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Biology

आंतों के रीमॉडेलिंग का अध्ययन करने के लिए लेजर एब्लेशन और इंट्रावाइटल माइक्रोस्कोपी

Published: June 9, 2023 doi: 10.3791/64756
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 3, 3, 1,2, 1,2
1Department of Molecular Pathology, The Netherlands Cancer Institute, 2Oncode Institute, 3Animal Laboratory Facility, The Netherlands Cancer Institute
* These authors contributed equally

Summary

यहां, हम लेजर-प्रेरित घाव पर आंत की छवियों को प्राप्त करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं। माउस आंत को मल्टीफोटॉन लेजर में उजागर करके, एक एकल या एकाधिक क्रिप्ट (ओं) का नुकसान स्थानीय रूप से प्रेरित होता है। महीनों से क्षतिग्रस्त क्षेत्र को बार-बार इमेजिंग करके, आंतों की वसूली की वास्तविक समय की गतिशीलता को कैप्चर किया जाता है।

Abstract

विवो में आंतों की वसूली की जांच करना एक उत्तम तकनीकी चुनौती है। अनुदैर्ध्य इमेजिंग प्रोटोकॉल की कमी ने कोशिका और ऊतक पैमाने की गतिशीलता में गहरी अंतर्दृष्टि को रोका है जो आंतों के उत्थान को व्यवस्थित करता है। यहां, हम एक इंट्रावाइटल माइक्रोस्कोपी विधि का वर्णन करते हैं जो स्थानीय रूप से एकल क्रिप्ट पैमाने पर ऊतक क्षति को प्रेरित करता है और जीवित चूहों में आंतों के उपकला की पुनर्योजी प्रतिक्रिया का पालन करता है। एकल क्रिप्ट या बड़े आंतों के क्षेत्रों को एक उच्च तीव्रता वाले मल्टीफोटॉन इन्फ्रारेड लेजर द्वारा समय और अंतरिक्ष-नियंत्रित तरीके से अलग किया गया था। बाद में दीर्घकालिक दोहराव वाले इंट्रावाइटल इमेजिंग ने समय के साथ क्षतिग्रस्त क्षेत्रों की ट्रैकिंग को सक्षम किया और कई हफ्तों की अवधि में ऊतक वसूली के दौरान क्रिप्ट गतिशीलता की निगरानी के लिए अनुमति दी। लेजर-प्रेरित क्षति पर पड़ोसी ऊतक में क्रिप्ट विखंडन, संलयन और गायब होने जैसी क्रिप्ट रीमॉडेलिंग घटनाएं देखी गईं। यह प्रोटोकॉल होमियोस्टैटिक और पैथोफिजियोलॉजिकल सेटिंग्स, जैसे उम्र बढ़ने और ट्यूमर दीक्षा दोनों में क्रिप्ट गतिशीलता के अध्ययन को सक्षम बनाता है।

Introduction

आंत के उपकला अस्तर को लगातार गैस्ट्रिक एसिड, विषाक्त पदार्थों और माइक्रोबायोटा द्वारा चुनौती दी जाती है जो उपकला बाधा के विघटन का कारण बन सकती है। आंतों की संरचना और ऊतक संगठन लगातार आत्म-नवीनीकरण और क्षति की मरम्मत के लिए विशिष्ट हैं। छोटी आंत के एकल-स्तरित उपकला को क्रिप्ट-विलस इकाइयों1 में व्यवस्थित किया जाता है। होमियोस्टैसिस में, क्रिप्ट के आधार पर रहने वाली एलजीआर 5 + आंतों की स्टेम कोशिकाएं विभेदित संतान को जन्म देती हैं। विभेदित बेटी कोशिकाएं एक कन्वेयर बेल्ट फैशन में विलस अक्ष के सिरे तक जाती हैं, जहां उन्हें बहा दिया जाता है ताकि आंतों के अस्तर को 3-5 दिनों में फिर से भर दिया जाए। लंबी अवधि में, सभी Lgr5+ कोशिकाएं ऊतक नवीकरण में समान रूप से योगदान नहीं करती हैं, क्योंकि यह क्रिप्ट (यानी, प्रतिगामी आंदोलन) 4,5 के आधार की ओर कन्वेयर बेल्ट के खिलाफ आगे बढ़ने के लिए कोशिकाओं की क्षमता पर भी निर्भर करता है। दरअसल, एलजीआर 5 + कोशिकाओं के पृथक्करण पर, उदाहरण के लिए, विकिरण, क्रिप्ट के आधार के बाहर पूर्वज कोशिकाएं स्टेम सेल पूल 6,7,8 को अलग करने और फिर से भरने के लिए आधार में चली जाती हैं।

तीव्र सूजन Lgr5+ स्टेम कोशिकाओं 9,10 के नुकसान का कारण बन सकती है। स्टेम सेल हानि के अलावा, कई बाहरी कारक क्रिप्ट स्केल पर एपिथेलियम को तीव्र नुकसान पहुंचा सकते हैं। विकिरण, रासायनिक उपचार और एंटीबायोटिक दवाओं को आंतों के क्रिप्ट और विली11 को घायल करने के लिए दिखाया गया है। क्रिप्ट्स और विली के बड़े क्षेत्र बैक्टीरिया, वायरल और परजीवी संक्रमण से प्रभावित हो सकतेहैं। आंत में क्रिप्ट विखंडन (एक क्रिप्ट का दो में विभाजन) 13 द्वारा क्रिप्ट स्केल पर आंतरिक और बाहरी क्षति से उबरने की उल्लेखनीय क्षमता होती है। घायल होने पर, क्षति से सटे क्षेत्र में क्रिप्ट क्रिप्ट संख्याओं को फिर से भरने के लिए विखंडन से गुजरते हैं। यह घटना भी होती है, हालांकि कुछ हद तक, होमियोस्टेसिस 14,15 के दौरान। होमियोस्टैसिस के दौरान क्रिप्ट संख्या में संभावित वृद्धि को संतुलित करने के लिए, क्रिप्ट्स फ्यूज (दो क्रिप्ट को एक में विलय) 16,17 भी कर सकते हैं। क्या क्रिप्ट फ्यूजन घायल होने के बाद क्रिप्ट नंबरों को फिर से स्थापित करने में भी भूमिका निभाता है, यह अज्ञात है। इसके अलावा, इस प्रक्रिया की गतिशीलता और नियामक कारकों को स्पष्ट किया जाना बाकी है।

