Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

אבלציה בלייזר ומיקרוסקופ תוך חיוני לחקר עיצוב מחדש של המעי

Published: June 9, 2023 doi: 10.3791/64756
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 3, 3, 1,2, 1,2
1Department of Molecular Pathology, The Netherlands Cancer Institute, 2Oncode Institute, 3Animal Laboratory Facility, The Netherlands Cancer Institute
* These authors contributed equally

Summary

כאן, אנו מציגים שיטה לקבלת תמונות של המעי על פצע המושרה בלייזר. על ידי חשיפת מעי העכבר ללייזר מולטיפוטון, אובדן של קריפט(ים) בודדים או מרובים מושרה באופן מקומי. על ידי הדמיה חוזרת ונשנית של האזור הפגוע במשך חודשים, נלכדת הדינמיקה בזמן אמת של התאוששות המעי.

Abstract

חקירת התאוששות המעי in vivo היא אתגר טכני מעולה. היעדר פרוטוקולי הדמיה אורכיים מנע תובנות עמוקות יותר על הדינמיקה בקנה מידה של תאים ורקמות המתזמרת את התחדשות המעי. במאמר זה אנו מתארים שיטת מיקרוסקופיה תוך-חיונית הגורמת באופן מקומי נזק לרקמות בסקאלת הקריפטה היחידה ועוקבת אחר התגובה הרגנרטיבית של אפיתל המעי בעכברים חיים. קריפטים בודדים או שדות מעיים גדולים יותר בוטלו על ידי לייזר אינפרא אדום רב-פוטוני בעוצמה גבוהה באופן מבוקר זמן ומרחב. הדמיה תוך-חיונית חוזרת לטווח ארוך אפשרה מעקב אחר האזורים הפגועים לאורך זמן ואפשרה ניטור של דינמיקת הקריפטה במהלך התאוששות הרקמה במשך תקופה של מספר שבועות. אירועי שיפוץ קריפטה כגון ביקוע קריפטה, איחוי והיעלמות נצפו ברקמה השכנה לאחר נזק שנגרם על ידי לייזר. פרוטוקול זה מאפשר לחקור את הדינמיקה של קריפטה הן בסביבה הומיאוסטטית והן בסביבה פתופיזיולוגית, כגון הזדקנות והתחלת גידול.

Introduction

רירית האפיתל של המעי מאותגרת כל הזמן על ידי חומצות קיבה, רעלנים ומיקרוביוטה שיכולים לגרום להפרעה במחסום האפיתל. מבנה המעי וארגון הרקמות מתמחים בחידוש עצמי מתמיד ותיקון נזקים. אפיתל חד שכבתי של המעי הדק מאורגן יחידות crypt-villus1. בהומאוסטזיס, תאי גזע מעיים Lgr5+ המתחדשים מעצמם השוכנים בבסיס הקריפטה מולידים צאצאים ממוינים. תאי הבת המובחנים נוסעים לקצה ציר הווילוס בצורה של מסוע, שם הם נשפכים כך שרירית המעי מתחדשת תוך 3-5 ימים 2,3. בטווח הארוך, לא כל תאי Lgr5+ תורמים באופן שווה לחידוש הרקמות, שכן הדבר תלוי גם ביכולתם של התאים לנוע כנגד המסוע לכיוון בסיס הקריפטה (כלומר, תנועה לאחור)4,5. ואכן, עם אבלציה של תאי Lgr5+ על ידי, למשל, קרינה, תאי אב מחוץ לבסיס הקריפטה נעים לתוך הבסיס כדי להתמיין ולחדש את מאגר תאי הגזע 6,7,8.

דלקת חריפה עלולה לגרום לאובדן תאי גזע Lgr5+ 9,10. בנוסף לאובדן תאי גזע, גורמים חיצוניים רבים יכולים לגרום נזק חריף לאפיתל בקנה מידה קריפטה. הקרנות, טיפולים כימיים ואנטיביוטיקה הוכחו כפוגעים בקריפטים של המעי ובווילי11. שדות גדולים יותר של קריפטים ווילי יכולים להיות מושפעים מזיהומים חיידקיים, ויראליים וטפיליים12. המעי הוא בעל יכולת יוצאת דופן להתאושש מנזק פנימי וחיצוני בקנה מידה של הקריפטה על ידי ביקוע קריפטה (חלוקה של קריפטה אחת לשתיים)13. עם הפציעה, קריפטות באזור הסמוך לנזק עוברות ביקוע כדי לחדש את מספרי הקריפטה. תופעה זו מתרחשת גם, אם כי במידה פחותה, במהלך הומאוסטזיס14,15. כדי לאזן עלייה פוטנציאלית במספר הקריפטים במהלך הומאוסטזיס, קריפטים יכולים גם להתיך (מיזוג שני קריפטות לאחד)16,17. לא ידוע אם היתוך קריפטה ממלא תפקיד גם בהקמה מחדש של מספרי קריפטה לאחר פציעה. יתר על כן, הדינמיקה והגורמים הרגולטוריים של תהליך זה נותרו ברורים.

מודלים של פציעות הם הכרחיים כדי לחקור התחדשות רקמות in vivo. מודלים שונים של פציעות שימשו לחקר התחדשות רקמת המעי. אסטרטגיות ניסיוניות קודמות השתמשו בקרינה במינון גבוה כדי לדלל מאגרי תאי גזע18 או בטיפול בדאקסטרן סולפט נתרן (DSS) כדי לגרום לקוליטיס כרונית וחריפה ואובדן קריפטה בעכברים 19,20. אבלציה של תא בודד באמצעים גנטיים או אופטיים שימשה לעידון נזק לרקמות ונחשבת לכלי אטרקטיבי להתרת תפקידם של תאי גזע ותאי אב 21,22 ולחקר התחדשות כלי הדם23. בנוסף, פותחה מערכת לפגיעה בביופסיה כדי לגרום נזק בשדות גדולים יותר של מספר קריפטים ווילי24. חשוב לציין, התגובה לעלבון המזיק עשויה להשתנות לאורך הציר הפרוקסימלי-דיסטלי של המעי, כפי שדווח לגבי קרינה, שגרמה לנזק רב יותר במעי הדק מאשר במעי הגס25. זה מדגיש את הצורך בשיטות ממוקדות השולטות הן בהיקף העלבון המזיק והן בלוקליזציה שלו במערכת העיכול.

