Summary
Hier presenteren we een methode om beelden van de darm te verkrijgen bij laser-geïnduceerde verwonding. Door de darm van de muis bloot te stellen aan een multifotonenlaser, wordt het verlies van een enkele of meerdere crypt(en) lokaal geïnduceerd. Door het beschadigde gebied gedurende maanden herhaaldelijk in beeld te brengen, wordt de real-time dynamiek van darmherstel vastgelegd.
Abstract
Het onderzoeken van darmherstel in vivo is een uitstekende technische uitdaging. Een gebrek aan longitudinale beeldvormingsprotocollen heeft diepere inzichten in de cel- en weefselschaaldynamiek die darmregeneratie orkestreert, verhinderd. Hier beschrijven we een intravitale microscopiemethode die lokaal weefselschade induceert op de schaal van één crypte en de regeneratieve respons van het darmepitheel bij levende muizen volgt. Enkele crypten of grotere darmvelden werden door een multifotonen-infraroodlaser met hoge intensiteit op een tijd- en ruimtegestuurde manier geableerd. Daaropvolgende langdurige repetitieve intravitale beeldvorming maakte het mogelijk om de beschadigde gebieden in de loop van de tijd te volgen en maakte het mogelijk om de cryptdynamiek tijdens weefselherstel gedurende een periode van meerdere weken te volgen. Crypt-remodelleringsgebeurtenissen zoals crypt-splijting, fusie en verdwijning werden waargenomen in het naburige weefsel bij laser-geïnduceerde schade. Dit protocol maakt de studie van cryptedynamica mogelijk, zowel in homeostatische als pathofysiologische omgevingen, zoals veroudering en tumorinitiatie.
Introduction
De epitheliale bekleding van de darm wordt voortdurend uitgedaagd door maagzuren, toxines en microbiota die verstoring van de epitheelbarrière kunnen veroorzaken. Darmstructuur en weefselorganisatie zijn gespecialiseerd om zichzelf voortdurend te vernieuwen en schade te herstellen. Het enkellaagse epitheel van de dunne darm is georganiseerd in crypt-villus units1. Bij homeostase geven zelfvernieuwende Lgr5+ darmstamcellen die zich aan de basis van de crypte bevinden aanleiding tot gedifferentieerd nageslacht. De gedifferentieerde dochtercellen reizen op een transportbandmanier naar de punt van de villusas, waar ze worden afgestoten zodat de darmwand in 3-5 dagen wordt aangevuld 2,3. Op de lange termijn dragen niet alle Lgr5+ cellen in gelijke mate bij aan weefselvernieuwing, omdat dit ook afhangt van het vermogen van cellen om tegen de transportband naar de basis van de crypte te bewegen (d.w.z. retrograde beweging)4,5. Inderdaad, bij ablatie van Lgr5+ cellen door bijvoorbeeld straling, verplaatsen voorlopercellen buiten de basis van de crypte zich naar de base om de stamcelpool 6,7,8 te dedifferentiëren en aan te vullen.
Acute ontsteking kan het verlies van Lgr5+ stamcellen veroorzaken 9,10. Naast stamcelverlies kunnen veel externe factoren acute schade aan het epitheel op de crypteschaal veroorzaken. Van straling, chemische behandelingen en antibiotica is aangetoond dat ze darmcrypten en villi11 beschadigen. Grotere velden van crypten en villi kunnen worden beïnvloed door bacteriële, virale en parasitaire infecties12. De darm bezit een opmerkelijk vermogen om te herstellen van interne en externe schade op crypteschaal door crypte splijting (een verdeling van één crypte in twee)13. Bij het verwonden ondergaan crypten in het gebied naast de schade splijting om de cryptenummers aan te vullen. Dit fenomeen treedt ook op, zij het in mindere mate, tijdens homeostase14,15. Om tegenwicht te bieden aan een mogelijke toename van het aantal crypten tijdens homeostase, kunnen crypten ook fuseren (twee crypten samenvoegen tot één)16,17. Of cryptfusie ook een rol speelt bij het herstellen van cryptenummers na verwonding is onbekend. Bovendien moeten de dynamiek en regulerende factoren van dit proces nog worden opgehelderd.
Letselmodellen zijn onmisbaar om weefselregeneratie in vivo te bestuderen. Verschillende letselmodellen zijn gebruikt om darmweefselregeneratie te bestuderen. Eerdere experimentele strategieën gebruikten hooggedoseerde straling om stamcelpools uit te putten18 of behandeling met dextransulfaatnatrium (DSS) om chronische en acute colitis en crypteverlies bij muizen te induceren 19,20. Eencellige ablatie met genetische of optische middelen is gebruikt om weefselschade te verfijnen en wordt beschouwd als een aantrekkelijk hulpmiddel om de rol van stam- en voorlopercellen te ontwarren 21,22 en vasculaire regeneratie te bestuderen23. Daarnaast is een biopsie-letselsysteem ontwikkeld om schade te veroorzaken in grotere velden van verschillende crypten en villi24. Belangrijk is dat de reactie op de schadelijke belediging kan variëren langs de proximale-distale as van de darm, zoals gerapporteerd voor straling, die meer schade aanrichtte in de dunne darm dan in de dikke darm25. Dit benadrukt de behoefte aan gerichte methoden die zowel de omvang van de schadelijke belediging als de lokalisatie ervan in het darmkanaal beheersen.
De omvang van de schade en het herstel zijn conventioneel beoordeeld met statische middelen, die beperkte informatie geven over de dynamiek van weefselherstel. Intravitale microscopie (IVM) heeft unieke mogelijkheden geopend om stamcelgedrag, epitheliale remodellering en regeneratie in veel organen te kwantificeren 26,27,28,29,30, en heeft impactvolle inzichten verschaft in de darmbiologie 4,5,21,31,32,33,34, 35,36.
Hier beschrijven we een methode om spatiotemporaal gedefinieerde darmschade te veroorzaken en het herstel van de darmepitheelwand vast te leggen. We gebruiken twee op fotonen gebaseerde laserablatie om darmcrypten te beschadigen en volgen de onmiddellijke wondrespons en het herstel op lange termijn door repetitieve intravitale microscopie. Ons protocol maakt het mogelijk om de regeneratieve remodellering van de darmweefselarchitectuur in kaart te brengen als reactie op lokale weefselschade. Cryptedynamiek, inclusief splijtings- en fusiegebeurtenissen, kan gemakkelijk worden gekwantificeerd en in de loop van de tijd worden gevolgd. De toepassing van laserablatie en repetitieve intravitale beeldvorming kan worden gebruikt als een platform om de weefselschaaldynamiek van darmarchitectuur tijdens homeostase en pathofysiologie, zoals tumorinitiatie, te onderzoeken.
Protocol
Alle dierproeven die in dit onderzoek worden beschreven, zijn uitgevoerd volgens de richtlijnen en goedkeuring van de Dienst Dierenwelzijn (AWB) van het Nederlands Kanker Instituut (NKI).
OPMERKING: Raadpleeg de dierethische commissie van het instituut voordat u dierproeven uitvoert.
1. Voorbereiding op chirurgie en intravitale beeldvorming
- Pre-chirurgische behandelingen
- Induceer 8-12 weken oude K19-CreERT237: Rosa26-mTmG 38 en Lgr5eGFP-IRES-CreERT218: Rosa26-Confetti39 muizen door tamoxifen opgelost in zonnebloemolie intraperitoneaal 4-6 weken voorafgaand aan de operatie te injecteren (figuur 1).
- Breng analgesie aan. Injecteer 200 μl buprenorfine (0,1 mg/kg lichaamsgewicht) verdund in NaCl 0,9% per 30 g muis subcutaan 30 minuten vóór de operatie. Dien carprofen (0,067 mg/ml) toe in een fles met 125 ml niet-aangezuurd alcoholhoudend drinkwater met autoclaaf 24 uur voor de operatie. U kunt ook 30 minuten voor het begin van de operatie subcutaan (5 mg/kg) een carprofeninjectie toedienen.
- Voorbereiding op de operatie
- Introduceer geautoclaveerde steriele chirurgische hulpmiddelen in de biohazard-kast.
- Zet het verwarmingskussen aan en stel de temperatuur in op 37 °C.
- Voorbereiding op intravitale beeldvorming
- Schakel de temperatuurgeregelde kamer van de microscoop ten minste 4 uur vóór de beeldvorming in om voldoende tijd te hebben voor temperatuurstabilisatie.
OPMERKING: De benodigde tijd kan variëren, afhankelijk van het gebruikte apparaat. - Houd de temperatuur in de klimaatkamer stabiel op 37 °C.
- Schakel de microscoop, scanner en laser met twee fotonen in.
- Start de beeldbewerkingssoftware.
- Stem de golflengte van de laser af op 960 nm en open de sluiter.
- Schakel de temperatuurgeregelde kamer van de microscoop ten minste 4 uur vóór de beeldvorming in om voldoende tijd te hebben voor temperatuurstabilisatie.
2. Chirurgie en intravitale beeldvorming
- Chirurgische blootstelling van de darm
- Verdoof de muis met 2% -3% isofluraan en plaats deze op een verwarmingskussen, bedekt met een steriele doek. Controleer de diepte van de anesthesie door de frequentie en kwaliteit van de ademhaling te beoordelen (één ademhaling / seconde) en door de reflex van de muis te controleren.
- Bedek de ogen van de muis met oogzalf.
- Injecteer 200 μL voorverwarmde steriele zoutoplossing subcutaan.
- Scheer de buik en verwijder het haar. Vervang de steriele doek in het operatiegebied.
- Plaats een rectale sonde om de temperatuur van de muis te controleren.
OPMERKING: De temperatuur moet ongeveer 37 °C zijn. - Trek een nieuw paar steriele handschoenen aan.
- Reinig het operatiegebied op een cirkelvormige manier met afwisselend scrubs van antiseptische oplossing gevolgd door 80% ethanol driemaal. Verwijder overtollige ethanol met een steriel wattenstaafje.
OPMERKING: Het is van cruciaal belang om de muis op dit punt te controleren op onderkoeling. - Bedek de muis met een steriel chirurgisch gordijn.
- Controleer de reflex van de muis.
- Maak een ~10 mm verticale middellijnincisie door de huid met behulp van een steriel scalpel.
- Snijd de linea alba in met een schaar om de rectus abdominis-spieren te scheiden en de buik te openen.
- Zoek de blindedarm van de muis met behulp van steriele wattenstaafjes gedrenkt in steriele voorverwarmde zoutoplossing om het als referentiepunt te gebruiken.
- Maak een kleine snee in een stuk steriel gaas, maak het nat in voorverwarmde steriele zoutoplossing en plaats het boven de incisie.
- Verwijder de darm met steriele wattenstaafjes gedrenkt in voorverwarmde steriele zoutoplossing. Houd de darm gehydrateerd door steriele voorverwarmde zoutoplossing toe te voegen.
- Plaats een steriele beeldkamer op maat naast de muis.
- Breng de muis over in de voorverwarmde steriele beeldvormingsdoos.
- Plaats de darm op het steriele glas van de beeldvormingsdoos. Plaats de kop van de muis in de inhalatiebuis van de beeldvormingsdoos, zoals weergegeven in figuur 1.
- Zet de muis indien nodig vast met steriele flexibele folie en tape.
- Plaats de beeldvormingsdoos met de muis in de microscoopkamer.
- Intravitale beeldvorming
- Controleer de muis tijdens het fotograferen door elke 15 minuten de frequentie en diepte van de ademhaling en temperatuur te controleren via een rectale sonde. Het percentage isofluraan moet tussen 1% -2% worden gehouden. Pas indien nodig aan.
- Zoek een gebied in de darm met behulp van het oculair van de microscoop.
- Verkrijg een breedbeeld van het gebied van belang met behulp van de interne camera van de microscoop, zoals te zien is in figuur 2A.
- Beeld het gebied van belang met behulp van de 960 nm laser van de multifoton microscoop. Pas het laservermogen en de golflengte aan volgens de fluoroforen die in het experiment zijn gebruikt.
- Verkrijg een 10-20 stappen z-stack van 3 μm van de regio van belang.
- Laser ablatie
- Kies een enkele positie of meerdere posities uit de tegel die eerder is afgebeeld.
- Gebruik de bleekpuntkalibratiefunctie in de beeldbewerkingssoftware bij een zoom van 32 en 124 x 124 pixelresolutie met een scansnelheid van 400 Hz, met behulp van de bidirectionele scaneigenschap voor 3-10 s, afhankelijk van de beoogde schade. Het initiëren van schade in het cryptegebied is te herkennen aan een toename van autofluorescentie in zowel de groene als de rode kanalen.
- Herhaal de vorige twee stappen voor meerdere regio's in dezelfde muis.
- Verkrijg na ablatie z-stacks van de beschadigde regio's om de locatie en omvang van de schade te bevestigen.
- Sluiting van de operatieplaats
- Plaats de muis, terwijl hij nog onder narcose is, in een steriel hechtgebied.
- Steek de blootgestelde darm terug in de buik met behulp van steriele wattenstaafjes gedrenkt in voorverwarmde steriele zoutoplossing.
- Hecht de linea alba door een eenvoudige continue hechting uit te voeren met behulp van een absorbeerbare 5-0 hechting. Sluit de ledematen van de hechting met chirurgische knopen.
- Herhaal dezelfde stap met de huidlaag.
- Schakel het isofluraanstation uit en reinig en steriliseer de beeldverwerkingsdoos en inlay.
- Reinig de chirurgische hulpmiddelen met de chirurgische instrumentenreiniger, enzymatische reiniger en chirurgisch instrumentsmeermiddel. Wanneer gedroogd, steriliseer de operatiehulpmiddelen samen met de operatiedoos in de autoclaaf.
- Postoperatieve zorg
- Laat de muis herstellen van een operatie terwijl de kooi gedurende ~ 1 uur op het verwarmingskussen wordt geplaatst.
OPMERKING: Plaats de muis indien mogelijk bij andere kooigenoten. Eenzame huisvesting is niet nodig voor herstel. - Controleer de temperatuur van de muis elke 15 minuten tijdens het herstel.
- Injecteer 200 μl buprenorfine (0,1 mg/kg lichaamsgewicht) verdund in NaCl 0,9% per 30 g muis subcutaan 6-12 uur na de operatie.
- Dien carprofen (0,067 mg/ml) toe in een fles met 125 ml niet-aangezuurd alcoholhoudend drinkwater met autoclaven gedurende 72 uur na de operatie.
- Weeg de muis en controleer het welzijn elke dag gedurende 1 week na de operatie.
- Laat de muis herstellen van een operatie terwijl de kooi gedurende ~ 1 uur op het verwarmingskussen wordt geplaatst.
3. Repetitieve chirurgie en intravitale beeldvorming
- Chirurgie
- Herhaal op het tweede tijdstip (ten minste 1 week na de eerste beeldvormingssessie) stap 1.1.2, 1.2, 1.3 en 2.1.
- Intravitale beeldvorming
- Herhaal stap 2.2.1-2.2.3.
- Gebruik het patroon van bloedvaten om dezelfde interessegebieden te vinden die op het eerste tijdstip zijn afgebeeld.
- Herhaal stap 2.2.4 en 2.2.5.
- Sluiting van de operatieplaats
- Herhaal stap 2.4.1.
- Als het niet de bedoeling is dat de muis op een ander tijdstip wordt afgebeeld, offer de muis dan op door cervicale dislocatie uit te voeren onder terminale anesthesie. Ga anders verder met de volgende stap.
OPMERKING: Volgens de richtlijnen van EU-richtlijn 2010/63/EU, bijlage IV, is cervicale dislocatie een aanvaardbare methode. - Herhaal stap 2.4.2-2.4.6.
- Postoperatieve zorg
- Herhaal stap 2.5.1-2.5.5.
Representative Results
Om het type resultaten aan te tonen dat kan worden verkregen met de laserablatiemethode in combinatie met intravitale beeldvorming, hebben we een experiment uitgevoerd zoals weergegeven in figuur 1. Eerst injecteerden we K19-CreERT2;mTmG (K19cre-mTmG) en Lgr5eGFP-IRES-CreERT2; Rosa26-Confetti (Lgr5cre-Confetti) muizen met tamoxifen om cellen stochastisch te labelen met een van de Confetti kleuren (of groen fluorescerend eiwit [GFP] in het geval van mTmG muizen). K19-cre induceert afstammingstracering van alle epitheelcellen, terwijl Lgr5-cre tracering induceert van stamcellen slechts 8,18,37. De tamoxifen-injectie werd 4-6 weken voor de operatie en de eerste beeldvormingssessie toegediend om crypten te verkrijgen waarin alle cellen monoklonaal zijn voor een bepaalde kleur. Robuuste identificatie van dezelfde weefselgebieden gedurende meerdere weken is essentieel om het lot van dezelfde crypten in de loop van de tijd te volgen. Inherente weefselarchitecturale kenmerken, zoals de vasculatuur, kunnen worden gebruikt als betrouwbare weefseloriëntatiepunten en werden hier vastgelegd met de interne camera van de microscoop. Bovendien hielp het labelen van een klein deel van de crypten met (ten minste twee) verschillende kleuren om dezelfde crypten in elke beeldvormingssessie te herkennen en hun gedrag te volgen tijdens het regeneratieve proces na laserschade. Bij het chirurgisch blootstellen van de darm van de muis en het verkrijgen van zowel camera- als fluorescerende beelden van het betreffende gebied (figuur 2A), kunnen bleekpuntinstellingen van de multifotonenlaser worden gebruikt om een of meer crypten te aborteren (figuur 2B, C). Het begin van schade kon worden herkend aan een toename van autofluorescentie in zowel de groene als de rode kanalen. Om de dynamiek van crypteherstel te bestuderen, werd de operatie- en beeldvormingsprocedure weken / maanden na de eerste beeldvormingssessie herhaald en werden weefselinherente structuren (vasculatuur en patronen van klonaal gelabelde crypten) gebruikt als oriëntatiepunten om exact dezelfde locatie van het letsel te vinden (figuur 2). Wanneer deze methode werd toegepast bij Lgr5Cre-Confetti-muizen, waarbij Lgr5-eGFP op een fragmentarische manier wordt uitgedrukt, konden veranderingen in cryptenummers en -vormen na de door laser veroorzaakte schade worden vastgelegd (figuur 3). Terwijl sommige regio's geen veranderingen vertoonden in het aantal en de structuur van crypten (figuur 3B), vertoonden andere regio's uitgebreide crypte-remodellering, zoals te zien is in het aantal cryptesplijtings- en fusiegebeurtenissen (figuur 3C) en het verlies van crypten 2 weken na het lasergeïnduceerde letsel (figuur 3D). Door verschillende groottes van schade te introduceren en de splijtings-, fusie- en verdwijningsgebeurtenissen na ablatie te kwantificeren, zoals in het voorbeeld in (figuur 3E), kan de dynamiek van door letsel geïnduceerde regeneratie in verschillende muismodellen in kaart worden gebracht.
Figuur 1: Schematische weergave van de experimentele opstelling. In vivo labeling van darmcellen wordt bereikt door tamoxifen intraperitoneaal te injecteren in genetisch gemodificeerde muismodellen om Cre-gemedieerde recombinatie in darmcrypten te induceren. Na dagen of weken (wanneer de crypten monoklonaal zijn voor een bepaalde kleur), wordt de darm chirurgisch blootgesteld en onderworpen aan laserablatie met behulp van een multifotonenmicroscoop met een temperatuurgecontroleerde kamer. De omvang van de crypteschade wordt onmiddellijk na ablatie gekenmerkt en de muis mag herstellen van de procedure. Herhaalde chirurgische blootstelling en IVM worden gebruikt om het darmherstel in de loop van de tijd te controleren. Het patroon en de verdeling van de bloedvasculatuur en verschillend gekleurde crypten worden gebruikt om dezelfde regio's weken of maanden na ablatie terug te vinden. Crypte remodellering (bijv. Splijting of fusie) kan worden waargenomen op de plaats van schade weken na ablatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Longitudinale beeldvorming van weefselregeneratie bij lasergeïnduceerde schade in de darm. Wanneer de darm op exact dezelfde manier is gepositioneerd, kunnen bloedvaten van de darm worden gebruikt als een kaart om exact dezelfde regio's te vinden en in beeld te brengen. (A) Camera overzichtsbeelden van de darm. Onderbroken witte lijnen vertegenwoordigen het patroon van de vasculatuur die grenst aan de plaats van schade (witte doos), gebruikt als een oriëntatiepunt om hetzelfde laser-ablated gebied op een ander tijdstip te vinden. De onderste twee afbeeldingen tonen de ingezoomde weergave van het witte vak. De pijl toont de exacte plaats van laserablatie op dag 1 en 1 maand later. (B) Fluorescerende beelden van een enkele crypteschade vastgelegd door een multifotonenmicroscoop. De pijl in het blauwe vak toont de plaats van de schade op dag 1 en 1 maand later. (C) Fluorescerende afbeeldingen van een beschadigd veld van crypten. De pijlen in het blauwe vak markeren het gebied van de schade op dag 1 en 1 maand later. Schaalstaven: 1 mm (A, boven); 0,25 mm (A, onder); 200 μm (groot overzicht B en C); en 50 μm (ingezoomde beelden B en C). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Intravitale beeldvorming van het lot van de crypte na laserablatie. (A) Met behulp van het Confetti-model kunnen crypten met verschillende kleuren in de loop van de tijd worden gevolgd om de dynamiek van herstel in kaart te brengen. De witte pijl toont de plaats van laserablatie. Het gele vak vertegenwoordigt een naburig gebied (<100 μm van de plaats van schade), terwijl de blauwe en paarse vakken gebieden vertegenwoordigen die ver (> 100 μm) van het laser-ablated gebied liggen. Verschillende vormen van regeneratie worden waargenomen. (B) Sommige regio's blijven ongewijzigd zoals in het paarse vak. (C) Andere regio's vertonen crypteverbouwing in de vorm van cryptesplijting of fusie; De onderbroken witte lijnen en pijlen geven cryptesplitsingsgebeurtenissen weer en de oranje onderbroken lijnen en pijlen geven cryptefusiegebeurtenissen weer. (D) In sommige regio's wordt crypteverdwijning waargenomen, zoals in het gele vak waar de crypte gemarkeerd met een oranje stippellijn verdween. (E) Een voorbeeldkwantificering van het aantal crypte-verbouwingsgebeurtenissen dat is waargenomen in de gebieden die grenzen (d.w.z. minder dan 100 μm) en ver van (d.w.z. meer dan 100 μm) de schadelocatie. Schaalstaven: 200 μm (A); 50 μm (B-D). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Dit protocol combineert microscopische laserablatie en longitudinale intravitale microscopie om intestinale regeneratie te volgen van vroege schaderespons tot weefselremodellering op lange termijn. De techniek is vastgesteld in strikte naleving van ethische overwegingen om microscopische laserablatie te induceren en in beeld te brengen, en wanneer het precies wordt gevolgd, zal het welzijn van dieren worden gehandhaafd. Tijdens de operatie is het belangrijk om ervoor te zorgen dat de integriteit van de darm goed bewaard blijft. Dit kan worden bereikt door het weefsel voorzichtig te hanteren met steriele natte wattenstaafjes, wat bloeden of uitdrogen van het weefsel voorkomt. De omvang van lasergeïnduceerde microscopische schade moet ook zorgvuldig worden beoordeeld door de verschillende darmlagen van het gebied na laserablatie in beeld te brengen. Indien de onderzoeker de frequentie van de in dit protocol beschreven experimentele stappen wenst aan te passen, dient de dierethische commissie van het instituut vóór het experiment te worden geraadpleegd om de gevolgen voor het welzijn vast te stellen.
Repetitieve intravitale microscopie maakt het mogelijk om weefselherstel in dezelfde muis in de loop van de tijd te volgen. Herhaalde chirurgische blootstelling van de darm verleent gemakkelijk optische toegang tot het hele darmkanaal. Weefselinherente kenmerken, zoals de vasculatuur, dienen als oriëntatiepunten om dezelfde darmgebieden in elke beeldvormingssessie te identificeren. Zo kan hetzelfde weefselgebied gedurende meerdere weken in beeld worden gebracht, waardoor men langdurige weefselregeneratie in hetzelfde darmgebied in dezelfde muis kan kwantificeren. De spatiotemporale controle die wordt geboden door de gecombineerde chirurgie- en beeldvormingsmethode brengt het voordeel met zich mee dat hetzelfde orgaan kan worden afgebeeld onder zowel homeostatische als regenererende omstandigheden in dezelfde muis, wat in contrast staat met eerdere modellen voor schade aan hele organen waarbij controles en regenererende monsters afkomstig zijn van verschillende muizen 11,12,18,19,20 . Daarom minimaliseert onze experimentele setting het vereiste aantal dieren dat nodig is voor het experiment en vermindert het de variatie binnen dieren.
Het oplossen van protocolproblemen moet beginnen met een beoordeling van de techniek voor het hanteren van muizen en darmen en een controle van microscopieapparatuur en -instellingen. Er zijn veel kritieke stappen in dit protocol die extra aandacht vereisen. Ten eerste, om het welzijn van dieren en een continue hoge gegevenskwaliteit te garanderen, moet al het werk worden uitgevoerd in een schone, steriele omgeving met behulp van aseptische techniek en moet de muistemperatuur worden gehandhaafd tijdens de operatie en elke beeldvormingssessie. Het weefsel gehydrateerd houden met steriele, voorverwarmde zoutoplossing tijdens beeldvorming is essentieel en voorkomt weefselfibrose.
Om ervoor te zorgen dat het experiment op een reproduceerbare manier wordt uitgevoerd, is het belangrijk om de lasers voor gebruik uit te lijnen voor optimale acquisitie en om het vermogen van de multifotonenlaser aan het begin van elke sessie te meten. Parameters zoals het type van het doel, de vergroting, de verblijftijd, het laservermogen en de golflengte hebben invloed op de mate van microscopische laserablatie en moeten worden overwogen. In deze studie worden zowel laserablatie als beeldvorming uitgevoerd met een laservermogen van 1,2 W (uit de lens) bij een golflengte van 960 nm door een Fluotar VISIR 25x/0,95 WATER-objectief. Het veranderen van de golflengte of optische scaneigenschappen beïnvloedt de mate van microscopische schade. Een lagere golflengte (zoals 840 nm) vertaalt zich in fotonen met een hogere energie en vaak in een hogere output van de laser, en kan microscopische schade versterken. Een hogere zoom resulteert in meer energie per regio, en dus minder tijd om crypten af te breken, en vice versa. De verblijftijd van de pixel kan ook worden verhoogd of verlaagd om de snelheid van ablatie en de omvang van de schade te veranderen. Wanneer het afgebeelde weefsel niet stabiel is (bijvoorbeeld vanwege peristaltische bewegingen), moet ablatie snel worden uitgevoerd. Hiervoor moet de ablatiesnelheid worden geoptimaliseerd door bijvoorbeeld de zoom- en/of laseroutput te verhogen.
Het vinden van hetzelfde darmgebied gedurende meerdere beeldvormingssessies is een andere cruciale stap die goed moet worden uitgevoerd om het succes van het experiment te garanderen. Om dit te doen, moet de darm op elk moment op exact dezelfde manier worden gepositioneerd. We raden aan om altijd de blindedarm als referentiepunt te gebruiken om dezelfde gebieden in de dunne en dikke darm te vinden. Het voorzichtig uitrekken van het weefsel van belang met wattenstaafjes zorgt ervoor dat het gebied van belang binnen het bereik van de objectieve werkafstand ligt en maximaliseert het aantal regio's dat kan worden getraceerd. Daarnaast raden we aan om altijd meerdere microscopische posities in elke muis af te breken en in beeld te brengen om rekening te houden met regio's die mogelijk niet zijn gelokaliseerd in een latere beeldvormingssessie. Als de regio's niet kunnen worden gevonden, hoewel de positionering van de darm correct is, kan het helpen om de muis te verplaatsen en de oriëntatie van het blootgestelde gebied te veranderen. Het volgen van crypten in de loop van de tijd kan omslachtig zijn voor experimenten waarbij grotere darmvelden van verschillende aangrenzende crypten worden geableerd. Dergelijke schadelijke beledigingen kunnen weefselremodellering buiten de epitheliale monolaag oproepen, wat kan culmineren in wijziging van de weefseloriëntatiepunten die worden gebruikt voor het volgen van het gebied in de loop van de tijd. Het kiezen van oriëntatiepunten op voldoende afstand van de beschadigde site en het vastleggen van grotere gezichtsvelden die het beschadigde gebied met enkele honderden micrometers overtreffen, verhoogt de kans op succesvolle langetermijnexperimenten. Naast een onjuiste positionering van de darm op het microscoopstadium, kunnen peristaltische bewegingen van het maagdarmkanaal de beeldvorming verstoren. Dit probleem kan op twee manieren worden verholpen. Als de frequentie van bewegingen niet te hoog is, kan het proces worden herhaald in hetzelfde gebied met een verhoogde blootstellingstijd. Als alternatief kunnen grotere hoeveelheden anesthesie worden gebruikt om de peristaltiek te verminderen. We raden aan om hogere doses isofluraan te beperken tot korte aanpassingen. Al met al moeten de beeldvormingssessies zo kort mogelijk worden gehouden, optimaal onder de 3 uur, om een snel herstel te garanderen.
De gecombineerde laserablatie en longitudinale intravitale microscopiebenadering heeft verschillende voordelen in vergelijking met andere schademodellen. Eerdere (chemische) schademodellen misten het vermogen om de schadelijke belediging lokaal te beperken 6,11,12,19,20. Laserablatie overwint deze tekortkoming door de schade te beperken tot een bepaald interessegebied. Dit stelt onderzoekers in staat om de locatie van het letsel te controleren, evenals de omvang van de schade. De ernst van de schade kan worden gemoduleerd om crypten of hele microscopische darmvelden te aborteren om te informeren over regeneratieve reacties op crypteschaal. Naast ruimtelijke controle maakt laserablatie het ook mogelijk om het begin van schade nauwkeurig te timen, waardoor de precisie van eerdere medicijn-, chemische en infectiemodellen 9,10,11,12,19,20 wordt overtroffen. Ons protocol borduurt voort op eerdere studies die laser-geïnduceerde thermische ablatie gebruikten als een methode om gelokaliseerde schade in de darm te induceren21,23. Eerdere laser-geïnduceerde schademodellen brachten lokale gebieden in de dunne darm21 of het luminale oppervlak van de distale dikke darm23 in beeld. De gecombineerde chirurgie- en laserablatiebenadering maakt het mogelijk om het darmepitheel (met name crypten) met een hoge resolutie te visualiseren en laserablatie en follow-up beeldvorming van weefselherstel uit te voeren in elke positie van de dunne darm, blindedarm en proximale dikke darm. Het vangt het herstel van dezelfde darmgebieden in de loop van de tijd, waardoor verschillende lagen van de darm (slijmvlies, submucosa, muscularis en serosa) kunnen worden gevisualiseerd volgens de experimentele opstelling. Onze techniek is voornamelijk toegesneden op langdurige herhaalde beeldvorming gedurende een periode van meerdere weken/maanden. Om de kortetermijnhersteldynamiek van crypten te bestuderen (bijvoorbeeld gedurende meerdere opeenvolgende dagen na schade), kan de hier beschreven laserablatiebenadering worden gecombineerd met intravitale beeldvormingsvensters27,28,40.
Dit protocol kan worden gebruikt voor een groot aantal onderzoekstoepassingen uit verschillende wetenschappelijke gebieden die regeneratie, immunologie en kankeronderzoek omvatten. Longitudinale beeldvorming van intestinale regeneratie werpt licht op de cellulaire dynamiek die de epitheliale integriteit en barrièrefunctie behoudt, de afweer van de gastheer tegen pathogenen in het darmlumen mogelijk maakt en die ten grondslag ligt aan de klaring en verspreiding van oncogene mutaties. Elke wetenschappelijke vraag zal unieke eisen stellen aan de omvang van laser-geïnduceerde schade en de duur van de beeldvorming. Fluorescerende reportermuizen en geïnjecteerde kleurstoffen kunnen de gegevens die kunnen worden verkregen drastisch uitbreiden en verfijnen door de visualisatie van elke cel en structuur van belang mogelijk te maken. Een Lgr5-CreERt2:Rosa26-Confetti-muis kan bijvoorbeeld worden gebruikt om stamcelprogenieën te visualiseren, terwijl de Rosa26-mTmG-reporter informeert over weefselarchitectuur. Samen maken deze recente technologische ontwikkelingen intravitale darmexperimenten tot een lucratief hulpmiddel om ons begrip van darmbiologie en -ziekte te vergroten.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd ondersteund door de Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek NWO (Vici-subsidie 09150182110004 aan J.v.R. en Veni-subsidie 09150161910151 aan H.A.M.), het OCENW. GROOT.2019.085 (naar J.v.R), en een EMBO postdoctoraal fellowship (subsidie ALTF 452-2019 naar H.A.M).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia induction box | Veterinary Technics | ||
| Autoclave | Certoclav | ||
| Betadine | Mylan | 202809 | |
| Diaper (underpad) | Absorin comfort | ||
| Dumont forceps | Fine Scientific Tools | 11255-20 or 11272-40 | Inox, style #55, used to hold the peritoneum |
| Enzymatic instrument cleaner | Roboz | EC-1000 | |
| Ethanol 80% | homemade | NA | |
| Eye ointment | Duratears Z (Alcon) | 288/28282-6 | |
| Fine Scissors Straight 9 cm | Fine Scientific Tools | 14060-09 | Used to cut skin and peritoneum of the mouse |
| Gauze 5 cmX5 cm | Cutisoft (Bsn medical) | 45847-00 | |
| Graefe Forceps Curved Serrated | Fine Scientific Tools | 11051-10 | Used to hold the skin |
| Hartman Hemostat Straight | Fine Scientific Tools | 13002-10 | Used for suturing |
| Heating pad | Comfort | T5-5000 | |
| Imaging box | Custom made | ||
| Incision film | Nobafilm | 172215 | |
| Inverted multi-photon microscope with automated stage | Leica Microsystems | NA | |
| Isoflurane (vetflurane) | Pharmachemie BV, Haarlem, Netherlands | 305788 | |
| Isoflurane vaporizer | Penlon sigma delta | ||
| Micropore paper tape | Micropore | ||
| NaCl 0.9% | Braun | Other brands available | |
| Needle 25G | BD | 300600 | |
| Paper tape tesa | Tesa | NA | |
| Parafilm | Bemis | PM-994 | semi-transparent tape |
| Razor blades | Supermax stainless steel | Other brands available | |
| Rectal probe | Kent Scientific | 20250-91 | |
| Rimadyl Cattle (carprofen) | Zoetis B.V | Registration# REG NL 10130 | |
| Student Fine Scissors Straight 11.5 cm | Fine Scientific Tools | 91460-11 | Used to cut gauze |
| Surgical instrument cleaner | Roboz | IC-1000 | |
| Surgical instrument lubricant | Roboz | IL-1000 | |
| Syringes (1 ml) | BD | 303172 | Other brands available |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| Temgesic (Buprenorphine hydrochloride) | Indivior UK Limited/Reckitt Benckiser Healthcare | Registration# RVG 08725 | |
| Vicryl polyglactin suture 5-0 FS-2 needle | Ethicon | V292ZH | |
| VirkonS | Bio-services | antiseptic solution | |
| Wooden cotton swab (sterile) | Klinion | 531530 | Other brands available |
References
- Clevers, H. The intestinal crypt, a prototype stem cell compartment. Cell. 154 (2), 274-284 (2013).
- Darwich, A. S., Aslam, U., Ashcroft, D. M., Rostami-Hodjegan, A. Meta-analysis of the turnover of intestinal epithelia in preclinical animal species and humans. Drug Metabolism and Disposition. 42 (12), 2016-2022 (2014).
- Beumer, J., Clevers, H. Regulation and plasticity of intestinal stem cells during homeostasis and regeneration. Development. 143 (20), 3639-3649 (2016).
- Ritsma, L., et al. Intestinal crypt homeostasis revealed at single-stem-cell level by in vivo live imaging. Nature. 507 (7492), 362-365 (2014).
- Azkanaz, M., et al. Retrograde movements determine effective stem cell numbers in the intestine. Nature. 607 (7919), 548-554 (2022).
- van Es, J. H., et al. Dll1+ secretory progenitor cells revert to stem cells upon crypt damage. Nature Cell Biology. 14 (10), 1099-1104 (2012).
- Tomic, G., et al. Phospho-regulation of ATOH1 is required for plasticity of secretory progenitors and tissue regeneration. Cell Stem Cell. 23 (3), 436-443 (2018).
- Asfaha, S., et al. Krt19+/Lgr5- cells are radioresistant cancer-initiating stem cells in the colon and intestine. Cell Stem Cell. 16 (6), 627-638 (2015).
- Schmitt, M., et al. Paneth cells respond to inflammation and contribute to tissue regeneration by acquiring stem-like features through SCF/c-Kit signaling. Cell Reports. 24 (9), 2312-2328 (2018).
- Davidson, L. A., et al. Alteration of colonic stem cell gene signatures during the regenerative response to injury. Biochimica et Biophysica Acta. 1822 (10), 1600-1607 (2012).
- Ijiri, K., Potten, C. S. Further studies on the response of intestinal crypt cells of different hierarchical status to eighteen different cytotoxic agents. British Journal of Cancer. 55 (2), 113-123 (1987).
- Andersson-Rolf, A., Zilbauer, M., Koo, B. K., Clevers, H. Stem cells in repair of gastrointestinal epithelia. Physiology. 32 (4), 278-289 (2017).
- Totafurno, J., Bjerknes, M., Cheng, H. The crypt cycle. Crypt and villus production in the adult intestinal epithelium. Biophysical Journal. 52 (2), 279-294 (1987).
- Dekaney, C. M., Gulati, A. S., Garrison, A. P., Helmrath, M. A., Henning, S. J. Regeneration of intestinal stem/progenitor cells following doxorubicin treatment of mice. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 297 (3), G461-G470 (2009).
- Cairnie, A. B., Millen, B. H. Fission of crypts in the small intestine of the irradiated mouse. Cell and Tissue Kinetics. 8 (2), 189-196 (1975).
- Bruens, L., Ellenbroek, S. I. J., van Rheenen, J., Snippert, H. J. In vivo imaging reveals existence of crypt fission and fusion in adult mouse intestine. Gastroenterology. 153 (3), 674-677 (2017).
- Baker, A. M., et al. Crypt fusion as a homeostatic mechanism in the human colon. Gut. 68 (11), 1986-1993 (2019).
- Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).
- Okayasu, I., et al. A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice. Gastroenterology. 98 (3), 694-702 (1990).
- Rakoff-Nahoum, S., Paglino, J., Eslami-Varzaneh, F., Edberg, S., Medzhitov, R. Recognition of commensal microflora by toll-like receptors is required for intestinal homeostasis. Cell. 118 (2), 229-241 (2004).
- Choi, J., et al. Intestinal crypts recover rapidly from focal damage with coordinated motion of stem cells that is impaired by aging. Scientific Reports. 8 (1), 10989 (2018).
- Tian, H., et al. A reserve stem cell population in small intestine renders Lgr5-positive cells dispensable. Nature. 478 (7368), 255-259 (2011).
- Choi, M., Yun, S. H. In vivo femtosecond endosurgery: an intestinal epithelial regeneration-after-injury model. Optics Express. 21 (25), 30842-30848 (2013).
- Seno, H., et al. Efficient colonic mucosal wound repair requires Trem2 signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (1), 256-261 (2009).
- Hua, G., et al. Distinct levels of radioresistance in Lgr5+ colonic epithelial stem cells versus Lgr5+ small intestinal stem cells. Cancer Research. 77 (8), 2124-2133 (2017).
- Rompolas, P., et al. Live imaging of stem cell and progeny behaviour in physiological hair-follicle regeneration. Nature. 487 (7408), 496-499 (2012).
- Alieva, M., Ritsma, L., Giedt, R. J., Weissleder, R., van Rheenen, J. Imaging windows for long-term intravital imaging: General overview and technical insights. Intravital. 3 (2), e29917 (2014).
- Rakhilin, N., et al. An intravital window to image the colon in real time. Nature Communications. 10 (1), 5647 (2019).
- Messal, H. A., et al. Antigen retrieval and clearing for whole-organ immunofluorescence by FLASH. Nature Protocols. 16 (1), 239-262 (2021).
- Farrelly, O., et al. Two-photon live imaging of single corneal stem cells reveals compartmentalized organization of the limbal niche. Cell Stem Cell. 28 (7), 1233-1247 (2021).
- Krndija, D., et al. Active cell migration is critical for steady-state epithelial turnover in the gut. Science. 365 (6454), 705-710 (2019).
- Bruens, L., et al. Calorie restriction increases the number of competing stem cells and decreases mutation retention in the intestine. Cell Reports. 32 (3), 107937 (2020).
- Bietar, B., Zhou, J., Lehmann, C. Utility of intestinal intravital microscopy for the study of CNS injury-induced immunodepression syndrome (CIDS). Clinical Hemorheology and Microcirculation. 79 (1), 137-147 (2021).
- Erreni, M., Doni, A., Weigert, R. Method for acute intravital imaging of the large intestine in live mice. Methods in Molecular Biology. 2304, 285-299 (2021).
- Hiltensperger, M., et al. Skin and gut imprinted helper T cell subsets exhibit distinct functional phenotypes in central nervous system autoimmunity. Nature Immunology. 22 (7), 880-892 (2021).
- Martínez-Sánchez, L. D. C., et al. Epithelial RAC1-dependent cytoskeleton dynamics controls cell mechanics, cell shedding and barrier integrity in intestinal inflammation. Gut. 72 (2), 275-294 (2022).
- Means, A. L., Xu, Y., Zhao, A., Ray, K. C., Gu, G. A CK19(CreERT) knockin mouse line allows for conditional DNA recombination in epithelial cells in multiple endodermal organs. Genesis. 46 (6), 318-323 (2008).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Snippert, H. J., et al. Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells. Cell. 143 (1), 134-144 (2010).
- Messal, H. A., van Rheenen, J., Scheele, C. L. An intravital microscopy toolbox to study mammary gland dynamics from cellular level to organ scale. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 26 (1), 9-27 (2021).