विवो में ऊतक पुनर्जनन का अध्ययन करने के लिए चोट मॉडल अपरिहार्य हैं। आंतों के ऊतक पुनर्जनन का अध्ययन करने के लिए विभिन्न चोट मॉडल का उपयोग किया गया है। पिछली प्रयोगात्मक रणनीतियों ने चूहों में पुरानी और तीव्र कोलाइटिस और क्रिप्ट हानि को प्रेरित करने के लिए स्टेम सेल पूल 18 या डेक्सट्रान सल्फेट सोडियम (डीएसएस) के साथ उपचार के लिए उच्च खुराक विकिरण का उपयोगकिया। आनुवंशिक या ऑप्टिक साधनों द्वारा एकल-कोशिका पृथक्करण का उपयोग ऊतक क्षति को परिष्कृत करने के लिए किया गया है और स्टेम और पूर्वज कोशिकाओं21,22 की भूमिका को अलग करने और संवहनी पुनर्जनन 23 का अध्ययन करने के लिए एक आकर्षक उपकरण माना जाताहै। इसके अतिरिक्त, कई क्रिप्ट्स और विली24 के बड़े क्षेत्रों में क्षति को प्रेरित करने के लिए एक बायोप्सी-चोट प्रणाली विकसित की गई है। महत्वपूर्ण रूप से, हानिकारक अपमान की प्रतिक्रिया आंत के समीपस्थ-डिस्टल अक्ष के साथ भिन्न हो सकती है, जैसा कि विकिरण के लिए बताया गया है, जिसने बृहदान्त्र25 की तुलना में छोटी आंत में अधिक नुकसान पहुंचाया। यह लक्षित तरीकों की आवश्यकता पर प्रकाश डालता है जो हानिकारक अपमान की सीमा और आंतों के पथ में इसके स्थानीयकरण दोनों को नियंत्रित करते हैं।

क्षति की सीमा और वसूली का मूल्यांकन पारंपरिक रूप से स्थिर साधनों द्वारा किया गया है, जो ऊतक वसूली की गतिशीलता के बारे में सीमित जानकारी प्रदान करते हैं। इंट्रावाइटल माइक्रोस्कोपी (आईवीएम) ने कई अंगों 26,27,28,29,30 में स्टेम सेल व्यवहार, उपकला रीमॉडेलिंग और पुनर्जनन को मापने के लिए अद्वितीय अवसर खोले हैं, और आंतों के जीव विज्ञान 4,5,21,31,32,33,34 में प्रभावशाली अंतर्दृष्टि प्रदान की है। 35,36.

यहां, हम स्थानिक-परिभाषित आंतों की क्षति का कारण बनने और आंतों के उपकला अस्तर की वसूली को पकड़ने के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं। हम आंतों के क्रिप्ट को नुकसान पहुंचाने के लिए दो फोटॉन-आधारित लेजर एब्लेशन का उपयोग करते हैं और दोहराए जाने वाले इंट्रावाइटल माइक्रोस्कोपी द्वारा तत्काल घाव प्रतिक्रिया और दीर्घकालिक वसूली का पालन करते हैं। हमारा प्रोटोकॉल स्थानीय ऊतक क्षति के जवाब में आंतों के ऊतक वास्तुकला के पुनर्योजी रीमॉडेलिंग को मैप करने की अनुमति देता है। विखंडन और संलयन घटनाओं सहित क्रिप्ट गतिशीलता को आसानी से परिमाणित किया जा सकता है और समय के साथ ट्रैक किया जा सकता है। लेजर एब्लेशन और दोहराए जाने वाले इंट्रावाइटल इमेजिंग के आवेदन का उपयोग होमोस्टेसिस और पैथोफिज़ियोलॉजी के दौरान आंतों की वास्तुकला के ऊतक-पैमाने की गतिशीलता की जांच करने के लिए एक मंच के रूप में किया जा सकता है, जैसे कि ट्यूमर दीक्षा।

Protocol

इस अध्ययन में वर्णित सभी पशु प्रयोगों को नीदरलैंड कैंसर संस्थान (एनकेआई) के पशु कल्याण निकाय (एडब्ल्यूबी) के दिशानिर्देशों और अनुमोदन के अनुसार किया गया था।

नोट: किसी भी पशु प्रयोगों को करने से पहले संस्थान की पशु नैतिकता समिति से परामर्श करें।

1. सर्जरी और इंट्रावाइटल इमेजिंग की तैयारी

  1. पूर्व शल्य चिकित्सा उपचार
    1. 8-12 सप्ताह के K19-CreERT237 को प्रेरित करें: Rosa26-mTmG38 और Lgr5eGFP-IRES-CreERT218: रोसा 26-कॉन्फेट्टी39 चूहों को सर्जरी से 4-6 सप्ताह पहले सूरजमुखी के तेल में घुले टैमोक्सीफेन को इंजेक्ट करके (चित्रा 1)।
    2. एनाल्जेसिया लगाएं। सर्जरी से 30 मिनट पहले 200 μL ब्यूप्रेनोर्फिन (0.1 मिलीग्राम / किग्रा शरीर का वजन) NaCl में 0.9% प्रति 30 ग्राम माउस को पतला इंजेक्ट करें। सर्जरी से 24 घंटे पहले 125 एमएल गैर-अम्लीय ऑटोक्लेव पेयजल वाली बोतल में कारप्रोफेन (0.067 मिलीग्राम / एमएल) का प्रबंधन करें। वैकल्पिक रूप से, सर्जरी शुरू होने से 30 मिनट पहले चमड़े के नीचे (5 मिलीग्राम / किग्रा) एक कारप्रोफेन इंजेक्शन का प्रबंधन करें।
  2. सर्जरी की तैयारी
    1. बायोहाजार्ड कैबिनेट में आटोक्लेव बाँझ सर्जिकल उपकरण पेश करें।
    2. हीटिंग पैड चालू करें और तापमान को 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें।
  3. इंट्रावाइटल इमेजिंग के लिए तैयारी
    1. तापमान स्थिरीकरण के लिए पर्याप्त समय की अनुमति देने के लिए इमेजिंग से कम से कम 4 घंटे पहले माइक्रोस्कोप के तापमान-नियंत्रित कक्ष को चालू करें।
      नोट: आवश्यक समय उपयोग की गई मशीन के आधार पर भिन्न हो सकता है।
    2. जलवायु कक्ष के अंदर तापमान को 37 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर रखें।
    3. दो-फोटॉन माइक्रोस्कोप, स्कैनर और लेजर चालू करें।
    4. इमेजिंग सॉफ्टवेयर लॉन्च करें।
    5. लेजर की तरंग दैर्ध्य को 960 एनएम तक ट्यून करें और शटर खोलें।