היקף הנזק וההתאוששות הוערכו באופן קונבנציונלי באמצעים סטטיים, המספקים מידע מוגבל על הדינמיקה של התאוששות רקמות. מיקרוסקופ תוך חיוני (IVM) פתח הזדמנויות ייחודיות לכימות התנהגות תאי גזע, עיצוב מחדש של אפיתל והתחדשות באיברים רבים 26,27,28,29,30, וסיפק תובנות משפיעות על ביולוגיה של המעי 4,5,21,31,32,33,34, 35,36.

כאן, אנו מתארים שיטה לגרום נזק למעי המוגדר מרחבית-טמפורלית וללכוד את ההתאוששות של רירית אפיתל המעי. אנו משתמשים בשני אבלציות לייזר מבוססות פוטונים כדי לפגוע בקריפטות מעיים ועוקבים אחר תגובת הפצע המיידית וההחלמה לטווח ארוך על ידי מיקרוסקופ תוך חיוני חוזר. הפרוטוקול שלנו מאפשר למפות את השיפוץ הרגנרטיבי של ארכיטקטורת רקמת המעי בתגובה לנזק מקומי לרקמות. דינמיקת קריפטה, כולל אירועי ביקוע ואיחוי, ניתנת לכימות בקלות ולמעקב לאורך זמן. היישום של אבלציה בלייזר והדמיה תוך-חיונית חוזרת יכול לשמש כפלטפורמה לחקר הדינמיקה בקנה מידה רקמתי של ארכיטקטורת מעיים במהלך הומאוסטזיס ופתופיזיולוגיה, כגון התחלת גידול.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים המתוארים במחקר זה בוצעו בהתאם להנחיות ולאישור של הגוף לרווחת בעלי חיים (AWB) של המכון ההולנדי לסרטן (NKI).

הערה: יש להתייעץ עם ועדת האתיקה של בעלי החיים של המכון לפני ביצוע ניסויים כלשהם בבעלי חיים.

1. הכנה לניתוח והדמיה תוך חיונית

  1. טיפולים טרום ניתוחיים
    1. השראת K19-CreERT2 בן 8-12 שבועות37: Rosa26-mTmG 38 ו-Lgr5eGFP-IRES-CreERT218: Rosa26-Confetti39 עכברים על-ידי הזרקת טמוקסיפן מומס בשמן חמניות תוך צפקי 4-6 שבועות לפני הניתוח (איור 1).
    2. החל שיכוך כאבים. יש להזריק 200 μL של בופרנורפין (0.1 מ"ג/ק"ג משקל גוף) מדולל ב-NaCl 0.9% לכל 30 גרם עכבר תת עורית 30 דקות לפני הניתוח. יש לתת קרפרופן (0.067 מ"ג/מ"ל) בבקבוק המכיל 125 מ"ל מי שתייה אוטוקלאביים לא חומציים 24 שעות לפני הניתוח. לחלופין, יש לבצע הזרקת קרפרופן תת עורית (5 מ"ג/ק"ג) 30 דקות לפני תחילת הניתוח.
  2. הכנה לניתוח
    1. הציגו כלי ניתוח סטריליים אוטוקלאביים בארון הסיכונים הביולוגיים.
    2. הפעל את כרית החימום והגדר את הטמפרטורה ל -37 מעלות צלזיוס.
  3. הכנה להדמיה תוך חיונית
    1. הפעל את התא מבוקר הטמפרטורה של המיקרוסקופ לפחות 4 שעות לפני ההדמיה כדי לאפשר מספיק זמן לייצוב טמפרטורה.
      הערה: הזמן הדרוש עשוי להשתנות בהתאם למכשיר שבו נעשה שימוש.
    2. שמור על הטמפרטורה בתוך תא האקלים יציב ב 37 °C (77 °F).
    3. הפעל את המיקרוסקופ הדו-פוטוני, הסורק והלייזר.
    4. הפעל את תוכנת ההדמיה.
    5. כוונן את אורך הגל של הלייזר ל- 960 ננומטר ופתח את התריס.

