Summary
在这里，我们描述了一种时间特异性方法，以有效操纵 体内小鼠胎盘中的关键发育途径。这是通过在胚胎第12.5天将CRISPR质粒注射和电穿孔到妊娠母亲的胎盘中进行的。
Abstract
胎盘是调节和维持子宫 内哺乳动物发育的重要器官。胎盘负责母亲和胎儿之间营养物质和废物的转移以及生长因子和激素的产生和输送。小鼠胎盘遗传操作对于了解胎盘在产前发育中的特定作用至关重要。表达胎盘特异性Cre的转基因小鼠具有不同的有效性，其他胎盘基因操作方法可能是有用的替代方案。本文描述了一种利用CRISPR基因操作直接改变胎盘基因表达的技术，可用于修饰靶基因的表达。使用相对先进的手术方法，怀孕的母亲在胚胎第12.5天（E12.5）进行剖腹手术，并通过玻璃微量移液器将CRISPR质粒输送到单个胎盘中。质粒在每次进样后立即电穿孔。母体恢复后，胎盘和胚胎可以继续发育，直到稍后的时间点进行评估。使用该技术后对胎盘和后代的评估可以确定时间特异性胎盘功能在发育中的作用。这种类型的操作将允许更好地了解胎盘遗传学和功能如何影响多种疾病背景下的胎儿生长和发育。
Introduction
胎盘是参与胎儿发育的重要器官。胎盘的主要作用是提供基本因素并调节营养物质和废物与胎儿之间的转移。哺乳动物胎盘由胎儿和母体组织组成，它们构成了胎母界面，因此，母体和胎儿的遗传学影响功能1。胎盘的遗传异常或功能受损会极大地改变胎儿的发育。先前的工作表明，胎盘遗传学和发育与胎儿特定器官系统的发育改变有关。特别是，胎盘异常与胎儿大脑，心脏和血管系统的变化有关2，3，4，5。
激素、生长因子和其他分子从胎盘到胎儿的运输在胎儿发育中起着重要作用6。已经表明，改变特定分子的胎盘产生可以改变神经发育。母体炎症可以通过改变胎盘中的色氨酸（TRP）代谢基因表达来增加血清素的产生，从而在胎儿大脑中产生血清素7。其他研究发现胎盘异常与心脏缺陷。胎盘异常被认为会导致先天性心脏缺陷，这是人类最常见的出生缺陷8。最近的一项研究已经确定了几个在胎盘和心脏中具有相似细胞途径的基因。如果被破坏，这些途径可能会导致两个器官的缺陷9。胎盘缺陷可能会加剧先天性心脏缺陷。胎盘遗传学和功能对特定胎儿器官系统发育的作用是一个新兴的研究领域。
小鼠具有血绒毛膜胎盘和人类胎盘的其他特征，这使它们成为研究人类疾病的非常有用的模型1。尽管胎盘很重要，但目前缺乏有针对性的体内基因操作。此外，目前有更多的选择可用于敲除或敲低，而不是胎盘中的过表达或功能获得操作10。有几种表达Cre的转基因系用于胎盘特异性操作，每种系在不同的时间点位于不同的滋养层谱系中。这些包括Cyp19-Cre，Ada/Tpbpa-Cre，PDGFRα-CreER和Gcm1-Cre 11，12，13，14。虽然这些Cre转基因是有效的，但它们可能无法在特定的时间点操纵某些基因。敲除或过表达胎盘基因表达的另一种常用方法是将慢病毒载体插入囊胚培养物中，这会导致滋养层特异性遗传操作15，16。该技术允许胎盘基因表达在发育早期发生强劲变化。RNA干扰在体内的使用在胎盘中很少使用。shRNA质粒的插入可以类似于本文中描述的CRIPSR技术进行。这已在E13.5完成，以成功降低胎盘中的PlGF表达，对后代脑脉管系统产生影响17。
除了主要用于敲除或敲低的技术外，诱导过表达通常使用腺病毒或插入外源性蛋白进行。用于过表达的技术具有不同的成功率，并且大多在妊娠后期进行。为了研究胰岛素样生长因子1（IGF-1）在胎盘功能中的作用，进行了腺病毒介导的胎盘基因转移以诱导IGF-1基因18，19的过表达。这是在小鼠妊娠后期通过直接胎盘注射在E18.5上进行的。为了提供额外的选择并规避已建立的胎盘遗传操作的可能失败，例如Cre-Lox组合失败，腺病毒的可能毒性以及shRNA的脱靶效应，可以使用胎盘的体内直接CRISPR操作20，21，22。开发该模型是为了解决缺乏过表达模型的问题，并创建一个具有灵活性的模型。
该技术基于Lecuyer等人的工作，其中shRNA和CRISPR质粒在体内直接靶向小鼠胎盘以改变PlGF表达17。该技术可用于在多个时间点使用CRISPR操作直接改变胎盘基因表达;对于这项工作，选择了E12.5。此时胎盘已经成熟，并且足够大，可以操纵，允许在E12.5上插入特定的CRISPR质粒，这可能对怀孕中晚期的胎儿发育产生重大影响23，24。与转基因方法不同，但与病毒诱导或RNA干扰类似，该技术允许使用相对先进的手术方法在特定时间点进行过表达或敲除，从而避免早期变化可能造成的胎盘受损或胚胎致死性。由于只有少数胎盘在一窝中接受实验质粒或对照质粒，因此该方法允许两种类型的内部对照。这些质控品是用适当的对照质粒进样和电穿孔的质粒，以及未接受直接操作的质粒。该技术经过优化，通过协同激活介质（SAM）CRISPR质粒在小鼠胎盘中产生IGF-1基因的过表达。选择了 IGF-1 基因，因为 IGF-1 是一种主要的生长激素，主要在出生前在胎盘中产生25，26.这种新的胎盘靶向CRISPR技术将允许直接操作，以帮助确定胎盘功能与胎儿发育之间的联系。
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Protocol
所有程序均按照联邦法规和爱荷华大学政策执行，并得到机构动物护理和使用委员会的批准。
1. 畜牧业
- 将动物保持在12小时的日光循环 中，随意进食和水。
- 使用8-15周龄的CD-1雌性小鼠。使用交配插头的存在来识别 E0.5。
- 在E0.5上，单独容纳怀孕的水坝。
2. 微量移液器的校准
注意：微量移液器的校准应在手术前尽可能进行。
- 在制作和校准微量移液器之前，将所有质粒稀释至无DNA酶水中的推荐浓度（0.1μg/μL）。将质粒与适当稀释的快速绿染料（PBS 中的 1 μg/μL）（最终质粒浓度：0.06 μg/μL）混合。
- 使用外径为1.5 mm，内径为0.86 mm的10 cm玻璃毛细管拉动微量移液器。
- 用无菌镊子小心地折断微量移液器（2-3毫米）的尖端。
- 将微量移液器装入连接到微量注射器的微毛细管尖端中。确保微量注射器连接到显微注射机，并且有足够的氮气水平来校准微量移液器。
- 将微量移液器连接到微量进样器后，用Fast Green染料溶液加载以执行校准（PBS中为1μg/μL）。校准微量移液器以注入约3.5μL的体积。 清空（“清除”）微量移液器以准备加载质粒溶液，如下所示。
注意：每个微量移液器略有不同。为避免在注射过程中损坏胎盘，注射时间应设置在0.5-1.5秒之间。压力应设置在 1-8.5 psi 之间。分别校准每个微量移液器;如果微量移液器无法在这些参数内校准，则不应使用。
3. 手术（图1A）
注意：要准备，请用70%乙醇清洁准备和手术区域的表面。在准备区域放置吸收性垫。在手术区域，放一个加热垫，然后在上面放一个吸收垫。手术前对所有工具进行消毒。大坝麻醉的时间应在1小时内。
- 麻醉
- 在手术前30分钟至1小时向妊娠母亲施用5mg / kg非甾体抗炎药（美洛昔康）或其他批准的镇痛药。
- 将怀孕的大坝放在连接到异氟烷蒸发器的诱导室中。
- 将蒸发器设置为 4% 异氟醚和 3.5 L/min 氧气。
- 一旦确认麻醉对脚趾夹伤和呼吸频率降低缺乏反应，将大坝从诱导室移至准备区域。
- 手术准备
- 在准备区域，用鼻锥仰卧位大坝。
- 当大坝在鼻锥中时，将蒸发器减少到 2% 异氟醚和 3.5 L/min 氧气。
- 彻底剃掉大坝的腹部并去除多余的皮毛。使用无菌棉头涂抹器，用聚维酮溶液和 70% 乙醇交替涂覆剃光的腹部 3 次。涂上聚维酮溶液的最后一层。为防止角膜干燥，将人工泪液凝胶放在大坝的双眼上（图2A，B）。
- 准备好后，将带有鼻锥的大坝移动到指定的手术区域。
- 子宫剖腹手术
注意：在整个手术过程中使用无菌手套。如果接触任何非无菌表面，请更换手套。- 在手术区域，将大坝仰卧，并用胶带将鼻锥固定到位。将吸收垫下方的加热垫设置为45°C。
- 使用镊子和剪刀，在皮肤上做一个大约 2 厘米的中线切口。用镊子撑开皮肤，并在皮肤上做一个垂直切口。在此之后，通过腹膜做另一个类似大小的切口以露出子宫角。使用镊子，在垂直切口的同时撑起腹膜（图2C，D）。
注意：切开腹膜时未能正确搭帐篷可能会导致肠道致命切口。 - 通过按压腹部两侧，通过切口轻轻按摩子宫角。通过不使用工具小心地引导子宫来做到这一点，只用手指以避免意外伤害。将暴露的子宫放在覆盖大坝腹部的无菌手术窗帘上，并在整个手术过程中用无菌盐水滴保持湿润，可以根据需要使用前将其加热至30°C（图2E，F）。
注意：子宫角可以按照Wang等人27中的描述进行识别。 - 一旦子宫暴露，选择三对胎盘进行操作。
注意：胎盘可以按照Elmore等人24的描述进行识别。为了最大限度地提高胚胎的存活率，不应治疗超过6个胎盘。如果胚胎少于12个，则不应注射超过4个胎盘。选择两个相邻的胎盘，使一个接受对照注射，另一个接受实验质粒。使用两个相邻的胎盘可以更好地比较子宫中相似位置的胎盘，还可以提高存活率。所选胎盘对是随机选择的，并在整个子宫角中间隔开（图1B）。 - 记录胎盘操作的位置和胚胎在子宫角内的组织，以便在收集过程中可以识别胚胎和胎盘，因为一个母亲将携带对照和实验处理的胎盘/胚胎。
- 胎盘注射和对照质粒电穿孔
注意：为保持无菌技术，请在使用前用冷灭菌剂对电穿孔桨和显微注射器进行消毒。如果接触任何非无菌表面，请更换手套。- 使用校准的微量移液器，加载足够量的适当对照质粒进行三次进样。在~0.5mm的深度横向进行所有注射到蜕膜（白色）和交界区（深红色）之间的胎盘中（图3A-F）。
- 在三个对照胎盘中进行注射。
注意：在实验进样之前执行所有对照质粒进样，以避免质粒与微量移液器交叉污染。这将允许使用相同的微量移液器，因为更换微量移液器和校准时间会大大增加手术时间并降低大坝的存活率。 - 在注射后2分钟内对对照质粒注射的胎盘进行电穿孔。
- 对于电穿孔，请使用连接到电穿孔机的一对 3 毫米桨。为确保CRISPR掺入效率和胚胎的活力，请使用以下电穿孔设置：2脉冲，30 V，30 ms脉冲，970 ms脉冲关闭，单极性。
- 注射后但在电穿孔前，用无菌盐水涂覆接触部位，用滴管或注射器将盐水精确地涂抹在子宫壁和桨上的三个部位。
- 轻轻按压胎盘侧面的电穿孔桨。将阳极桨放在注射部位和正对的阴极上（图4A-C）。
- 按压电穿孔机上的脉冲，等待两个脉冲完成，然后再取出电穿孔桨。
注意：在脉冲期间，桨和胎盘之间经常看到少量白色泡沫。如果没有发生这种情况，请在进一步使用前用电压表检查桨的电压。如果电压表上的读数与电穿孔电压设置不匹配，则拨片不起作用。
- 胎盘注射和实验质粒电穿孔
- 按照步骤 3.4.1 中的相同说明进行操作。到步骤 3.4.2。使用实验质粒代替对照质粒。
- 在注射后2分钟内对所有三个实验性注射胎盘进行电穿孔。这应以与注射对照质粒相同的方式进行。按照步骤 3.4.4 操作。到步骤 3.4.7。
- 手术完成
- 胎盘操作完成后，仅用手指轻轻按摩腹腔内的子宫角（图5A）。
- 首先，使用45厘米长的涂层和编织可溶解缝合线和13毫米3/8c针合金在腹膜层上进行双结单缝合。将缝合线间隔2-3毫米（图5B）。
- 缝合腹膜层后，用可溶解的缝合线缝合皮肤。将单缝线打结三重，间隔2-3毫米，以确保大坝无法解开缝合（图5C）。
- 缝合完成后，将异氟醚设置为1%，将氧气设置为3.5 L / min，并将组织粘合剂涂在皮肤上的缝合线上（图5D）。
注意：纸巾粘合剂是可选的，但建议使用，以防止由于大坝咀嚼而重新打开切口。 - 当组织粘合剂干燥后，关闭蒸发器，并从手术区域取出大坝。将大坝放在背上的支撑笼中。
4. 术后护理和监测
- 让怀孕的大坝在监督下的干净笼子中休养至少 30 分钟，以确保手术没有立即并发症。观察，直到它完全走动并且可以在没有帮助的情况下翻转站起来。手术后单独安置大坝。
- 遵循机构术后护理和监测，直到胚胎采集。记录坝重，并每天监测缝合线和切口部位。
5. E14.5胎盘采集
- 在 E14.5 上，用氯胺酮/甲苯噻嗪混合物（1 mg/mL 氯胺酮和 0.1 mg/mL 甲苯噻嗪）深度麻醉大坝，然后颈椎脱臼大坝。
- 用剪刀在大坝腹部做一个V形切口，然后切除子宫。立即放在冰上的5厘米培养皿上。使用镊子，小心地从子宫中取出胚胎和相应的胎盘。
注意：记录胚胎位置和子宫角中的相应胎盘，以确定在手术过程中接受直接操作的胎盘。 - 记录胎盘重量。使用不含RNA酶的镊子和剃须刀，将胎盘从中线切成两半。将一半放入4°C的4%PFA中。 再次将剩余的一半切成两半，并将剩余的四分之一在-80°C下储存在两个管中，一个装有RNA储存试剂。
注意：胚胎和其他母体组织可以从收集中储存在-80°C以备将来使用。
6. 胎盘基因表达分析
- 使用在RNA储存试剂中储存在-80°C的胎盘的四分之一。
- 如Elser等人所述，使用Trizol方法进行RNA分离，分光光度计进行RNA浓度，cDNA合成试剂盒以及使用SYBR绿色预混液28的qPCR，处理胎盘以进行qPCR。代替Elser等人引用的Turbo DNAfree试剂盒DNAse，在Trizol RNA分离后使用RNAcleanup试剂盒，以确保样品不含污染物28。
注意：阅读Trizol的材料安全数据表（MSDS），并在化学通风橱中使用它。 - 用GFP引物评估对照质粒的质粒插入和用BLAST引物（ 补充表1中列出的引物）的实验质粒插入。使用CT值确定质粒的存在。
注意：CT值高于35是假阳性，只有低于35的CT值才应被视为质粒已成功插入的阳性指标。 - 评估归一化为管家基因的 IGF-1 胎盘表达 18s （ 补充表1中列出的引物）。使用ddCT方法计算倍数变化，然后计算实验样品的归一化倍数变化到对照样品的平均倍数变化。
7. 胎盘蛋白水平分析
- 使用储存在-80°C的胎盘的四分之一。 在由 11.5 mM Tris HCl、5 mM MgCl2 和 10 mM 蛋白酶抑制剂制成的缓冲溶液中匀浆组织，最终 pH值为 7.4。使用手持式均质器和杵分解组织。
注意：样品不应超过缓冲液体积的10%。 - 在缓冲液中以1：12稀释匀浆样品，使其在二辛可宁酸测定（BCA）试剂盒的可检测范围内。根据制造商的说明进行BCA测定，并使用酶标仪定量总蛋白质。
- 进行BCA测定后，将所有样品标准化为IGF-1 ELISA的相同总蛋白质浓度2mg / mL，如Gumusoglu等人所做的那样29。
- 根据制造商的说明执行 IGF-1 ELISA， 并使用标准浓度曲线用酶标仪定量 IGF-1 蛋白水平.
8. 使用荧光 原位 杂交标记的空间CRIPSR验证
- 将胎盘两半在4°C的4%PFA中适当固定1-3天后，将它们在4°C下移动到20%蔗糖中，然后在最佳切割温度（OCT）化合物中冷冻。
- 将OCT包埋的胎盘在-20°C低温恒温器中连续切片成10μm切片，并将它们放在要标记的载玻片上。将胎盘切成两半，以便所有三个子区域都可见。将载玻片储存在-80°C直至用于 原位 杂交。
- 按照制造商的方案进行荧光 原位 杂交（FISH）标记。用dCas9-3xNLS-VP64探针杂交一张载玻片，用Prl8a8探针杂交同一胎盘的第二张“姐妹”载玻片。
注意：dCas9-3xNLS-VP64探针检测过表达质粒的存在。Prl8a8探针突出显示了交界区的海绵养层，这使得胎盘的亚区域是可识别的。这两个探针标记在单独的“姐妹”载玻片上，以避免多通道荧光对胎盘中的绿色自发荧光的干扰。 - 用检测染料（Opal 620）标记两个探针。完成制造商的 FISH 协议后，应用 DAPI 安装介质，并在载玻片上放置盖玻片。用透明指甲油密封盖玻片。
- 在正置复合荧光显微镜上对载玻片进行成像，并使用适当的图像处理软件对其进行处理。这里使用了CellSens软件。
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Representative Results
一般手术结果（图6）
在这项研究中，有三个纵的组。这些包括注射普通CRISPR Cas9对照质粒（Cas9对照），活化对照CRISPR质粒（行动对照）或IGF-1 SAM活化质粒（Igf1-OE）的胎盘。Cas9对照更适合敲除质粒，活化对照更适合过表达/活化质粒。为了评估通过注射和电穿孔操纵胎盘引起的活力变化，在E14.5上分析了垫料中的胚胎存活率（图6A）。选择该时间点是因为使用电穿孔进行CRISPR质粒体内插入的其他研究表明，表达变化可以在8-22小时内实现30，31，32。在E14.5处收集允许CRISPR质粒整合并激活基因表达的增加约48小时。结果发现，手术操作大坝影响了所有胚胎的存活，但与接受注射和电穿孔的操纵胎盘相关的胚胎显着降低了存活率。未经处理的胚胎（在同一窝中但未进行靶向操作）的存活率从100%存活率降至平均79.05%。纵胚胎的存活率显著下降，平均存活率为55.56%。三个纵组之间没有发现显着差异。
为了确定操纵胎盘是否发生显着的粗略变化，记录了胎盘重量。任何组的胎盘重量没有显着差异（图6B），胎盘和胚胎的总体外观没有变化。在E14.5收集时，在解剖显微镜上拍摄了具有代表性的坏死后镜图像。拍摄来自不同治疗组的胎盘/胚胎的图像，全部在同一窝中。羊膜囊或暴露的胚胎及其相应的胎盘中，任何治疗组的表型外观都没有明显的损伤或变化（图6D-I）。虽然使用IGF-1活化质粒在操纵组的形态上没有看到明显差异，但对于靶向其他基因的其他实验质粒可能更实质性地影响胎盘或胚胎的基本生长和功能调节因子，这可能并非如此。在Cas9控制和Act控制胎盘之间的任何测量中都没有发现差异。因此，这两组被合并，并被称为所有分析的Con或对照。这些结果表明，使用该技术在E12.5上操纵子宫内的胎盘会导致胚胎存活率降低，但仍有显着的活力。结果还表明，胎盘生长总体上没有显着影响，因为操纵和未处理的胎盘之间的体重没有显着变化。这表明所提出的技术可以允许健康和可行的CRISPR操纵胎盘及其相应胚胎的存活。
在E14.5上收集胚胎之前，手术后每天记录大坝重量变化（图6C）。手术在E12.5上进行，因此所有大坝重量变化都相对于E12.5上的重量列出。实验性（Exp）母体接受胎盘操作，而假母体接受麻醉和剖腹手术，持续时间相似，没有胎盘操作。许多怀孕的母亲在手术后的第二天体重略有下降或没有变化（E13.5）;这可能是由于手术期间和手术后短暂的饮食中断。大多数大坝在E14.5上显示出重量增加，但偶尔仍然观察到重量减轻。手术后对母体母亲体重的跟踪可以监测胚胎存活率。怀孕母亲术后体重的变化很常见，并不表明所有治疗的胚胎都丢失了。假坝与实验坝的术后体重变化没有显著差异。这表明，在将CRISPR质粒插入胎盘后，母体的健康状况通常得到保留。总体而言，这表明虽然这种手术技术会导致胚胎活力下降，但它仍然产生很大比例的健康后代可用于研究。
分析E14.5胎盘中的表达和CRISPR掺入（图7）
为了确定IGF-1活化质粒的细胞插入是否成功过表达IGF-1，进行了qPCR。正如预期的那样，当折叠变化归一化为18s表达时，qPCR显示IGF1-OE胎盘中IGF-1表达与对照胎盘相比显着增加（韦尔奇t检验，p = 0.0302）（图7A）。为了确定IGF-1蛋白水平是否改变，对所有组的胎盘进行了ELISA。与qPCR一致，E14.5胎盘的ELISA评估显示，与对照胎盘相比，IGF1-OE胎盘中的IGF-1蛋白水平显着增加（Welch的t检验，p = 0.0469）（图7B）。qPCR和ELISA表明，过表达质粒分别成功提高了IGF-1基因表达和IGF-1蛋白的产生。
为了确保质粒的递送对操纵的胎盘具有特异性，对特定的 IGF-1 活化质粒和CRISPR Cas9对照质粒进行了qPCR。这些qPCR在操纵的胎盘和与注射胎盘相邻的未经处理的胎盘上进行。用于评估活化质粒表达的qPCR引物靶向BLAST质粒序列，这是活化系统的一部分（图7C）。未经处理的胎盘显示不存在原始质粒（周期阈值[CT]未确定，在图表上标记为40），Igf1-OE胎盘显示CT约为30。进行qPCR以评估对照质粒表达，靶向插入的GFP基因序列（图7D）。未经处理的胎盘显示CT值超过35，可能是由引物二聚反应引起的，因为这些值超出了预期的表达范围。对照显示CT值约为30。这些qPCR可作为质量检查，以证明IGF-1的预期过表达或缺乏 IGF-1 ，并且质粒仅存在于预期的操纵胎盘中。
使用胎盘切片对 IGF-1 活化质粒进行空间验证。将固定在OCT化合物中并冷冻的胎盘以10μm连续切片到载玻片上，以便所有层都可见。然后将载玻片在-80°C下冷冻，直到用于FISH标记。为了验证IGF-1 CRISPR活化质粒在胎盘内的位置，使用了带有红色荧光标记的dCas9-3xNLS-VP64探针。该探针针对激活系统的功能组件。绿色自发荧光用于显示胎盘母胎界面的亚区域（图7E，F）。在未经处理的胎盘中未检测到dCas9-3xNLS-VP64，因为它们未接受CRISPR操作处理（图7E）。正如预期的那样，IGF1-OE胎盘显示dCas9-3xNLS-VP64的标记，如红色所示（图7F）。在胎盘的所有三个亚区都发现了CRISPR掺入，交界区的标记最清晰（图7E）。dCas9-3xNLS-VP64标记的荧光强度在质粒处理的胎盘中有所不同，表明一些胎盘比其他胎盘表达质粒更高，并且标记的精确位置/程度存在差异，但标记通常存在于所有亚区域。为了确认dCas9-3xNLS-VP64标记的位置，进行了靶向海绵滋养层的Prl8a8 FISH标记以标记中间连接亚区（图7G，H）。这是在标记为dCas9-3xNLS-VP64的切片的“姐妹”切片上的同一胎盘的相邻切片中进行的。正如预期的那样，Prl8a8标记指示的结构在IGF1-OE和未经处理的胎盘之间相似。蜕膜和迷宫区可以通过红色交界区周围的蓝色核 （DAPI） 标记来识别（图 7G，H）。dCas9-3xNLS-VP64的FISH标记澄清了质粒入到所有三个亚区，并通过Prl8a8标记证实了这一点。FISH标记的结果证实， IGF-1 活化质粒的掺入是成功的，质粒没有迁移到未经处理的胎盘中。
图 1：协议示 意图。 （A） 外科手术的简化示意图。该技术主要步骤的时间顺序。（B）显示子宫角内操纵胎盘间距的示例的示意图。这两个面板都是用 BioRender.com 创建的。 请点击此处查看此图的大图。
图2：子宫剖腹手术。 （A-B）在手术准备期间，（A）剃光的大坝腹部，以及（B）涂有碘溶液的剃光区域。（C-F）在手术区域，（C）腹部皮肤有~2厘米的切口，（D）腹膜有~2厘米的切口;肠子是可见的。（E）通过切口部位操纵子宫角。子宫角可见。（F）将完全暴露的子宫角放在无菌手术单上。请点击此处查看此图的大图。
图3：将CRISPR质粒注射到E12.5 胎盘中。 （A，B）子宫角内胚胎和胎盘的方向。（A） 标记子宫角的斜视图，显示蜕膜、胎儿区和胚胎。虚线表示注射部位的位置。（B）图 A中未标记的子宫角。（中，四）插入胎盘注射部位的微量移液器的侧视图。D为蜕膜，FZ为胎儿区，E为胚胎，虚线为注射部位位置。（D） 来自面板 C 的微量移液器插入的未标记图像。（中、女）注射后胎盘中染料的侧视图。（E）子宫角的标记图像，显示已注射CRIPSR质粒的胎盘，其中包含可见染料和未注射的胎盘。（F）图 E中未标记的子宫角图像。 请点击此处查看此图的大图。
图4：注射CRISPR质粒后E12.5胎盘的电穿孔。 （A）子宫角胎盘的顶视图。标记了阳极和阴极电穿孔桨，白色箭头表示注射部位的位置。（B）胎盘电穿孔的斜视图。（C）胎盘电穿孔的侧视图。（D-F）面板 A、B 和 C 的简化轮廓。阳极和阴极桨被标记，P是胎盘，E是胚胎，未标记区域是子宫。请点击此处查看此图的大图。
图5：腹部皮肤和腹膜的缝合 。 （A）手术完成后子宫角返回腹部。腹部皮肤和腹膜切口可见。（B）腹膜切口完全缝合。（C）腹部皮肤切口完全缝合。（D）将组织粘合剂应用于腹部皮肤缝合线。 请点击此处查看此图的大图。
图6：一般手术结果。 （A）手术后2天E14.5收集的胚胎存活率。与未处理的胚胎相比，在操纵组中观察到存活率显着降低（Mann-Whitney U检验：未处理与Cas9对照，p = 0.0077;未经处理与行动控制，p = 0.0330;和未经处理与IGF1-OE，p = 0.0032）。在纵组的存活率中未观察到显着差异（单因素方差分析，p = 0.9454）。每个点代表单个窝的存活百分比（未处理的n = 22，Cas9对照n = 9，行动对照n = 13和IGF1-OE n = 22窝）。（B）E14.5上存活胚胎的胎盘重量（单因素方差分析，p = 0.1436）（未处理的n = 138，Cas9对照n = 15，作用对照n = 20和IGF1-OE n = 36个胎盘）。（C）在接受假剖腹手术或接受实验性（Exp）胎盘操作的大坝中观察到的E13.5和E14.5手术后大坝重量变化。两组大坝术后体重变化无显著差异（未配对t检验：E13.5 p=0.5452和E14.5 p=0.2493）（假坝n=3和Exp坝n=10）。所有误差线代表SEM。 （D-F） 羊膜囊坏死后E14.5胚胎的图像，胎盘仍然附着。（F）最右边角的比例尺代表3.75毫米。 （G-I）胚胎的斜图像和相应胎盘的顶视图。（I）最右边角的比例尺代表3.75毫米。 （D-I）所有治疗组标签都列在图像下方。请点击此处查看此图的大图。
图7：E14.5胎盘中表达和CRISPR掺入的分析。 （A）E14.5对照和IGF1-OE胎盘中IGF-1表达的qPCR分析。在IGF1-OE胎盘中观察到IGF-1表达显着增加（韦尔奇t检验，p = 0.0302）（对照n = 15和IGF1-OE n = 20个胎盘）。 （B）E14.5对照和IGF1-OE胎盘中IGF-1蛋白水平的ELISA。与对照水平相比，在IGF1-OE胎盘中观察到IGF-1水平显着增加（韦尔奇t检验，p = 0.0469）（对照n = 13和IGF1-OE n = 15胎盘）。（C）来自IGF-1 SAM质粒的BLAST序列的qPCR分析。仅在IGF1-OE胎盘中发现BLAST的表达，在未经处理的胎盘中未发现/未确定的表达（未处理的n = 4和IGF1-OE n = 9胎盘）。（D）来自CRISPR Cas9对照质粒的GFP序列的qPCR分析。在对照胎盘中发现质粒的表达，在未处理的样品中发现CT值超过35/假阳性结果（未处理的n = 4和对照= 5个胎盘）。虚线表示 35 CT 处的假阳性阈值。每个数据点来自一个胎盘。所有误差线代表SEM。 （E-H） 10 μm 厚度的 E14.5 胎盘切片的荧光原位杂交。（E） 未经处理和 （F） IGF1-OE 胎盘切片，带有红色标记的 dCas9-3xNLS-VP64 探针。红色信号仅存在于IGF1-OE胎盘中。绿色信号为自发荧光，用于帮助识别胎盘亚区。（G）未经处理和（H）IGF1-OE胎盘切片，用红色标记的Prl8a8探针识别中间交界区的海绵养层。蓝色的 DAPI 显示围绕该交汇区的蜕膜和迷宫区域。（H） 最右边角的比例尺代表 2 毫米。 请点击此处查看此图的大图。
补充表1：本研究中使用的引物。请点击此处下载此文件。
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Discussion
胎盘是胎儿生长的主要调节因子，如前所述，胎盘基因表达或功能的变化可能会显着影响胎儿发育6。这里概述的方案可用于使用相对先进的手术方法对小鼠胎盘进行靶向体内CRISPR操作。该技术允许大量可存活的胚胎及其相应的胎盘，可用于进一步研究（图6A，B）。这项技术使我们能够成功地在E14.5上过表达胎盘IGF-1（图7A，B）。使用的质粒显示出特异性，因为插入的质粒保留在操纵的胎盘中，并且不存在于相邻的未处理胎盘中（图7C，D）。FISH 确认了 dCas9-3xNLS-VP64 和 Prl8a8 的 IGF-1 活化质粒的空间分布，这表明活化质粒存在于 IGF1-OE 胎盘的三个亚区中，而不是存在于未处理胎盘的任何亚区（图 7E-H）。该技术可用于以以前的技术无法实现的方式改变胎盘基因表达。使用该技术将使人们更好地了解胎盘基因表达和功能在多种情况下对胎儿发育的影响。
为了优化该程序对母体和胎儿结局的成功，探索了改变多个参数的影响，包括注射和电穿孔设置以及使用的材料。为了提高大坝的存活率和恢复率，发现麻醉时间不应超过1 h，因为较长的手术时间显着降低了生存率。如果麻醉时间达到约2小时，生存的可能性显着降低到20%以下，可能是由于异氟醚下延长时间的负面影响。除了麻醉时间外，导致孕产妇死亡的最常见的手术并发症是在做皮肤和腹膜切口时未能正确撑起腹膜。如果腹膜没有正确搭建帐篷，肠道可能会受伤，这可能会导致手术后几天死亡。子宫暴露的时间也会影响母亲和胚胎的存活。在成功的实验中，子宫暴露的平均时间约为15分钟;超过30分钟的暴露会导致吸收增加和可能的母体疾病。暴露的子宫和任何其他暴露的器官（通常是肠道）必须保持湿润，但过多的盐水会冷却动物;当定期润湿暴露的器官时，应使用少于1mL的无菌盐水。
注射和电穿孔的参数极大地影响了胚胎的存活。进样体积不应超过约4.5 μL，因为这会导致再吸收。注射时间和压力对于最大化存活率很重要;注射时间应设置在0.5 s和1.5 s之间，尽管0.8 s似乎是最佳的。压力应设置在 1-8.5 psi 之间。低注射时间和高注射PSI水平的胚胎存活率。还观察到，如果微量移液器太钝，胚胎活力可能会降低，并且溶液也会经常从微量移液器中泄漏出来。用于可视化注射的染料类型会影响存活率。亚甲蓝用于此目的会导致孕产妇死亡，但过滤的固绿染料溶液对孕产妇健康没有负面影响。电穿孔设置是根据先前体内33的电穿孔研究从推荐的制造商设置优化的。电穿孔被发现是造成最大损伤和降低胚胎存活率的操作。推荐的体内胚胎电穿孔设置建议使用四个脉冲以最大限度地提高CRISPR效率，但建议使用两个脉冲以获得更高的存活率33。结果发现，四个脉冲导致几乎所有的胚胎都吸收。两个脉冲可以提高活力，同时保持CRISPR效率。电穿孔桨的大小也显着影响了胚胎的存活。结果发现，当与推荐的设置一起使用时，5 mm电穿孔桨几乎可以完全吸收。事实上，制造商指南中推荐使用3毫米电穿孔桨，可显着提高胚胎活力33。同样重要的是要注意，许多电穿孔桨具有一定的脉冲寿命。在它们被使用到这个最大值之后，可以看到质量下降。如果在脉冲期间桨和胎盘之间没有形成小的白色泡沫，则可以确定这一点。可以使用电压表检查电穿孔桨电压，以确定它是否产生预期的电压。
这项研究在几个方面受到限制。此技术是特定于时间的，最好不早于 E10.5 且不晚于 E16.5 执行。这是由于胎盘在E10.5之前太小，而在E16.5之后，质粒可能没有足够的时间产生预期的效果。这个时间框架意味着这种技术更适合小鼠的特定类型的研究。该技术对于研究神经发育很有用，因为E12.5处于大脑内许多结构的神经发生的关键时期34。该技术可能不适用于研究胎盘对发育早期阶段的影响，例如发生在E8.535上的神经板形成。敲除CRISPR质粒的结果目前尚不清楚;该方法在基因表达减少中的应用需要进一步研究，因为仅证明了基因的过表达/激活。尽管如此，预计该技术也将成功插入敲除CRISPR质粒。
该技术还可以允许对转基因胎盘组织进行初级培养36。根据所使用的CRISPR类型，例如CRISPRi和CRISPRa，可以使用原代培养物进行挽救研究37，38。该技术也可用于进一步探索胎盘遗传与后代功能异常和问题之间的联系。具体来说，之前的一项研究发现胎盘特异性基因组风险评分与精神分裂症风险之间存在显着相关性39。这项研究发现了许多可能在精神分裂症发展中发挥作用的胎盘基因，这些基因尚未在动物模型中得到探索。这种技术有助于进一步研究这种类型的和其他技术。
从胎盘的CRISPR修饰中获得的知识可以转化为一系列不同的生物医学应用。确定胎盘中特定基因表达如何影响胎儿发育的研究可用于创建胎盘靶向药物干预，以治疗这些异常。直接针对胎儿的治疗可能是困难和危险的40，41。胎盘是更容易获得的治疗目标。在心脏或大脑发育问题可能产前改变的情况下，直接的心脏或大脑操作是高风险的。这种风险可以通过胎盘干预来避免，胎盘干预更合理，并可能导致神经发育障碍的预防策略，其中分子环境（部分由胎盘提供）可能至关重要5。该技术还可用于治疗先天性心脏病等疾病，该疾病与胎盘疾病有关9。由于先天性心脏病是一种常见的出生缺陷，胎盘干预治疗的可能性可能会产生重大影响8。由于胎盘具有许多功能，该技术可用于推进多种疾病的干预措施的发展。总体而言，这种胎盘靶向技术可用于进一步了解胎盘遗传学和功能对胎儿发育多个领域的影响。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者承认以下资金来源：R01 MH122435，NIH T32GM008629和NIH T32GM145441。作者感谢Val Sheffield博士和Calvin Carter博士在爱荷华大学的实验室使用他们的手术室和设备，以及Eric Van Otterloo博士，Nandakumar Narayanan博士和Matthew Weber博士在显微镜方面的帮助。作者还感谢Sara Maurer博士，Maya Evans和Sreelekha Kundu对试点手术的帮助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml Tubes | USA Scientific Inc | 1615-5500 | |
| 4% Paraformeldhyde (PFA) in PBS | Thermo Fisher Scientific | J61899.AP | |
| 96 Well plate | Cornings | 3598 | For BCA kit |
| Absorbent Underpads | Fisher Scientific | 14-206-62 | |
| Activation Control Plasmid | Santa Cruz Biotechnology | sc-437275 | Dnase-free water provided for dilution |
| AMV Reverse Transcriptase | New England Biolabs | M0277L | Use for cDNA synthesis |
| Anesthetic Gas Vaporizor | Vetamac | VAD-601TT | VAD-compact vaporizer |
| Artifical Tear Gel | Akorn | NDC 59399-162-35 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | Protein quantification |
| Biovortexer | Bellco Glass, Inc. | 198050000 | Hand-held tissue homogenizer |
| CellSens Software | Olympus | V4.1.1 | Image processing to FISH images. |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | EP022628168 | Plate centrifuge |
| Chloroform | Thermo Fisher Scientific | J67241-AP | RNA isolation |
| Cotton Tipped Applicators | ProAdvantage | 77100 | Sterilize before use |
| CRISPR/Cas9 Control Plasmid | Santa Cruz Biotechnology | sc-418922 | Dnase-free water provided for dilution |
| CryoStat | Leica | CM1950 | |
| Dissection Microscope | Leica | M125 C | Used for post-necroscopy imaging |
| Dissolvable Sutures | Med Vet International | J385H | |
| Distilled Water | Gibco | 15230162 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Thermo fisher Scientific | 14190144 | (-) Calcium; (-) Magnesium |
| ECM 830 Electro Electroporator (Electroporation Machine) | BTX Harvard Apparatus | 45-0662 | Generator only |
| Electric Razor | Wahl | CL9990 | Kent Scientific |
| Electroporation paddles/Tweezertrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0487 | 3 mm diameter paddles; wires included |
| Embedding Cassette: 250 PK | Grainger | 21RK94 | Placenta embedding cassettes |
| Ethanol | Thermo Fisher Scientific | 268280010 | |
| F-Air Canisters | Penn Veterinary Supply Inc | BIC80120 | Excess isoflurane filter |
| Fast Green Dye FCF | Sigma | F7252-5G | Dissolve to 1 μg/ml and filter; protect from light |
| Filter-based microplate photometer (plate reader) | Fisher Scientific | 14377576 | Can be used for BCA and ELISA |
| Forceps | VWR | 82027-386 | Fine tips, straight, serrated |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma Aldrich | HT501128 | |
| Glass Capillaries - Borosilicate Glass (Micropipette) | Sutter Instrument | B150-86-10 | O.D.: 1.5 mm, I.D.: 0.86 mm, 10 cm length |
| Halt Protease and Phosphotase inhibitor cocktail (100x) | Thermo Scientific | 1861281 | Protein homogenization buffer |
| Heating Pad | Thermotech | S766D | Digitial Moist Heating Pad |
| Hemostats | VWR | 10806-188 | Fully surrated jaw; curved |
| Hot Water Bath | Fisher Scientific | 20253 | Isotemp 205 |
| Igf-1 SAM Plasmid (m1) | Santa Cruz Biotechnology | sc-421056-ACT | Dnase-free water provided for dilution |
| Induction Chamber | Vetamac | 941443 | No specific liter size required |
| Isoflurane | Piramal Pharma Limited | NDC 66794-013-25 | |
| Isoproponal/2-Proponal | Fisher Scientific | A451-4 | RNA isolation |
| Ketamine HCl 100mg/ml | Akorn | NDC 59399-114-10 | |
| MgCl2/Magneisum Chloride | Sigma Aldrich | 63069-100ML | 1M. Protein homogenization buffer |
| MicroAmp™ Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode | Fisher Scientific | 4309849 | Barcoded plates not required |
| Microcapillary Tip | Eppendorf | 5196082001 | Attached to BTX Microinjector |
| Microinjector | BTX Harvard Apparatus | 45-0766 | Stainless Steel Pipette Holder, 130 mm Length, for 1 to 1.5 mm Pipettes |
| Microject 1000A (Injection Machine) | BTX Harvard Apparatus | 45-0751 | MicroJect 1000A Plus System |
| Micropipette Puller Model P-97 | Sutter Instrument | P-97 | Flaming/Brown type micropipette puller |
| Microplate Mixer (Plate Shaker) | scilogex | 822000049999 | |
| Mouse/Rat IGF-I/IGF-1 Quantikine ELISA Kit | R & D Systems | MG100 | |
| Needles | BD - Becton, Dickson, and Company | 305106 | 30 Gx 1/2 (0.3 mm x 13 mm) |
| Nitrogen Tank | Linde | 7727-37-9 | Any innert gas |
| Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drug (NSAID) | Norbrook Laboratories Limited | NDC 55529-040-10 | Analesgic such as Meloxicam |
| Nose Cone | Vetamac | 921609 | 9-14 mm |
| Opal 620 detection dye | Akoya Biosciences | SKU FP1495001KT | Used for FISH |
| Optimal Cutting Temperature (O.C.T) Compound | Sakura | 4583 | |
| Oxygen Tank | Linde | 7782 - 44 - 7 | Medical grade oxygen |
| Pestles | USA Scientific Inc | 14155390 | |
| Povidone-Iodine Solution, 5% | Avrio Health L.P. | NDC 67618-155-16 | |
| Power SYBR™ Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4367659 | Use for qPCR |
| Random Hexamers (Random Primers) | New England Biolabs | S1330S | Use for cDNA synthesis |
| Razor Blade | Grainger | 26X080 | |
| RNA Cleanup Kit & Concentrator | Zymo Research | R1013 | |
| RNALater | Thermo Fisher Scientific | AM7021 | |
| RNAscope kit v.2.5 | Advanced Cells Diagnostics | 323100 | Contains all reagents required for fluorescent in situ hybridization. Probes sold separately. |
| RNAscope™ Probe- Mm-Prl8a8-C2 | Advanced Cells Diagnostics | 528641-C2 | |
| RNAscope™ Probe- Vector-dCas9-3xNLS-VP64 | Advanced Cells Diagnostics | 527421 | |
| Roto-Therm Mini | Benchmark | R2020 | Dry oven for in situ hybridization |
| Scissors | VWR | 82027-578 | Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4¹/? |
| Sodium Chloride (Saline) | Hospra | NDC 0409-4888-03 | Sterile, 0.9% |
| Sodium Citrate, Trisodium Salt, Dihydrate, [Citric Acid, Trisodium Dihydrate] | Research Product International | 03-04-6132 | |
| Sodium Hydroxide 1N Concentrate, Fisher Chemical | Fisher Scientific | SS277 | Protein homogenization buffer |
| Steamer | Bella | B00DPX8UBA | |
| Sterile Surgical Drape | Busse | 696 | Sterilize before use |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Surgipath Cover Glass 24x60 | Leica | 3800160 | |
| Syringes | BD - Becton, Dickson, and Company | 309659 | BD Luer Slip Tip Syringe sterile, single use, 1 mL |
| Thermo Scientific™ Invitrogen™ Nanodrop™ One Spectrophotometer with WiFi and Qubit™ 4 Fluorometer | Fisher Scientific | 13-400-525 | This configuration comes with Qubit 4 fluorometer. Qubit quantification not required. |
| Tissue Adhesive | 3M | 1469SB | VetBond |
| Tris HCl | Thermo Fisher Scientific | 15568025 | 1M. Protein homogenization buffer |
| TRIzol™ Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | RNA isolation |
| TSA Buffer Pack | Advanced Cells Diagnostics | 322810 | Used to dilute Opal 620 detection dye |
| Universal F-Circuit | Vetamac | 40200 | Attached to vaporizer and vaporizer accessories |
| Upright Compound Fluorescence Microscope | Olympus | BX61VS | Used for FISH imaging |
| Vectorshield with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Coverslip mounting media |
| ViiA™ 7 Real-Time PCR System with 384-Well Block | Thermo Fisher Scientific | 4453536 | This is for SYBR 384-well block detection. TaqMan and/or smaller blocks available |
| Wet n Wild Nail Polish Wild Shine, Clear Nail Protector, Nail Color | Amazon | C450B | |
| Xylazine 20mg/ml | Anased | 343730_RX |
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