Summary
在这里，我们描述了一种简单的方法，将专为患者设计的商业连续血糖监测仪植入小鼠，并提供脚本来分析结果。
Abstract
小鼠是用于研究糖尿病等代谢疾病的常见模式生物。葡萄糖水平通常通过尾出血来测量，这需要处理小鼠，引起压力，并且不能提供在黑暗周期中自由行为的小鼠的数据。在小鼠中进行最先进的连续葡萄糖测量需要将探针插入小鼠的主动脉弓以及专门的遥测系统。大多数实验室尚未采用这种具有挑战性且昂贵的方法。在这里，我们提出了一个简单的协议，涉及利用数百万患者使用的市售连续血糖监测仪来连续测量小鼠的葡萄糖，作为基础研究的一部分。葡萄糖感应探针通过皮肤的小切口插入小鼠背部的皮下空间，并使用几条缝合线紧紧固定到位。将设备缝合到鼠标皮肤上，以确保其保持在原位。该设备可以测量长达2周的葡萄糖水平，并将数据发送到附近的接收器，而无需处理小鼠。提供了用于记录的葡萄糖水平的基本数据分析的脚本。这种方法从手术到计算分析，具有成本效益，并且在代谢研究中可能非常有用。
Introduction
糖尿病（DM）是一种以高血糖水平为特征的毁灭性疾病。1型糖尿病可能是胰腺中产生胰岛素的β细胞的自身免疫攻击的结果。另一方面，2型DM和妊娠DM的特征在于β细胞无法分泌足够的胰岛素以响应葡萄糖水平的升高1。小鼠是用于研究DM的常见模式生物，因为它具有相似的生理机能，其正常葡萄糖水平接近人类。此外，由于关键信号通路的突变或暴露于特定饮食后，特定的小鼠品系可能会发展为DM，这使得疾病建模成为可能2，3，4。
通常使用为患者设计的血糖仪通过从小鼠尾巴尖端提取一小滴血液（1-2μL）来测量小鼠的血糖。这种方法会引起压力并需要处理小鼠，这会影响葡萄糖水平并禁止在自由行为的小鼠中或当研究人员不接近5时测量血糖水平。小鼠出血可能会对附近的小鼠造成压力，特别是对尚未测量血糖的同一笼子的小鼠，从而影响结果。小鼠的反应因处理者而异，测量葡萄糖的人可能会影响小鼠的葡萄糖水平。这些陷阱需要仔细的实验设计，并导致实验之间的一些不一致。
通过使用最先进的遥测技术将葡萄糖传感器植入小鼠的主动脉弓中，可以测量自由移动的小鼠的葡萄糖，而不会出血6。由此产生的测量结果非常好，可以持续很长时间，但是植入这些传感器具有挑战性，并且遥测系统价格昂贵，导致这种方法的适度采用，并且在非专业实验室中没有采用。近年来已经开发了针对小鼠尺寸及其生理机能量身定制的皮下或其他葡萄糖传感器，但这些再次需要高技能的专家，并且在某些情况下价格昂贵6，7，8，9，10。
最初开发用于监测DM患者血糖水平的商用连续血糖监测仪（CGM）提供了另一种在自由移动的小鼠中测量葡萄糖的选择，与植入探针相比，成本和技术专业知识要求更低。这些探针已被一些实验室5，11，12，13，14，15用于基础研究，包括使用该协议的同事16。这些设备通常包括传感器、安装设备、接收器和软件应用程序。传感器具有引导酶葡萄糖传感器的套管、胶带、能量源、短期记忆和存储数据并将其发送到接收器的无线通信模块。接收器可以显示当前的葡萄糖水平并将数据发送到服务器;这个接收器可以是手机。该软件应用程序为患者和医疗团队提供有关患者血糖的数据。在患者中，使用安装装置可以轻松连接传感器。通过将安装装置压在皮肤上来皮下插入套管，传感器在胶带的帮助下保持原位。
这是一个详细的协议，用于调整商业CGM设备以测量小鼠的葡萄糖水平。该协议描述了如何通过手术插入葡萄糖传感器并将其连接到鼠标。提供了用于基本数据分析和数据可视化的脚本。提供了潜在的陷阱、故障排除和标准结果的示例。以下协议特定于某个 CGM，但可以很容易地适应其他类型的商业 CGM。
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Protocol
这些实验得到了希伯来大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
注意：所有工具都必须消毒，并且必须使用无菌技术处理套管。以下协议针对特定的 CGM 进行了微调。该协议可以适应其他CGM。
1.术前镇痛给药
- 皮下注射5%葡萄糖和0.45%生理盐水与美洛昔康，体重为5mg / kg。
2.麻醉给药
- 将鼠标放在感应室中，盖紧盖子。将诱导室中的麻醉诱导设置为3%异氟醚，流速为500mL / min。
- 一旦鼠标没有反应，将鼠标从腔室中取出，并将鼻锥安装到鼠标上。用指间捏确认麻醉水平。在重量为30g的小鼠中，将浓度设置为1%-1.5%异氟醚，流速设置为100mL / min。
- 将眼药膏涂抹在眼睛上，以防止麻醉期间干燥。
3. 传感器准备
- 将传感器安装到传感器安装设备上，露出传感器的胶带和套管侧（图1A）。要小心，因为针头插入套管并暴露在外。
- 将两个5-0锥点缝合到套管两侧的胶带上（图1A）。
4. 脱毛消毒
- 在鼠标背部的中线上剃掉大约 4 厘米 x 4 厘米的区域。
- 在剃光区域施用脱毛膏，以确保完全脱毛。
- 擦拭皮肤，并使用含有2%葡萄糖酸氯己定和70%异丙醇的消毒液进行消毒。
5. 背侧皮肤准备