2. ניתוח והדמיה תוך חיונית

  1. חשיפה כירורגית של המעי
    1. מרדימים את העכבר באמצעות איזופלורן 2%-3% ומניחים אותו על כרית חימום, מכוסה במטלית סטרילית. בדוק את עומק ההרדמה על ידי הערכת תדירות ואיכות הנשימה (נשימה אחת לשנייה) ועל ידי בדיקת הרפלקס של העכבר.
    2. לכסות את העיניים של העכבר עם משחת העין.
    3. יש להזריק 200 μL של מלח סטרילי שחומם מראש באופן תת-עורי.
    4. לגלח את הבטן ולהסיר את השיער. החליפו את הבד הסטרילי באזור הניתוח.
    5. הכנס בדיקה רקטלית כדי לפקח על הטמפרטורה של העכבר.
      הערה: הטמפרטורה צריכה להיות כ 37 °C (77 °F).
    6. לבשו זוג חדש של כפפות סטריליות.
    7. נקו את אזור הניתוח בצורה מעגלית עם קרצוף לסירוגין של תמיסת חיטוי ואחריה 80% אתנול שלוש פעמים. הסר עודף אתנול עם צמר גפן סטרילי.
      הערה: זה קריטי כדי לפקח על העכבר עבור היפותרמיה בשלב זה.
    8. כסו את העכבר במדרס כירורגי סטרילי.
    9. בדוק את הרפלקס של העכבר.
    10. בצע חתך קו אמצע אנכי ~ 10 מ"מ דרך העור באמצעות אזמל סטרילי.
    11. חותכים את linea alba באמצעות מספריים כדי להפריד את שרירי הבטן פי הטבעת ולפתוח את הבטן.
    12. מצא את הצקום של העכבר באמצעות צמר גפן סטרילי ספוג במי מלח סטריליים שחוממו מראש כדי להשתמש בו כנקודת התייחסות.
    13. עושים חתך קטן בחתיכת גזה סטרילית, מרטיבים אותה במי מלח סטריליים שחוממו מראש, ומניחים אותו מעל החתך.
    14. הוציאו את המעי עם צמר גפן סטרילי ספוג במי מלח סטריליים שחוממו מראש. שמור על המעי hydrated על ידי הוספת מלוחים סטריליים שחוממו מראש.
    15. הניחו תא הדמיה סטרילי בהתאמה אישית ליד העכבר.
    16. העבר את העכבר לקופסת ההדמיה הסטרילית שחוממה מראש.
    17. מניחים את המעי על הזכוכית הסטרילית של קופסת ההדמיה. הניחו את ראש העכבר בתוך צינור השאיפה של קופסת ההדמיה, כפי שמוצג באיור 1.
    18. במידת הצורך, אבטח את העכבר באמצעות סרט וסרט סטריליים גמישים.
    19. מקם את קופסת ההדמיה המכילה את העכבר בתא המיקרוסקופ.
  2. הדמיה תוך חיונית
    1. עקוב אחר העכבר במהלך ההדמיה על ידי בדיקת התדירות ועומק הנשימה והטמפרטורה באמצעות בדיקה רקטלית כל 15 דקות. אחוז איזופלורן צריך להישמר בין 1%-2%. התאם במידת הצורך.
    2. מצא אזור במעי באמצעות העינית של המיקרוסקופ.
    3. קבלו מבט רחב שדה על האזור המעניין באמצעות המצלמה הפנימית של המיקרוסקופ, כפי שניתן לראות באיור 2A.
    4. צלם את האזור המעניין באמצעות לייזר 960 ננומטר של מיקרוסקופ מולטיפוטון. התאימו את עוצמת הלייזר ואת אורך הגל בהתאם לפלואורופורים ששימשו בניסוי.
    5. לרכוש 10-20 צעד z ערימה של 3 מיקרומטר של האזור של עניין.
  3. אבלציה בלייזר
    1. בחר מיקום בודד או מיקומים מרובים מהאריח שצולם קודם לכן.
    2. השתמש בפונקציית כיול נקודת האקונומיקה בתוכנת ההדמיה בזום של רזולוציה של 32 ו- 124 x 124 פיקסלים במהירות סריקה של 400 הרץ, תוך שימוש במאפיין הסריקה הדו-כיוונית למשך 3-10 שניות, בהתאם לגודל הנזק המיועד. ייזום הנזק באזור הקריפטה יכול להיות מוכר על ידי עלייה autofluorescence בשני ערוצים ירוק ואדום.
    3. חזור על שני השלבים הקודמים עבור אזורים מרובים באותו עכבר.
    4. לאחר אבלציה, לרכוש z-stacks של האזורים הפגועים כדי לאשר את המיקום ואת היקף הנזק.
  4. סגירת אתר הניתוח
    1. הניחו את העכבר, בעודו תחת הרדמה, באזור תפירה סטרילי.
    2. החזירו את המעי החשוף לבטן באמצעות צמר גפן סטרילי ספוג במי מלח סטריליים שחוממו מראש.
    3. תפרו את linea alba על ידי ביצוע תפר רציף פשוט באמצעות תפר 5-0 נספג. סגור את הגפיים של התפר עם קשרים כירורגיים.
    4. חזור על אותו שלב עם שכבת העור.
    5. כבו את תחנת האיזופלורן ונקו ועיקרו את תיבת ההדמיה והשיבוץ.
    6. נקו את כלי הניתוח עם מנקה כלי הניתוח, מנקה אנזימטי וחומר סיכה לכלי ניתוח. לאחר הייבוש, יש לעקר את כלי הניתוח יחד עם קופסת הניתוח באוטוקלאב.
  5. טיפול לאחר הניתוח
    1. תן לעכבר להתאושש מהניתוח בזמן שהכלוב מונח על כרית החימום למשך ~ 1 שעות.
      הערה: מקם את העכבר עם חברים אחרים לכלוב במידת האפשר. דיור בודד אינו הכרחי להתאוששות.
    2. בדוק את הטמפרטורה של העכבר כל 15 דקות במהלך ההתאוששות.
    3. יש להזריק 200 μL של בופרנורפין (0.1 מ"ג/ק"ג משקל גוף) מדולל ב-NaCl 0.9% לכל 30 גרם עכבר תת עורית 6-12 שעות לאחר הניתוח.
    4. יש לתת קרפרופן (0.067 מ"ג/מ"ל) בבקבוק המכיל 125 מ"ל מי שתייה אוטוקלאביים לא חומציים למשך 72 שעות לאחר הניתוח.
    5. לשקול את העכבר ולפקח על הרווחה כל יום במשך שבוע לאחר הניתוח.

3. ניתוחים חוזרים והדמיה תוך חיונית

  1. כירורגיה
    1. בנקודת הזמן השנייה (לפחות שבוע לאחר פגישת ההדמיה הראשונה), חזור על שלבים 1.1.2, 1.2, 1.3 ו- 2.1.
  2. הדמיה תוך חיונית
    1. חזור על שלבים 2.2.1-2.2.3.
    2. השתמש בתבנית של כלי הדם כדי למצוא את אותם אזורי עניין שצולמו בנקודת הזמן הראשונה.
    3. חזור על שלבים 2.2.4 ו- 2.2.5.
  3. סגירת אתר הניתוח
    1. חזור על שלב 2.4.1.
    2. אם העכבר אינו אמור להיות מצולם בנקודת זמן אחרת, להקריב את העכבר על ידי ביצוע נקע צוואר הרחם תחת הרדמה סופנית. אחרת, המשך לשלב הבא.
      הערה: בהתאם להנחיות דירקטיבת האיחוד האירופי 2010/63/EU, נספח IV, פריקת צוואר הרחם היא שיטה מקובלת.
    3. חזור על שלבים 2.4.2-2.4.6.
  4. טיפול לאחר הניתוח
    1. חזור על שלבים 2.5.1-2.5.5.

