Summary
Здесь мы представляем метод получения изображений кишечника при лазерно-индуцированном ранении. Подвергая кишечник мыши воздействию многофотонного лазера, локально индуцируется потеря одного или нескольких крипт. Многократная визуализация поврежденного участка в течение нескольких месяцев фиксирует динамику восстановления кишечника в режиме реального времени.
Abstract
Исследование восстановления кишечника in vivo - сложная техническая задача. Отсутствие протоколов продольной визуализации помешало более глубокому пониманию динамики клеточного и тканевого масштаба, которая организует регенерацию кишечника. Здесь мы описываем метод прижизненной микроскопии, который локально индуцирует повреждение тканей в масштабе одной крипты и следует за регенеративной реакцией кишечного эпителия у живых мышей. Одиночные крипты или более крупные кишечные поля удалялись высокоинтенсивным многофотонным инфракрасным лазером с контролем времени и пространства. Последующая долгосрочная повторяющаяся прижизненная визуализация позволила отслеживать поврежденные участки с течением времени и позволяла контролировать динамику крипт во время восстановления тканей в течение нескольких недель. События ремоделирования крипты, такие как деление, слияние и исчезновение крипты, наблюдались в соседних тканях при повреждении, вызванном лазером. Этот протокол позволяет изучать динамику крипт как в гомеостатических, так и в патофизиологических условиях, таких как старение и инициация опухоли.
Introduction
Эпителиальная оболочка кишечника постоянно подвергается воздействию желудочных кислот, токсинов и микробиоты, которые могут вызвать нарушение эпителиального барьера. Структура кишечника и организация тканей специализируются на постоянном самообновлении и восстановлении повреждений. Однослойный эпителий тонкой кишки организован в крипты-ворсинки1. В гомеостазе самообновляющиеся кишечные стволовые клетки Lgr5+, которые находятся у основания крипты, дают начало дифференцированному потомству. Дифференцированные дочерние клетки перемещаются к кончику оси ворсинок по конвейерной ленте, где они сбрасываются, так что слизистая оболочка кишечника пополняется через 3-5 дней 2,3. В долгосрочной перспективе не все Lgr5+ клетки в равной степени способствуют обновлению тканей, поскольку это также зависит от способности клеток двигаться против конвейерной ленты к основанию крипты (т.е. ретроградное движение)4,5. Действительно, при абляции клеток Lgr5+, например, радиацией, клетки-предшественники вне основания крипта перемещаются в основание для дедифференцировки и пополнения пула стволовых клеток 6,7,8.
Острое воспаление может привести к потере стволовых клеток Lgr5+ 9,10. Помимо потери стволовых клеток, многие внешние факторы могут вызвать острое повреждение эпителия в масштабе крипты. Было показано, что радиация, химическая обработка и антибиотики повреждают кишечные крипты и ворсинки11. Более крупные поля крипт и ворсинок могут быть поражены бактериальными, вирусными и паразитарными инфекциями12. Кишечник обладает замечательной способностью восстанавливаться после внутренних и внешних повреждений в масштабе крипты путем деления крипты (разделение одной крипты на две)13. При ранении склепы в области, прилегающей к урону, подвергаются делению для пополнения номеров склепов. Это явление также встречается, хотя и в меньшей степени, во время гомеостаза14,15. Чтобы уравновесить потенциальное увеличение количества крипт во время гомеостаза, крипты также могут сливаться (объединять две крипты в одну)16,17. Неизвестно, играет ли слияние крипт также роль в восстановлении номеров крипт после ранения. Кроме того, динамику и регуляторные факторы этого процесса еще предстоит выяснить.
Модели травм незаменимы для изучения регенерации тканей in vivo. Для изучения регенерации тканей кишечника использовались различные модели травм. В предыдущих экспериментальных стратегиях использовались высокие дозы радиации для истощения пулов стволовых клеток18 или лечение декстрансульфатом натрия (DSS), чтобы вызвать хронический и острый колит и потерю крипт у мышей19,20. Одноклеточная абляция генетическим или оптическим путем использовалась для уточнения повреждений тканей и считалась привлекательным инструментом для распутывания роли стволовых клеток и клеток-предшественников 21,22 и изучения сосудистой регенерации23. Кроме того, была разработана система биопсии, чтобы вызвать повреждение в больших полях нескольких крипт иворсинок 24. Важно отметить, что реакция на повреждающее оскорбление может варьироваться вдоль проксимально-дистальной оси кишечника, как сообщается для облучения, которое вызвало большее повреждение в тонкой кишке, чем в толстой кишке25. Это подчеркивает необходимость целенаправленных методов, которые контролируют как степень повреждающего поражения, так и его локализацию в кишечном тракте.
Степень повреждения и восстановление обычно оцениваются статическими средствами, которые дают ограниченную информацию о динамике восстановления тканей. Прижизненная микроскопия (IVM) открыла уникальные возможности для количественной оценки поведения стволовых клеток, ремоделирования эпителия и регенерации во многих органах 26,27,28,29,30 и дала впечатляющее представление о биологии кишечника 4,5,21,31,32,33,34, С. 35,36.
