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Genetics

Maus-In-vivo-Plazenta-gezielte CRISPR-Manipulation

Published: April 14, 2023 doi: 10.3791/64760
Automatic Translation
1,2,3, 2,3, 1,2,3,4
1Interdisciplinary Graduate Program in Genetics, University of Iowa, 2Department of Psychiatry, Carver College of Medicine, University of Iowa, 3Iowa Neuroscience Institute, Carver College of Medicine, University of Iowa, 4Hawk-IDDRC, University of Iowa

Summary

In dieser Arbeit beschreiben wir eine zeitspezifische Methode, um kritische Entwicklungswege in der Plazenta der Maus in vivo effektiv zu manipulieren. Dies geschieht durch die Injektion und Elektroporation von CRISPR-Plasmiden in die Plazenta trächtiger Muttertiere am Embryonaltag 12.5.

Abstract

Die Plazenta ist ein essentielles Organ, das die Entwicklung von Säugetieren im Mutterleib reguliert und aufrechterhält. Die Plazenta ist verantwortlich für den Transfer von Nährstoffen und Abfallstoffen zwischen Mutter und Fötus sowie für die Produktion und Abgabe von Wachstumsfaktoren und Hormonen. Plazentare genetische Manipulationen bei Mäusen sind entscheidend für das Verständnis der spezifischen Rolle der Plazenta in der pränatalen Entwicklung. Plazenta-spezifische Cre-exprimierende transgene Mäuse haben eine unterschiedliche Wirksamkeit, und andere Methoden zur Manipulation von Plazenta-Genen können nützliche Alternativen sein. Diese Arbeit beschreibt eine Technik zur direkten Veränderung der plazentaren Genexpression mittels CRISPR-Genmanipulation, mit der die Expression von Zielgenen modifiziert werden kann. Bei einem relativ fortschrittlichen chirurgischen Ansatz werden trächtige Muttertiere am Embryonaltag 12,5 (E12,5) einer Laparotomie unterzogen und ein CRISPR-Plasmid wird durch eine Glasmikropipette in die einzelnen Plazenten eingebracht. Das Plasmid wird sofort nach jeder Injektion elektroporiert. Nach der Wiederherstellung des Muttertiers können sich die Plazenta und die Embryonen bis zur Beurteilung zu einem späteren Zeitpunkt weiterentwickeln. Die Beurteilung der Plazenta und der Nachkommen nach der Anwendung dieser Technik kann die Rolle der zeitspezifischen Plazentafunktion in der Entwicklung bestimmen. Diese Art der Manipulation ermöglicht ein besseres Verständnis dafür, wie sich die Genetik und Funktion der Plazenta auf das Wachstum und die Entwicklung des Fötus in verschiedenen Krankheitskontexten auswirkt.

Introduction

Die Plazenta ist ein wesentliches Organ, das an der Entwicklung des Fötus beteiligt ist. Die Hauptaufgabe der Plazenta besteht darin, wesentliche Faktoren bereitzustellen und den Transfer von Nährstoffen und Abfallstoffen zum und vom Fötus zu regulieren. Die Plazenta von Säugetieren besteht sowohl aus fötalem als auch aus mütterlichem Gewebe, die die Schnittstelle zwischen Fötus und Mutter bilden, und so wirkt sich die Genetik sowohl der Mutter als auch des Fötus auf die Funktionaus 1. Genetische Anomalien oder eine gestörte Funktion der Plazenta können die Entwicklung des Fötus drastisch verändern. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass die Genetik und Entwicklung der Plazenta mit der veränderten Entwicklung bestimmter Organsysteme beim Fötus verbunden ist. Insbesondere Anomalien in der Plazenta sind mit Veränderungen des fetalen Gehirns, des Herzens und des Gefäßsystems verbunden 2,3,4,5.

Der Transport von Hormonen, Wachstumsfaktoren und anderen Molekülen von der Plazenta zum Fötus spielt eine wichtige Rolle bei der Entwicklung des Fötus6. Es hat sich gezeigt, dass die Veränderung der Plazentaproduktion bestimmter Moleküle die Neuroentwicklung verändern kann. Eine mütterliche Entzündung kann die Produktion von Serotonin erhöhen, indem sie die metabolische Genexpression von Tryptophan (TRP) in der Plazenta verändert, was in der Folge zu einer Anhäufung von Serotonin im fetalen Gehirn führt7. Andere Studien haben neben Herzfehlern auch Plazentaanomalien gefunden. Es wird angenommen, dass Anomalien in der Plazenta zu angeborenen Herzfehlern beitragen, dem häufigsten Geburtsfehler beim Menschen8. Eine kürzlich durchgeführte Studie hat mehrere Gene identifiziert, die sowohl in der Plazenta als auch im Herzen ähnliche zelluläre Signalwege aufweisen. Wenn diese Signalwege gestört sind, können sie zu Defekten in beiden Organen führen9. Die Defekte in der Plazenta können angeborene Herzfehler verschlimmern. Die Rolle der Plazentagenetik und -funktion bei der Entwicklung spezifischer fetaler Organsysteme ist ein aufstrebendes Forschungsgebiet.

Mäuse haben hämochoriale Plazenten und andere Merkmale menschlicher Plazenten, was sie zu sehr nützlichen Modellen für die Erforschung menschlicher Krankheiten macht1. Trotz der Bedeutung der Plazenta fehlt es derzeit an gezielten in vivo Genmanipulationen. Darüber hinaus stehen derzeit mehr Optionen für Knockouts oder Knockdowns zur Verfügung als für Überexpressions- oder Gain-of-Function-Manipulationen in der Plazenta10. Es gibt mehrere transgene Cre-exprimierende Linien für plazentaspezifische Manipulationen, jede in verschiedenen Trophoblastenlinien zu unterschiedlichen Zeitpunkten. Dazu gehören Cyp19-Cre, Ada/Tpbpa-Cre, PDGFRα-CreER und Gcm1-Cre 11,12,13,14. Obwohl diese Cre-Transgene effizient sind, sind sie möglicherweise nicht in der Lage, einige Gene zu bestimmten Zeitpunkten zu manipulieren. Eine weitere häufig verwendete Methode, um die plazentare Genexpression entweder auszuknocken oder zu überexprimieren, ist die Insertion lentiviraler Vektoren in die Blastozystenkultur, was zu einer trophoblastenspezifischen genetischen Manipulation führt15,16. Diese Technik ermöglicht eine robuste Veränderung der Plazenta-Genexpression in einem frühen Entwicklungsstadium. Die Verwendung von RNA-Interferenz in vivo wurde in der Plazenta nur spärlich genutzt. Die Insertion von shRNA-Plasmiden kann ähnlich wie die in dieser Arbeit beschriebene CRIPSR-Technik durchgeführt werden. Dies wurde bei E13.5 durchgeführt, um die PlGF-Expression in der Plazenta erfolgreich zu verringern, mit Auswirkungen auf das Gehirnsystem der Nachkommen17.

Zusätzlich zu Techniken, die in erster Linie für Knockout oder Knockdown verwendet werden, wird die Induktion einer Überexpression häufig mit Adenoviren oder der Insertion eines exogenen Proteins durchgeführt. Die Techniken, die für die Überexpression verwendet werden, haben unterschiedliche Erfolgsraten und wurden meist später in der Trächtigkeit durchgeführt. Um die Rolle des insulinähnlichen Wachstumsfaktors 1 (IGF-1) in der Plazentafunktion zu untersuchen, wurde ein adenoviral vermittelter Plazenta-Gentransfer durchgeführt, um die Überexpression des IGF-1-Gens zu induzieren18,19. Dies wurde spät in der Trächtigkeit der Maus auf E18.5 mittels direkter Plazentainjektion durchgeführt. Um zusätzliche Optionen bereitzustellen und mögliche Misserfolge etablierter plazentagenetischer Manipulationen, wie z. B. Cre-Lox-Kombinationsfehler, die mögliche Toxizität von Adenoviren und die Off-Target-Effekte von shRNA, zu umgehen, kann in vivo die direkte CRISPR-Manipulation der Plazenta verwendet werden20,21,22. Dieses Modell wurde entwickelt, um das Fehlen von Überexpressionsmodellen zu beheben und ein Modell mit Flexibilität zu erstellen.

Diese Technik basiert auf der Arbeit von Lecuyer et al., in der shRNA- und CRISPR-Plasmide direkt in vivo auf die Plazenta der Maus gerichtet wurden, um die PlGF-Expression zu verändern 17. Diese Technik kann verwendet werden, um die Plazenta-Genexpression durch CRISPR-Manipulation zu mehreren Zeitpunkten direkt zu verändern. für diese Arbeit wurde E12.5 ausgewählt. Die Plazenta ist zu diesem Zeitpunkt gereift und groß genug, um sie zu manipulieren, was die Insertion eines spezifischen CRISPR-Plasmids auf E12.5 ermöglicht, was einen erheblichen Einfluss auf die fetale Entwicklung von der mittleren bis zur späten Schwangerschaft haben kann23,24. Im Gegensatz zu transgenen Ansätzen, aber ähnlich wie bei viralen Induktionen oder RNA-Interferenzen, ermöglicht diese Technik eine Überexpression oder einen Knockout zu bestimmten Zeitpunkten mit einem relativ fortschrittlichen chirurgischen Ansatz, wodurch eine mögliche Beeinträchtigung der Plazentation oder embryonale Letalität durch frühere Veränderungen vermieden wird. Da nur wenige Plazenten das Versuchs- oder Kontrollplasmid innerhalb eines Wurfes erhalten, erlaubt der Ansatz zwei Arten von internen Kontrollen. Bei diesen Kontrollen handelt es sich um solche, die mit dem entsprechenden Kontrollplasmid injiziert und elektroporiert werden, und solche, die keine direkte Manipulation erhalten. Diese Technik wurde optimiert, um eine Überexpression des IGF-1-Gens in der Mausplazenta über ein synergistisches Aktivierungsmediator (SAM) CRISPR-Plasmid zu erzeugen. Die Wahl fiel auf das IGF-1-Gen, da es sich bei IGF-1 um ein essentielles Wachstumshormon handelt, das dem Fötus zugeführt wird und vor der Geburt hauptsächlich in der Plazenta produziert wird25,26. Diese neue, auf die Plazenta ausgerichtete CRISPR-Technik wird eine direkte Manipulation ermöglichen, um den Zusammenhang zwischen Plazentafunktion und fetaler Entwicklung zu definieren.

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Protocol

Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Bundesvorschriften und den Richtlinien der University of Iowa durchgeführt und vom Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt.

1. Tiere und Haltung

  1. Halten Sie die Tiere in einem 12-stündigen Tageslichtzyklus mit Futter und Wasser ad libitum.
  2. Verwenden Sie weibliche CD-1-Mäuse im Alter von 8-15 Wochen. Verwenden Sie das Vorhandensein eines Kopulationspfropfens, um E0.5 zu identifizieren.
  3. Auf E0.5 werden die trächtigen Mütter einzeln untergebracht.

2. Kalibrierung der Mikropipette

HINWEIS: Die Kalibrierung der Mikropipette sollte nach Möglichkeit vor der Operation durchgeführt werden.

  1. Vor der Herstellung und Kalibrierung der Mikropipette werden alle Plasmide auf die empfohlene Konzentration (0,1 μg/μl) in DNasefreiem Wasser verdünnt. Mischen Sie das Plasmid mit entsprechend verdünntem Fast Green-Farbstoff (1 μg/μl in PBS) (endgültige Plasmidkonzentration: 0,06 μg/μl).
  2. Ziehen Sie Mikropipetten mit 10 cm Glaskapillaren mit einem Außendurchmesser von 1,5 mm und einem Innendurchmesser von 0,86 mm mit einem Mikropipettenzieher.
  3. Brechen Sie die Spitze einer Mikropipette (2-3 mm) vorsichtig mit einer sterilen Pinzette ab.
  4. Füllen Sie die Mikropipette in eine Mikrokapillarspitze, die an einem Mikroinjektor befestigt ist. Stellen Sie sicher, dass der Mikroinjektor an der Mikroinjektionsmaschine angebracht ist und dass genügend Stickstoff vorhanden ist, um die Mikropipette zu kalibrieren.
  5. Sobald die Mikropipette am Mikroinjektor befestigt ist, beladen Sie sie mit der Fast Green-Farbstofflösung, um die Kalibrierung durchzuführen (1 μg/μl in PBS). Kalibrieren Sie die Mikropipette, um ein Volumen von ca. 3,5 μl zu injizieren. Entleeren ("reinigen") Sie die Mikropipette, um die Beladung der Plasmidlösungen wie folgt vorzubereiten.
    Anmerkungen: Jede Mikropipette ist etwas anders. Um eine Schädigung der Plazenta während der Injektion zu vermeiden, sollte die Injektionszeit zwischen 0,5-1,5 s eingestellt werden. Der Druck sollte zwischen 1 und 8,5 psi eingestellt werden. Kalibrieren Sie jede Mikropipette separat. Wenn die Mikropipette nicht innerhalb dieser Parameter kalibriert werden kann, sollte sie nicht verwendet werden.

3. Chirurgie (Abbildung 1A)

Anmerkungen: Reinigen Sie zur Vorbereitung die Oberflächen sowohl des Präparations- als auch des Operationsbereichs mit 70 % Ethanol. Legen Sie eine saugfähige Unterlage in den Vorbereitungsbereich. Legen Sie im Operationsbereich ein Heizkissen ab und legen Sie dann eine saugfähige Unterlage darauf. Sterilisieren Sie alle Werkzeuge vor der Operation. Die Zeit, in der der Damm unter Narkose steht, sollte unter 1 Stunde liegen.

  1. Betäubung
    1. Verabreichen Sie dem trächtigen Muttertier 30 Minuten bis 1 Stunde vor der Operation 5 mg/kg NSAR (Meloxicam) oder ein anderes zugelassenes Analgetikum.
    2. Legen Sie die trächtige Mutter in eine Induktionskammer, die an einem Isofluran-Verdampfer befestigt ist.
    3. Stellen Sie den Verdampfer auf 4% Isofluran und 3,5 l/min Sauerstoff ein.
    4. Sobald die Anästhesie durch das Ausbleiben des Ansprechens auf ein Zehenzwicken und eine reduzierte Atemfrequenz bestätigt wurde, entfernen Sie den Damm aus der Induktionskammer in den Präparationsbereich.
  2. Vorbereitung auf die Operation
    1. Legen Sie den Damm in Rückenlage mit einem Nasenkegel in den Vorbereitungsbereich.
    2. Reduzieren Sie den Verdampfer auf 2% Isofluran und 3,5 l/min Sauerstoff, während sich der Damm im Nasenkegel befindet.
    3. Rasieren Sie den Bauch des Muttertiers gründlich und entfernen Sie überschüssiges Fell. Beschichten Sie den rasierten Bauch abwechselnd dreimal mit Povidon-Lösung und 70%igem Ethanol mit sterilen Applikatoren mit Wattespitze. Tragen Sie die letzte Schicht Povidon-Lösung auf. Um ein Austrocknen der Hornhaut zu verhindern, tragen Sie künstliches Tränengel auf beide Augen des Muttertiers auf (Abbildung 2A, B).
    4. Bewegen Sie nach der Präparation den Damm mit dem Nasenkegel in den dafür vorgesehenen Operationsbereich.
  3. Uterus Laparotomie
    Anmerkungen: Verwenden Sie während des gesamten chirurgischen Eingriffs sterile Handschuhe. Wechseln Sie die Handschuhe, wenn eine unsterile Oberfläche berührt wird.
    1. Legen Sie im Operationsbereich den Damm in Rückenlage und befestigen Sie den Nasenkegel mit Klebeband. Stellen Sie das Heizkissen unter dem saugfähigen Pad auf 45 °C ein.
    2. Machen Sie mit einer Pinzette und einer Schere einen ca. 2 cm langen Schnitt in der Mittellinie durch die Haut. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Haut zu spannen, und machen Sie einen vertikalen Schnitt in die Haut. Machen Sie danach einen weiteren ähnlich großen Schnitt durch das Bauchfell, um die Gebärmutterhörner freizulegen. Zelten Sie das Bauchfell mit einer Pinzette, während Sie den vertikalen Schnitt machen (Abbildung 2C, D).
      HINWEIS: Wenn das Bauchfell nicht richtig eingeschnitten wird, kann dies zu einem tödlichen Einschnitt des Darms führen.
    3. Massieren Sie die Gebärmutterhörner sanft durch den Schnitt, indem Sie auf die Seiten des Bauches drücken. Führen Sie dazu die Gebärmutter vorsichtig und ohne Hilfsmittel und nur mit den Fingern, um versehentliche Verletzungen zu vermeiden. Legen Sie den freiliegenden Uterus auf ein steriles OP-Tuch, das den Bauch des Damms bedeckt, und halten Sie es während der gesamten Operation mit Tropfen steriler Kochsalzlösung feucht, die vor der Anwendung bei Bedarf auf 30 °C erwärmt werden kann (Abbildung 2E, F).
      ANMERKUNG: Die Uterushörner können wie in Wang et al.27 beschrieben identifiziert werden.
    4. Sobald die Gebärmutter freigelegt ist, wählen Sie drei Plazentapaare zur Manipulation aus.
      HINWEIS: Die Plazenta können wie von Elmore et al.24 beschrieben identifiziert werden. Um das Überleben der Embryonen zu maximieren, sollten nicht mehr als 6 Plazenten behandelt werden. Wenn weniger als 12 Embryonen vorhanden sind, sollten nicht mehr als 4 Plazenten injiziert werden. Wählen Sie zwei benachbarte Plazenten aus, so dass eine eine Kontrollinjektion und die andere das experimentelle Plasmid erhält. Die Verwendung von zwei benachbarten Plazenten ermöglicht einen besseren Vergleich von Plazenten an ähnlichen Stellen in der Gebärmutter und ermöglicht auch eine erhöhte Überlebensrate. Die ausgewählten Plazentapaare werden zufällig ausgewählt und in beiden Uterushörnern verteilt (Abbildung 1B).
    5. Zeichnen Sie die Lage der Plazentamanipulationen und die Organisation der Embryonen in den Uterushörnern auf, damit die Embryonen und Plazenten während der Entnahme identifiziert werden können, da ein Damm sowohl Kontroll- als auch experimentell behandelte Plazenten/Embryonen trägt.
  4. Plazentainjektion und Elektroporation des Kontrollplasmids
    Anmerkungen: Um eine aseptische Technik beizubehalten, sterilisieren Sie die Elektroporationspaddel und den Mikroinjektor vor dem Gebrauch mit einem kalten Sterilisationsmittel. Wechseln Sie die Handschuhe, wenn eine unsterile Oberfläche berührt wird.
    1. Laden Sie mit der kalibrierten Mikropipette eine ausreichende Menge des entsprechenden Kontrollplasmids für drei Injektionen. Führen Sie alle Injektionen in einer Tiefe von ~0,5 mm seitlich in die Plazenta zwischen der Dezidua (weiß) und der Verbindungszone (dunkelrot) durch (Abbildung 3A-F).
    2. Führen Sie Injektionen in die drei Kontrollplazenten durch.
      Anmerkungen: Führen Sie alle Kontrollplasmidinjektionen vor den experimentellen Injektionen durch, um eine Kreuzkontamination der Plasmide mit der Mikropipette zu vermeiden. Auf diese Weise kann dieselbe Mikropipette verwendet werden, da der Wechsel der Mikropipetten und der Kalibrierzeit die Operationszeit drastisch verlängert und das Überleben des Muttertiers verringert.
    3. Führen Sie die Elektroporation der mit Kontrollplasmid injizierten Plazenten innerhalb von 2 Minuten nach der Injektion durch.
    4. Verwenden Sie für die Elektroporation ein Paar 3-mm-Paddel, die an einer Elektroporationsmaschine befestigt sind. Um die Effizienz der CRISPR-Inkorporation und die Lebensfähigkeit von Embryonen zu gewährleisten, verwenden Sie die folgenden Elektroporationseinstellungen: 2 Impulse, 30 V, 30 ms Impuls, 970 ms Impuls aus, unipolar.
    5. Nach der Injektion, aber unmittelbar vor der Elektroporation, beschichten Sie die Kontaktstellen mit steriler Kochsalzlösung und tragen Sie die Kochsalzlösung mit einer Pipette oder Spritze genau auf die drei Stellen der Gebärmutterwand und der Paddel auf.
    6. Drücken Sie die Elektroporationspaddel vorsichtig auf die seitlichen Seiten der Plazenta. Platzieren Sie das Anodenpaddel über der Injektionsstelle und der Kathode direkt gegenüber (Abbildung 4A-C).
    7. Drücken Sie den Impuls an der Elektroporationsmaschine und warten Sie, bis die beiden Impulse abgeschlossen sind, bevor Sie die Elektroporationspaddel entfernen.
      Anmerkungen: Während des Pulses ist oft eine kleine Menge weißer Schaum zwischen den Paddeln und der Plazenta zu sehen. Wenn dies nicht der Fall ist, überprüfen Sie vor dem weiteren Gebrauch die Spannung der Paddel mit einem Voltmeter. Wenn der Messwert auf dem Voltmeter nicht mit der eingestellten Elektroporationsspannung übereinstimmt, sind die Paddel nicht funktionsfähig.
  5. Plazentainjektion und Elektroporation des experimentellen Plasmids
    1. Befolgen Sie die gleichen Anweisungen wie in Schritt 3.4.1. zu Schritt 3.4.2. Verwendung des experimentellen Plasmids anstelle des Kontrollplasmids.
    2. Führen Sie die Elektroporation aller drei experimentell injizierten Plazenten innerhalb von 2 Minuten nach der Injektion durch. Dies sollte auf die gleiche Weise durchgeführt werden wie bei denen, die mit den Kontrollplasmiden injiziert werden. Befolgen Sie Schritt 3.4.4. zu Schritt 3.4.7.
  6. Abschluss der Operation
    1. Sobald die Plazentamanipulation abgeschlossen ist, massieren Sie die Gebärmutterhörner sanft nur mit den Fingern zurück in die Bauchhöhle (Abbildung 5A).
    2. Führen Sie zunächst doppelt geknotete Einzelnähte auf der Peritoneumschicht mit beschichteten und geflochtenen auflösbaren Nähten von 45 cm Länge mit einer 13 mm 3/8c-Nadellegierung durch. Abstand zwischen den Nähten 2-3 mm (Abbildung 5B).
    3. Nachdem Sie die Bauchfellschicht vernäht haben, vernähen Sie die Haut mit auflösbaren Nähten. Verknoten Sie die einzelnen Nähte im Abstand von 2-3 mm dreifach, um sicherzustellen, dass der Damm die Naht nicht lösen kann (Abbildung 5C).
    4. Sobald die Naht abgeschlossen ist, stellen Sie das Isofluran auf 1 % und den Sauerstoffgehalt auf 3,5 l/min ein und tragen Sie Gewebekleber auf die Nähte auf der Haut auf (Abbildung 5D).
      Anmerkungen: Gewebekleber ist optional, wird aber empfohlen, um ein erneutes Öffnen des Einschnitts durch Kauen des Damms zu verhindern.
    5. Wenn der Gewebekleber getrocknet ist, schalten Sie den Verdampfer aus und entfernen Sie den Damm aus dem Operationsbereich. Legen Sie den Damm in einen stützenden Käfig auf den Rücken.

4. Nachsorge und Überwachung

  1. Lassen Sie die trächtige Mutter mindestens 30 Minuten lang in einem sauberen Käfig unter Aufsicht genesen, um sicherzustellen, dass keine unmittelbaren Komplikationen der Operation auftreten. Beobachten Sie, bis es vollständig gehfähig ist und ohne Hilfe auf die Füße springen kann. Einzelne Unterbringung des Damms nach der Operation.
  2. Verfolgen Sie die institutionelle postoperative Betreuung und Überwachung bis zur Embryonenentnahme. Notieren Sie das Gewicht des Damms und überwachen Sie täglich die Nähte und die Inzisionsstelle.

5. E14.5 Plazentaentnahme

  1. Bei E14.5 wird der Damm mit einem Ketamin/Xylazin-Cocktail (1 mg/ml Ketamin und 0,1 mg/ml Xylazin) tief betäubt und anschließend zervikal disloziert.
  2. Machen Sie mit einer Schere einen V-förmigen Schnitt in den Bauch des Damms und entfernen Sie die Gebärmutter. Sofort auf eine 5 cm Petrischale auf Eis stellen. Mit einer Pinzette wird der Embryo und die dazugehörige Plazenta vorsichtig aus der Gebärmutter entfernt.
    HINWEIS: Zeichnen Sie die Position des Embryos und die entsprechende Plazenta in den Gebärmutterhörnern auf, um festzustellen, welcher Embryo während der Operation direkt manipuliert wurde.
  3. Notieren Sie die Plazentagewichte. Schneiden Sie die Plazenta mit einer RNAse-freien Pinzette und einem Rasierer entlang der Mittellinie in zwei Hälften. Eine Hälfte in 4%iges PFA bei 4 °C geben. Schneiden Sie die restliche Hälfte wieder in zwei Hälften und lagern Sie die restlichen zwei Viertel bei −80 °C in zwei Röhrchen, eines davon mit RNA-Speicherreagenz.
    HINWEIS: Embryonen und anderes mütterliches Gewebe können aus der Sammlung bei −80 °C für die zukünftige Verwendung gelagert werden.

6. Analyse der Genexpression der Plazenta

  1. Verwenden Sie das Viertel der Plazenta, das bei −80 °C in einem RNA-Speicherreagenz gelagert wird.
  2. Verarbeiten Sie die Plazenten für die qPCR, wie in Elser et al. beschrieben, unter Verwendung der Trizol-Methode zur RNA-Isolierung, eines Spektralphotometers für die RNA-Konzentration, eines cDNA-Synthesekits und der qPCR mit SYBR Green Master Mix28. Verwenden Sie anstelle der Turbo-DNAfree-Kit-DNAse, auf die in Elser et al. verwiesen wird, nach der Trizol-RNA-Isolierung ein RNAcleanup-Kit, um sicherzustellen, dass die Proben keine Verunreinigungenenthalten 28.
    HINWEIS: Lesen Sie das Sicherheitsdatenblatt (MSDS) für Trizol und verwenden Sie es in einem chemischen Abzug.
  3. Beurteilen Sie die Plasmidinsertion des Kontrollplasmids mit GFP-Primern und des experimentellen Plasmids mit BLAST-Primern (Primer in Ergänzungstabelle 1). Verwenden Sie den CT-Wert, um das Vorhandensein des Plasmids zu bestimmen.
    HINWEIS: CT-Werte über 35 sind falsch positive Ergebnisse, und nur solche unter 35 sollten als positiver Indikator dafür angesehen werden, dass das Plasmid erfolgreich eingesetzt wurde.
  4. Die IGF-1-Plazentaexpression, die auf das Housekeeping-Gen 18s normalisiert ist, wird beurteilt (Primer sind in der ergänzenden Tabelle 1 aufgeführt). Verwenden Sie die ddCT-Methode, um die Faltungsänderung zu berechnen, und berechnen Sie dann die normalisierte Faltungsänderung der experimentellen Stichproben auf die mittlere Faltungsänderung der Kontrollstichproben.

7. Analyse des Plazentaproteinspiegels

  1. Verwenden Sie das Viertel der Plazenta, das bei −80 °C gelagert wurde. Das Gewebe wird in einer Pufferlösung aus 11,5 mM Tris HCl, 5 mM MgCl2 und 10 mM Proteaseinhibitor indiH2O mit einem End-pH-Wert von7,4 homogenisiert. Verwenden Sie einen Handhomogenisator und einen Stößel, um das Gewebe aufzubrechen.
    Anmerkungen: Die Probe sollte 10 % des Volumens des Puffers nicht überschreiten.
  2. Verdünnen Sie die homogenisierten Proben im Puffer im Verhältnis 1:12, so dass sie sich im nachweisbaren Bereich eines Bicinchoninsäure-Assay-Kits (BCA) befinden. Führen Sie den BCA-Assay gemäß den Anweisungen des Herstellers durch und quantifizieren Sie das Gesamtprotein mit einem Plattenlesegerät.
  3. Nach der Durchführung des BCA-Assays werden alle Proben für den IGF-1-ELISA auf die gleiche Gesamtproteinkonzentration von 2 mg/ml normalisiert, wie dies in Gumusoglu et al.29 der Fall war.
  4. Führen Sie den IGF-1-ELISA gemäß den Anweisungen des Herstellers durch und quantifizieren Sie die IGF-1-Proteinspiegel mit einem Plattenlesegerät unter Verwendung einer Standardkonzentrationskurve.

8. Räumliche CRIPSR-Verifikation mittels Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungsmarkierung

  1. Nachdem die Plazentahälften 1-3 Tage lang in 4%igem PFA bei 4 °C fixiert wurden, werden sie in 20%ige Saccharose bei 4 °C eingeschoben, bevor sie in optimaler Schnitttemperatur (OCT) eingefroren werden.
  2. Die in OCT eingebetteten Plazentahälften werden in einem −20 °C-Kryostaten seriell in 10-μm-Schnitte geschnitten und auf Objektträger gelegt, um sie zu beschriften. Schneiden Sie die Plazentahälften so, dass alle drei Teilregionen sichtbar sind. Lagern Sie die Objektträger bei −80 °C, bis sie für die In-situ-Hybridisierung verwendet werden.
  3. Führen Sie eine Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungsmarkierung (FISH) gemäß den Protokollen des Herstellers durch. Hybridisieren Sie einen Objektträger mit einer dCas9-3xNLS-VP64-Sonde und einen zweiten "Schwester"-Objektträger der gleichen Plazenta mit einer Prl8a8-Sonde.
    HINWEIS: Die Sonde dCas9-3xNLS-VP64 detektiert das Vorhandensein des Überexpressionsplasmids. Die Prl8a8-Sonde hebt Spongiotrophoblasten der Junktionszone hervor, wodurch die Subregionen der Plazenta identifiziert werden können. Diese beiden Sonden sind auf separaten "Schwester"-Objektträgern beschriftet, um eine Interferenz der Mehrkanalfluoreszenz mit der grünen Autofluoreszenz in der Plazenta zu vermeiden.
  4. Beschriften Sie beide Sonden mit dem Detektionsfarbstoff (Opal 620). Nachdem Sie das Protokoll des Herstellers für FISH ausgefüllt haben, tragen Sie DAPI-Eindeckmedium auf und legen Sie ein Deckglas auf den Objektträger. Versiegeln Sie das Deckglas mit klarem Nagellack.
  5. Stellen Sie die Objektträger auf einem aufrechten Fluoreszenzmikroskop dar und verarbeiten Sie sie mit einer geeigneten Bildverarbeitungssoftware. Hier kam die Software CellSens zum Einsatz.

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Representative Results

Allgemeine Behandlungsergebnisse (Abbildung 6)
In der Studie gab es drei manipulierte Gruppen. Dazu gehörten Plazenten, die mit einem allgemeinen CRISPR-Cas9-Kontrollplasmid (Cas9-Kontrolle), einem CRISPR-Plasmid zur Aktivierungskontrolle (Act Control) oder einem IGF-1-SAM-Aktivierungsplasmid (Igf1-OE) injiziert wurden. Die Cas9-Kontrolle ist besser für Knockout-Plasmide geeignet, und die Aktivierungskontrolle ist besser für Überexpressions-/Aktivierungsplasmide geeignet. Um die Viabilitätsveränderungen zu beurteilen, die durch die Manipulation der Plazenta durch Injektion und Elektroporation verursacht werden, wurde das Überleben der Embryonen innerhalb des Wurfes an E14.5 analysiert (Abbildung 6A). Dieser Zeitpunkt wurde gewählt, da andere Studien, die die In-vivo-Insertion von CRISPR-Plasmiden mittels Elektroporation durchgeführt haben, gezeigt haben, dass Expressionsänderungen innerhalb von 8-22 h erreicht werden können30,31,32. Die Sammlung an E14.5 ermöglicht es dem CRISPR-Plasmid ca. 48 Stunden, sich zu integrieren und eine Erhöhung der Genexpression zu aktivieren. Es wurde festgestellt, dass die chirurgische Manipulation des Damms das Überleben aller Embryonen beeinflusste, aber die Embryonen, die mit den manipulierten Plazenten assoziiert waren, die einer Injektion und Elektroporation unterzogen wurden, hatten das Überleben signifikant reduziert. Die Überlebensrate der unbehandelten Embryonen (im selben Wurf, aber ohne gezielte Manipulation) konnte von 100% Überleben auf durchschnittlich 79,05% gesenkt werden. Das Überleben der manipulierten Embryonen verringerte sich signifikant mit einer durchschnittlichen Überlebensrate von 55,56%. Es wurde kein signifikanter Unterschied zwischen den drei manipulierten Gruppen gefunden.

Um festzustellen, ob signifikante grobe Veränderungen in den manipulierten Plazenten auftraten, wurde das Plazentagewicht aufgezeichnet. Es gab keinen signifikanten Unterschied im Plazentagewicht einer Gruppe (Abbildung 6B), und das grobe Erscheinungsbild der Plazenta und des Embryos blieb unverändert. Repräsentative Bilder nach der Nekroskopie wurden mit einem Präpariermikroskop bei der Entnahme auf E14.5 aufgenommen. Es wurden Bilder der Plazenta/Embryonen aus verschiedenen Behandlungsgruppen gemacht, die alle innerhalb desselben Wurfes lagen. Es gab keine auffällige Schädigung oder Veränderung des phänotypischen Erscheinungsbildes in keiner Behandlungsgruppe, weder in der Fruchtblase noch im exponierten Embryo und der entsprechenden Plazenta (Abbildung 6D-I). Während bei der Verwendung eines IGF-1-Aktivierungsplasmids keine groben Unterschiede in der Morphologie der manipulierten Gruppen festgestellt wurden, gilt dies möglicherweise nicht für andere experimentelle Plasmide, die auf andere Gene abzielen, die wesentliche Wachstums- und Funktionsregulatoren der Plazenta oder des Embryos stärker beeinflussen können. Es wurden in keiner Weise Unterschiede zwischen der Cas9-Kontrollplazenta und der Akt-Kontrollplazenta gefunden. Daher wurden diese beiden Gruppen zusammengefasst und für alle Analysen als Con oder Controls bezeichnet. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Manipulation der Plazenta in utero auf E12.5 mit dieser Technik zu einer Verringerung des Überlebens des Embryos führt, aber es besteht immer noch eine signifikante Lebensfähigkeit. Die Ergebnisse zeigen auch, dass das Plazentawachstum insgesamt nicht signifikant beeinflusst wird, da es keine signifikante Gewichtsänderung zwischen den manipulierten und unbehandelten Plazenten gab. Dies zeigt, dass die vorgeschlagene Technik das Überleben gesunder und lebensfähiger CRISPR-manipulierter Plazenten und ihrer entsprechenden Embryonen ermöglichen kann.

Die Gewichtsveränderung der Mutter wurde jeden Tag nach der Operation vor der Embryonenentnahme auf E14.5 aufgezeichnet (Abbildung 6C). Die Operation fand auf E12.5 statt, so dass alle Gewichtsänderungen der Mutter relativ zum Gewicht auf E12.5 aufgeführt sind. Die experimentellen (Exp-)Dämme wurden einer Plazenta-Manipulation unterzogen, während die Schein-Dämme einer Anästhesie und einer Laparotomie von ähnlicher Dauer ohne Plazenta-Manipulation unterzogen wurden. Viele trächtige Muttertiere zeigten am Tag nach dem Eingriff eine leichte Gewichtsabnahme oder keine Gewichtsveränderung (E13.5); Dies war wahrscheinlich auf eine gestörte Nahrungsaufnahme während und kurz nach der Operation zurückzuführen. Die meisten Muttertiere zeigten ein erhöhtes Gewicht auf E14.5, aber gelegentlich wurde immer noch eine Gewichtsabnahme beobachtet. Die Nachverfolgung des mütterlichen Muttergewichts nach der Operation ermöglichte die Überwachung des Überlebens der Embryonen. Unterschiede zwischen dem Gewicht der trächtigen Muttertiere nach der Operation waren üblich und deuteten nicht darauf hin, dass alle behandelten Embryonen verloren gingen. Es gab keine signifikanten Unterschiede in den postoperativen Gewichtsveränderungen bei den Schein- und Versuchsmuttern. Dies zeigt, dass das Wohlbefinden des Damms nach dem Einsetzen der CRISPR-Plasmide in die Plazenta im Allgemeinen erhalten blieb. Insgesamt zeigt dies, dass diese chirurgische Technik zwar zu einer Verringerung der Lebensfähigkeit von Embryonen führen kann, aber immer noch einen erheblichen Prozentsatz gesunder Nachkommen liefert, die für die Studie verwendet werden können.

Analyse der Expression und des CRISPR-Einbaus in E14.5-Plazenten (Abbildung 7)
Um festzustellen, ob die zelluläre Insertion des IGF-1-Aktivierungsplasmids für die Überexpression von IGF-1 erfolgreich war, wurde eine qPCR durchgeführt. Wie erwartet, zeigte die qPCR einen signifikanten Anstieg der IGF-1-Expression in den IGF1-OE-Plazenten im Vergleich zu den Kontrollplazenten, wenn die Faltungsänderung auf 18s-Expression normalisiert wurde (Welch-t-Test, p = 0,0302) (Abbildung 7A). Um festzustellen, ob die IGF-1-Proteinspiegel verändert waren, wurde ein ELISA an den Plazenten aller Gruppen durchgeführt. In Übereinstimmung mit der qPCR zeigte die ELISA-Beurteilung der E14.5-Plazenten einen signifikanten Anstieg der IGF-1-Proteinspiegel in den IGF1-OE-Plazenten im Vergleich zu den Kontrollplazenten (Welch-t-Test, p = 0,0469) (Abbildung 7B). Die qPCR und der ELISA zeigten, dass das Überexpressionsplasmid die IGF-1-Genexpression bzw. die IGF-1-Proteinproduktion erfolgreich erhöhte.

Um sicherzustellen, dass die Abgabe des Plasmids spezifisch für die manipulierten Plazenten war, wurde eine qPCR für das spezifische IGF-1-Aktivierungsplasmid und das CRISPR-Cas9-Kontrollplasmid durchgeführt. Diese qPCRs wurden sowohl an den manipulierten Plazenten als auch an den unbehandelten Plazenten durchgeführt, die an die injizierten Plazenten angrenzten. Die qPCR-Primer, die zur Beurteilung der Aktivierungsplasmidexpression verwendet wurden, zielten auf eine Sequenz des BLAST-Plasmids ab, das Teil des Aktivierungssystems ist (Abbildung 7C). Die unbehandelten Plazenten zeigten kein Vorhandensein des BLAST-Plasmids (Zyklusschwelle [CT] unbestimmt, in der Grafik mit 40 gekennzeichnet), und die Igf1-OE-Plazenten zeigten eine CT um 30. Die qPCR, die zur Beurteilung der Kontrollplasmidexpression durchgeführt wurde, zielte auf eine Sequenz des eingefügten GFP-Gens ab (Abbildung 7D). Die unbehandelten Plazenten wiesen CT-Werte über 35 auf, was wahrscheinlich auf eine Dimerisierung des Primers zurückzuführen ist, da diese Werte außerhalb des erwarteten Expressionsbereichs liegen. Die Kontrollen zeigten einen CT-Wert von ca. 30. Diese qPCRs dienen als Qualitätskontrolle, um die erwartete Überexpression von IGF-1 oder deren Fehlen zu demonstrieren und dass die Plasmide nur in den erwarteten manipulierten Plazenten vorhanden sind.

Die räumliche Verifizierung des IGF-1-Aktivierungsplasmids erfolgte mittels Plazentaschnitten. Plazenta, die in OCT-Compound fixiert und eingefroren wurden, wurden seriell bei 10 μm auf Objektträger geschnitten, so dass alle Schichten sichtbar waren. Die Objektträger wurden dann bei −80 °C eingefroren, bis sie für die FISH-Kennzeichnung verwendet wurden. Um zu überprüfen, wo in der Plazenta das IGF-1 CRISPR-Aktivierungsplasmid eingebaut wurde, wurde eine dCas9-3xNLS-VP64-Sonde mit roter Fluoreszenzmarkierung verwendet. Diese Sonde zielt auf eine funktionale Komponente des Aktivierungssystems ab. Die grüne Autofluoreszenz wurde verwendet, um die Subregionen der plazentaren Schnittstelle zwischen Mutter und Fötus zu demonstrieren (Abbildung 7E,F). In den unbehandelten Plazenten konnte kein dCas9-3xNLS-VP64 nachgewiesen werden, da sie nicht mit CRISPR-Manipulation behandelt worden waren (Abbildung 7E). Wie erwartet, zeigten die IGF1-OE-Plazenten eine Markierung für dCas9-3xNLS-VP64, die in Rot dargestellt ist (Abbildung 7F). Die CRISPR-Inkorporation wurde in allen drei Subregionen der Plazenta gefunden, mit der deutlichsten Markierung der Junktionszone (Abbildung 7E). Die Fluoreszenzintensität der dCas9-3xNLS-VP64-Markierung variierte zwischen den plasmidbehandelten Plazenten, was darauf hindeutet, dass einige das Plasmid stärker exprimierten als andere, und es gab Variationen in der genauen Position/Ausdehnung der Markierung, aber die Markierung war im Allgemeinen in allen Subregionen vorhanden. Um die Lokalisation der dCas9-3xNLS-VP64-Markierung zu bestätigen, wurde eine Prl8a8 FISH-Markierung durchgeführt, die auf Spongiotrophoblasten abzielt, um die mittlere Subregion zu markieren (Abbildung 7G,H). Dies wurde in benachbarten Schnitten aus der gleichen Plazenta auf einem "Schwester"-Objektträger der Schnitte durchgeführt, die für dCas9-3xNLS-VP64 markiert waren. Erwartungsgemäß war die Struktur, die durch die Prl8a8-Markierung angezeigt wurde, zwischen der IGF1-OE und den unbehandelten Plazenten ähnlich. Die Dezidua und die Labyrinthzone konnten durch die Markierung der blauen Kerne (DAPI) identifiziert werden, die die rote Adjunktionszone umgibt (Abbildung 7G,H). Die FISH-Markierung von dCas9-3xNLS-VP64 verdeutlichte, dass das Plasmid in alle drei Subregionen eingefügt wurde, was mit der Prl8a8-Markierung bestätigt wurde. Die Ergebnisse der FISH-Markierung bestätigten, dass der Einbau des IGF-1-Aktivierungsplasmids erfolgreich war und das Plasmid nicht in unbehandelte Plazenten migrierte.

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Darstellung des Protokolls . (A) Vereinfachte schematische Darstellung des chirurgischen Eingriffs. Chronologische Reihenfolge der wichtigsten Schritte der Technik. (B) Schematische Darstellung eines Beispiels für manipulierte Plazentaabstände innerhalb der Uterushörner. Beide Paneele wurden mit BioRender.com erstellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Uterus-Laparotomie. (A-B) Während der Operationsvorbereitung (A) der rasierte Bauch eines Muttertiers und (B) der rasierte Bereich, der mit Jodlösung beschichtet ist. (C-F) Im Operationsbereich (C) ein ~2 cm Schnitt in der Bauchhaut und (D) ein ~2 cm langer Schnitt im Bauchfell; Eingeweide sind sichtbar. (E) Manipulation der Gebärmutterhörner durch die Inzisionsstelle. Die Hörner der Gebärmutter sind sichtbar. (F) Vollständig freiliegende Gebärmutterhörner, die auf einem sterilen OP-Tuch platziert werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Injektion von CRISPR-Plasmiden in die E12.5-Plazenta. (A,B) Orientierung der Embryonen und der Plazenta in den Uterushörnern. (A) Schrägansicht eines beschrifteten Gebärmutterhorns, das Decidua, fetale Zonen und einen Embryo zeigt. Die gestrichelte Linie stellt dar, wo sich die Injektionsstelle befinden soll. (B) Ein unbeschriftetes Gebärmutterhorn aus Tafel A. (C,D) Seitenansicht der Mikropipette, die in die Injektionsstelle in der Plazenta eingeführt wird. D ist die Decidua, FZ sind die fetalen Zonen, E ist der Embryo und die gestrichelte Linie stellt die Position der Injektionsstelle dar. (D) Unbeschriftetes Bild des Einführens der Mikropipette von Panel C. (E,F) Seitenansicht des Farbstoffs in der Plazenta nach der Injektion. (E) Beschriftetes Bild eines Gebärmutterhorns, das eine Plazenta zeigt, die mit einem CRIPSR-Plasmid injiziert wurde, das einen sichtbaren Farbstoff enthält, und eine Plazenta, die nicht injiziert wurde. (F) Unbeschriftetes Bild des Gebärmutterhorns in Tafel E. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4: Elektroporation von E12.5-Plazenten nach Injektion von CRISPR-Plasmiden. (A) Draufsicht auf Plazenten in einem Uterushorn. Die Anoden- und Kathoden-Elektroporationspaddel sind beschriftet, und der weiße Pfeil zeigt die Position der Injektionsstelle an. (B) Schrägansicht der Elektroporation einer Plazenta. (C) Seitenansicht der Elektroporation einer Plazenta. (D-F) Vereinfachte Gliederung der Felder A, B und C. Die Anoden- und Kathodenpaddel sind beschriftet, P ist die Plazenta, E ist der Embryo und der unmarkierte Bereich ist die Gebärmutter. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 5
Abbildung 5: Naht der Bauchhaut und des Bauchfells . (A) Die Uterushörner kehrten nach Abschluss der Operation in den Bauch zurück. Bauchhaut- und Bauchfellschnitte sind sichtbar. (B) Peritoneuminzision vollständig vernäht. (C) Bauchhautschnitt vollständig vernäht. (D) Auftragen von Gewebekleber auf die Nähte der Bauchhaut. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 6
Abbildung 6: Allgemeine Behandlungsergebnisse. (A) Überlebensraten der Embryonen nach der Operation, gemessen an E14.5, 2 Tage nach dem Eingriff. Eine signifikante Verkürzung des Überlebens wurde in den manipulierten Gruppen im Vergleich zu den unbehandelten Embryonen beobachtet (Mann-Whitney-U-Test: Untreated vs. Cas9 Control, p = 0,0077; Unbehandelt vs. Aktkontrolle, p = 0,0330; und unbehandelt vs. IGF1-OE, p = 0,0032). Es wurden keine signifikanten Unterschiede im Überleben der manipulierten Gruppen beobachtet (einfaktorielle ANOVA, p = 0,9454). Jeder Punkt stellt den prozentualen Überlebensanteil eines einzelnen Wurfes dar (unbehandelt n = 22, Cas9-Kontrolle n = 9, Aktkontrolle n = 13 und IGF1-OE n = 22 Würfe). (B) Plazentagewicht der überlebenden Embryonen auf E14,5 (einfaktorielle ANOVA, p = 0,1436) (unbehandelt n = 138, Cas9-Kontrolle n = 15, Aktkontrolle n = 20 und IGF1-OE n = 36 Plazenta). (C) Gewichtsänderungen des Muttertiers nach der Operation an E13.5 und E14.5, beobachtet bei Muttertieren, die sich einer Schein-Laparotomie unterzogen oder einer experimentellen (Exp) Plazentamanipulation unterzogen wurden. Es wird kein signifikanter Unterschied zwischen den Gewichtsveränderungen der beiden Gruppen von Muttertieren nach der Operation festgestellt (ungepaarte t-Tests: E13,5 p=0,5452 und E14,5 p=0,2493) (Scheinmütter n=3 und Exp-Muttertiere n=10). Alle Fehlerbalken stellen das REM dar. (D-F) Bilder von E14.5-Embryonen nach der Nekroskopie in der Fruchtblase mit noch befestigter Plazenta. (F) Der Maßstabsbalken in der rechten Ecke stellt 3,75 mm dar. (G-I) Schrägbild des Embryos und Draufsicht auf die entsprechende Plazenta. (I) Die Maßstabsleiste in der rechten Ecke entspricht 3,75 mm. (D-I) Alle Beschriftungen der Behandlungsgruppe sind unter den Bildern aufgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 7
Abbildung 7: Analyse der Expression und des CRISPR-Einbaus in E14.5-Plazenten. (A) qPCR-Analyse der IGF-1-Expression in E14.5-Kontroll- und IGF1-OE-Plazenten. In den IGF1-OE-Plazenten wurde ein signifikanter Anstieg der IGF-1-Expression, normalisiert auf 18s-Expression, beobachtet (Welch-t-Test, p = 0,0302) (Kontrolle n = 15 und IGF1-OE n = 20 Plazenten). (B) ELISA der IGF-1-Proteinspiegel in E14.5-Kontroll- und IGF1-OE-Plazenten. Ein signifikanter Anstieg der IGF-1-Spiegel wurde in den IGF1-OE-Plazenten im Vergleich zu den Kontrollwerten beobachtet (Welch-t-Test, p = 0,0469) (Kontrolle n = 13 und IGF1-OE n = 15 Plazenten). (C) qPCR-Analyse der BLAST-Sequenz aus dem IGF-1 SAM-Plasmid. Die Expression von BLAST wurde nur in den IGF1-OE-Plazenten gefunden, und keine/unbestimmte Expression wurde in den unbehandelten Plazenten gefunden (unbehandelte n = 4 und IGF1-OE n = 9 Plazenten). (D) qPCR-Analyse der GFP-Sequenz aus dem CRISPR-Cas9-Kontrollplasmid. Die Expression des Plasmids wurde in den Kontrollplazenten gefunden, und in den unbehandelten Proben wurden CT-Werte über 35/falsch positive Ergebnisse gefunden (unbehandelte n = 4 und Kontrollen = 5 Plazenten). Die gestrichelte Linie stellt den Schwellenwert für falsch positive Ergebnisse bei 35 CT dar. Jeder Datenpunkt stammt von einer Plazenta. Alle Fehlerbalken repräsentieren das REM. (E-H) Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung von E14.5-Plazentaschnitten bei 10 μm Dicke. (E) Unbehandelte und (F) IGF1-OE-Plazentaschnitte mit einer rot markierten dCas9-3xNLS-VP64-Sonde. Das rote Signal ist nur in der IGF1-OE-Plazenta vorhanden. Das grüne Signal ist Autofluoreszenz, die zur Identifizierung der Plazenta-Subregionen verwendet wird. (G) Unbehandelte und (H) IGF1-OE-Plazentaschnitte mit einer rot markierten Prl8a8-Sonde zur Identifizierung von Spongiotrophoblasten der mittleren Adjunktionszone. DAPI in blauer Farbe zeigt die Dezidua und Labyrinthzonen, die diese Verbindungszone umgeben. (H) Die Maßstabsleiste in der rechten Ecke stellt 2 mm dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Ergänzende Tabelle 1: In dieser Studie verwendete Primer. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

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Discussion

Die Plazenta ist ein primärer Regulator des fetalen Wachstums, und wie bereits erwähnt, können Veränderungen in der Genexpression oder -funktion der Plazenta die Entwicklung des Fötus erheblich beeinflussen6. Das hier beschriebene Protokoll kann verwendet werden, um eine gezielte in vivo CRISPR-Manipulation der Mausplazenta mit einem relativ fortschrittlichen chirurgischen Ansatz durchzuführen. Diese Technik ermöglicht eine signifikante Ausbeute an lebensfähigen Embryonen und den entsprechenden Plazenten, die für weitere Studien verwendet werden können (Abbildung 6A,B). Diese Technik ermöglichte es uns, plazentare IGF-1 auf E14.5 erfolgreich zu überexprimieren (Abbildung 7A,B). Die verwendeten Plasmide zeigten Spezifität, da die insertierten Plasmide in den manipulierten Plazenten verblieben, während sie in den benachbarten unbehandelten Plazenten nicht vorhanden waren (Abbildung 7C,D). Die räumliche Verteilung des IGF-1-Aktivierungsplasmids wurde durch FISH für dCas9-3xNLS-VP64 und Prl8a8 bestätigt, was zeigte, dass das Aktivierungsplasmid in den drei Subregionen der IGF1-OE-Plazenta und nicht in irgendwelchen Subregionen der unbehandelten Plazenta vorhanden war (Abbildung 7E-H). Diese Technik kann verwendet werden, um die Genexpression der Plazenta auf eine Weise zu verändern, die mit früheren Techniken möglicherweise nicht möglich war. Der Einsatz dieser Technik wird ein besseres Verständnis des Einflusses der Genexpression und -funktion der Plazenta auf die Entwicklung des Fötus in verschiedenen Kontexten ermöglichen.

Um den Erfolg dieses Verfahrens für mütterliche und fetale Ergebnisse zu optimieren, wurden die Auswirkungen der Änderung mehrerer Parameter untersucht, einschließlich der Injektions- und Elektroporationseinstellungen sowie der verwendeten Materialien. Um das Überleben und die Erholung der Mutter zu erhöhen, wurde festgestellt, dass die Zeit unter Narkose 1 Stunde nicht überschreiten sollte, da längere Operationszeiten das Überleben signifikant verringerten. Wenn die Zeit unter Narkose etwa 2 Stunden beträgt, sinkt die Überlebenswahrscheinlichkeit dramatisch auf Werte unter 20%, wahrscheinlich aufgrund der negativen Auswirkungen einer längeren Zeit unter Isofluran. Abgesehen von der Zeit unter Narkose war die häufigste Komplikation einer Operation, die zum Tod der Mutter führte, das Versäumnis, das Bauchfell richtig zu spannen, während die Haut- und Bauchfellschnitte gemacht wurden. Wenn das Bauchfell nicht richtig befestigt ist, kann der Darm verletzt werden, was in den Tagen nach der Operation zum Tod führen kann. Die Zeit, in der die Gebärmutter freigelegt wird, wirkt sich auch auf das Überleben des Muttertiers und der Embryonen aus. Die durchschnittliche Zeit, die der Uterus in erfolgreichen Experimenten exponiert wurde, betrug etwa 15 Minuten; Eine Exposition von mehr als 30 Minuten kann zu verstärkten Resorptionen und möglichen Erkrankungen der Mutter führen. Die freiliegende Gebärmutter und alle anderen freiliegenden Organe (oft Darm) müssen feucht gehalten werden, aber zu viel Kochsalzlösung kann das Tier kühlen. Bei regelmäßiger Befeuchtung der freiliegenden Organe sollte weniger als 1 ml sterile Kochsalzlösung verwendet werden.

Die Parameter der Injektion und der Elektroporation hatten einen großen Einfluss auf das Überleben des Embryos. Das Injektionsvolumen sollte ca. 4,5 μL nicht überschreiten, da dies zu Resorptionen führte. Die Injektionszeit und der Injektionsdruck sind wichtig, um das Überleben zu maximieren. Die Injektionszeit sollte zwischen 0,5 s und 1,5 s eingestellt werden, wobei 0,8 s optimal erschienen. Der Druck sollte zwischen 1 und 8,5 psi eingestellt werden. Niedrige Überlebensraten der Embryonen wurden bei niedrigen Injektionszeiten und hohen PSI-Spiegeln bei der Injektion beobachtet. Es wurde auch beobachtet, dass, wenn die Mikropipette zu stumpf ist, es zu einer Abnahme der embryonalen Lebensfähigkeit kommen kann und die Lösung auch oft aus der Mikropipette austritt. Die Art des Farbstoffs, der zur Visualisierung der Injektionen verwendet wird, kann das Überleben beeinflussen. Methylenblau führte zu diesem Zweck zum Tod der Mutter, aber eine gefilterte Fast Green-Farbstofflösung zeigte keine negativen Auswirkungen auf die Gesundheit der Mutter. Die Elektroporationseinstellungen wurden anhand der empfohlenen Herstellereinstellungen auf der Grundlage früherer Elektroporationsstudien in vivooptimiert 33. Es stellte sich heraus, dass die Elektroporation die Manipulation war, die den größten Schaden verursachte und das Überleben der Embryonen verringerte. Die empfohlenen In-vivo-Elektroporationseinstellungen für Embryonen legen vier Pulse nahe, um die CRISPR-Effizienz zu maximieren, aber für eine höhere Überlebensrate werden zwei Pulse empfohlen33. Es stellte sich heraus, dass vier Impulse dazu führten, dass fast alle Embryonen resorbiert wurden. Zwei Pulse ermöglichten eine erhöhte Lebensfähigkeit bei gleichzeitiger Beibehaltung der CRISPR-Effizienz. Auch die Größe des Elektroporationspaddels hatte einen signifikanten Einfluss auf das Überleben des Embryos. Es wurde festgestellt, dass 5-mm-Elektroporationspaddel zu einer fast vollständigen Resorption führten, wenn sie mit den empfohlenen Einstellungen verwendet wurden. In der Tat werden 3-mm-Elektroporationspaddel in der Anleitung des Herstellers empfohlen und erhöhen die Lebensfähigkeit des Embryos signifikant33. Es ist auch wichtig zu beachten, dass viele Elektroporationspaddel eine bestimmte Pulslebensdauer haben. Nachdem sie bis zu diesem Maximum genutzt wurden, ist eine Qualitätsabnahme zu beobachten. Dies ist zu erkennen, wenn sich während eines Pulses kein kleiner weißer Schaum zwischen Paddel und Plazenta bildet. Die Spannung des Elektroporationspaddels kann mit einem Voltmeter überprüft werden, um festzustellen, ob es die erwartete Spannung erzeugt.

Diese Studie ist in einigen Punkten eingeschränkt. Diese Technik ist zeitspezifisch und sollte wahrscheinlich am besten frühestens in E10.5 und spätestens in E16.5 durchgeführt werden. Dies liegt daran, dass die Plazenta vor E10.5 zu klein war und das Plasmid nach E16.5 möglicherweise nicht mehr genug Zeit hat, um den gewünschten Effekt zu erzielen. Dieser Zeitrahmen bedeutet, dass diese Technik besser für bestimmte Arten von Studien an Mäusen geeignet ist. Diese Technik ist nützlich für die Untersuchung der neurologischen Entwicklung, da E12.5 für viele Strukturen im Gehirn in eine entscheidende Zeit der Neurogenese fällt34. Diese Technik ist möglicherweise nicht nützlich, um die Auswirkungen der Plazenta auf die frühen Entwicklungsstadien zu untersuchen, wie z. B. die Bildung von Neuralplatten, die auf E8.5stattfindet 35. Die Ergebnisse eines Knockout-CRISPR-Plasmids sind derzeit nicht bekannt; Die Anwendung dieser Methode zur Genexpressionsreduktion bedarf weiterer Untersuchungen, da nur die Überexpression/Aktivierung eines Gens nachgewiesen wurde. Trotzdem wird erwartet, dass diese Technik auch für die Insertion eines Knockout-CRISPR-Plasmids erfolgreich sein wird.

Diese Technik könnte auch die Möglichkeit bieten, eine Primärkultur von genetisch verändertem Plazentagewebe durchzuführen36. Abhängig von der Art des verwendeten CRISPR, wie z. B. CRISPRi und CRISPRa, kann eine Primärkultur verwendet werden, um eine Rettungsstudie durchzuführen37,38. Diese Technik könnte auch verwendet werden, um die Zusammenhänge zwischen plazentaren genetischen und funktionellen Anomalien und Problemen bei den Nachkommen weiter zu untersuchen. Insbesondere fand eine frühere Studie eine signifikante Korrelation zwischen plazentaspezifischen genomischen Risikowerten und Schizophrenierisiken39. In dieser Studie wurden viele Plazentagene identifiziert, die eine Rolle bei der Entwicklung von Schizophrenie spielen könnten, die in Tiermodellen noch nicht erforscht wurden. Diese Technik eignet sich für weitere Studien dieser und anderer Art.

Die Erkenntnisse, die durch die CRISPR-Modifikation der Plazenta gewonnen wurden, könnten in eine Reihe verschiedener biomedizinischer Anwendungen übertragen werden. Studien, die herausfinden, wie sich eine bestimmte Genexpression in der Plazenta auf die Entwicklung des Fötus auswirken kann, könnten verwendet werden, um plazentaspezifische pharmakologische Interventionen zu entwickeln, die diese Anomalien behandeln könnten. Behandlungen, die direkt auf einen Fötus abzielen, können schwierig und gefährlich sein40,41. Die Plazenta ist ein leichter zugängliches Ziel für die Behandlung. Bei Entwicklungsstörungen im Herzen oder Gehirn, die pränatal veränderbar sein können, ist eine direkte Manipulation des Herzens oder des Gehirns ein hohes Risiko. Ein solches Risiko könnte durch eine Plazentaintervention vermieden werden, die plausibler ist und zu präventiven Strategien für neurologische Entwicklungsstörungen führen könnte, für die das molekulare Milieu, das zum Teil von der Plazenta bereitgestellt wird, entscheidend sein kann5. Diese Technik könnte auch zur Behandlung von Krankheiten wie angeborenen Herzfehlern eingesetzt werden, die mit Plazentaerkrankungen in Verbindung gebracht werden9. Da es sich bei angeborenen Herzfehlern um einen häufigen Geburtsfehler handelt, könnte die Möglichkeit einer Plazenta-Intervention erhebliche Auswirkungen haben8. Da die Plazenta viele Funktionen hat, könnte diese Technik verwendet werden, um die Entwicklung von Interventionen für mehrere Krankheiten voranzutreiben. Insgesamt könnte diese auf die Plazenta ausgerichtete Technik verwendet werden, um das Verständnis des Einflusses der Plazentagenetik und -funktion auf mehrere Bereiche der fetalen Entwicklung zu verbessern.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Die Autoren nennen die folgenden Finanzierungsquellen: R01 MH122435, NIH T32GM008629 und NIH T32GM145441. Die Autoren danken den Labors von Dr. Val Sheffield und Dr. Calvin Carter an der University of Iowa für die Nutzung ihres Operationsraums und ihrer Ausrüstung sowie Dr. Eric Van Otterloo, Dr. Nandakumar Narayanan und Dr. Matthew Weber für ihre Unterstützung bei der Mikroskopie. Die Autoren danken auch Dr. Sara Maurer, Maya Evans und Sreelekha Kundu für ihre Unterstützung bei den Pilotoperationen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 ml Tubes USA Scientific Inc 1615-5500
4% Paraformeldhyde (PFA) in PBS Thermo Fisher Scientific J61899.AP
96 Well plate Cornings 3598 For BCA kit
Absorbent Underpads Fisher Scientific 14-206-62
Activation Control Plasmid Santa Cruz Biotechnology sc-437275 Dnase-free water provided for dilution
AMV Reverse Transcriptase New England Biolabs M0277L Use for cDNA synthesis
Anesthetic Gas Vaporizor Vetamac VAD-601TT VAD-compact vaporizer
Artifical Tear Gel Akorn NDC 59399-162-35
BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific 23227 Protein quantification
Biovortexer Bellco Glass, Inc. 198050000 Hand-held tissue homogenizer
CellSens Software Olympus V4.1.1 Image processing to FISH images.
Centrifuge 5810 Eppendorf EP022628168 Plate centrifuge
Chloroform Thermo Fisher Scientific J67241-AP RNA isolation
Cotton Tipped Applicators ProAdvantage 77100 Sterilize before use
CRISPR/Cas9 Control Plasmid Santa Cruz Biotechnology sc-418922 Dnase-free water provided for dilution
CryoStat Leica CM1950
Dissection Microscope Leica M125 C Used for post-necroscopy imaging
Dissolvable Sutures Med Vet International J385H
Distilled Water Gibco 15230162
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) Thermo fisher Scientific 14190144 (-) Calcium; (-) Magnesium
ECM 830 Electro Electroporator (Electroporation Machine) BTX Harvard Apparatus 45-0662 Generator only
Electric Razor Wahl CL9990 Kent Scientific
Electroporation paddles/Tweezertrodes BTX Harvard Apparatus 45-0487 3 mm diameter paddles; wires included
Embedding Cassette: 250 PK Grainger 21RK94 Placenta embedding cassettes
Ethanol Thermo Fisher Scientific 268280010
F-Air Canisters Penn Veterinary Supply Inc BIC80120 Excess isoflurane filter
Fast Green Dye FCF Sigma F7252-5G Dissolve to 1 μg/ml and filter; protect from light
Filter-based microplate photometer (plate reader) Fisher Scientific 14377576 Can be used for BCA and ELISA
Forceps VWR 82027-386 Fine tips, straight, serrated
Formalin solution, neutral buffered, 10% Sigma Aldrich HT501128
Glass Capillaries - Borosilicate Glass (Micropipette) Sutter Instrument B150-86-10 O.D.: 1.5 mm, I.D.: 0.86 mm, 10 cm length
Halt Protease and Phosphotase inhibitor cocktail (100x) Thermo Scientific 1861281 Protein homogenization buffer
Heating Pad Thermotech S766D Digitial Moist Heating Pad
Hemostats VWR 10806-188 Fully surrated jaw; curved
Hot Water Bath Fisher Scientific 20253 Isotemp 205
Igf-1 SAM Plasmid (m1) Santa Cruz Biotechnology sc-421056-ACT Dnase-free water provided for dilution
Induction Chamber Vetamac 941443 No specific liter size required
Isoflurane Piramal Pharma Limited NDC 66794-013-25
Isoproponal/2-Proponal Fisher Scientific A451-4 RNA isolation
Ketamine HCl 100mg/ml Akorn NDC 59399-114-10
MgCl2/Magneisum Chloride Sigma Aldrich 63069-100ML 1M. Protein homogenization buffer
MicroAmp™ Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode Fisher Scientific 4309849 Barcoded plates not required
Microcapillary Tip Eppendorf 5196082001 Attached to BTX Microinjector
Microinjector BTX Harvard Apparatus 45-0766 Stainless Steel Pipette Holder, 130 mm Length, for 1 to 1.5 mm Pipettes
Microject 1000A (Injection Machine) BTX Harvard Apparatus 45-0751 MicroJect 1000A Plus System
Micropipette Puller Model P-97 Sutter Instrument P-97 Flaming/Brown type micropipette puller
Microplate Mixer (Plate Shaker) scilogex 822000049999
Mouse/Rat IGF-I/IGF-1 Quantikine ELISA Kit R & D Systems MG100
Needles BD - Becton, Dickson, and Company 305106 30 Gx 1/2 (0.3 mm x 13 mm)
Nitrogen Tank Linde 7727-37-9 Any innert gas
Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drug (NSAID) Norbrook Laboratories Limited NDC 55529-040-10 Analesgic such as Meloxicam
Nose Cone Vetamac 921609 9-14 mm
Opal 620 detection dye Akoya Biosciences SKU FP1495001KT Used for FISH
Optimal Cutting Temperature (O.C.T) Compound Sakura 4583
Oxygen Tank Linde 7782 - 44 - 7 Medical grade oxygen
Pestles USA Scientific Inc 14155390
Povidone-Iodine Solution, 5% Avrio Health L.P. NDC 67618-155-16
Power SYBR™ Green PCR Master Mix Thermo Fisher Scientific 4367659 Use for qPCR
Random Hexamers (Random Primers) New England Biolabs S1330S Use for cDNA synthesis
Razor Blade Grainger 26X080
RNA Cleanup Kit & Concentrator Zymo Research R1013
RNALater Thermo Fisher Scientific AM7021
RNAscope kit v.2.5 Advanced Cells Diagnostics 323100 Contains all reagents required for fluorescent in situ hybridization. Probes sold separately.
RNAscope™ Probe- Mm-Prl8a8-C2 Advanced Cells Diagnostics  528641-C2
RNAscope™ Probe- Vector-dCas9-3xNLS-VP64 Advanced Cells Diagnostics 527421
Roto-Therm Mini Benchmark R2020 Dry oven for in situ hybridization
Scissors VWR 82027-578 Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4¹/?
Sodium Chloride (Saline) Hospra NDC 0409-4888-03 Sterile,  0.9%
Sodium Citrate, Trisodium Salt, Dihydrate, [Citric Acid, Trisodium Dihydrate] Research Product International 03-04-6132
Sodium Hydroxide 1N Concentrate, Fisher Chemical Fisher Scientific SS277 Protein homogenization buffer
Steamer Bella B00DPX8UBA
Sterile Surgical Drape Busse 696 Sterilize before use
Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
Surgipath Cover Glass 24x60 Leica 3800160
Syringes BD - Becton, Dickson, and Company 309659 BD Luer Slip Tip Syringe sterile, single use, 1 mL
Thermo Scientific™ Invitrogen™ Nanodrop™ One Spectrophotometer with WiFi and Qubit™ 4 Fluorometer Fisher Scientific 13-400-525 This configuration comes with Qubit 4 fluorometer.  Qubit quantification not required.
Tissue Adhesive 3M 1469SB VetBond
Tris HCl Thermo Fisher Scientific 15568025 1M. Protein homogenization buffer
TRIzol™ Reagent Thermo Fisher Scientific 15596018 RNA isolation
TSA Buffer Pack Advanced Cells Diagnostics 322810 Used to dilute Opal 620 detection dye
Universal F-Circuit Vetamac 40200 Attached to vaporizer and vaporizer accessories
Upright Compound Fluorescence Microscope Olympus BX61VS Used for FISH imaging
Vectorshield with DAPI Vector Laboratories H-1200 Coverslip mounting media
ViiA™ 7 Real-Time PCR System with 384-Well Block Thermo Fisher Scientific 4453536 This is for SYBR 384-well block detection.  TaqMan and/or smaller blocks available
Wet n Wild Nail Polish Wild Shine, Clear Nail Protector, Nail Color Amazon C450B
Xylazine 20mg/ml Anased 343730_RX

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References

  1. Cross, J. C., et al. Genes, development and evolution of the placenta. Placenta. 24 (2-3), 123-130 (2003).
  2. Perez-Garcia, V., et al. Placentation defects are highly prevalent in embryonic lethal mouse mutants. Nature. 555 (7697), 463-468 (2018).
  3. Rosenfeld, C. S. The placenta-brain-axis. Journal of Neuroscience Research. 99 (1), 271-283 (2021).
  4. Maslen, C. L. Recent advances in placenta-heart interactions. Frontiers in Physiology. 9, 735 (2018).
  5. Kundu, S., Maurer, S. V., Stevens, H. E. Future horizons for neurodevelopmental disorders: Placental mechanisms. Frontiers in Pediatrics. 9, 653230 (2021).
  6. Woods, L., Perez-Garcia, V., Hemberger, M. Regulation of placental development and its impact on fetal growth-new insights from mouse models. Frontiers in Endocrinology. 9, 570 (2018).
  7. Goeden, N., et al. Maternal Inflammation disrupts fetal neurodevelopment via increased placental output of serotonin to the fetal brain. Journal of Neuroscience. 36 (22), 6041-6049 (2016).
  8. vander Bom, T., et al. The changing epidemiology of congenital heart disease. Nature Reviews Cardiology. 8 (1), 50-60 (2011).
  9. Wilson, R. L., et al. Analysis of commonly expressed genes between first trimester fetal heart and placenta cell types in the context of congenital heart disease. Scientific Reports. 12 (1), 10756 (2022).
  10. Renaud, S. J., Karim Rumi, M. A., Soares, M. J. Review: Genetic manipulation of the rodent placenta. Placenta. 32, S130-S135 (2011).
  11. Wenzel, P. L., Leone, G. Expression of Cre recombinase in early diploid trophoblast cells of the mouse placenta. Genesis. 45 (3), 129-134 (2007).
  12. Zhou, C. C., et al. Targeted expression of Cre recombinase provokes placental-specific DNA recombination in transgenic mice. PLoS One. 7 (2), e29236 (2012).
  13. Wattez, J. S., Qiao, L., Lee, S., Natale, D. R. C., Shao, J. The platelet-derived growth factor receptor alpha promoter-directed expression of cre recombinase in mouse placenta. Developmental Dynamics. 248 (5), 363-374 (2019).
  14. Nadeau, V., et al. Map2k1 and Map2k2 genes contribute to the normal development of syncytiotrophoblasts during placentation. Development. 136 (8), 1363-1374 (2009).
  15. Chakraborty, D., Muto, M., Soares, M. J. Ex vivo trophoblast-specific genetic manipulation using lentiviral delivery. BioProtocol. 7 (24), e2652 (2017).
  16. Okada, Y., et al. Complementation of placental defects and embryonic lethality by trophoblast-specific lentiviral gene transfer. Nature Biotechnology. 25 (2), 233-237 (2007).
  17. Lecuyer, M., et al. a placental marker of fetal brain defects after in utero alcohol exposure. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 44 (2017).
  18. Jones, H. N., Crombleholme, T., Habli, M. Adenoviral-mediated placental gene transfer of IGF-1 corrects placental insufficiency via enhanced placental glucose transport mechanisms. PLoS One. 8 (9), e74632 (2013).
  19. Jones, H., Crombleholme, T., Habli, M. Regulation of amino acid transporters by adenoviral-mediated human insulin-like growth factor-1 in a mouse model of placental insufficiency in vivo and the human trophoblast line BeWo in vitro. Placenta. 35 (2), 132-138 (2014).
  20. Song, A. J., Palmiter, R. D. Detecting and avoiding problems when using the Cre-lox system. Trends in Genetics. 34 (5), 333-340 (2018).
  21. Chuah, M. K., Collen, D., VandenDriessche, T. Biosafety of adenoviral vectors. Current Gene Therapy. 3 (6), 527-543 (2003).
  22. Evers, B., et al. CRISPR knockout screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).
  23. Rossant, J., Cross, J. C. Placental development: Lessons from mouse mutants. Nature Reviews Genetics. 2 (7), 538-548 (2001).
  24. Elmore, S. A., et al. Histology atlas of the developing mouse placenta. Toxicologic Pathology. 50 (1), 60-117 (2022).
  25. Sferruzzi-Perri, A. N., Sandovici, I., Constancia, M., Fowden, A. L. Placental phenotype and the insulin-like growth factors: Resource allocation to fetal growth. The Journal of Physiology. 595 (15), 5057-5093 (2017).
  26. Agrogiannis, G. D., Sifakis, S., Patsouris, E. S., Konstantinidou, A. E. Insulin-like growth factors in embryonic and fetal growth and skeletal development (Review). Molecular Medicine Reports. 10 (2), 579-584 (2014).
  27. Wang, L., Jiang, H., Brigande, J. V. Gene transfer to the developing mouse inner ear by in vivo electroporation. Journal of Visualized Experiments. (64), e3653 (2012).
  28. Elser, B. A., et al. Combined maternal exposure to cypermethrin and stress affect embryonic brain and placental outcomes in mice. Toxicological Sciences. 175 (2), 182-196 (2020).
  29. Gumusoglu, S. B., et al. Chronic maternal interleukin-17 and autism-related cortical gene expression, neurobiology, and behavior. Neuropsychopharmacology. 45 (6), 1008-1017 (2020).
  30. Liu, F., Huang, L. Electric gene transfer to the liver following systemic administration of plasmid DNA. Gene Therapy. 9 (16), 1116-1119 (2002).
  31. Kalli, C., Teoh, W. C., Leen, E. Introduction of genes via sonoporation and electroporation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 818, 231-254 (2014).
  32. Wu, W., et al. Efficient in vivo gene editing using ribonucleoproteins in skin stem cells of recessive dystrophic epidermolysis bullosa mouse model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (7), 1660-1665 (2017).
  33. Nakamura, H. Electroporation and Sonoporation in Developmental Biology. , Springer. Tokyo, Japan. (2009).
  34. Bond, A. M., et al. Differential timing and coordination of neurogenesis and astrogenesis in developing mouse hippocampal subregions. Brain Sciences. 10 (12), 909 (2020).
  35. Kojima, Y., Tam, O. H., Tam, P. P. Timing of developmental events in the early mouse embryo. Seminars in Cell & Developmental Biology. 34, 65-75 (2014).
  36. Pennington, K. A., Schlitt, J. M., Schulz, L. C. Isolation of primary mouse trophoblast cells and trophoblast invasion assay. Journal of Visualized Experiments. (59), e3202 (2012).
  37. Mandegar, M. A., et al. CRISPR Interference efficiently induces specific and reversible gene silencing in human iPSCs. Cell Stem Cell. 18 (4), 541-553 (2016).
  38. Dai, Z., et al. Inducible CRISPRa screen identifies putative enhancers. Journal of Genetics and Genomics. 48 (10), 917-927 (2021).
  39. Ursini, G., et al. Placental genomic risk scores and early neurodevelopmental outcomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. (7), e2019789118 (2021).
  40. Smajdor, A. Ethical challenges in fetal surgery. Journal of Medical Ethics. 37 (2), 88-91 (2011).
  41. Antiel, R. M. Ethical challenges in the new world of maternal-fetal surgery. Seminars in Perinatology. 40 (4), 227-233 (2016).

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Genetik Heft 194 Plazenta Maus CRISPR insulinähnlicher Wachstumsfaktor 1 Elektroporation Überexpression Entwicklung
<em>Maus-In-vivo-Plazenta-gezielte</em> CRISPR-Manipulation
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Carver, A. J., Taylor, R. J.,… More

Carver, A. J., Taylor, R. J., Stevens, H. E. Mouse In Vivo Placental Targeted CRISPR Manipulation. J. Vis. Exp. (194), e64760, doi:10.3791/64760 (2023).

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