Representative Results

כדי להדגים את סוג התוצאות שניתן לקבל משיטת אבלציה בלייזר בשילוב עם הדמיה תוך-חיונית, ביצענו ניסוי כפי שמוצג באיור 1. ראשית, הזרקנו K19-CreERT2;mTmG (K19cre-mTmG) ו- Lgr5eGFP-IRES-CreERT2; עכברי Rosa26-Confetti (Lgr5cre-Confetti) עם טמוקסיפן כדי לסמן תאים באופן סטוכסטי עם אחד מצבעי הקונפטי (או חלבון פלואורסצנטי ירוק [GFP] במקרה של עכברי mTmG). K19-cre משרה מעקב אחר שושלת מכל תאי האפיתל, בעוד Lgr5-cre משרה מעקב מתאי גזע רק 8,18,37. זריקת הטמוקסיפן ניתנה 4-6 שבועות לפני הניתוח ופגישת ההדמיה הראשונה על מנת להשיג קריפטות בהן כל התאים חד שבטיים לצבע מסוים. זיהוי חזק של אותם אזורי רקמה במשך מספר שבועות חיוני כדי לעקוב אחר גורלם של אותם קריפטות לאורך זמן. מאפיינים אדריכליים של רקמות, כגון כלי הדם, יכולים לשמש כציוני דרך אמינים ברקמה, ותועדו כאן במצלמה הפנימית של המיקרוסקופ. בנוסף, תיוג חלק קטן של קריפטים עם (לפחות שניים) צבעים שונים עזר לזהות את אותם קריפטים בכל סשן הדמיה ולעקוב אחר התנהגותם במהלך תהליך ההתחדשות לאחר נזק לייזר. לאחר חשיפה כירורגית של מעי העכבר וקבלת תמונות מצלמה ופלואורסצנטיות של האזור המעניין (איור 2A), ניתן להשתמש בהגדרות נקודת האקונומיקה של לייזר רב-פוטוני כדי לעבד קריפט אחד או יותר (איור 2B,C). התחלת הנזק יכולה להיות מוכרת על ידי עלייה באוטופלואורסצנטיות הן בערוצים הירוקים והן בערוצים האדומים. כדי לחקור את הדינמיקה של שחזור קריפטה, הניתוח והליך ההדמיה חזרו על עצמם שבועות/חודשים לאחר פגישת ההדמיה הראשונה, ומבנים אינהרנטיים של רקמות (כלי דם ודפוסים של קריפטים המסומנים באופן קלוני) שימשו כציוני דרך כדי למצוא את אותו מיקום בדיוק של הפציעה (איור 2). כאשר שיטה זו יושמה בעכברי Lgr5Cre-Confetti, שבהם Lgr5-eGFP מבוטא באופן טלאי, ניתן היה ללכוד שינויים במספר הקריפטים ובצורות בעקבות הנזק שנגרם על-ידי לייזר (איור 3). בעוד שאזורים מסוימים לא הראו שינויים במספר ובמבנה של הקריפטים (איור 3B), אזורים אחרים הראו שיפוץ נרחב של הקריפטות, כפי שניתן לראות במספר אירועי הביקוע והאיחוי של קריפטים (איור 3C) ואובדן הקריפטים שבועיים לאחר הפציעה כתוצאה מלייזר (איור 3D). על-ידי הצגת גדלים שונים של נזק וכימות אירועי הביקוע, האיחוי וההיעלמות לאחר אבלציה, כמו בדוגמה שמוצגת (איור 3E), ניתן למפות את הדינמיקה של התחדשות הנגרמת על ידי פציעה במודלים שונים של עכברים.

