, med stora mängder röda blodkroppar ackumulerade i såret vid 7 dpr (pilar). En massa fibrin har dykt upp på resektionsplatsen vid 14 dpr (pilspetsar). Hjärtan har regenererat helt utan ärr vid 30 dpr. Skalstång = 500 μm. Förkortning: dpr = dagar efter resektion. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Myokardfibrosanalys av X. tropicalis hjärtan från 0 dpr till 30 dpr. Representativa bilder av Massons färgning av hjärtan från bluff- och resektionsgrupperna vid 0 dpr till 30 dpr. (A) Representativ bild av Massons färgning av hjärtan från skengruppen, med streckade linjer som anger de ungefärliga amputationsplanen. (B) Representativ bild av Massons färgning av hjärtan från resektionsgruppen vid 0 dpr. (C–E) Representativa bilder av Massons färgning av hjärtan från resektionsgruppen vid 7-30 dpr, med stora mängder röda blodkroppar ackumulerade i såret vid 7 dpr (pilar). En massa fibrin har dykt upp på resektionsplatsen vid 14 dpr (pilspetsar). Hjärtan har regenererat helt utan ärr vid 30 dpr. Skalstång = 500 μm. Förkortning: dpr = dagar efter resektion. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Apikal resektion, som involverar kirurgisk amputation av hjärtans topp, har beskrivits i zebrafisk och möss 6,18; Detta har dock inte beskrivits i X. tropicalis. Denna rapport beskriver en trovärdig modell av hjärtskada och visar att hjärtat hos vuxna X. tropicalis kan regenerera helt efter apikal resektion utan ärrbildning. Vissa brister måste dock förbättras, och vissa detaljer måste uppmärksammas.
Även om apikal resektion kan skapa en hjärtskademodell, är det utmanande att säkerställa samma omfattning av excision av hjärtat på grund av mångfalden av grodorna, som har olika hjärtstorlekar. För att säkerställa att hjärtan med toppar av samma storlek resekteras är det nödvändigt att välja grodor av samma storlek, och operatören måste öva mycket före experimentet.
För det andra är förmågan att exakt och snabbt lokalisera och exponera hjärtat avgörande för procedurens framgång, eftersom processen att hitta hjärtat kan resultera i punktering av de intilliggande blodkärlen och orsaka blödning, vilket hindrar procedurens framsteg eller till och med orsakar misslyckande. Anestesiens varaktighet bör inte vara för kort eller för lång. Om den är för kort kan grodan vakna innan operationen är klar, och om denna process är för lång kommer det sannolikt att leda till grodans död. Som nämnts i protokollavsnitt 2-5 måste sutureringen göras med försiktighet. För att säkerställa att förhållandet mellan mängden toppresektion jämfört med hela hjärtat är ungefär detsamma över grodor, analyseras hjärtvikten (HW) och ytan med eller utan resektion20, och en liten del av hjärtspetsen resekteras för att säkerställa kammarexponering6.
Kryoskada, MI och apikal resektion är de tre mest använda metoderna för att inducera hjärtskada hos zebrafisk och möss 6,18,21. Begränsningen i denna artikel är att endast den tredje metoden användes, vilket innebär att detta arbete inte ger någon information om de olika regenerativa svaren efter skada med de andra två metoderna6. Kryoskada resulterar i döden av ett stort antal celler i ~ 20% av ventrikelväggen, liknande däggdjursinfarkt21. MI, som också kallas koronar artärocklusion, har högre överlevnad i X. tropicalis jämfört med apikal resektion hos möss6 men är svårare att uppnå i X. tropicalis eftersom hjärtan hos tropiska klogrodor är mindre än hos möss. X. tropicalis apikala resektionsmetod som etablerades i denna studie är enklare att utföra och har en hög postoperativ överlevnad.