2. सर्जरी और इंट्रावाइटल इमेजिंग

  1. आंत का सर्जिकल एक्सपोजर
    1. 2% -3% आइसोफ्लुरेन का उपयोग करके माउस को एनेस्थेटाइज करें और इसे बाँझ कपड़े से ढके हीटिंग पैड पर रखें। श्वास की आवृत्ति और गुणवत्ता (एक सांस / सेकंड) का आकलन करके और माउस के रिफ्लेक्स की जांच करके संज्ञाहरण की गहराई की जांच करें।
    2. माउस की आंखों को आंखों के मलहम के साथ कवर करें।
    3. चमड़े के नीचे 200 μL पूर्व-गर्म बाँझ खारा इंजेक्ट करें।
    4. पेट को शेव करें और बालों को हटा दें। सर्जिकल क्षेत्र में बाँझ कपड़े को बदलें।
    5. माउस के तापमान की निगरानी के लिए एक रेक्टल जांच डालें।
      नोट: तापमान लगभग 37 डिग्री सेल्सियस होना चाहिए।
    6. बाँझ दस्ताने की एक नई जोड़ी डालें।
    7. सर्जिकल क्षेत्र को एंटीसेप्टिक घोल के वैकल्पिक स्क्रब के साथ एक गोलाकार तरीके से साफ करें, जिसके बाद 80% इथेनॉल तीन बार करें। एक बाँझ कपास के फाहे के साथ अतिरिक्त इथेनॉल निकालें।
      नोट: इस बिंदु पर हाइपोथर्मिया के लिए माउस की निगरानी करना महत्वपूर्ण है।
    8. माउस को बाँझ सर्जिकल ड्रेप के साथ कवर करें।
    9. माउस के रिफ्लेक्स की जांच करें।
    10. बाँझ स्केलपेल का उपयोग करके त्वचा के माध्यम से ~ 10 मिमी ऊर्ध्वाधर मध्य रेखा चीरा लगाएं।
    11. रेक्टस एब्डोमिनिस मांसपेशियों को अलग करने और पेट को खोलने के लिए कैंची का उपयोग करके लिनिया अल्बा को इंजेक्ट करें।
    12. बाँझ पूर्व-गर्म खारा में भिगोए गए बाँझ कपास स्वैब का उपयोग करके माउस के सेकुम का पता लगाएं ताकि इसे संदर्भ बिंदु के रूप में उपयोग किया जा सके।
    13. बाँझ धुंध के एक टुकड़े में एक छोटा सा कट बनाएं, इसे पहले से गर्म बाँझ खारा में गीला करें, और इसे चीरा के ऊपर रखें।
    14. आंत को बाँझ कपास के स्वैब के साथ बाहर निकालें, जो पहले से गर्म बाँझ खारे में भिगोए हुए हैं। बाँझ पूर्व-गर्म खारा जोड़कर आंत को हाइड्रेटेड रखें।
    15. माउस के बगल में एक बाँझ कस्टम-निर्मित इमेजिंग कक्ष रखें।
    16. माउस को पहले से गरम बाँझ इमेजिंग बॉक्स में स्थानांतरित करें।
    17. इमेजिंग बॉक्स के बाँझ ग्लास पर आंत रखें। माउस के सिर को इमेजिंग बॉक्स के इनहेलेशन ट्यूब के अंदर रखें, जैसा कि चित्र 1 में दिखाया गया है।
    18. यदि आवश्यक हो, तो बाँझ लचीली फिल्म और टेप के साथ माउस को सुरक्षित करें।
    19. माइक्रोस्कोप कक्ष में माउस युक्त इमेजिंग बॉक्स रखें।
  2. इंट्रावाइटल इमेजिंग
    1. हर 15 मिनट में एक रेक्टल जांच के माध्यम से श्वास और तापमान की आवृत्ति और गहराई की जांच करके इमेजिंग के दौरान माउस की निगरानी करें। आइसोफ्लुरेन का प्रतिशत 1% -2% के बीच रखा जाना चाहिए। यदि आवश्यक हो तो समायोजित करें।
    2. माइक्रोस्कोप के आईपीस का उपयोग करके आंत में एक क्षेत्र खोजें।
    3. माइक्रोस्कोप के आंतरिक कैमरे का उपयोग करके रुचि के क्षेत्र का एक विस्तृत क्षेत्र दृश्य प्राप्त करें, जैसा कि चित्र 2 ए में देखा गया है।
    4. मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोप के 960 एनएम लेजर का उपयोग करके रुचि के क्षेत्र की छवि। प्रयोग में प्रयुक्त फ्लोरोफोरे के अनुसार लेजर शक्ति और तरंग दैर्ध्य को समायोजित करें।
    5. रुचि के क्षेत्र के 3 μm का 10-20 चरण z-स्टैक प्राप्त करें।
  3. लेजर एब्लेशन
    1. पहले चित्रित टाइल से एक एकल स्थिति या कई स्थान चुनें।
    2. इमेजिंग सॉफ्टवेयर में ब्लीच पॉइंट कैलिब्रेशन फ़ंक्शन का उपयोग 32 और 124 x 124 पिक्सेल रिज़ॉल्यूशन के ज़ूम पर स्कैन गति 400 हर्ट्ज के साथ करें, 3-10 सेकंड के लिए द्विदिश स्कैनिंग गुण का उपयोग करके, नुकसान के आकार के आधार पर। क्रिप्ट क्षेत्र में क्षति की शुरुआत को हरे और लाल दोनों चैनलों में ऑटोफ्लोरेसेंस में वृद्धि से पहचाना जा सकता है।
    3. एक ही माउस में कई क्षेत्रों के लिए पिछले दो चरणों को दोहराएँ।
    4. पृथक्करण के बाद, क्षति के स्थान और सीमा की पुष्टि करने के लिए क्षतिग्रस्त क्षेत्रों के जेड-स्टैक प्राप्त करें।
  4. सर्जिकल साइट को बंद करना
    1. माउस को, एनेस्थीसिया के तहत, एक बाँझ व्याख्यान क्षेत्र में रखें।
    2. पहले से गर्म बाँझ खारे में भिगोए गए बाँझ कपास के स्वैब का उपयोग करके उजागर आंत को पेट में वापस डालें।
    3. एक अवशोषक 5-0 सीवन का उपयोग करके एक सरल निरंतर सीवन का प्रदर्शन करके लिनिया अल्बा को सीवन करें। सर्जिकल गांठों के साथ सीवन के छोरों को बंद करें।
    4. त्वचा की परत के साथ एक ही चरण दोहराएं।
    5. आइसोफ्लुरेन स्टेशन को बंद करें और इमेजिंग बॉक्स और इनले को साफ और निष्फल करें।
    6. सर्जिकल इंस्ट्रूमेंट क्लीनर, एंजाइमैटिक क्लीनर और सर्जिकल इंस्ट्रूमेंट लुब्रिकेंट के साथ सर्जरी टूल्स को साफ करें। सूखने पर, ऑटोक्लेव में सर्जरी बॉक्स के साथ सर्जरी के उपकरणों को निष्फल करें।
  5. सर्जरी के बाद की देखभाल
    1. माउस को सर्जरी से ठीक होने दें जबकि पिंजरे को ~ 1 घंटे के लिए हीटिंग पैड पर रखा जाता है।
      नोट: यदि संभव हो तो माउस को अन्य पिंजरे के साथियों के साथ रखें। वसूली के लिए एकान्त आवास आवश्यक नहीं है।
    2. वसूली के दौरान हर 15 मिनट में माउस के तापमान की जांच करें।
    3. सर्जरी के बाद 6-12 घंटे तक 200 μL ब्यूप्रेनोर्फिन (0.1 मिलीग्राम / किग्रा शरीर का वजन) NaCl 0.9% प्रति 30 ग्राम माउस में पतला इंजेक्ट करें।
    4. सर्जरी के बाद 72 घंटे के लिए 125 एमएल गैर-अम्लीय ऑटोक्लेव पेयजल वाली बोतल में कारप्रोफेन (0.067 मिलीग्राम / एमएल) का उपयोग करें।
    5. माउस का वजन करें और सर्जरी के बाद 1 सप्ताह के लिए हर दिन कल्याण की निगरानी करें।