Здесь мы описываем метод, позволяющий вызвать пространственно-временное повреждение кишечника и зафиксировать восстановление эпителиальной оболочки кишечника. Мы используем двухфотонную лазерную абляцию для повреждения кишечных крипт и следим за немедленной реакцией на рану и долгосрочным восстановлением с помощью повторяющейся прижизненной микроскопии. Наш протокол позволяет отобразить регенеративное ремоделирование архитектуры кишечной ткани в ответ на локальное повреждение тканей. Динамика крипты, включая события деления и синтеза, может быть легко количественно определена и отслежена с течением времени. Применение лазерной абляции и повторяющейся прижизненной визуализации может быть использовано в качестве платформы для исследования динамики кишечной архитектуры в тканевом масштабе во время гомеостаза и патофизиологии, таких как инициация опухоли.
Protocol
Все эксперименты на животных, описанные в этом исследовании, были проведены в соответствии с руководящими принципами и одобрением Органа по защите животных (AWB) Нидерландского института рака (NKI).
ПРИМЕЧАНИЕ: Проконсультируйтесь с комитетом по этике животных института, прежде чем проводить какие-либо эксперименты на животных.
1. Подготовка к операции и прижизненная визуализация
- Предоперационное лечение
- Индуцируют 8-12-недельных мышей K19-CreERT237: Rosa26-mTmG 38 и Lgr5eGFP-IRES-CreERT218: Rosa26-Confetti39 мышей, вводя тамоксифен, растворенный в подсолнечном масле, внутрибрюшинно за 4-6 недель до операции (рис. 1).
- Применяют анальгезию. Введите 200 мкл бупренорфина (0,1 мг / кг массы тела), разбавленного NaCl 0,9% на 30 г мыши подкожно за 30 минут до операции. Вводят карпрофен (0,067 мг/мл) во флаконе, содержащем 125 мл неподкисленной автоклавной питьевой воды за 24 ч до операции. В качестве альтернативы можно ввести инъекцию карпрофена подкожно (5 мг / кг) за 30 минут до начала операции.
- Подготовка к операции
- Внедрите автоклавные стерильные хирургические инструменты в шкаф биологической опасности.
- Включите грелку и установите температуру 37 °C.
- Подготовка к прижизненной визуализации
- Включите камеру микроскопа с регулируемой температурой не менее чем за 4 часа до получения изображения, чтобы дать достаточно времени для стабилизации температуры.
ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимое время может варьироваться в зависимости от используемой машины. - Поддерживайте стабильную температуру внутри климатической камеры на уровне 37 °C.
- Включите двухфотонный микроскоп, сканер и лазер.
- Запустите программное обеспечение для обработки изображений.
- Настройте длину волны лазера на 960 нм и откройте затвор.
- Включите камеру микроскопа с регулируемой температурой не менее чем за 4 часа до получения изображения, чтобы дать достаточно времени для стабилизации температуры.
2. Хирургия и прижизненная визуализация
- Хирургическое облучение кишечника
- Обезболите мышь, используя 2%-3% изофлуран, и поместите ее на грелку, накрытую стерильной тканью. Проверьте глубину анестезии, оценив частоту и качество дыхания (один вдох/секунда) и проверив рефлекс мыши.
- Покройте глаза мыши глазной мазью.
- Вводят 200 мкл предварительно подогретого стерильного физиологического раствора подкожно.
- Побрейте живот и удалите волосы. Поменяйте стерильную ткань в хирургической области.
- Вставьте ректальный зонд, чтобы контролировать температуру мыши.
ПРИМЕЧАНИЕ: Температура должна быть примерно 37 °C. - Наденьте новую пару стерильных перчаток.
- Очистите операционную область круговым путем чередующимися скрабами с антисептическим раствором, а затем трижды втирайте 80% этанол. Удалите излишки этанола стерильным ватным тампоном.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе очень важно следить за мышью на предмет переохлаждения. - Накройте мышь стерильной хирургической простыней.
- Проверьте рефлекс мыши.
- Сделайте вертикальный разрез по средней линии ~ 10 мм через кожу с помощью стерильного скальпеля.
- Надрежьте белую линию ножницами, чтобы отделить прямые мышцы живота и открыть живот.
- Найдите слепую кишку мыши с помощью стерильных ватных тампонов, смоченных в стерильном предварительно подогретом физиологическом растворе, чтобы использовать его в качестве ориентира.
- Сделайте небольшой надрез в кусочке стерильной марли, смочите его в предварительно нагретом стерильном физиологическом растворе и поместите над разрезом.
- Извлеките кишечник стерильными ватными тампонами, смоченными в предварительно подогретом стерильном физиологическом растворе. Поддерживайте гидратацию кишечника, добавляя стерильный предварительно подогретый физиологический раствор.
- Поместите стерильную камеру визуализации, изготовленную на заказ, рядом с мышью.