Den apikala resektion som utvecklats i denna rapport kommer att vara en betydelsefull metod för att undersöka de molekylära mekanismerna för regenerering i hjärtat av X. tropicalis. En tidigare studie visade också att Fosl1 är oumbärligt för hjärtregenerering i X. tropicalis efter apikal resektion20. Denna modell av apikal resektion hjärtskada i X. tropicalis kan användas för att lära sig mer om de molekylära mekanismerna bakom hjärtregenerering för att främja studier av gener och molekylära mekanismer relaterade till mänsklig hjärtregenerering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att deklarera.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av bidrag från Kinas nationella nyckelforskningsprogram (2016YFE0204700), Kinas nationella naturvetenskapliga stiftelse (82070257, 81770240) och forskningsbidraget från Key Laboratory of Regenerative Medicine, utbildningsministeriet, Jinan University (ZSYXM202004 och ZSYXM202104), Kina.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | GHTECH | 64-19-7-500ml | |
| Acid Alcohol Fast Differentiation Solution | Beyotime | C0163M | |
| Acid Fuchsin | aladdin | A104916 | |
| Alcohol Soluble Eosin Y Stainin Solution | Servicebio | G1001-500ML | |
| BioReagent | Beyotime | ST2600-100g | |
| Ethanol absolute | Guangzhou Chemical Reagent Factory | HB15-GR-0.5L | |
| Hematoxylin Stain Solution | Servicebio | G1004-500ML | |
| Neutral balsam | Solarbio | G8590 | |
| Operating Scissors | Prosperich | HC-JZ-YK-Z-10cm | |
| Paraffins | Leica | 39601095 | |
| Para-formaldehyde Fixative | Servicebio | G1101-500ML | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) powder | Servicebio | G0002-2L | |
| Phosphomolybdic acid hydrate | Macklin | P815551 | |
| Stereo microscope | Leica | ||
| surgical forceps | ChangZhou | zfq-11-btjw | |
| Surgical Suture | HUAYON | 18-5140 | |
| Tricaine | Macklin | ||
| Xylene | Guangzhou Chemical Reagent Factory | IC02-AR-0.5L |
References
- Thiara, B.
- van Amerongen, M. J., Engel, F. B. Features of cardiomyocyte proliferation and its potential for cardiac regeneration. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 12 (6), 2233-2244 (2008).
- Burke, A. P., Virmani, R.
- Sessions, S. K., Bryant, S. V. Evidence that regenerative ability is an intrinsic property of limb cells in Xenopus. Journal of Experimental Zoology. 247 (1), 39-44 (1988).
- Laflamme, M. A.
- Mahmoud, A. I., Porrello, E. R., Kimura, W., Olson, E. N., Sadek, H. A. Surgical models for cardiac regeneration in neonatal mice. Nature Protocols. 9 (2), 305-311 (2014).
- Tzahor, E., Poss, K. D. Cardiac regeneration strategies: Staying young at heart. Science. 356 (6342), 1035-1039 (2017).
- Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).
- Porrello, E. R., et al. Regulation of neonatal and adult mammalian heart regeneration by the miR-15 family. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (1), 187-192 (2013).
- Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T.
- Liao, S., et al. Heart regeneration in adult Xenopus tropicalis after apical resection. Cell & Bioscience. 7, 70 (2017).
- Marshall, L. N., et al. Stage-dependent cardiac regeneration in Xenopus is regulated by thyroid hormone availability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3614-3623 (2019).
- Witman, N., Murtuza, B., Davis, B., Arner, A., Morrison, J. I. Recapitulation of developmental cardiogenesis governs the morphological and functional regeneration of adult newt hearts following injury. Developmental Biology. 354 (1), 67-76 (2011).
- Cano-Martinez, A., et al. Functional and structural regeneration in the axolotl heart (Ambystoma mexicanum) after partial ventricular amputation. Archivos de Cardiología de México. 80 (2), 79-86 (2010).
- Kragl, M., et al. Cells keep a memory of their tissue origin during axolotl limb regeneration. Nature. 460 (7251), 60-65 (2009).
- Oberpriller, J. O., Oberpriller, J. C. Response of the adult newt ventricle to injury. Journal of Experimental Zoology. 187 (2), 249-253 (1974).
- Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish. Development. 138 (9), 1663-1674 (2011).
- Ellman, D. G., et al. Apex resection in zebrafish (Danio rerio) as a model of heart regeneration: A video-assisted guide. International Journal of Molecular Sciences. 22 (11), 5865 (2021).
- Lee-Liu, D., et al. Genome-wide expression profile of the response to spinal cord injury in Xenopus laevis reveals extensive differences between regenerative and non-regenerative stages. Neural Development. 9, 12 (2014).
- Wu, H. Y., et al. Fosl1 is vital to heart regeneration upon apex resection in adult Xenopus tropicalis. npj Regenerative Medicine. 6 (1), 36 (2021).
- Chablais, F., Jazwinska, A. Induction of myocardial infarction in adult zebrafish using cryoinjury. Journal of Visualized Experiments. (62), e3666 (2012).