Figure 1
איור 1: ייצוג סכמטי של מערך הניסוי. תיוג In vivo של תאי מעיים מושג על ידי הזרקת טמוקסיפן תוך צפקי במודלים של עכברים מהונדסים גנטית כדי לגרום לרקומבינציה בתיווך Cre בקריפטות מעיים. לאחר ימים או שבועות (כאשר הקריפטות הן חד שבטיות לצבע מסוים), המעי נחשף בניתוח ונתון לאבלציה בלייזר באמצעות מיקרוסקופ מולטיפוטון עם תא מבוקר טמפרטורה. היקף הנזק לקריפטה מאופיין מיד לאחר אבלציה והעכבר רשאי להתאושש מההליך. חשיפה כירורגית חוזרת ונשנית ו- IVM משמשים למעקב אחר התאוששות המעי לאורך זמן. הדפוס והפיזור של כלי הדם והקריפטים בצבעים שונים משמשים כדי למצוא בחזרה את אותם אזורים שבועות או חודשים לאחר אבלציה. שיפוץ קריפטה (למשל, ביקוע או איחוי) ניתן לראות באתר הנזק שבועות לאחר אבלציה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: הדמיה אורכית של התחדשות רקמות לאחר נזק שנגרם על-ידי לייזר במעי. כאשר המעי ממוקם באותו אופן בדיוק, כלי הדם של המעי יכולים לשמש כמפה כדי למצוא ולצלם את אותם אזורים בדיוק. (A) תמונות סקירה של המעי. קווים לבנים מקווקווים מייצגים את תבנית כלי הדם הסמוכים לאתר הנזק (קופסה לבנה), המשמשת כנקודת ציון למציאת אותו אזור בלייזר בנקודת זמן אחרת. שתי התמונות התחתונות מציגות את התצוגה המוגדלת של התיבה הלבנה. החץ מתאר את האתר המדויק של אבלציה בלייזר ביום הראשון וחודש לאחר מכן. (B) תמונות פלואורסצנטיות של נזק לקריפטה בודדת שצולמו במיקרוסקופ רב-פוטוני. החץ בתיבה הכחולה מראה את מיקום הנזק ביום הראשון וחודש לאחר מכן. (C) תמונות פלורסנט של שדה קריפטות פגום. החיצים בתיבה הכחולה מסמנים את אזור הנזק ביום הראשון וחודש לאחר מכן. פסי קנה מידה: 1 מ"מ (A, למעלה); 0.25 מ"מ (A, למטה); 200 מיקרומטר (סקירה גדולה B ו - C); ו-50 מיקרומטר (תמונות מוגדלות B ו-C). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: הדמיה תוך-חיונית של גורלות קריפטה לאחר אבלציה בלייזר. (A) באמצעות מודל קונפטי, ניתן לעקוב אחר קריפטים המסומנים בצבעים שונים לאורך זמן כדי למפות את הדינמיקה של ההתאוששות. החץ הלבן מתאר את האתר של אבלציה בלייזר. הקופסה הצהובה מייצגת אזור שכן (<100 מיקרומטר ממקום הפגיעה), ואילו הקופסאות הכחולות והסגולות מייצגות אזורים רחוקים (>100 מיקרומטר) מהאזור המודבק בלייזר. מצבים שונים של התחדשות נצפים. (B) אזורים מסוימים נשארים ללא שינוי כמו בתיבה הסגולה. (C) אזורים אחרים מציגים עיצוב מחדש של קריפטה בצורה של ביקוע קריפטה או איחוי; הקווים הלבנים והחצים המקווקווים מתארים אירועי ביקוע קריפטה והקווים והחצים המקווקווים הכתומים מתארים אירועי היתוך קריפטה. (D) באזורים מסוימים נצפית היעלמות קריפטה, כמו בתיבה הצהובה שבה הקריפטה המסומנת בקו מקווקו כתום נעלמה. (E) כימות לדוגמה המראה את מספר אירועי שיפוץ הקריפטה שנצפו באזורים הסמוכים (כלומר, פחות מ-100 מיקרומטר) ורחוקים (כלומר, יותר מ-100 מיקרומטר) מאתר הנזק. מוטות קנה מידה: 200 מיקרומטר (A); 50 מיקרומטר (B-D). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

פרוטוקול זה משלב אבלציה מיקרוסקופית בלייזר ומיקרוסקופ תוך-חיוני אורכי כדי לעקוב אחר התחדשות המעי מתגובת נזק מוקדמת לעיצוב מחדש של רקמות לטווח ארוך. הטכניקה נקבעה תוך הקפדה על שיקולים אתיים לגרימת אבלציה מיקרוסקופית בלייזר, וכאשר מיישמים אותה במדויק תשמור על רווחת בעלי החיים. במהלך הניתוח, חשוב לוודא כי שלמות המעי נשמרת היטב. ניתן להשיג זאת על ידי טיפול עדין ברקמה עם צמר גפן סטרילי רטוב, אשר מונע דימום או התייבשות של הרקמה. יש להעריך בזהירות את מידת הנזק המיקרוסקופי הנגרם בלייזר על ידי הדמיה של שכבות המעי השונות באזור לאחר אבלציה בלייזר. אם החוקר מעוניין להתאים את תדירות צעדי הניסוי המתוארים בפרוטוקול זה, יש להתייעץ עם ועדת האתיקה של בעלי החיים של המכון לפני הניסוי כדי לקבוע את ההשלכות על רווחת המכון.

מיקרוסקופ תוך חיוני חוזר מאפשר לעקוב אחר התאוששות רקמות באותו עכבר לאורך זמן. חשיפה כירורגית חוזרת ונשנית של המעי מעניקה בקלות גישה אופטית למערכת העיכול כולה. מאפיינים הטבועים ברקמות, כגון כלי הדם, משמשים כציוני דרך לזיהוי אותם אזורי מעיים בכל מפגש הדמיה. כך, ניתן לצלם את אותו אזור רקמה במשך מספר שבועות, מה שמאפשר לכמת התחדשות רקמה ארוכת טווח באותו אזור מעיים באותו עכבר. השליטה המרחבית-זמנית שמציעה שיטת הניתוח וההדמיה המשולבת מביאה את היתרון שניתן לצלם את אותו איבר בתנאים הומיאוסטטיים והתחדשות באותו עכבר, בניגוד למודלים קודמים של נזק לכל האיברים, שבהם בקרות ודגימות התחדשות מקורן בעכברים שונים 11,12,18,19,20 . לפיכך, הגדרת הניסוי שלנו ממזערת את מספר בעלי החיים הנדרש לניסוי ומפחיתה את השונות בין בעלי החיים.

פתרון בעיות פרוטוקול צריך להתחיל עם סקירה של טכניקת הטיפול בעכבר ובמעי, ובקרה של ציוד מיקרוסקופיה והגדרות. ישנם שלבים קריטיים רבים בפרוטוקול זה הדורשים תשומת לב נוספת. ראשית, על מנת להבטיח את רווחת בעלי החיים ואיכות נתונים גבוהה רציפה, כל העבודה צריכה להתבצע בסביבה סטרילית נקייה בטכניקה אספטית, ויש לשמור על טמפרטורת העכבר במהלך הניתוח ובכל מפגש הדמיה. שמירה על לחות הרקמה עם מי מלח סטריליים שחוממו מראש במהלך ההדמיה היא חיונית ומונעת פיברוזיס ברקמות.