3. दोहराए जाने वाले सर्जरी और इंट्रावाइटल इमेजिंग

  1. शल्यचिकित्सा
    1. दूसरे समय बिंदु पर (पहले इमेजिंग सत्र के कम से कम 1 सप्ताह बाद), चरण 1.1.2, 1.2, 1.3 और 2.1 दोहराएं।
  2. इंट्रावाइटल इमेजिंग
    1. चरण 2.2.1-2.2.3 दोहराएँ।
    2. पहली बार बिंदु पर चित्रित रुचि के समान क्षेत्रों को खोजने के लिए रक्त वाहिकाओं के पैटर्न का उपयोग करें।
    3. चरण 2.2.4 और 2.2.5 दोहराएँ।
  3. सर्जिकल साइट को बंद करना
    1. चरण 2.4.1 दोहराएँ।
    2. यदि माउस को किसी अन्य समय बिंदु पर चित्रित नहीं किया जाना है, तो टर्मिनल संज्ञाहरण के तहत ग्रीवा अव्यवस्था करके माउस का त्याग करें। अन्यथा, अगले चरण के साथ जारी रखें।
      नोट: यूरोपीय संघ के निर्देश 2010/63 / ईयू, परिशिष्ट IV के दिशानिर्देशों के अनुसार, गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था एक स्वीकार्य विधि है।
    3. चरण 2.4.2-2.4.6 दोहराएँ।
  4. सर्जरी के बाद की देखभाल
    1. चरण 2.5.1-2.5.5 दोहराएँ।

Representative Results

इंट्रावाइटल इमेजिंग के साथ संयुक्त लेजर एब्लेशन विधि से प्राप्त किए जा सकने वाले परिणामों के प्रकार को प्रदर्शित करने के लिए, हमने चित्रा 1 में दिखाए गए अनुसार एक प्रयोग किया। सबसे पहले, हमने K19-CreERT2;mTmG (K19cre-mTmG) और Lgr5eGPP-IRES-CreERT2 को इंजेक्ट किया; रोसा 26-कॉन्फेट्टी (Lgr5cre-Confetti) चूहों को टैमोक्सीफेन के साथ स्टोकेस्टिक रूप से कोशिकाओं को कॉन्फेट्टी रंगों (या mTmG चूहों के मामले में हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन [GFP]) में से एक के साथ स्टोकेस्टिक रूप से लेबल किया जाता है। K19-cre सभी उपकला कोशिकाओं से वंश अनुरेखण को प्रेरित करता है, जबकि Lgr5-cre स्टेम कोशिकाओं से केवल 8,18,37 ट्रेसिंग को प्रेरित करता है। टैमोक्सीफेन इंजेक्शन को सर्जरी से 4-6 सप्ताह पहले प्रशासित किया गया था और क्रिप्ट प्राप्त करने के लिए पहला इमेजिंग सत्र जिसमें सभी कोशिकाएं एक निश्चित रंग के लिए मोनोक्लोनल होती हैं। समय के साथ एक ही क्रिप्ट के भाग्य को ट्रैक करने के लिए कई हफ्तों में एक ही ऊतक क्षेत्रों की मजबूत पहचान आवश्यक है। अंतर्निहित ऊतक वास्तुशिल्प विशेषताएं, जैसे वाहिका, विश्वसनीय ऊतक स्थलों के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, और यहां माइक्रोस्कोप के आंतरिक कैमरे के साथ रिकॉर्ड किया गया था। इसके अलावा, (कम से कम दो) अलग-अलग रंगों के साथ क्रिप्ट के एक छोटे से अंश को लेबल करने से प्रत्येक इमेजिंग सत्र में एक ही क्रिप्ट को पहचानने और लेजर क्षति के बाद पुनर्योजी प्रक्रिया के दौरान उनके व्यवहार का पालन करने में मदद मिली। शल्य चिकित्सा द्वारा माउस की आंत को उजागर करने और रुचि के क्षेत्र (चित्रा 2 ए) के कैमरा और फ्लोरोसेंट छवियों दोनों को प्राप्त करने पर, मल्टीफोटॉन लेजर की ब्लीच पॉइंट सेटिंग्स का उपयोग एक या अधिक क्रिप्ट (चित्रा 2 बी, सी) को हटाने के लिए किया जा सकता है। क्षति की शुरुआत को हरे और लाल दोनों चैनलों में ऑटोफ्लोरेसेंस में वृद्धि से पहचाना जा सकता है। क्रिप्ट रिकवरी की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए, सर्जरी और इमेजिंग प्रक्रिया को पहले इमेजिंग सत्र के हफ्तों / महीनों बाद दोहराया गया था और ऊतक अंतर्निहित संरचनाओं (वाहिका और क्लोनल रूप से लेबल किए गए क्रिप्ट के पैटर्न) को चोट के ठीक उसी स्थान को खोजने के लिए लैंडमार्क के रूप में उपयोग किया गया था (चित्रा 2)। जब इस विधि को Lgr5Cre-Confetti चूहों में लागू किया गया था, जहां Lgr5-eGFP को पैची तरीके से व्यक्त किया जाता है, तो लेजर-प्रेरित क्षति के बाद क्रिप्ट संख्याओं और आकृतियों में परिवर्तन को कैप्चर किया जा सकता है (चित्रा 3)। जबकि कुछ क्षेत्रों ने क्रिप्ट्स की संख्या और संरचना में कोई बदलाव नहीं दिखाया (चित्रा 3 बी), अन्य क्षेत्रों ने व्यापक क्रिप्ट रीमॉडेलिंग दिखाया, जैसा कि क्रिप्ट विखंडन और संलयन घटनाओं (चित्रा 3 सी) की संख्या और लेजर-प्रेरित चोट (चित्रा 3 डी) के 2 सप्ताह बाद क्रिप्ट के नुकसान में देखा गया है। क्षति के विभिन्न आकारों को पेश करके और पृथक्करण के बाद विखंडन, संलयन और गायब होने की घटनाओं को निर्धारित करके, जैसा कि (चित्रा 3 ई) में दिखाया गया उदाहरण है, चोट-प्रेरित पुनर्जनन की गतिशीलता को विभिन्न माउस मॉडल में मैप किया जा सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: प्रयोगात्मक सेटअप का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। आंतों की कोशिकाओं के विवो लेबलिंग में आंतों के क्रिप्ट में क्रे-मध्यस्थता पुनर्संयोजन को प्रेरित करने के लिए आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस मॉडल में टैमोक्सीफेन इंट्रापरिटोनियल इंजेक्ट करके प्राप्त किया जाता है। दिनों या हफ्तों के बाद (जब क्रिप्ट एक निश्चित रंग के लिए मोनोक्लोनल होते हैं), आंत को शल्य चिकित्सा से उजागर किया जाता है और तापमान-नियंत्रित कक्ष के साथ मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके लेजर एब्लेशन के अधीन किया जाता है। क्रिप्ट क्षति की सीमा को एब्लेशन के तुरंत बाद विशेषता दी जाती है और माउस को प्रक्रिया से ठीक होने की अनुमति दी जाती है। बार-बार सर्जिकल एक्सपोजर और आईवीएम का उपयोग समय के साथ आंतों की वसूली की निगरानी के लिए किया जाता है। रक्त वाहिका और अलग-अलग रंग के क्रिप्ट के पैटर्न और वितरण का उपयोग पृथक्करण के हफ्तों या महीनों बाद समान क्षेत्रों को वापस खोजने के लिए किया जाता है। क्रिप्ट रीमॉडेलिंग (जैसे, विखंडन या संलयन) को पृथक्करण के हफ्तों बाद क्षति स्थल पर देखा जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: आंत में लेजर-प्रेरित क्षति पर ऊतक पुनर्जनन की अनुदैर्ध्य इमेजिंग। जब आंत को ठीक उसी तरह से तैनात किया जाता है, तो आंत की रक्त वाहिकाओं को सटीक रूप से समान क्षेत्रों को खोजने और छवि बनाने के लिए मानचित्र के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। (ए) आंत की कैमरा अवलोकन छवियां। डैश्ड व्हाइट लाइनें क्षति की साइट (सफेद बॉक्स) के पड़ोसी वाहिका के पैटर्न का प्रतिनिधित्व करती हैं, जिसका उपयोग किसी अन्य समय बिंदु पर उसी लेजर-एब्लेटेड क्षेत्र को खोजने के लिए एक लैंडमार्क के रूप में किया जाता है। निचली दो छवियों में सफेद बॉक्स का ज़ूम-इन दृश्य दिखाई देता है। तीर दिन 1 और 1 महीने बाद लेजर एब्लेशन की सटीक साइट को दर्शाता है। (बी) मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोप द्वारा कैप्चर किए गए एकल क्रिप्ट क्षति की फ्लोरोसेंट छवियां। नीले बॉक्स में तीर दिन 1 और 1 महीने बाद क्षति की साइट दिखाता है। (सी) क्रिप्ट्स के क्षतिग्रस्त क्षेत्र की फ्लोरोसेंट छवियां। नीले बॉक्स में तीर दिन 1 और 1 महीने बाद क्षति के क्षेत्र को चिह्नित करते हैं। स्केल बार: 1 मिमी (ए, शीर्ष); 0.25 मिमी (ए, नीचे); 200 μm (बड़ा अवलोकन B और C); और 50 μm (ज़ूम की गई छवियां B और C)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: लेजर एब्लेशन के बाद क्रिप्ट भाग्य की इंट्रावाइटल इमेजिंग। (ए) कॉन्फेट्टी मॉडल का उपयोग करके, रिकवरी की गतिशीलता को मैप करने के लिए समय के साथ विभिन्न रंगों के साथ लेबल किए गए क्रिप्ट का पालन किया जा सकता है। सफेद तीर लेजर एब्लेशन की साइट को दर्शाता है। पीला बॉक्स एक पड़ोसी क्षेत्र (क्षति की साइट से <100 μm) का प्रतिनिधित्व करता है, जबकि नीले और बैंगनी बक्से लेजर-एब्लेटेड क्षेत्र से दूर (>100 μm) क्षेत्रों का प्रतिनिधित्व करते हैं। पुनर्जनन के विभिन्न तरीके देखे जाते हैं। (बी) कुछ क्षेत्र बैंगनी बॉक्स की तरह अपरिवर्तित रहते हैं। (सी) अन्य क्षेत्र क्रिप्ट विखंडन या संलयन के रूप में क्रिप्ट रीमॉडेलिंग का प्रदर्शन करते हैं; धराशायी सफेद रेखाएं और तीर क्रिप्ट विखंडन घटनाओं को दर्शाते हैं और नारंगी डैश्ड लाइनें और तीर क्रिप्ट संलयन घटनाओं को दर्शाते हैं। (डी) कुछ क्षेत्रों में, क्रिप्ट गायब होते देखा जाता है, जैसे कि पीले बॉक्स में जहां एक नारंगी डैश लाइन के साथ हाइलाइट किया गया क्रिप्ट गायब हो गया। (E) क्षति स्थल के आस-पास के क्षेत्रों (यानी, 100 μm से कम) और दूर (यानी, 100 μm से अधिक) में देखी गई क्रिप्ट रीमॉडेलिंग घटनाओं की संख्या को दर्शाने वाला एक उदाहरण परिमाणीकरण। स्केल सलाखों: 200 μm (A); 50 μm (B-D)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

यह प्रोटोकॉल सूक्ष्म लेजर एब्लेशन और अनुदैर्ध्य इंट्रावाइटल माइक्रोस्कोपी को जोड़ता है ताकि दीर्घकालिक ऊतक रीमॉडेलिंग के लिए प्रारंभिक क्षति प्रतिक्रिया से आंतों के पुनर्जनन का पालन किया जा सके। तकनीक को माइक्रोस्कोपिक लेजर एब्लेशन को प्रेरित करने और छवि बनाने के लिए नैतिक विचारों के सख्त पालन में स्थापित किया गया है, और जब ठीक से पालन किया जाता है तो पशु कल्याण को बनाए रखा जाएगा। सर्जरी के दौरान, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि आंत की अखंडता अच्छी तरह से संरक्षित है। यह बाँझ गीले कपास स्वैब के साथ ऊतक को धीरे से संभालकर प्राप्त किया जा सकता है, जो ऊतक से रक्तस्राव या सूखने को रोकता है। लेजर-प्रेरित सूक्ष्म क्षति की सीमा को लेजर एब्लेशन के बाद क्षेत्र की विभिन्न आंतों की परतों की इमेजिंग करके सावधानीपूर्वक मूल्यांकन किया जाना चाहिए। यदि शोधकर्ता इस प्रोटोकॉल में वर्णित प्रयोगात्मक चरणों की आवृत्ति को अनुकूलित करना चाहता है, तो कल्याण पर परिणाम स्थापित करने के लिए प्रयोग से पहले संस्थान की पशु नैतिकता समिति से परामर्श किया जाना चाहिए।

दोहराए जाने वाले इंट्रावाइटल माइक्रोस्कोपी समय के साथ एक ही माउस में ऊतक वसूली की निगरानी करने की अनुमति देता है। आंत का बार-बार सर्जिकल एक्सपोजर आसानी से पूरे आंत्र पथ तक ऑप्टिकल पहुंच प्रदान करता है। ऊतक अंतर्निहित विशेषताएं, जैसे वाहिका, प्रत्येक इमेजिंग सत्र में समान आंतों के क्षेत्रों की पहचान करने के लिए मील के पत्थर के रूप में काम करती हैं। इस प्रकार, एक ही ऊतक क्षेत्र को कई हफ्तों में चित्रित किया जा सकता है, जो एक ही माउस में एक ही आंतों के क्षेत्र में दीर्घकालिक ऊतक पुनर्जनन को निर्धारित करने में सक्षम बनाता है। संयुक्त सर्जरी और इमेजिंग विधि द्वारा पेश किए गए स्थानिक नियंत्रण से यह लाभ मिलता है कि एक ही अंग को एक ही माउस में होमियोस्टैटिक और पुन: उत्पन्न करने वाली दोनों स्थितियों के तहत चित्रित किया जा सकता है, जो पिछले पूरे अंग क्षति मॉडल के विपरीत खड़ा है जहां नियंत्रण और पुन: उत्पन्न नमूने विभिन्न चूहों से उत्पन्न हुए 11,12,18,19,20 . इसलिए, हमारी प्रयोगात्मक सेटिंग प्रयोग के लिए आवश्यक जानवरों की आवश्यक संख्या को कम करती है और अंतर-पशु भिन्नता को कम करती है।

प्रोटोकॉल समस्या निवारण माउस और आंत हैंडलिंग तकनीक की समीक्षा और माइक्रोस्कोपी उपकरण और सेटिंग्स के नियंत्रण के साथ शुरू होना चाहिए। इस प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदम हैं जिन पर अतिरिक्त ध्यान देने की आवश्यकता है। सबसे पहले, पशु कल्याण और निरंतर उच्च डेटा गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए, सभी काम को सड़न रोकनेवाला तकनीक का उपयोग करके एक स्वच्छ बाँझ वातावरण में किया जाना चाहिए, और सर्जरी और प्रत्येक इमेजिंग सत्र के दौरान माउस तापमान बनाए रखा जाना चाहिए। इमेजिंग के दौरान ऊतक को बाँझ, पूर्व-गर्म खारा के साथ हाइड्रेटेड रखना आवश्यक है और ऊतक फाइब्रोसिस को रोकता है।

यह सुनिश्चित करने के लिए कि प्रयोग प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तरीके से किया जाता है, इष्टतम अधिग्रहण के लिए उपयोग करने से पहले लेजर को संरेखित करना और प्रत्येक सत्र की शुरुआत में मल्टीफोटॉन लेजर के पावर आउटपुट को मापना महत्वपूर्ण है। उद्देश्य के प्रकार, आवर्धन, आवास समय, लेजर शक्ति और तरंग दैर्ध्य जैसे मापदंडों का सूक्ष्म लेजर पृथक्करण की सीमा पर प्रभाव पड़ता है और इस पर विचार किया जाना चाहिए। इस अध्ययन में, लेजर एब्लेशन और इमेजिंग दोनों को 1.2 डब्ल्यू (लेंस से बाहर) की लेजर शक्ति के साथ 960 एनएम तरंग दैर्ध्य पर फ्लूटार वीआईएसआईआर 25x / 0.95 जल उद्देश्य के माध्यम से आयोजित किया जाता है। तरंगदैर्ध्य या ऑप्टिकल स्कैनिंग गुणों को बदलना सूक्ष्म क्षति की सीमा को प्रभावित करता है। एक कम तरंगदैर्ध्य (जैसे 840 एनएम) उच्च ऊर्जा फोटॉन में अनुवाद करता है और अक्सर लेजर के उच्च उत्पादन में, और सूक्ष्म क्षति को बढ़ा सकता है। एक उच्च ज़ूम के परिणामस्वरूप प्रति क्षेत्र अधिक ऊर्जा होती है, और इसलिए क्रिप्ट्स को हटाने के लिए कम समय होता है, और इसके विपरीत। एब्लेशन की गति और क्षति की सीमा को बदलने के लिए पिक्सेल निवास समय को बढ़ाया या घटाया जा सकता है। जब छवि ऊतक स्थिर नहीं होता है (उदाहरण के लिए, पेरिस्टालिक आंदोलनों के कारण), पृथक्करण को तेजी से करने की आवश्यकता होती है। इस उद्देश्य के लिए, एब्लेशन की गति को अनुकूलित किया जाना चाहिए, उदाहरण के लिए, ज़ूम और / या लेजर आउटपुट में वृद्धि।

कई इमेजिंग सत्रों में एक ही आंतों के क्षेत्र को खोजना एक और महत्वपूर्ण कदम है जिसे प्रयोग की सफलता सुनिश्चित करने के लिए ठीक से निष्पादित करने की आवश्यकता है। ऐसा करने के लिए, आंत को हर समय बिंदुओं पर ठीक उसी तरीके से तैनात करने की आवश्यकता होती है। हम हमेशा छोटी और बड़ी आंत में समान क्षेत्रों को खोजने के लिए एक संदर्भ बिंदु के रूप में सेकुम का उपयोग करने की सलाह देते हैं। कपास के स्वैब के साथ रुचि के ऊतक को धीरे-धीरे खींचना यह सुनिश्चित करता है कि रुचि का क्षेत्र उद्देश्य कार्य दूरी की सीमा में है और उन क्षेत्रों की संख्या को अधिकतम करता है जिन्हें वापस पता लगाया जा सकता है। इसके अलावा, हम हमेशा प्रत्येक माउस में कई सूक्ष्म पदों को हटाने और छवि बनाने की सलाह देते हैं ताकि उन क्षेत्रों को ध्यान में रखा जा सके जिन्हें बाद के इमेजिंग सत्र में वापस स्थानीयकृत नहीं किया जा सकता है। यदि क्षेत्रों को नहीं पाया जा सकता है, भले ही आंत की स्थिति सही है, यह माउस को पुनर्स्थापित करने और उजागर क्षेत्र के अभिविन्यास को बदलने में मदद कर सकता है। समय के साथ क्रिप्ट्स को ट्रैक करना प्रयोगों के लिए बोझिल हो सकता है जहां कई आसन्न क्रिप्ट्स के बड़े आंतों के क्षेत्रों को हटा दिया जाता है। इस तरह के हानिकारक अपमान उपकला मोनोलेयर से परे ऊतक रीमॉडेलिंग पैदा कर सकते हैं, जो समय के साथ क्षेत्र की ट्रैकिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले ऊतक स्थलों के संशोधन में समाप्त हो सकता है। क्षतिग्रस्त साइट के लिए पर्याप्त दूरी पर स्थलों का चयन करना और दृश्य के बड़े क्षेत्रों को कैप्चर करना जो क्षतिग्रस्त क्षेत्र को कई सौ माइक्रोमीटर से पार करते हैं, सफल दीर्घकालिक प्रयोगों की संभावना को बढ़ाते हैं। माइक्रोस्कोप चरण पर आंत की गलत स्थिति के अलावा, जठरांत्र संबंधी मार्ग के पेरिस्टालिक आंदोलन इमेजिंग में हस्तक्षेप कर सकते हैं। इस समस्या को दो तरीकों से सुधारा जा सकता है। यदि आंदोलनों की आवृत्ति बहुत अधिक नहीं है, तो प्रक्रिया को एक ही क्षेत्र में बढ़े हुए जोखिम समय के साथ दोहराया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, एनेस्थीसिया की उच्च मात्रा का उपयोग पेरिस्टलोसिस को कम करने के लिए किया जा सकता है। हम आइसोफ्लुरेन की उच्च खुराक को छोटे समायोजन तक सीमित करने की सलाह देते हैं। कुल मिलाकर, इमेजिंग सत्रों को तेजी से वसूली सुनिश्चित करने के लिए 3 घंटे से कम, जितना संभव हो उतना छोटा रखा जाना चाहिए।

अन्य क्षति मॉडल की तुलना में संयुक्त लेजर एब्लेशन और अनुदैर्ध्य इंट्रावाइटल माइक्रोस्कोपी दृष्टिकोण के कई फायदे हैं। पिछले (रासायनिक) क्षति मॉडल में हानिकारक अपमान 6,11,12,19,20 को स्थानीय रूप से सीमित करने की क्षमता का अभाव था। लेजर एब्लेशन हित के परिभाषित क्षेत्र में नुकसान को सीमित करके इस कमी को दूर करता है। यह शोधकर्ताओं को चोट के स्थान को नियंत्रित करने में सक्षम बनाता है, साथ ही क्षति की सीमा भी। क्रिप्ट स्केल पर पुनर्योजी प्रतिक्रियाओं के बारे में सूचित करने के लिए क्षति की गंभीरता को क्रिप्ट या पूरे सूक्ष्म आंतों के क्षेत्रों को कम करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। स्थानिक नियंत्रण के अलावा, लेजर एब्लेशन भी क्षति की शुरुआत को ठीक से समय देने की अनुमति देता है, जिससे पिछली दवा, रासायनिक और संक्रमण मॉडल 9,10,11,12,19,20 की सटीकता को पार किया जा सकता है। हमारा प्रोटोकॉल पिछले अध्ययनों पर विस्तार करता है जो आंत21,23 में स्थानीय क्षति को प्रेरित करने के लिए एक विधि के रूप में लेजर-प्रेरित थर्मल एब्लेशन का उपयोग करते थे। पिछले लेजर-प्रेरित क्षति मॉडल ने छोटी आंत21 या डिस्टल कोलन23 की ल्यूमिनल सतह में स्थानीय क्षेत्रों को चित्रित किया। संयुक्त सर्जरी और लेजर एब्लेशन दृष्टिकोण एक उच्च रिज़ॉल्यूशन पर आंतों के उपकला (विशेष रूप से क्रिप्ट्स) की कल्पना करना संभव बनाता है, और छोटी आंत, सेकम और समीपस्थ बृहदान्त्र की किसी भी स्थिति में ऊतक वसूली की लेजर एब्लेशन और अनुवर्ती इमेजिंग करता है। यह समय के साथ एक ही आंतों के क्षेत्रों की वसूली को पकड़ता है, प्रयोगात्मक सेटअप के अनुसार आंत की विभिन्न परतों (म्यूकोसा, सबम्यूकोसा, मस्कुलरिस और सेरोसा) की कल्पना करने की अनुमति देता है। हमारी तकनीक मुख्य रूप से कई हफ्तों / महीनों की अवधि के लिए दीर्घकालिक दोहराई जाने वाली इमेजिंग के लिए तैयार की गई है। क्रिप्ट्स की अल्पकालिक वसूली गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए (उदाहरण के लिए, क्षति के बाद लगातार कई दिनों के लिए), यहां वर्णित लेजर एब्लेशन दृष्टिकोण को इंट्रावाइटल इमेजिंग विंडो 27,28,40 के साथ जोड़ा जा सकता है।

इस प्रोटोकॉल का उपयोग विभिन्न वैज्ञानिक क्षेत्रों से अनुसंधान अनुप्रयोगों की भीड़ के लिए किया जा सकता है जो पुनर्जनन, इम्यूनोलॉजी और कैंसर अनुसंधान का विस्तार करते हैं। आंतों के पुनर्जनन की अनुदैर्ध्य इमेजिंग सेलुलर गतिशीलता पर प्रकाश डालती है जो उपकला अखंडता और बाधा समारोह को संरक्षित करती है, आंतों के लुमेन में रोगजनकों के खिलाफ मेजबान रक्षा को सक्षम करती है, और जो ऑन्कोजेनिक उत्परिवर्तन की निकासी और प्रसार को रेखांकित करती है। प्रत्येक वैज्ञानिक प्रश्न लेजर-प्रेरित क्षति की सीमा और इमेजिंग की अवधि पर अद्वितीय मांग करेगा। फ्लोरोसेंट रिपोर्टर चूहे और इंजेक्शन रंग उस डेटा का काफी विस्तार और परिष्कृत कर सकते हैं जिसे किसी भी सेल और रुचि की संरचना के विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देकर प्राप्त किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, एक Lgr5-CreERt2: Rosa26-Confetti माउस का उपयोग स्टेम सेल संतानों की कल्पना करने के लिए किया जा सकता है, जबकि Rosa26-mTmG रिपोर्टर ऊतक वास्तुकला पर सूचित करता है। साथ में, ये हालिया तकनीकी प्रगति आंतों के जीव विज्ञान और बीमारी की हमारी समझ को आगे बढ़ाने के लिए इंट्रावाइटल आंतों के प्रयोग को एक आकर्षक उपकरण बनाती है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस अध्ययन को नीदरलैंड ऑर्गनाइजेशन ऑफ साइंटिफिक रिसर्च एनडब्ल्यूओ (जेवीआर को विसी अनुदान 09150182110004 और एचएएम को वेनी अनुदान 09150161910151), ओसीईएनडब्ल्यू द्वारा समर्थित किया गया था। GROOT.2019.085 (J.v.R के लिए), और एक EMBO पोस्टडॉक्टरल फैलोशिप (H.A.M को ALTF 452-2019 प्रदान करें)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anesthesia induction box Veterinary Technics
Autoclave Certoclav
Betadine Mylan 202809
Diaper (underpad) Absorin comfort
Dumont forceps Fine Scientific Tools 11255-20 or 11272-40 Inox, style #55, used to hold the peritoneum
Enzymatic instrument cleaner Roboz EC-1000
Ethanol 80% homemade NA
Eye ointment Duratears Z (Alcon) 288/28282-6
Fine Scissors Straight 9 cm Fine Scientific Tools 14060-09 Used to cut skin and peritoneum of the mouse
Gauze 5 cmX5 cm Cutisoft (Bsn medical) 45847-00
Graefe Forceps Curved Serrated Fine Scientific Tools 11051-10 Used to hold the skin
Hartman Hemostat Straight Fine Scientific Tools 13002-10 Used for suturing
Heating pad Comfort T5-5000
Imaging box Custom made
Incision film Nobafilm 172215
Inverted multi-photon microscope with automated stage Leica Microsystems NA
Isoflurane (vetflurane) Pharmachemie BV, Haarlem, Netherlands 305788
Isoflurane vaporizer Penlon sigma delta
Micropore paper tape Micropore
NaCl 0.9% Braun Other brands available
Needle 25G BD 300600
Paper tape tesa Tesa NA
Parafilm Bemis PM-994 semi-transparent tape
Razor blades Supermax stainless steel Other brands available
Rectal probe Kent Scientific 20250-91
Rimadyl Cattle (carprofen) Zoetis B.V Registration# REG NL 10130
Student Fine Scissors Straight 11.5 cm Fine Scientific Tools 91460-11 Used to cut gauze
Surgical instrument cleaner Roboz IC-1000
Surgical instrument lubricant Roboz IL-1000
Syringes (1 ml) BD 303172 Other brands available
Tamoxifen Sigma T5648
Temgesic (Buprenorphine hydrochloride) Indivior UK Limited/Reckitt Benckiser Healthcare Registration# RVG 08725
Vicryl polyglactin suture 5-0 FS-2 needle Ethicon V292ZH
VirkonS Bio-services antiseptic solution
Wooden cotton swab (sterile) Klinion 531530 Other brands available

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जीव विज्ञान अंक 196 लेजर एब्लेशन इंट्रावाइटल माइक्रोस्कोपी आंत पुनर्जनन क्षति क्रिप्ट रीमॉडेलिंग
आंतों के रीमॉडेलिंग का अध्ययन करने के लिए लेजर एब्लेशन और इंट्रावाइटल माइक्रोस्कोपी
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Laskaris, D., Azkanaz, M., de Vreij-Kruidenier, M. A., van Rijswoud-Ram, D., Messal, H. A., van Rheenen, J. Laser Ablation and Intravital Microscopy to Study Intestinal Remodeling. J. Vis. Exp. (196), e64756, doi:10.3791/64756 (2023).

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