- Переместите мышь в предварительно нагретую стерильную коробку для визуализации.
- Поместите кишечник на стерильное стекло коробки для визуализации. Поместите голову мыши внутрь ингаляционной трубки коробки визуализации, как показано на рисунке 1.
- При необходимости закрепите мышь стерильной гибкой пленкой и скотчем.
- Поместите коробку для визуализации с мышью в камеру микроскопа.
- Прижизненная визуализация
- Контролируйте мышь во время визуализации, проверяя частоту, глубину дыхания и температуру с помощью ректального зонда каждые 15 минут. Процент изофлурана должен поддерживаться в пределах 1-2%. При необходимости отрегулируйте.
- Найдите область в кишечнике с помощью окуляра микроскопа.
- Получите широкоугольное изображение интересующей области с помощью внутренней камеры микроскопа, как показано на рисунке 2A.
- Изображение интересующей области с помощью лазера с длиной волны 960 нм многофотонного микроскопа. Отрегулируйте мощность лазера и длину волны в соответствии с флуорофорами, используемыми в эксперименте.
- Приобретите 10-20-ступенчатый z-стек размером 3 мкм интересующей области.
- Лазерная абляция
- Выберите одну или несколько позиций на плитке, изображенной ранее.
- Используйте функцию калибровки точки отбеливания в программном обеспечении для обработки изображений с зумом 32 и разрешением 124 x 124 пикселей со скоростью сканирования 400 Гц, используя свойство двунаправленного сканирования в течение 3-10 с, в зависимости от размера целевого повреждения. Начало повреждения в области крипты можно распознать по увеличению автофлуоресценции как в зеленом, так и в красном каналах.
- Повторите предыдущие два шага для нескольких областей в одной мыши.
- После абляции соберите z-стеки поврежденных областей, чтобы подтвердить местоположение и степень повреждения.
- Закрытие операционного участка
- Поместите мышь, еще находясь под наркозом, в стерильную зону наложения швов.
- Вставьте открытую кишку обратно в брюшную полость с помощью стерильных ватных тампонов, смоченных в предварительно нагретом стерильном физиологическом растворе.
- Сшить белую линию, выполнив простой непрерывный шов с использованием рассасывающегося шва 5-0. Закройте конечности шва хирургическими узлами.
- Повторите тот же шаг со слоем кожи.
- Выключите изофлурановую станцию, очистите и стерилизуйте коробку визуализации и вкладыш.
- Очистите хирургические инструменты с помощью очистителя хирургических инструментов, ферментативного очистителя и смазки для хирургических инструментов. После высыхания стерилизуйте хирургические инструменты вместе с операционным боксом в автоклаве.
- Послеоперационный уход
- Дайте мышке восстановиться после операции, пока клетка помещается на грелку на ~1 час.
ПРИМЕЧАНИЕ: По возможности поместите мышь с другими соседями по клетке. Одиночное жилье для выздоровления не требуется. - Проверяйте температуру мыши каждые 15 минут во время восстановления.
- Вводят 200 мкл бупренорфина (0,1 мг / кг массы тела), разведенного NaCl 0,9% на 30 г мыши подкожно через 6-12 ч после операции.
- Вводят карпрофен (0,067 мг / мл) во флаконе, содержащем 125 мл неподкисленной автоклавной питьевой воды, в течение 72 ч после операции.
- Взвешивайте мышь и следите за самочувствием каждый день в течение 1 недели после операции.
- Дайте мышке восстановиться после операции, пока клетка помещается на грелку на ~1 час.
3. Повторяющиеся операции и прижизненная визуализация
- Хирургия
- Во второй момент времени (по крайней мере, через 1 неделю после первого сеанса визуализации) повторите шаги 1.1.2, 1.2, 1.3 и 2.1.
- Прижизненная визуализация
- Повторите шаги 2.2.1-2.2.3.
- Используйте рисунок кровеносных сосудов, чтобы найти те же области интереса, что и в первый момент времени.
- Повторите шаги 2.2.4 и 2.2.5.
- Закрытие операционного участка
- Повторите шаг 2.4.1.
- Если мышь не предназначена для изображения в другой момент времени, пожертвуйте мышью, выполнив вывих шейки матки под терминальной анестезией. В противном случае перейдите к следующему шагу.
ПРИМЕЧАНИЕ: В соответствии с руководящими принципами Директивы ЕС 2010/63/ЕС, приложение IV, вывих шейки матки является приемлемым методом. - Повторите шаги 2.4.2-2.4.6.
- Послеоперационный уход
- Повторите шаги 2.5.1-2.5.5.
Representative Results
Чтобы продемонстрировать тип результатов, которые могут быть получены с помощью метода лазерной абляции в сочетании с прижизненной визуализацией, мы провели эксперимент, как показано на рисунке 1. Во-первых, мы вводили K19-CreERT2;mTmG (K19cre-mTmG) и Lgr5eGFP-IRES-CreERT2; Мыши Rosa26-Confetti (Lgr5cre-Confetti) с тамоксифеном стохастически маркируют клетки одним из цветов конфетти (или зеленым флуоресцентным белком [GFP] в случае мышей mTmG). K19-cre индуцирует отслеживание линии от всех эпителиальных клеток, в то время как Lgr5-cre индуцирует прослеживание от стволовых клеток только 8,18,37. Инъекцию тамоксифена вводили за 4-6 недель до операции и первого сеанса визуализации с целью получения крипт, в которых все клетки являются моноклональными по определенному цвету. Надежная идентификация одних и тех же областей ткани в течение нескольких недель необходима для отслеживания судьбы одних и тех же крипт с течением времени. Присущие тканям архитектурные особенности, такие как сосудистая сеть, могут быть использованы в качестве надежных тканевых ориентиров, и здесь они были записаны с помощью внутренней камеры микроскопа. Кроме того, маркировка небольшой части крипт (по крайней мере, двумя) разными цветами помогла распознать одни и те же крипты в каждом сеансе визуализации и проследить их поведение во время регенеративного процесса после лазерного повреждения. После хирургического облучения кишечника мыши и получения как камерных, так и флуоресцентных изображений интересующей области (рис. 2A), настройки точки отбеливания многофотонного лазера могут быть использованы для удаления одной или нескольких крипт (рис. 2B, C). Начало повреждения можно распознать по увеличению автофлуоресценции как в зеленом, так и в красном каналах. Чтобы изучить динамику восстановления крипты, хирургическое вмешательство и процедура визуализации были повторены через недели/месяцы после первого сеанса визуализации, а присущие тканям структуры (сосудистая сеть и паттерны клонально меченных крипт) использовались в качестве ориентиров для поиска точно такого же места повреждения (рис. 2). Когда этот метод был применен у мышей Lgr5Cre-Confetti, где Lgr5-eGFP экспрессируется неоднородно, можно было зафиксировать изменения в числах и формах крипт после повреждения, вызванного лазером (рис. 3). В то время как в некоторых регионах не наблюдалось никаких изменений в количестве и структуре крипт (рис. 3B), в других регионах наблюдалось обширное ремоделирование крипт, что видно по количеству событий деления и синтеза крипт (рис. 3C) и потере крипт через 2 недели после лазерно-индуцированной травмы (рис. 3D). Вводя различные размеры повреждений и количественно оценивая события деления, слияния и исчезновения после абляции, как в примере, показанном на (рис. 3E), динамика регенерации, вызванной травмой, может быть отображена на разных моделях мышей.
Рисунок 1: Схематическое изображение экспериментальной установки. Маркировка клеток кишечника in vivo достигается путем внутрибрюшинного введения тамоксифена в генетически модифицированных моделях мышей, чтобы индуцировать Cre-опосредованную рекомбинацию в кишечных криптах. Через несколько дней или недель (когда крипты являются моноклональными для определенного цвета) кишечник подвергается хирургическому вмешательству и лазерной абляции с использованием многофотонного микроскопа с камерой с контролируемой температурой. Степень повреждения крипты характеризуется сразу после абляции, и мышь может восстановиться после процедуры. Повторное хирургическое воздействие и IVM используются для мониторинга восстановления кишечника с течением времени. Структура и распределение кровеносной сети крови и разноцветные крипты используются, чтобы найти одни и те же области через несколько недель или месяцев после абляции. Ремоделирование крипты (например, деление или слияние) может наблюдаться на месте повреждения через несколько недель после абляции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Продольная визуализация регенерации тканей при лазерно-индуцированном повреждении кишечника. Когда кишечник расположен точно таким же образом, кровеносные сосуды кишечника можно использовать в качестве карты для поиска и изображения одних и тех же областей. (А) Обзорные изображения кишечника с камеры. Пунктирные белые линии представляют собой узор сосудистой сети, прилегающей к месту повреждения (белый ящик), используемый в качестве ориентира для нахождения той же области лазерной абляции в другой момент времени. На двух нижних изображениях показан увеличенный вид белого прямоугольника. Стрелкой показано точное место лазерной абляции на 1-й день и через 1 месяц. (B) Флуоресцентные изображения одного повреждения крипты, полученные с помощью многофотонного микроскопа. Стрелка в синем поле показывает место повреждения на 1-й день и через 1 месяц. (C) Флуоресцентные изображения поврежденного поля склепов. Стрелки в синем поле отмечают область повреждения на 1-й день и через 1 месяц. Масштабные линейки: 1 мм (А, сверху); 0,25 мм (А, снизу); 200 мкм (большой обзор B и C); и 50 мкм (увеличенные изображения B и C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Прижизненная визуализация судеб крипт после лазерной абляции. (A) Используя модель конфетти, можно отслеживать крипты, помеченные разными цветами, с течением времени, чтобы отобразить динамику восстановления. Белой стрелкой изображено место лазерной абляции. Желтая рамка представляет собой соседнюю область (<100 мкм от места повреждения), а синяя и фиолетовая области представляют области, удаленные (>100 мкм) от области, удаленной лазером. Наблюдаются разные режимы регенерации. (B) Некоторые регионы остаются неизменными, как в фиолетовой рамке. (C) в других регионах наблюдается ремоделирование крипты в форме деления или слияния крипты; Пунктирные белые линии и стрелки изображают события деления склепа, а оранжевые пунктирные линии и стрелки изображают события слияния крипты. (D) В некоторых регионах наблюдается исчезновение крипты, как в желтой рамке, где склеп, выделенный оранжевой пунктирной линией, исчез. (E) Пример количественной оценки, показывающий количество событий ремоделирования крипты, наблюдаемых в областях, прилегающих (т.е. менее 100 мкм) и удаленных (т.е. более 100 мкм) от места повреждения. Масштабные линейки: 200 мкм (А); 50 мкм (Б-Д). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Discussion
Этот протокол сочетает в себе микроскопическую лазерную абляцию и продольную прижизненную микроскопию для отслеживания регенерации кишечника от ранней реакции на повреждение до долгосрочного ремоделирования тканей. Этот метод был разработан в строгом соответствии с этическими соображениями, чтобы индуцировать и визуализировать микроскопическую лазерную абляцию, и при точном следовании будет поддерживать благополучие животных. Во время хирургического вмешательства важно убедиться в том, что целостность кишечника хорошо сохранена. Этого можно достичь, аккуратно обрабатывая ткань стерильными влажными ватными тампонами, что предотвращает кровотечение или высыхание ткани. Степень микроскопического повреждения, вызванного лазером, также должна быть тщательно оценена путем визуализации различных кишечных слоев области после лазерной абляции. Если исследователь желает адаптировать частоту экспериментальных шагов, описанных в этом протоколе, перед экспериментом следует проконсультироваться с комитетом по этике животных института, чтобы установить последствия для благополучия.
Повторяющаяся прижизненная микроскопия позволяет контролировать восстановление тканей у одной и той же мыши с течением времени. Повторное хирургическое воздействие на кишечник легко обеспечивает оптический доступ ко всему кишечному тракту. Присущие тканям особенности, такие как сосудистая сеть, служат ориентирами для идентификации одних и тех же областей кишечника в каждом сеансе визуализации. Таким образом, один и тот же участок ткани может быть визуализирован в течение нескольких недель, что позволяет количественно оценить долгосрочную регенерацию ткани в одной и той же области кишечника у одной и той же мыши. Пространственно-временной контроль, предлагаемый комбинированным методом хирургии и визуализации, дает то преимущество, что один и тот же орган может быть визуализирован как в гомеостатических, так и в регенерирующих условиях у одной и той же мыши, что контрастирует с предыдущими моделями повреждения всего органа, где контрольные и регенерирующие образцы происходили от разных мышей 11,12,18,19,20 . Следовательно, наша экспериментальная установка сводит к минимуму необходимое количество животных, необходимых для эксперимента, и уменьшает внутриживотную изменчивость.
Устранение неполадок протокола должно начинаться с обзора техники работы с мышью и кишечником, а также контроля оборудования и настроек микроскопии. В этом протоколе есть много важных шагов, которые требуют дополнительного внимания. Во-первых, чтобы обеспечить благополучие животных и постоянное высокое качество данных, все работы должны выполняться в чистой стерильной среде с использованием асептической техники, а температура мыши должна поддерживаться во время операции и каждого сеанса визуализации. Поддержание ткани гидратированной стерильным, предварительно подогретым физиологическим раствором во время визуализации имеет важное значение и предотвращает фиброз тканей.
Чтобы убедиться, что эксперимент проводится воспроизводимым образом, важно выровнять лазеры перед использованием для оптимального сбора данных и измерить выходную мощность многофотонного лазера в начале каждого сеанса. Такие параметры, как тип объектива, увеличение, время пребывания, мощность лазера и длина волны, влияют на степень микроскопической лазерной абляции и должны учитываться. В этом исследовании как лазерная абляция, так и визуализация проводятся с мощностью лазера 1,2 Вт (вне линзы) на длине волны 960 нм через объектив Fluotar VISIR 25x/0,95 WATER. Изменение длины волны или оптических сканирующих свойств влияет на степень микроскопического повреждения. Меньшая длина волны (например, 840 нм) приводит к фотонам с более высокой энергией и часто к более высокой выходной мощности лазера и может усиливать микроскопические повреждения. Более высокое масштабирование приводит к большему количеству энергии на регион и, следовательно, к меньшему времени на удаление крипт, и наоборот. Время нахождения пикселей также может быть увеличено или уменьшено, чтобы изменить скорость абляции и степень повреждения. Когда визуализированная ткань нестабильна (например, из-за перистальтических движений), абляцию необходимо проводить быстро. Для этого скорость абляции должна быть оптимизирована, например, путем увеличения масштаба и/или мощности лазера.
Поиск одной и той же области кишечника в течение нескольких сеансов визуализации является еще одним важным шагом, который необходимо выполнить должным образом, чтобы обеспечить успех эксперимента. Для этого кишечник должен быть расположен одинаково во все моменты времени. Мы рекомендуем всегда использовать слепую кишку в качестве ориентира, чтобы найти одни и те же области в тонкой и толстой кишке. Мягкое растяжение интересующей ткани ватными тампонами гарантирует, что интересующая область находится в диапазоне рабочего расстояния объектива, и максимизирует количество областей, которые можно проследить. Кроме того, мы рекомендуем всегда удалять и визуализировать несколько микроскопических положений у каждой мыши, чтобы учесть области, которые не могут быть локализованы в более позднем сеансе визуализации. Если области не могут быть найдены, даже если положение кишечника правильное, это может помочь изменить положение мыши и изменить ориентацию открытой области. Отслеживание крипт с течением времени может быть обременительным для экспериментов, в которых удаляются более крупные кишечные поля нескольких соседних крипт. Такие повреждающие повреждения могут вызвать ремоделирование ткани за пределами эпителиального монослоя, что может привести к модификации тканевых ориентиров, используемых для отслеживания области с течением времени. Выбор ориентиров на достаточном расстоянии от поврежденного участка и захват больших полей зрения, превышающих поврежденный участок на несколько сотен микрометров, увеличивает шансы на успешные долгосрочные эксперименты. Помимо неправильного расположения кишечника на предмете микроскопа, перистальтические движения желудочно-кишечного тракта могут мешать визуализации. Эта проблема может быть решена двумя способами. Если частота движений не слишком высока, процесс может повториться в той же области с увеличенным временем воздействия. В качестве альтернативы можно использовать большее количество анестезии для уменьшения перистальтики. Мы рекомендуем ограничить более высокие дозы изофлурана короткими корректировками. В целом, сеансы визуализации должны быть как можно короче, оптимально менее 3 часов, чтобы обеспечить быстрое восстановление.
Комбинированная лазерная абляция и продольная прижизненная микроскопия имеет ряд преимуществ по сравнению с другими моделями повреждений. В предыдущих (химических) моделях повреждений отсутствовала способность локально ограничивать повреждающее повреждение 6,11,12,19,20. Лазерная абляция преодолевает этот недостаток, ограничивая повреждение определенной областью интереса. Это позволяет исследователям контролировать местоположение травмы, а также степень повреждения. Тяжесть повреждения может быть модулирована для удаления крипт или целых микроскопических кишечных полей для информирования о регенеративных реакциях в масштабе крипты. В дополнение к пространственному контролю, лазерная абляция также позволяет точно рассчитать время начала повреждения, тем самым превосходя точность предыдущих моделей лекарств, химикатов и инфекций 9,10,11,12,19,20. Наш протокол расширяет предыдущие исследования, в которых использовалась лазерно-индуцированная термическая абляция в качестве метода индуцирования локализованного повреждения кишечника21,23. Предыдущие модели повреждений, индуцированных лазером, визуализировали локальные области тонкой кишки 21 или люминальную поверхность дистального отделатолстой кишки23. Комбинированная хирургия и лазерная абляция позволяют визуализировать эпителий кишечника (в частности, крипты) с высоким разрешением, а также выполнять лазерную абляцию и последующую визуализацию восстановления тканей в любом положении тонкой кишки, слепой кишки и проксимального отдела толстой кишки. Он фиксирует восстановление одних и тех же областей кишечника с течением времени, позволяя визуализировать различные слои кишечника (слизистая оболочка, подслизистая оболочка, мускулярия и сероза) в соответствии с экспериментальной установкой. Наша методика в основном предназначена для длительной повторной визуализации в течение нескольких недель/месяцев. Для изучения краткосрочной динамики восстановления крипт (например, в течение нескольких дней подряд после повреждения) описанный здесь подход лазерной абляции можно комбинировать с окнами прижизненной визуализации27,28,40.
Этот протокол может быть использован для множества исследовательских приложений из различных научных областей, которые охватывают регенерацию, иммунологию и исследования рака. Продольная визуализация регенерации кишечника проливает свет на клеточную динамику, которая сохраняет целостность эпителия и барьерную функцию, обеспечивает защиту хозяина от патогенов в просвете кишечника и лежит в основе клиренса и распространения онкогенных мутаций. Каждый научный вопрос предъявляет уникальные требования к степени лазерно-индуцированного повреждения и продолжительности визуализации. Флуоресцентные репортерные мыши и инъекционные красители могут значительно расширить и уточнить данные, которые могут быть получены, позволяя визуализировать любую интересующую клетку и структуру. Например, мышь Lgr5-CreERt2:Rosa26-Confetti может быть использована для визуализации потомства стволовых клеток, в то время как репортер Rosa26-mTmG информирует об архитектуре ткани. Вместе эти последние технологические достижения делают прижизненные эксперименты с кишечником прибыльным инструментом для улучшения нашего понимания биологии и болезней кишечника.
Disclosures
Авторам раскрывать нечего.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано Нидерландской организацией научных исследований NWO (грант Vici 09150182110004 J.V.R. и грант Veni 09150161910151 H.A.M.), OCENW. GROOT.2019.085 (для J.v.R) и постдокторская стипендия EMBO (грант ALTF 452-2019 для H.A.M.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia induction box | Veterinary Technics | ||
| Autoclave | Certoclav | ||
| Betadine | Mylan | 202809 | |
| Diaper (underpad) | Absorin comfort | ||
| Dumont forceps | Fine Scientific Tools | 11255-20 or 11272-40 | Inox, style #55, used to hold the peritoneum |
| Enzymatic instrument cleaner | Roboz | EC-1000 | |
| Ethanol 80% | homemade | NA | |
| Eye ointment | Duratears Z (Alcon) | 288/28282-6 | |
| Fine Scissors Straight 9 cm | Fine Scientific Tools | 14060-09 | Used to cut skin and peritoneum of the mouse |
| Gauze 5 cmX5 cm | Cutisoft (Bsn medical) | 45847-00 | |
| Graefe Forceps Curved Serrated | Fine Scientific Tools | 11051-10 | Used to hold the skin |
| Hartman Hemostat Straight | Fine Scientific Tools | 13002-10 | Used for suturing |
| Heating pad | Comfort | T5-5000 | |
| Imaging box | Custom made | ||
| Incision film | Nobafilm | 172215 | |
| Inverted multi-photon microscope with automated stage | Leica Microsystems | NA | |
| Isoflurane (vetflurane) | Pharmachemie BV, Haarlem, Netherlands | 305788 | |
| Isoflurane vaporizer | Penlon sigma delta | ||
| Micropore paper tape | Micropore | ||
| NaCl 0.9% | Braun | Other brands available | |
| Needle 25G | BD | 300600 | |
| Paper tape tesa | Tesa | NA | |
| Parafilm | Bemis | PM-994 | semi-transparent tape |
| Razor blades | Supermax stainless steel | Other brands available | |
| Rectal probe | Kent Scientific | 20250-91 | |
| Rimadyl Cattle (carprofen) | Zoetis B.V | Registration# REG NL 10130 | |
| Student Fine Scissors Straight 11.5 cm | Fine Scientific Tools | 91460-11 | Used to cut gauze |
| Surgical instrument cleaner | Roboz | IC-1000 | |
| Surgical instrument lubricant | Roboz | IL-1000 | |
| Syringes (1 ml) | BD | 303172 | Other brands available |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| Temgesic (Buprenorphine hydrochloride) | Indivior UK Limited/Reckitt Benckiser Healthcare | Registration# RVG 08725 | |
| Vicryl polyglactin suture 5-0 FS-2 needle | Ethicon | V292ZH | |
| VirkonS | Bio-services | antiseptic solution | |
| Wooden cotton swab (sterile) | Klinion | 531530 | Other brands available |
References
- Clevers, H. The intestinal crypt, a prototype stem cell compartment. Cell. 154 (2), 274-284 (2013).
- Darwich, A. S., Aslam, U., Ashcroft, D. M., Rostami-Hodjegan, A. Meta-analysis of the turnover of intestinal epithelia in preclinical animal species and humans. Drug Metabolism and Disposition. 42 (12), 2016-2022 (2014).
- Beumer, J., Clevers, H. Regulation and plasticity of intestinal stem cells during homeostasis and regeneration. Development. 143 (20), 3639-3649 (2016).
- Ritsma, L., et al. Intestinal crypt homeostasis revealed at single-stem-cell level by in vivo live imaging. Nature. 507 (7492), 362-365 (2014).
- Azkanaz, M., et al. Retrograde movements determine effective stem cell numbers in the intestine. Nature. 607 (7919), 548-554 (2022).
- van Es, J. H., et al. Dll1+ secretory progenitor cells revert to stem cells upon crypt damage. Nature Cell Biology. 14 (10), 1099-1104 (2012).
- Tomic, G., et al. Phospho-regulation of ATOH1 is required for plasticity of secretory progenitors and tissue regeneration. Cell Stem Cell. 23 (3), 436-443 (2018).
- Asfaha, S., et al. Krt19+/Lgr5- cells are radioresistant cancer-initiating stem cells in the colon and intestine. Cell Stem Cell. 16 (6), 627-638 (2015).
- Schmitt, M., et al. Paneth cells respond to inflammation and contribute to tissue regeneration by acquiring stem-like features through SCF/c-Kit signaling. Cell Reports. 24 (9), 2312-2328 (2018).
- Davidson, L. A., et al. Alteration of colonic stem cell gene signatures during the regenerative response to injury. Biochimica et Biophysica Acta. 1822 (10), 1600-1607 (2012).
- Ijiri, K., Potten, C. S. Further studies on the response of intestinal crypt cells of different hierarchical status to eighteen different cytotoxic agents. British Journal of Cancer. 55 (2), 113-123 (1987).
- Andersson-Rolf, A., Zilbauer, M., Koo, B. K., Clevers, H. Stem cells in repair of gastrointestinal epithelia. Physiology. 32 (4), 278-289 (2017).
- Totafurno, J., Bjerknes, M., Cheng, H. The crypt cycle. Crypt and villus production in the adult intestinal epithelium. Biophysical Journal. 52 (2), 279-294 (1987).
- Dekaney, C. M., Gulati, A. S., Garrison, A. P., Helmrath, M. A., Henning, S. J. Regeneration of intestinal stem/progenitor cells following doxorubicin treatment of mice. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 297 (3), G461-G470 (2009).
- Cairnie, A. B., Millen, B. H. Fission of crypts in the small intestine of the irradiated mouse. Cell and Tissue Kinetics. 8 (2), 189-196 (1975).
- Bruens, L., Ellenbroek, S. I. J., van Rheenen, J., Snippert, H. J. In vivo imaging reveals existence of crypt fission and fusion in adult mouse intestine. Gastroenterology. 153 (3), 674-677 (2017).
- Baker, A. M., et al. Crypt fusion as a homeostatic mechanism in the human colon. Gut. 68 (11), 1986-1993 (2019).
- Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).
- Okayasu, I., et al. A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice. Gastroenterology. 98 (3), 694-702 (1990).
- Rakoff-Nahoum, S., Paglino, J., Eslami-Varzaneh, F., Edberg, S., Medzhitov, R. Recognition of commensal microflora by toll-like receptors is required for intestinal homeostasis. Cell. 118 (2), 229-241 (2004).
- Choi, J., et al. Intestinal crypts recover rapidly from focal damage with coordinated motion of stem cells that is impaired by aging. Scientific Reports. 8 (1), 10989 (2018).
- Tian, H., et al. A reserve stem cell population in small intestine renders Lgr5-positive cells dispensable. Nature. 478 (7368), 255-259 (2011).
- Choi, M., Yun, S. H. In vivo femtosecond endosurgery: an intestinal epithelial regeneration-after-injury model. Optics Express. 21 (25), 30842-30848 (2013).
- Seno, H., et al. Efficient colonic mucosal wound repair requires Trem2 signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (1), 256-261 (2009).
- Hua, G., et al. Distinct levels of radioresistance in Lgr5+ colonic epithelial stem cells versus Lgr5+ small intestinal stem cells. Cancer Research. 77 (8), 2124-2133 (2017).
- Rompolas, P., et al. Live imaging of stem cell and progeny behaviour in physiological hair-follicle regeneration. Nature. 487 (7408), 496-499 (2012).
- Alieva, M., Ritsma, L., Giedt, R. J., Weissleder, R., van Rheenen, J. Imaging windows for long-term intravital imaging: General overview and technical insights. Intravital. 3 (2), e29917 (2014).
- Rakhilin, N., et al. An intravital window to image the colon in real time. Nature Communications. 10 (1), 5647 (2019).
- Messal, H. A., et al. Antigen retrieval and clearing for whole-organ immunofluorescence by FLASH. Nature Protocols. 16 (1), 239-262 (2021).
- Farrelly, O., et al. Two-photon live imaging of single corneal stem cells reveals compartmentalized organization of the limbal niche. Cell Stem Cell. 28 (7), 1233-1247 (2021).
- Krndija, D., et al. Active cell migration is critical for steady-state epithelial turnover in the gut. Science. 365 (6454), 705-710 (2019).
- Bruens, L., et al. Calorie restriction increases the number of competing stem cells and decreases mutation retention in the intestine. Cell Reports. 32 (3), 107937 (2020).
- Bietar, B., Zhou, J., Lehmann, C. Utility of intestinal intravital microscopy for the study of CNS injury-induced immunodepression syndrome (CIDS). Clinical Hemorheology and Microcirculation. 79 (1), 137-147 (2021).
- Erreni, M., Doni, A., Weigert, R. Method for acute intravital imaging of the large intestine in live mice. Methods in Molecular Biology. 2304, 285-299 (2021).
- Hiltensperger, M., et al. Skin and gut imprinted helper T cell subsets exhibit distinct functional phenotypes in central nervous system autoimmunity. Nature Immunology. 22 (7), 880-892 (2021).
- Martínez-Sánchez, L. D. C., et al. Epithelial RAC1-dependent cytoskeleton dynamics controls cell mechanics, cell shedding and barrier integrity in intestinal inflammation. Gut. 72 (2), 275-294 (2022).
- Means, A. L., Xu, Y., Zhao, A., Ray, K. C., Gu, G. A CK19(CreERT) knockin mouse line allows for conditional DNA recombination in epithelial cells in multiple endodermal organs. Genesis. 46 (6), 318-323 (2008).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Snippert, H. J., et al. Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells. Cell. 143 (1), 134-144 (2010).
- Messal, H. A., van Rheenen, J., Scheele, C. L. An intravital microscopy toolbox to study mammary gland dynamics from cellular level to organ scale. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 26 (1), 9-27 (2021).