כדי להבטיח שהניסוי מתבצע באופן שניתן לשחזר, חשוב ליישר את הלייזרים לפני השימוש לרכישה אופטימלית ולמדוד את תפוקת הכוח של לייזר המולטיפוטון בתחילת כל הפעלה. פרמטרים כגון סוג המטרה, הגדלה, זמן מגורים, עוצמת לייזר ואורך גל משפיעים על מידת אבלציית לייזר מיקרוסקופית ויש לקחת אותם בחשבון. במחקר זה, הן אבלציה בלייזר והן הדמיה מתבצעות בעוצמת לייזר של 1.2 W (מחוץ לעדשה) באורך גל של 960 ננומטר באמצעות מטרת Fluotar VISIR 25x/0.95 WATER. שינוי אורך הגל או תכונות הסריקה האופטית משפיע על מידת הנזק המיקרוסקופי. אורך גל נמוך יותר (כגון 840 ננומטר) מתורגם לפוטונים בעלי אנרגיה גבוהה יותר ולעתים קרובות בתפוקה גבוהה יותר של הלייזר, ועשוי להגביר את הנזק המיקרוסקופי. זום גבוה יותר מביא ליותר אנרגיה לכל אזור, ולכן פחות זמן לעבד קריפטים, ולהיפך. ניתן גם להגדיל או להקטין את זמן השהייה של הפיקסלים כדי לשנות את מהירות האבלציה ואת מידת הנזק. כאשר הרקמה המודמית אינה יציבה (למשל, בגלל תנועות פריסטלטיות), אבלציה צריכה להתבצע במהירות. לשם כך, מהירות האבלציה צריכה להיות אופטימלית על ידי, למשל, הגדלת הזום ו / או פלט לייזר.

מציאת אותו אזור מעיים על פני מפגשי הדמיה מרובים היא צעד קריטי נוסף שיש לבצע כראוי כדי להבטיח את הצלחת הניסוי. כדי לעשות זאת, המעי צריך להיות ממוקם באותו אופן בדיוק בכל נקודות הזמן. אנו ממליצים תמיד להשתמש בצקום כנקודת התייחסות כדי למצוא את אותם אזורים במעי הדק והגס. מתיחת הרקמה המעניינת בעדינות עם צמר גפן מבטיחה שאזור העניין נמצא בטווח מרחק העבודה האובייקטיבי וממקסמת את מספר האזורים שניתן לעקוב אחריהם. בנוסף, אנו ממליצים תמיד לבצע ablate ולצלם מיקומים מיקרוסקופיים מרובים בכל עכבר כדי לקחת בחשבון אזורים שייתכן שלא ימוקמו בחזרה בהפעלת הדמיה מאוחרת יותר. אם לא ניתן למצוא את האזורים, למרות שמיקום המעי נכון, זה יכול לעזור למקם מחדש את העכבר ולשנות את כיוון האזור החשוף. מעקב אחר קריפטות לאורך זמן יכול להיות מסורבל עבור ניסויים שבהם שדות מעיים גדולים יותר של כמה קריפטות סמוכות הם ablated. עלבונות מזיקים כאלה יכולים לעורר עיצוב מחדש של רקמות מעבר לחד-שכבה האפיתליאלית, מה שיכול להגיע לשיאו בשינוי ציוני הדרך של הרקמה המשמשים למעקב אחר האזור לאורך זמן. בחירת ציוני דרך במרחק מספיק לאתר הפגוע ולכידת שדות ראייה גדולים יותר העולים על השטח הפגוע בכמה מאות מיקרומטרים מגדילים את הסיכוי לניסויים מוצלחים לטווח ארוך. בנוסף למיקום שגוי של המעי על שלב המיקרוסקופ, תנועות פריסטלטיות של מערכת העיכול עלולות להפריע להדמיה. ניתן לשפר בעיה זו בשתי דרכים. אם תדירות התנועות אינה גבוהה מדי, ניתן לחזור על התהליך באותו אזור עם זמן חשיפה מוגבר. לחלופין, ניתן להשתמש בכמויות גבוהות יותר של הרדמה כדי להפחית פריסטליקה. אנו ממליצים להגביל מינונים גבוהים יותר של איזופלורן להתאמות קצרות. בסך הכל, מפגשי ההדמיה צריכים להישמר קצרים ככל האפשר, בצורה אופטימלית מתחת ל -3 שעות, כדי להבטיח התאוששות מהירה.

לגישה המשולבת של אבלציה בלייזר ומיקרוסקופ תוך חיוני אורכי יש מספר יתרונות בהשוואה לדגמי נזק אחרים. מודלים קודמים של נזק (כימי) חסרו את היכולת להגביל מקומית את העלבון המזיק 6,11,12,19,20. אבלציה בלייזר מתגברת על חסרון זה על ידי הגבלת הנזק לאזור עניין מוגדר. זה מאפשר לחוקרים לשלוט במיקום הפגיעה, כמו גם בהיקף הנזק. חומרת הנזק יכולה להיות מווסתת כדי לאבלט קריפטים או שדות מעיים מיקרוסקופיים שלמים כדי ליידע על תגובות רגנרטיביות בקנה מידה קריפטה. בנוסף לשליטה מרחבית, אבלציה בלייזר מאפשרת גם לתזמן במדויק את הופעת הנזק, ובכך לעלות על הדיוק של מודלים קודמים של תרופות, כימיקלים וזיהומים 9,10,11,12,19,20. הפרוטוקול שלנו מרחיב מחקרים קודמים שהשתמשו באבלציה תרמית הנגרמת בלייזר כשיטה לגרימת נזק מקומי במעי21,23. מודלים קודמים של נזק שנגרם על ידי לייזר צילמו אזורים מקומיים במעי הדק21 או את פני השטח הלומינליים של המעי הגס הדיסטלי23. הגישה המשולבת של ניתוח ואבלציה בלייזר מאפשרת לדמיין את אפיתל המעי (קריפטות בפרט) ברזולוציה גבוהה, ולבצע אבלציה בלייזר והדמיית מעקב של התאוששות רקמות בכל תנוחה של המעי הדק, הצקום והמעי הגס הפרוקסימלי. זה לוכד את ההתאוששות של אותם אזורי מעיים לאורך זמן, ומאפשר לדמיין שכבות שונות של המעי (רירית, submucosa, muscularis, ו serosa) על פי מערך הניסוי. הטכניקה שלנו מותאמת בעיקר להדמיה חוזרת לטווח ארוך לתקופה של מספר שבועות/חודשים. כדי לחקור את דינמיקת ההתאוששות לטווח קצר של קריפטות (למשל, במשך מספר ימים רצופים לאחר הנזק), ניתן לשלב את גישת אבלציית הלייזר המתוארת כאן עם חלונות הדמיה תוך חיוניים27,28,40.