- 使用锋利的剪刀在脊柱上方的剃须区域中心做一个2毫米的切口（图1B）。
- 简而言之，在皮肤下插入具有钝边的小镊子以形成一个小的皮下袋，以便套管可以很容易地插入皮下袋（图1B）。
- 将步骤3.2中的缝合线穿过切口两侧的皮肤（图1C）。
6. 传感器插入
- 将传感器从传感器安装装置上完全取下（插管与针头无关），并用镊子握住传感器，以防止周围的胶带粘在自身上。
- 小心地将套管插入皮下袋。
- 拉动两侧的缝合线，然后收紧并绑扎它们以将传感器牢固地固定到位，从而防止套管在胶带随着时间的推移松动后从皮下袋中滑出。
7. 传感器连接和缝合
- 通过绑住内部缝合线并使用传感器周围的胶带将传感器牢固地固定在背面。
- 在传感器周围进行八条不连续的缝合线，将传感器胶带的边界连接到皮肤上（图1D）。
8. 激活阅读器
- 插入传感器后，通过打开读卡器，按启动新传感器，然后根据制造商的说明滑动 传感器来激活读卡器。
- 第一次读数只能在安装 CGM 后的几分钟内完成。在此CGM的情况下，可以在60分钟后进行第一次读数。
9. 阅读结果
- 将阅读器靠近鼠标放置（无需触摸它）。存储在传感器中的所有数据都传输到读取器。
注意：不同的 CGM 设备在历史数据保存容量期间可能有所不同。在此CGM的情况下，两个读数之间最多可以存储8小时。
10. 卸下传感器
- 麻醉小鼠（见第2节）。
- 使用锋利的剪刀剪断将传感器连接到鼠标背面的缝合线。
- 通过轻轻移除传感器来移除并切断切口处的缝合线。
- 如有必要，使用单缝合线关闭小鼠背面的切口。
11. 数据分析
- 数据下载：按照 CGM 制造商提供的说明下载数据。
注意：每个 CGM 都有不同的格式，用户可能可以轻松访问，也可能不容易访问。这是选择 CGM 时的一个重要考虑因素。 - 要使用提供的软件进行分析，请根据 Github （https://github.com/mika-littor/CGM-in-Mice-Analysis.git） 上自述文件中的说明格式化数据。
图1：传感器与鼠标的连接 。 （A）用红色箭头标记的两条缝合线穿过CGM传感器底部套管两侧的传感器胶带，用白色箭头标记。（B）使用锋利的剪刀在脊柱沿剃光区域的中心做一个2毫米的小切口。将边缘钝的小镊子短暂插入皮下，形成一个小的皮下袋，以便套管可以皮下插入。（C）来自 A 的相同缝合线在切口的每一侧皮下通过。红色箭头标记连接到传感器的缝合线，如 A所示，蓝色箭头标记缝合线通过鼠标背部皮肤的位置，黑色箭头显示切口。（D）插入套管后，将内缝线收紧并绑在切口附近以固定CGM。然后将传感器缝合到皮肤上。 请点击此处查看此图的大图。
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Representative Results
手术结果
显示了八只HSD：ICR小鼠（8周龄）喂食高脂肪高蔗糖饮食（HFHS）18周和五只瘦HSD：ICR小鼠（12周龄）的结果。我们使用的设备存储数据长达 8 小时。进入当地动物设施的时间限制在07：00-19：00，因此禁止在小鼠活跃的下午晚些时候收集数据。因此，在手术前将小鼠放置在有反向照明的房间中7天，黑暗时间在8：30至20：30之间。并非所有设备或动物设施都需要这样做，我们建议使用可以存储信息超过 12 小时的设备。
手术后没有死亡率。在实验期间，手术导致体重减轻了约10%（图2A）。因此，在手术后最初几天，在减肥期间进行的测量应谨慎解释。体重减轻不是由于小鼠无法伸手去拿食物和水。CGM测量和尾尖血糖测量的比较显示，在禁食和非禁食状态下具有良好的一致性（图2B）。CGM平均活跃11天（图2C）。此类设备的最长天数为 14 天。当设备早些时候处于非活动状态时，不是由于 CGM 脱落。
图2：应用CGM的一般结果 。 （A）CGM活动期间的平均重量减轻。n = 8只小鼠。（B）手持式血糖仪和CGM装置的葡萄糖读数之间的平均差值。差异与0 mg/dL无显著差异。n = 6只小鼠的10个读数。（C）CGM在n = 8只小鼠中活跃的平均时间。误差线表示平均值的标准误差。 请点击此处查看此图的大图。
原始输出
一天的葡萄糖水平显示在CGM软件生成的图表上（图3A）。可以使用提供的代码查看几天的数据（图 3B）。为了清楚起见，我们显示了 3 天的数据。
图3：数据分析 。 （A）商业产出。18：00至午夜之间未收集数据。阴影区域显示患者的正常血糖值，在70-100mg / dL之间。（B） 使用提供的代码从单个鼠标获得 3 天的原始输出数据。请注意 A 和 B 之间 y 轴上的刻度差异。轴参数和所有其他参数都可以在代码中调制。为清楚起见，显示了 3 天的数据。 请点击此处查看此图的大图。
分析
提取数据后，可以使用提供的代码或任何其他定制软件进行分析。以下是单个小鼠在每个时间点的平均（图4A，C）和中位数（图4B，D）葡萄糖水平。滑动窗口可用于平滑绘图。为清楚起见，仅显示两只小鼠。
图 4：使用提供的脚本的数据分析输出 。 （A）特定小鼠每个时间点的平均葡萄糖水平和（B）中位葡萄糖水平。阴影区域表示葡萄糖水平的标准偏差。（C）两只小鼠的平均和（D）中位葡萄糖水平。为清楚起见，仅显示两只小鼠。虚线表示从浅色（20：30-08：30）到深色（8：30-20：30）的过渡。使用20分钟的滑动窗口来平滑曲线。可以在代码中修改窗口的大小和所有参数。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
该协议提供了一种简单，廉价的方法来监测小鼠的葡萄糖水平，该方法不需要具有挑战性的显微手术，并且不涉及出血或处理小鼠。该方法易于在每个设施中实施，并且不会对小鼠造成死亡，疼痛或过度不适。协议中最关键的步骤是将葡萄糖传感器的套管插入小鼠的皮肤下。增加一些缝合线可以使套管在原位停留更长的时间。传感器很小，随着鼠标的移动，可能会被遮挡或放错位置。传感器必须通过内部缝合线固定，并通过几条缝合线连接到鼠标背面。该协议可以适应许多商业CGM系统。
小鼠在手术后体重减轻，这是手术后预期的，并且可能与手术和麻醉的压力，携带装置的负担以及本研究中使用的特定方案施加的单一外壳有关。随着CGM设备变得越来越轻，越来越精确，这些效果预计将变得更小。我们观察到携带CGM的小鼠在笼子里自由移动，并到达需要攀爬的食物颗粒。该方法受到每个 CGM 随时间推移运行的能力的限制。研究人员应该监测体重减轻，并考虑这种方法与需要频繁处理和出血小鼠的标准替代品相比的优缺点，这些替代品假设出血一只小鼠对其邻居的血糖几乎没有影响，并且涉及测量白天压力条件下的葡萄糖水平。
上面描述的协议相当简单、快速且可扩展。它不需要动物设施中的特殊设置或昂贵的设备，可以与作为实验一部分的其他程序并行使用，并且可以用于任何遗传背景或任何营养。提供数据分析脚本是为了方便在数据分析方面经验不足的研究小组进行分析。希望这个详细的协议和数据分析脚本将使其他实验室能够在代谢和其他研究领域的实验中测量葡萄糖。
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Disclosures
作者没有利益冲突需要披露。
Acknowledgments
我们感谢Dvir Mintz DVM和动物设施的兽医和畜牧工作人员以及我们小组的成员，进行了富有成效的讨论。这项研究得到了以色列科学基金会授予D.B.Z.的1541/21赠款的支持，D.B.Z.是Zuckerman STEM教师。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2% Chlorhexidine Gluconate and 70% Isopropyl Alcohol | 3M | ID 7000136290 | |
| 5% Dextrose and 0.45% Sodium Chloride Injection, USP | Braun | L6120 | |
| Castroviejo needle holder | FST | 12061-02 | |
| Extra Fine Bonn scissors | FST | 14084-08 | |
| FreeStyle Libre 1 reader | Abbott | ART27543 | |
| FreeStyle Libre sensor | Abbott | ART36687 | |
| FreeStyle Libre sensor applicator | Abbott | ART36787 | |
| Gauze pads | Sion medical | PC912017 | |
| Graefe Forceps | FST | 11052-10 | |
| Hair Removal Cream | Veet | 3116523 | |
| High-fat high-sucrose diet | Envigo Teklad diets | TD.08811 | |
| Isoflurane, USP Terrell | Piramal | 26675-46-7 | |
| Meloxicam 5 mg/mL | Chanelle Pharma | 08749/5024 | |
| MiniARCO Clipper kit | Moser | CL8787-KIT | |
| PROLENE Polypropylene Suture 5-0 | Ethicon | 8725H | |
| Puralube Opthalmic Ointment | Perrigo | 574402511 | |
| Q-tips | B.H.W | 271676 | |
| SomnoSuite Low-Flow Anesthesia System | Kent Scientific | SOMNO |
References
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