פרוטוקול זה יכול לשמש למגוון יישומי מחקר מתחומים מדעיים מגוונים המשתרעים על פני התחדשות, אימונולוגיה וחקר הסרטן. הדמיה אורכית של התחדשות המעי שופכת אור על הדינמיקה התאית השומרת על שלמות האפיתל ותפקוד המחסום, מאפשרת הגנה למארח מפני פתוגנים בלומן המעי, ועומדת בבסיס פינוי והתפשטות מוטציות אונקוגניות. כל שאלה מדעית תטיל דרישות ייחודיות על היקף הנזק הנגרם על ידי לייזר ומשך ההדמיה. עכברי כתב פלואורסצנטי וצבעים מוזרקים יכולים להרחיב ולשכלל באופן דרסטי את הנתונים שניתן לרכוש על ידי מתן אפשרות הדמיה של כל תא ומבנה מעניין. לדוגמה, עכבר Lgr5-CreERt2:Rosa26-Confetti יכול לשמש כדי לדמיין צאצאים של תאי גזע, בעוד כתב Rosa26-mTmG מודיע על ארכיטקטורת רקמות. יחד, ההתקדמות הטכנולוגית האחרונה הופכת ניסויים תוך-חיוניים במעיים לכלי משתלם לקידום הבנתנו את הביולוגיה של המעי ומחלות.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

מחקר זה נתמך על ידי הארגון ההולנדי למחקר מדעי NWO (מענק Vici 09150182110004 ל- J.v.R. ומענק Veni 09150161910151 ל- H.A.M), OCENW. GROOT.2019.085 (ל- J.V.R), ומלגת EMBO לפוסט-דוקטורט (מענק ALTF 452-2019 ל- H.A.M).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anesthesia induction box Veterinary Technics
Autoclave Certoclav
Betadine Mylan 202809
Diaper (underpad) Absorin comfort
Dumont forceps Fine Scientific Tools 11255-20 or 11272-40 Inox, style #55, used to hold the peritoneum
Enzymatic instrument cleaner Roboz EC-1000
Ethanol 80% homemade NA
Eye ointment Duratears Z (Alcon) 288/28282-6
Fine Scissors Straight 9 cm Fine Scientific Tools 14060-09 Used to cut skin and peritoneum of the mouse
Gauze 5 cmX5 cm Cutisoft (Bsn medical) 45847-00
Graefe Forceps Curved Serrated Fine Scientific Tools 11051-10 Used to hold the skin
Hartman Hemostat Straight Fine Scientific Tools 13002-10 Used for suturing
Heating pad Comfort T5-5000
Imaging box Custom made
Incision film Nobafilm 172215
Inverted multi-photon microscope with automated stage Leica Microsystems NA
Isoflurane (vetflurane) Pharmachemie BV, Haarlem, Netherlands 305788
Isoflurane vaporizer Penlon sigma delta
Micropore paper tape Micropore
NaCl 0.9% Braun Other brands available
Needle 25G BD 300600
Paper tape tesa Tesa NA
Parafilm Bemis PM-994 semi-transparent tape
Razor blades Supermax stainless steel Other brands available
Rectal probe Kent Scientific 20250-91
Rimadyl Cattle (carprofen) Zoetis B.V Registration# REG NL 10130
Student Fine Scissors Straight 11.5 cm Fine Scientific Tools 91460-11 Used to cut gauze
Surgical instrument cleaner Roboz IC-1000
Surgical instrument lubricant Roboz IL-1000
Syringes (1 ml) BD 303172 Other brands available
Tamoxifen Sigma T5648
Temgesic (Buprenorphine hydrochloride) Indivior UK Limited/Reckitt Benckiser Healthcare Registration# RVG 08725
Vicryl polyglactin suture 5-0 FS-2 needle Ethicon V292ZH
VirkonS Bio-services antiseptic solution
Wooden cotton swab (sterile) Klinion 531530 Other brands available

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Clevers, H. The intestinal crypt, a prototype stem cell compartment. Cell. 154 (2), 274-284 (2013).
  2. Darwich, A. S., Aslam, U., Ashcroft, D. M., Rostami-Hodjegan, A. Meta-analysis of the turnover of intestinal epithelia in preclinical animal species and humans. Drug Metabolism and Disposition. 42 (12), 2016-2022 (2014).
  3. Beumer, J., Clevers, H. Regulation and plasticity of intestinal stem cells during homeostasis and regeneration. Development. 143 (20), 3639-3649 (2016).
  4. Ritsma, L., et al. Intestinal crypt homeostasis revealed at single-stem-cell level by in vivo live imaging. Nature. 507 (7492), 362-365 (2014).
  5. Azkanaz, M., et al. Retrograde movements determine effective stem cell numbers in the intestine. Nature. 607 (7919), 548-554 (2022).
  6. van Es, J. H., et al. Dll1+ secretory progenitor cells revert to stem cells upon crypt damage. Nature Cell Biology. 14 (10), 1099-1104 (2012).
  7. Tomic, G., et al. Phospho-regulation of ATOH1 is required for plasticity of secretory progenitors and tissue regeneration. Cell Stem Cell. 23 (3), 436-443 (2018).
  8. Asfaha, S., et al. Krt19+/Lgr5- cells are radioresistant cancer-initiating stem cells in the colon and intestine. Cell Stem Cell. 16 (6), 627-638 (2015).
  9. Schmitt, M., et al. Paneth cells respond to inflammation and contribute to tissue regeneration by acquiring stem-like features through SCF/c-Kit signaling. Cell Reports. 24 (9), 2312-2328 (2018).
  10. Davidson, L. A., et al. Alteration of colonic stem cell gene signatures during the regenerative response to injury. Biochimica et Biophysica Acta. 1822 (10), 1600-1607 (2012).
  11. Ijiri, K., Potten, C. S. Further studies on the response of intestinal crypt cells of different hierarchical status to eighteen different cytotoxic agents. British Journal of Cancer. 55 (2), 113-123 (1987).
  12. Andersson-Rolf, A., Zilbauer, M., Koo, B. K., Clevers, H. Stem cells in repair of gastrointestinal epithelia. Physiology. 32 (4), 278-289 (2017).
  13. Totafurno, J., Bjerknes, M., Cheng, H. The crypt cycle. Crypt and villus production in the adult intestinal epithelium. Biophysical Journal. 52 (2), 279-294 (1987).
  14. Dekaney, C. M., Gulati, A. S., Garrison, A. P., Helmrath, M. A., Henning, S. J. Regeneration of intestinal stem/progenitor cells following doxorubicin treatment of mice. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 297 (3), G461-G470 (2009).
  15. Cairnie, A. B., Millen, B. H. Fission of crypts in the small intestine of the irradiated mouse. Cell and Tissue Kinetics. 8 (2), 189-196 (1975).
  16. Bruens, L., Ellenbroek, S. I. J., van Rheenen, J., Snippert, H. J. In vivo imaging reveals existence of crypt fission and fusion in adult mouse intestine. Gastroenterology. 153 (3), 674-677 (2017).
  17. Baker, A. M., et al. Crypt fusion as a homeostatic mechanism in the human colon. Gut. 68 (11), 1986-1993 (2019).
  18. Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).
  19. Okayasu, I., et al. A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice. Gastroenterology. 98 (3), 694-702 (1990).
  20. Rakoff-Nahoum, S., Paglino, J., Eslami-Varzaneh, F., Edberg, S., Medzhitov, R. Recognition of commensal microflora by toll-like receptors is required for intestinal homeostasis. Cell. 118 (2), 229-241 (2004).
  21. Choi, J., et al. Intestinal crypts recover rapidly from focal damage with coordinated motion of stem cells that is impaired by aging. Scientific Reports. 8 (1), 10989 (2018).
  22. Tian, H., et al. A reserve stem cell population in small intestine renders Lgr5-positive cells dispensable. Nature. 478 (7368), 255-259 (2011).
  23. Choi, M., Yun, S. H. In vivo femtosecond endosurgery: an intestinal epithelial regeneration-after-injury model. Optics Express. 21 (25), 30842-30848 (2013).
  24. Seno, H., et al. Efficient colonic mucosal wound repair requires Trem2 signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (1), 256-261 (2009).
  25. Hua, G., et al. Distinct levels of radioresistance in Lgr5+ colonic epithelial stem cells versus Lgr5+ small intestinal stem cells. Cancer Research. 77 (8), 2124-2133 (2017).
  26. Rompolas, P., et al. Live imaging of stem cell and progeny behaviour in physiological hair-follicle regeneration. Nature. 487 (7408), 496-499 (2012).
  27. Alieva, M., Ritsma, L., Giedt, R. J., Weissleder, R., van Rheenen, J. Imaging windows for long-term intravital imaging: General overview and technical insights. Intravital. 3 (2), e29917 (2014).
  28. Rakhilin, N., et al. An intravital window to image the colon in real time. Nature Communications. 10 (1), 5647 (2019).
  29. Messal, H. A., et al. Antigen retrieval and clearing for whole-organ immunofluorescence by FLASH. Nature Protocols. 16 (1), 239-262 (2021).
  30. Farrelly, O., et al. Two-photon live imaging of single corneal stem cells reveals compartmentalized organization of the limbal niche. Cell Stem Cell. 28 (7), 1233-1247 (2021).
  31. Krndija, D., et al. Active cell migration is critical for steady-state epithelial turnover in the gut. Science. 365 (6454), 705-710 (2019).
  32. Bruens, L., et al. Calorie restriction increases the number of competing stem cells and decreases mutation retention in the intestine. Cell Reports. 32 (3), 107937 (2020).
  33. Bietar, B., Zhou, J., Lehmann, C. Utility of intestinal intravital microscopy for the study of CNS injury-induced immunodepression syndrome (CIDS). Clinical Hemorheology and Microcirculation. 79 (1), 137-147 (2021).
  34. Erreni, M., Doni, A., Weigert, R. Method for acute intravital imaging of the large intestine in live mice. Methods in Molecular Biology. 2304, 285-299 (2021).
  35. Hiltensperger, M., et al. Skin and gut imprinted helper T cell subsets exhibit distinct functional phenotypes in central nervous system autoimmunity. Nature Immunology. 22 (7), 880-892 (2021).
  36. Martínez-Sánchez, L. D. C., et al. Epithelial RAC1-dependent cytoskeleton dynamics controls cell mechanics, cell shedding and barrier integrity in intestinal inflammation. Gut. 72 (2), 275-294 (2022).
  37. Means, A. L., Xu, Y., Zhao, A., Ray, K. C., Gu, G. A CK19(CreERT) knockin mouse line allows for conditional DNA recombination in epithelial cells in multiple endodermal organs. Genesis. 46 (6), 318-323 (2008).
  38. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
  39. Snippert, H. J., et al. Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells. Cell. 143 (1), 134-144 (2010).
  40. Messal, H. A., van Rheenen, J., Scheele, C. L. An intravital microscopy toolbox to study mammary gland dynamics from cellular level to organ scale. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 26 (1), 9-27 (2021).

Tags

ביולוגיה גיליון 196 אבלציה בלייזר מיקרוסקופיה תוך חיונית מעי רגנרציה נזק שיפוץ קריפטה
אבלציה בלייזר ומיקרוסקופ תוך חיוני לחקר עיצוב מחדש של המעי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Laskaris, D., Azkanaz, M., de… More

Laskaris, D., Azkanaz, M., de Vreij-Kruidenier, M. A., van Rijswoud-Ram, D., Messal, H. A., van Rheenen, J. Laser Ablation and Intravital Microscopy to Study Intestinal Remodeling. J. Vis. Exp. (196), e64756, doi:10.3791/64756 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter