Summary
여기에서는 생체 내에서 마우스 태반의 중요한 발달 경로를 효과적으로 조작하는 시간별 방법을 설명합니다. 이것은 배아 12.5일째에 임신한 댐의 태반에 CRISPR 플라스미드를 주입하고 전기천공하여 수행됩니다.
Abstract
태반은 자궁 내 포유류의 발달을 조절하고 유지하는 필수 기관입니다. 태반은 산모와 태아 사이의 영양분과 노폐물의 전달, 성장 인자와 호르몬의 생산 및 전달을 담당합니다. 생쥐의 태반 유전자 조작은 태아 발달에서 태반의 특정 역할을 이해하는 데 중요합니다. 태반 특이적 Cre 발현 형질전환 마우스는 다양한 효과를 가지며 태반 유전자 조작을 위한 다른 방법이 유용한 대안이 될 수 있습니다. 이 논문은 표적 유전자의 발현을 수정하는 데 사용할 수 있는 CRISPR 유전자 조작을 사용하여 태반 유전자 발현을 직접 변경하는 기술을 설명합니다. 비교적 진보된 외과적 접근법을 사용하여 임신한 댐은 배아 12.5일(E12.5)에 개복술을 받고 CRISPR 플라스미드는 유리 마이크로피펫을 통해 개별 태반으로 전달됩니다. 플라스미드는 각 주입 후 즉시 전기천공됩니다. 댐 복구 후 태반과 배아는 나중에 평가될 때까지 계속 발달할 수 있습니다. 이 기술을 사용한 후 태반과 자손을 평가하면 발달에서 시간별 태반 기능의 역할을 결정할 수 있습니다. 이러한 유형의 조작을 통해 태반 유전학 및 기능이 여러 질병 상황에서 태아의 성장과 발달에 어떤 영향을 미치는지 더 잘 이해할 수 있습니다.
Introduction
태반은 태아 발달에 관여하는 필수 기관입니다. 태반의 주요 역할은 필수 요소를 제공하고 태아와의 영양분과 노폐물의 이동을 조절하는 것입니다. 포유류의 태반은 태아와 모체의 조직으로 구성되어 있으며, 태아와 모체의 경계면을 이루고 있으며, 따라서 산모와 태아의 유전적 영향이 기능에 영향을 미친다1. 태반의 유전적 기형이나 기능 장애는 태아 발달을 크게 변화시킬 수 있습니다. 이전 연구에서는 태반 유전학 및 발달이 태아의 특정 장기 시스템의 변화된 발달과 관련이 있음을 보여주었습니다. 특히, 태반의 이상은 태아의 뇌, 심장 및 혈관계의 변화와 관련이 있다 2,3,4,5.
호르몬, 성장 인자 및 기타 분자를 태반에서 태아로 운반하는 것은 태아 발달에 중요한 역할을 한다6. 특정 분자의 태반 생산을 변경하면 신경 발달이 바뀔 수 있음이 밝혀졌습니다. 산모의 염증은 태반에서 트립토판(TRP) 대사 유전자 발현을 변화시켜 세로토닌 생성을 증가시킬 수 있으며, 이는 이후 태아의 뇌에 세로토닌 축적을 생성한다7. 다른 연구에서는 심장 결함과 함께 태반 이상을 발견했습니다. 태반의 이상은 인간에게 가장 흔한 선천적 기형인 선천성 심장 기형의 원인이 되는 것으로 생각된다8. 최근 연구에 따르면 태반과 심장 모두에서 유사한 세포 경로를 가진 여러 유전자가 확인되었습니다. 이러한 경로가 중단되면 두 기관 모두에 결함이 발생할 수 있습니다9. 태반의 결함은 선천성 심장 결함을 악화시킬 수 있습니다. 특정 태아 장기 시스템 발달에 대한 태반 유전학 및 기능의 역할은 새로운 연구 분야입니다.
생쥐는 혈맥막 태반과 인간 태반의 다른 특징을 가지고 있어 인간 질병 연구에 매우 유용한 모델이 된다1. 태반의 중요성에도 불구하고, 현재 표적 생체 내 유전자 조작이 부족합니다. 또한, 현재 태반의 과발현 또는 기능 획득 조작보다 녹아웃 또는 녹다운에 사용할 수 있는 옵션이 더 많다(10). 태반 특이적 조작을 위한 여러 형질전환 Cre 발현 라인이 있으며, 각각은 서로 다른 시점에서 서로 다른 영양막 계통에 있습니다. 여기에는 Cyp19-Cre, Ada/Tpbpa-Cre, PDGFRα-CreER 및 Gcm1-Cre11,12,13,14가 포함됩니다. 이러한 Cre 이식유전자는 효율적이지만 특정 시점에서 일부 유전자를 조작할 수 없을 수 있습니다. 태반 유전자 발현을 녹아웃하거나 과발현하기 위해 일반적으로 사용되는 또 다른 방법은 렌티바이러스 벡터를 배반포 배양에 삽입하는 것인데, 이는 영양모세포 특이적 유전자 조작을 유발합니다15,16. 이 기술은 발달 초기에 태반 유전자 발현의 강력한 변화를 허용합니다. 생체 내에서 RNA 간섭의 사용은 태반에서 드물게 활용되었습니다. shRNA 플라스미드의 삽입은 본 논문에 기술된 CRIPSR 기법과 유사하게 수행될 수 있다. 이것은 태반에서 PlGF 발현을 성공적으로 감소시키기 위해 E13.5에서 수행되었으며, 자손의 뇌 혈관 구조에 영향을 미쳤다17.
녹아웃 또는 녹다운에 주로 사용되는 기술 외에도 과발현 유도는 일반적으로 아데노바이러스 또는 외인성 단백질의 삽입으로 수행됩니다. 과발현에 사용되는 기술은 다양한 성공률을 가지며 대부분 임신 후반에 수행되었습니다. 태반 기능에서 인슐린 유사 성장 인자 1(IGF-1)의 역할을 조사하기 위해 IGF-1 유전자18,19의 과발현을 유도하기 위해 선소 매개 태반 유전자 전달을 수행했습니다. 이것은 직접 태반 주사를 통해 E18.5에서 마우스 임신 후기에 수행되었습니다. 추가 옵션을 제공하고 Cre-Lox 조합 실패, 아데노바이러스의 가능한 독성 및 shRNA의 비표적 효과와 같은 확립된 태반 유전자 조작의 가능한 실패를 피하기 위해 태반의 생체 내 직접 CRISPR 조작을 사용할 수 있습니다20,21,22. 이 모델은 과발현 모델의 부족을 해결하고 유연성이 있는 모델을 만들기 위해 개발되었습니다.
이 기술은 PlGF 발현을 변경하기 위해 shRNA와 CRISPR 플라스미드를 생체 내에서 마우스 태반에 직접 표적으로 삼은 Lecuyer et al.의 연구를 기반으로 합니다17. 이 기술은 여러 시점에서 CRISPR 조작을 사용하여 태반 유전자 발현을 직접 변경하는 데 사용할 수 있습니다. 이 작업을 위해 E12.5가 선택되었습니다. 태반은 이 시점까지 성숙했고 조작할 수 있을 만큼 충분히 커서 E12.5에 특정 CRISPR 플라스미드를 삽입할 수 있으며, 이는 임신 중기에서 후기까지 태아 발달에 상당한 영향을 미칠 수 있습니다23,24. 형질전환 접근법과 달리 바이러스 유도 또는 RNA 간섭과 유사한 이 기술은 비교적 진보된 외과적 접근법을 사용하여 특정 시점에서 과발현 또는 녹아웃을 허용하므로 이전 변화로 인한 태반 손상 또는 배아 치사 가능성을 방지합니다. 소수의 태반만이 한 배설물 내에서 실험 또는 대조 플라스미드를 받기 때문에 이 접근 방식은 두 가지 유형의 내부 제어를 허용합니다. 이러한 대조군은 적절한 대조군 플라스미드로 주입 및 전기천공된 대조군과 직접적인 조작을 받지 않는 대조군입니다. 이 기술은 상승 활성화 매개체(SAM) CRISPR 플라스미드를 통해 마우스 태반에서 IGF-1 유전자의 과발현을 생성하도록 최적화되었습니다. IGF-1 유전자는 출생 전에 태반에서 주로 생산되는 태아에게 전달되는 필수 성장 호르몬이기 때문에선택되었습니다 25,26. 이 새로운 태반 표적 CRISPR 기술은 태반 기능과 태아 발달 사이의 연관성을 정의하는 데 도움이 되는 직접 조작을 가능하게 합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
모든 절차는 연방 규정 및 아이오와 대학 정책에 따라 수행되었으며 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다.
1. 동물과 축산
- 동물에게 음식과 물을 임의로 12시간 일광 주기로 유지하십시오.
- 생후 8-15주령의 CD-1 암컷 마우스를 사용한다. E0.5를 식별하기 위해 교합 플러그가 있는지 확인하십시오.
- E0.5에서 임신한 댐을 단독으로 수용합니다.
2. 마이크로피펫의 교정
알림: 마이크로피펫의 보정은 가능하면 수술 전에 수행해야 합니다.
- 마이크로피펫을 만들고 보정하기 전에 모든 플라스미드를 DNase가 없는 물에서 권장 농도(0.1μg/μL)로 희석합니다. 플라스미드를 적절하게 희석된 Fast Green 염료(PBS에서 1μg/μL)(최종 플라스미드 농도: 0.06μg/μL)와 혼합합니다.
- 마이크로피펫 풀러로 외경 1.5mm, 내경 0.86mm의 10cm 유리 모세관을 사용하여 마이크로피펫을 당깁니다.
- 멸균 집게로 마이크로 피펫 (2-3 mm)의 끝을 조심스럽게 떼어냅니다.
- 마이크로인젝터에 부착된 마이크로모세관 팁에 마이크로피펫을 로드합니다. 마이크로 인젝터가 마이크로 주입기에 부착되어 있고 마이크로 피펫을 교정하기에 충분한 수준의 질소가 있는지 확인하십시오.
- 마이크로피펫이 마이크로인젝터에 부착되면 Fast Green 염료 용액을 로드하여 보정을 수행합니다(PBS에서 1μg/μL). 마이크로피펫을 보정하여 약 3.5μL의 부피를 주입합니다. 아래와 같이 플라스미드 용액을 로딩하기 위해 마이크로피펫을 비우십시오("투명").
참고: 각 마이크로피펫은 약간 다릅니다. 주사 중 태반 손상을 방지하려면 주사 시간을 0.5-1.5초 사이로 설정해야 합니다. 압력은 1-8.5psi 사이로 설정해야 합니다. 각 마이크로피펫을 개별적으로 보정합니다. 마이크로피펫을 이러한 매개변수 내에서 보정할 수 없는 경우 사용해서는 안 됩니다.
3. 수술(그림 1A)
알림: 준비하려면 준비 부위와 수술 부위의 표면을 70% 에탄올로 청소하십시오. 준비 영역에 흡수성 언더패드를 놓습니다. 수술 부위에 히팅 패드를 내려 놓고 그 위에 흡수성 언더 패드를 놓습니다. 수술 전에 모든 도구를 소독하십시오. 댐이 마취 상태에있는 시간은 1 시간 미만이어야합니다.
- 마취
- 수술 30분에서 1시간 전에 임신한 댐에 5mg/kg의 NSAID(멜록시캄) 또는 다른 승인된 진통제를 투여하십시오.
- 임신한 댐을 이소플루란 기화기에 부착된 유도 챔버에 넣습니다.
- 기화기를 4% 이소플루란 및 3.5L/min 산소로 설정합니다.
- 발가락 꼬집음에 대한 반응 부족과 호흡률 감소로 마취가 확인되면 유도 챔버에서 준비 구역으로 댐을 제거합니다.
- 수술 준비
- 준비 구역에서 코 콘으로 댐을 앙와위에 놓습니다.
- 댐이 노즈 콘에 있는 동안 기화기를 2% 이소플루란 및 3.5L/min 산소로 줄입니다.
- 댐의 복부를 철저히 면도하고 과도한 모피를 제거하십시오. 면도한 복부를 포비돈 용액과 70% 에탄올로 번갈아 가며 멸균 면봉 어플리케이터를 사용하여 세 번 코팅합니다. 포비돈 용액의 최종 코팅을 적용합니다. 각막 건조를 방지하려면 댐의 양쪽 눈에 인공 눈물 젤을 바르십시오(그림 2A, B).
- 준비가 끝나면 노즈 콘이 있는 댐을 지정된 수술 부위로 옮깁니다.
- 자궁 개복술
알림: 수술 과정 내내 멸균 장갑을 사용하십시오. 멸균되지 않은 표면이 접촉한 경우 장갑을 교체하십시오.- 수술 부위에 댐을 누운 자세로 놓고 노즈콘을 테이프로 제자리에 고정합니다. 흡수 패드 아래의 가열 패드를 45 °C로 설정합니다.
- 집게와 가위를 사용하여 피부를 통해 약 2cm의 정중선 절개를합니다. 집게를 사용하여 피부를 천막으로 만들고 피부에 수직 절개를하십시오. 그런 다음 복막을 통해 비슷한 크기의 절개를 다시 하여 자궁 뿔을 노출시킵니다. 집게를 사용하여 수직 절개를 하는 동안 복막에 텐트를 칩니다(그림 2C, D).
참고: 복막을 절개하는 동안 제대로 텐트를 치지 않으면 장의 치명적인 절개로 이어질 수 있습니다. - 복부의 측면을 눌러 절개를 통해 자궁 뿔을 부드럽게 마사지하십시오. 우발적 인 부상을 방지하기 위해 손가락 만 사용하여 도구없이 자궁을 조심스럽게 안내하면됩니다. 노출된 자궁을 댐의 복부를 덮고 있는 멸균 수술용 드레이프 위에 놓고 필요에 따라 사용하기 전에 30°C로 데울 수 있는 멸균 식염수 방울로 수술 내내 촉촉하게 유지하십시오(그림 2E, F).
참고: 자궁 뿔은 Wang et al.27에 설명된 대로 식별할 수 있습니다. - 자궁이 노출되면 조작을 위해 세 쌍의 태반을 선택하십시오.
참고: 태반은 Elmore et al.24에 설명된 대로 식별할 수 있습니다. 배아의 생존을 극대화하려면 6 개 이상의 태반을 치료해야합니다. 배아가 12개 미만인 경우 4개 이하의 태반을 주입해야 합니다. 하나는 대조 주사를 받고 다른 하나는 실험 플라스미드를 받도록 인접한 두 개의 태반을 선택합니다. 인접한 두 개의 태반을 사용하면 자궁의 유사한 위치에 있는 태반을 더 잘 비교할 수 있고 생존율도 높일 수 있습니다. 선택된 태반 쌍은 무작위로 선택되고 양쪽 자궁 뿔 전체에 걸쳐 이격됩니다(그림 1B). - 태반 조작의 위치와 자궁 뿔 내 배아 조직을 기록하여 수집 중에 배아와 태반을 식별할 수 있도록 합니다., 하나의 댐이 대조 태반/배아를 모두 운반하기 때문입니다.
- 대조군 플라스미드의 태반 주입 및 전기천공
알림: 무균 기술을 유지하려면 사용하기 전에 전기 천공 패들과 미세 인젝터를 차가운 살균제로 멸균하십시오. 멸균되지 않은 표면이 접촉한 경우 장갑을 교체하십시오.- 보정된 마이크로피펫을 사용하여 3회 주입을 위해 충분한 양의 적절한 대조군 플라스미드를 로드합니다. 탈락부(흰색)와 접합부(진한 빨간색) 사이의 태반에 측면으로 ~0.5mm 깊이에서 모든 주사를 수행합니다(그림 3A-F).
- 3개의 대조군 태반에 주사를 시행합니다.
참고: 마이크로피펫과 플라스미드의 교차 오염을 방지하기 위해 실험 주입 전에 모든 대조군 플라스미드 주입을 수행하십시오. 이렇게 하면 마이크로피펫과 교정 시간을 변경하면 수술 시간이 크게 증가하고 댐 생존율이 감소하므로 동일한 마이크로피펫을 사용할 수 있습니다. - 주입 후 2분 이내에 플라스미드 주입된 대조군 태반의 전기천공을 수행합니다.
- electroporation의 경우 electroporation 기계에 부착된 한 쌍의 3mm 패들을 사용하십시오. CRISPR 통합 효율과 배아의 생존 가능성을 보장하려면 2펄스, 30V, 30ms 펄스, 970ms 펄스 꺼짐, 단극 전기천공 설정을 사용하십시오.
- 주사 후 전기 천공 직전에 접촉 부위를 멸균 식염수로 코팅하고 식염수를 자궁벽의 세 부위에 정확하게 바르고 스포이드 또는 주사기로 패들을 도포합니다.
- 태반의 측면에 있는 전기 천공 패들을 부드럽게 누릅니다. 양극 패들을 주입 부위와 음극 바로 반대편에 놓습니다(그림 4A-C).
- electroporation 기계의 펄스를 누르고 electroporation 패들을 제거하기 전에 두 펄스가 완료될 때까지 기다립니다.
알림: 맥박 동안 패들과 태반 사이에 소량의 흰색 거품이 자주 나타납니다. 이것이 발생하지 않으면 볼륨을 확인하십시오.tage 더 사용하기 전에 전압계로 패들에서. 전압계의 판독값이 electroporation vol과 일치하지 않는 경우tage 설정, 패들이 작동하지 않습니다.
- 실험 플라스미드의 태반 주입 및 전기천공
- 3.4.1 단계와 동일한 지침을 따르십시오. 단계 3.4.2로 이동합니다. 대조군 플라스미드 대신 실험 플라스미드를 사용한다.
- 주입 후 2분 이내에 주입된 세 가지 실험 태반 모두의 전기천공을 수행합니다. 이는 대조군 플라스미드를 주입한 것과 동일한 방식으로 수행해야 합니다. 3.4.4단계를 따릅니다. 단계 3.4.7로 이동합니다.
- 수술 완료
- 태반 조작이 완료되면 손가락만 사용하여 자궁 뿔을 복강 안으로 부드럽게 마사지합니다(그림 5A).
- 먼저 13mm 3/8c 바늘 합금으로 45cm 길이의 코팅 및 편조 용해성 봉합사를 사용하여 복막층에 이중 매듭 단일 봉합을 수행합니다. 봉합사를 2-3mm 간격으로 배치합니다(그림 5B).
- 복막 층을 봉합 한 후 용해성 봉합사로 피부를 봉합하십시오. 댐이 봉합을 취소할 수 없도록 단일 봉합사를 2-3mm 간격으로 삼중 매듭을 짓습니다(그림 5C).
- 봉합이 완료되면 이소플루란을 1%로, 산소를 3.5L/min으로 설정하고 조직의 접착제를 피부의 봉합사에 도포합니다(그림 5D).
알림: 조직 접착제는 선택 사항이지만 댐 씹기로 인해 절개 부위가 다시 열리는 것을 방지하기 위해 권장됩니다. - 조직 접착제가 마르면 기화기를 끄고 수술 부위에서 댐을 제거합니다. 댐을 뒤쪽에 있는 지지 케이지에 놓습니다.
4. 수술 후 관리 및 모니터링
- 임신한 댐이 수술의 즉각적인 합병증이 없도록 최소 30분 동안 감독 하에 깨끗한 케이지에서 회복되도록 합니다. 완전히 걸을 수 있고 도움 없이 발로 뛸 수 있을 때까지 관찰하십시오. 수술 후 댐을 단독으로 수용하십시오.
- 배아 수집까지 기관의 수술 후 관리 및 모니터링을 따르십시오. 댐 무게를 기록하고 봉합사와 절개 부위를 매일 모니터링합니다.
5. E14.5 태반 수집
- E14.5에서 케타민/자일라진 칵테일(1mg/mL 케타민 및 0.1mg/mL 자일라진)로 댐을 심하게 마취한 다음 댐을 자궁경부로 탈구합니다.
- 가위로 댐의 복부에 V 자 모양 절개를하고 자궁을 제거하십시오. 얼음 위의 5cm 페트리 접시에 즉시 놓습니다. 집게를 사용하여 자궁에서 배아와 해당 태반을 조심스럽게 제거하십시오.
참고: 자궁 뿔의 배아 위치와 해당 태반을 기록하여 수술 중 직접 조작을 받은 태반을 확인합니다. - 태반 무게를 기록하십시오. RNAse가 없는 집게와 면도기를 사용하여 태반을 정중선 아래로 반으로 자릅니다. 4 °C에서 4 % PFA에 절반을 넣으십시오. 나머지 절반을 다시 반으로 자르고 나머지 2/4는 RNA 저장 시약이 있는 두 개의 튜브에 -80°C에서 보관합니다.
참고: 배아 및 기타 모체 조직은 향후 사용을 위해 -80°C에서 컬렉션에서 보관할 수 있습니다.
6. 태반 유전자 발현 분석
- RNA 저장 시약에 -80 ° C에서 보관 된 태반의 4 분의 1을 사용하십시오.
- RNA 분리를 위한 Trizol 방법, RNA 농도를 위한 분광광도계, cDNA 합성 키트 및 SYBR Green Master Mix28을 사용한 qPCR을 사용하여 Elser et al.에 설명된 대로 qPCR을 위한 태반을 처리합니다. Elser et al.에 언급된 Turbo DNAfree 키트 DNAse 대신에, Trizol RNA 분리 후 RNAcleanup 키트를 사용하여 샘플에 오염 물질이 포함되어 있지 않은지 확인한다28.
알림: Trizol에 대한 물질안전보건자료(MSDS)를 읽고 화학 흄 후드에 사용하십시오. - GFP 프라이머를 사용한 대조군 플라스미드 및 BLAST 프라이머를 사용한 실험 플라스미드의 플라스미드 삽입을 평가합니다( 보충 표 1에 나열된 프라이머). CT 값을 사용하여 플라스미드의 존재를 확인합니다.
참고: 35 이상의 CT 값은 위양성이며 35 미만의 CT 값만 플라스미드가 성공적으로 삽입되었다는 양성 지표로 간주되어야 합니다. - 하우스키핑 유전자 18s로 정규화된 IGF-1 태반 발현을 평가합니다(보충 표 1에 나열된 프라이머). ddCT 방법을 사용하여 배수 변화를 계산한 다음 실험 샘플의 정규화된 배수 변화를 대조군 샘플의 평균 배수 변화로 계산합니다.
7. 태반 단백질 수준 분석
- -80 °C에서 보관된 태반의 1/4을 사용하십시오. 최종 pH가 7.4인diH2O중 11.5mM Tris HCl, 5mMMgCl2 및 10mM 프로테아제 억제제로 만든 완충 용액에서 조직을 균질화합니다. 휴대용 균질화기와 유봉을 사용하여 조직을 분해하십시오.
알림: sample은 버퍼 부피의 10%를 초과해서는 안 됩니다. - 균질화된 샘플을 1:12에서 완충액으로 희석하여 BCA(bicinchoninic acid assay) 키트의 검출 가능한 범위 내에 있도록 합니다. 제조업체의 지침에 따라 BCA 분석을 수행하고 플레이트 리더를 사용하여 총 단백질을 정량화합니다.
- BCA 분석을 수행 한 후 Gumusoglu et al.2에서와 같이 IGF-1 ELISA에 대해 모든 샘플을 동일한 총 단백질 농도 인 29 mg / mL로 표준화합니다.
- 제조자의 지시에 따라 IGF-1 ELISA를 수행하고, 표준 농도 곡선을 사용하여 플레이트 판독기로 IGF-1 단백질 수준을 정량화한다.
8. 형광 in situ 하이브리드화 라벨링을 사용한 공간 CRIPSR 검증
- 태반 반쪽을 4°C에서 4% PFA에 1-3일 동안 적절하게 고정한 후 4°C에서 20% 자당으로 옮긴 후 최적 절단 온도(OCT) 화합물로 동결합니다.
- OCT 내장 태반 반쪽을 -20°C 저온 유지 장치에서 10μm 섹션으로 연속적으로 분할하고 라벨을 붙일 슬라이드에 놓습니다. 세 개의 하위 영역이 모두 보이도록 태반을 반으로 나눕니다. in situ 하이브리드화에 사용될 때까지 슬라이드를 -80°C에서 보관합니다.
- 제조업체의 프로토콜에 따라 FISH(Fluorescence in situ hybridization) 라벨링을 수행합니다. 하나의 슬라이드를 dCas9-3xNLS-VP64 프로브와 하이브리드화하고 동일한 태반의 두 번째 "자매" 슬라이드를 Prl8a8 프로브와 하이브리드화합니다.
참고: dCas9-3xNLS-VP64 프로브는 과발현 플라스미드의 존재를 감지합니다. Prl8a8 프로브는 태반의 하위 영역을 식별할 수 있도록 하는 접합 영역의 해면영양모세포를 강조 표시합니다. 이 두 프로브는 태반의 녹색 자가형광과 다채널 형광의 간섭을 피하기 위해 별도의 "자매" 슬라이드에 레이블이 붙어 있습니다. - 두 프로브에 검출 염료(Opal 620)를 붙입니다. FISH에 대한 제조업체의 프로토콜을 완료한 후 DAPI 마운팅 매체를 적용하고 슬라이드에 커버슬립을 놓습니다. 커버슬립을 투명 매니큐어로 밀봉합니다.
- 정립 복합 형광 현미경으로 슬라이드를 이미지화하고 적절한 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 처리합니다. 여기서는 CellSens 소프트웨어가 사용되었습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
일반 절차 결과(그림 6)
이 연구에는 세 가지 조작 된 그룹이있었습니다. 여기에는 일반적인 CRISPR Cas9 대조군 플라스미드(Cas9 Control), 활성화 대조군 CRISPR 플라스미드(Act Control) 또는 IGF-1 SAM 활성화 플라스미드(Igf1-OE)가 주입된 태반이 포함되었습니다. Cas9 Control은 knockout 플라스미드에 더 적합하며, activation control은 과발현/활성화 플라스미드에 더 적합합니다. 주입 및 전기천공을 통해 태반을 조작함으로써 발생하는 생존력 변화를 평가하기 위해, 깔짚 내의 배아 생존을 E14.5에서 분석하였다(도 6A). 이 시점은 전기천공을 사용하여 CRISPR 플라스미드의 생체 내 삽입을 수행한 다른 연구에서 발현 변화가 8-22시간 30,31,32시간 이내에 달성될 수 있음을 보여주었기 때문에 선택되었습니다. E14.5에서의 수집은 약 48시간 후에 CRISPR 플라스미드가 유전자 발현의 증가를 통합하고 활성화할 수 있도록 합니다. 댐의 외과적 조작이 모든 배아의 생존에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌지만, 주사와 전기천공을 받은 조작된 태반과 관련된 배아는 생존율을 현저히 감소시켰습니다. 처리되지 않은 배아의 생존율 (동일한 깔짚에서 표적 조작을 거치지 않음)은 100 % 생존율에서 평균 79.05 %로 감소했다. 조작된 배아의 생존율은 평균 55.56%로 유의하게 감소했습니다. 조작된 세 그룹 간에 유의미한 차이는 발견되지 않았습니다.
조작된 태반에서 상당한 총체적 변화가 발생했는지 확인하기 위해 태반 중량을 기록했습니다. 어떤 그룹의 태반 무게에도 큰 차이가 없었으며(그림 6B), 태반과 배아의 전체적인 모습은 변하지 않았습니다. 대표적인 괴사후 이미지는 E14.5에서 수집 시 해부 현미경으로 촬영되었습니다. 다른 치료 그룹의 태반/배아의 이미지를 모두 동일한 깔짚 내에서 촬영했습니다. 양막 또는 노출된 배아 및 그에 상응하는 태반에서 어떤 치료 그룹에서도 표현형 외관의 눈에 띄는 손상이나 변화가 없었습니다(그림 6D-I). IGF-1 활성화 플라스미드를 사용하여 조작된 그룹의 형태에서 큰 차이는 나타나지 않았지만, 태반 또는 배아의 필수 성장 및 기능 조절자에 보다 실질적으로 영향을 미칠 수 있는 다른 유전자를 표적으로 하는 다른 실험 플라스미드에는 해당되지 않을 수 있습니다. Cas9 대조군과 작용 대조군 태반 사이의 어떤 측정에서도 차이가 발견되지 않았습니다. 따라서 이 두 그룹을 결합하여 모든 분석에 대해 Con 또는 Controls라고 했습니다. 이러한 결과는 이 기술을 사용하여 E12.5에서 자궁 내 태반을 조작하면 배아 생존이 감소하지만 여전히 상당한 생존 가능성이 있음을 보여줍니다. 결과는 또한 조작된 태반과 치료되지 않은 태반 사이에 체중에 큰 변화가 없었기 때문에 태반 성장이 전반적으로 큰 영향을 받지 않는다는 것을 보여줍니다. 이것은 제안된 기술이 건강하고 생존 가능한 CRISPR 조작 태반과 그에 상응하는 배아의 생존을 허용할 수 있음을 보여줍니다.
댐 체중 변화는 E14.5에서 배아 수집 전에 수술 후 매일 기록되었습니다(그림 6C). 수술은 E12.5에서 이루어 졌으므로 모든 댐 무게 변화는 E12.5의 무게와 관련하여 나열됩니다. 실험용(Exp) 댐은 태반 조작을 받은 반면, 가짜 댐은 태반 조작 없이 비슷한 기간의 마취와 개복술을 받았습니다. 많은 임신 댐은 시술 다음날 체중이 약간 감소하거나 변화가 없었습니다 (E13.5). 이것은 수술 중 및 수술 후 잠시 동안 식사 장애로 인한 것 같습니다. 대부분의 댐은 E14.5에서 중량 증가를 보였지만 때때로 중량 감소가 여전히 관찰되었습니다. 수술 후 산모 댐 중량을 추적하여 배아 생존을 모니터링할 수 있었습니다. 수술 후 임신한 댐의 체중 차이는 일반적이었고 처리된 모든 배아가 손실되었음을 나타내지 않았습니다. 가짜 댐과 실험용 댐의 수술 후 체중 변화에는 유의미한 차이가 없었습니다. 이것은 CRISPR 플라스미드를 태반에 삽입한 후 댐의 웰빙이 일반적으로 보존되었음을 보여줍니다. 전반적으로, 이것은 이 수술 기술이 배아의 생존력을 감소시킬 수 있지만 여전히 연구에 사용할 수 있는 상당한 비율의 건강한 자손을 산출한다는 것을 보여줍니다.
E14.5 태반의 발현 및 CRISPR 혼입 분석(그림 7)
IGF-1 활성화 플라스미드의 세포 삽입이 IGF-1 과발현에 성공적이었는지를 확인하기 위해, qPCR을 수행하였다. 예상한 바와 같이, qPCR은 폴드 변화가 18s 발현으로 정규화되었을 때 대조군 태반에 비해 IGF1-OE 태반에서 IGF-1 발현의 상당한 증가를 보여주었다(Welch's t-test, p = 0.0302)(도 7A). IGF-1 단백질 수준이 변경되었는지 확인하기 위해 모든 그룹의 태반에 대해 ELISA를 수행했습니다. qPCR과 일치하게, E14.5 태반의 ELISA 평가는 대조군 태반에 비해 IGF1-OE 태반에서 IGF-1 단백질 수준의 유의한 증가를 보여주었다(Welch's t-test, p = 0.0469)(도 7B). qPCR과 ELISA는 과발현 플라스미드가 각각 IGF-1 유전자 발현과 IGF-1 단백질 생산을 성공적으로 증가시키는 것으로 나타났습니다.
플라스미드의 전달이 조작된 태반에 특이적인지 확인하기 위해 특이적 IGF-1 활성화 플라스미드 및 CRISPR Cas9 대조군 플라스미드에 대해 qPCR을 수행했습니다. 이러한 qPCR은 조작된 태반과 주입된 태반에 인접한 처리되지 않은 태반 모두에서 수행되었습니다. 활성화 플라스미드 발현을 평가하기 위해 사용된 qPCR 프라이머는 활성화 시스템의 일부인 BLAST 플라스미드의 서열을 표적으로 하였다(도 7C). 처리되지 않은 태반은 BLAST 플라스미드의 존재를 나타내지 않았으며(주기 역치[CT] 미결정, 그래프에서 40으로 표시됨), Igf1-OE 태반은 약 30의 CT를 나타내었다. 대조군 플라스미드 발현을 평가하기 위해 수행된 qPCR은 삽입된 GFP 유전자로부터의 서열을 표적화하였다(도 7D). 치료되지 않은 태반은 35 이상의 CT 값을 보였는데, 이는 프라이머 이합체화로 인한 것일 수 있는데, 이는 이 값이 예상 발현 범위를 벗어났기 때문입니다. 대조군은 약 30의 CT 값을 보였다. 이러한 qPCR은 IGF-1 의 예상되는 과발현 또는 그 결핍을 입증하기 위한 품질 검사 역할을 하며 플라스미드는 예상되는 조작된 태반에만 존재한다는 것을 입증합니다.
IGF-1 활성화 플라스미드의 공간적 검증은 태반 절편을 이용하여 수행하였다. OCT 화합물에 고정되고 동결된 태반을 슬라이드 상에 10μm로 연속적으로 절편하여 모든 층이 보이도록 하였다. 이어서, 슬라이드를 FISH 라벨링에 사용될 때까지 -80°C에서 동결시켰다. 태반 내에서 IGF-1 CRISPR 활성화 플라스미드가 통합된 위치를 확인하기 위해 적색 형광 표지가 있는 dCas9-3xNLS-VP64 프로브를 사용했습니다. 이 프로브는 활성화 시스템의 기능적 구성 요소를 대상으로 합니다. 태반 모체-태아 경계면의 하위 영역을 입증하기 위해 녹색 자가형광이 사용되었습니다(그림 7E,F). dCas9-3xNLS-VP64는 CRISPR 조작으로 처리되지 않았기 때문에 처리되지 않은 태반에서 검출되지 않았습니다(그림 7E). 예상대로 IGF1-OE 태반은 빨간색으로 표시된 바와 같이 dCas9-3xNLS-VP64에 대한 라벨링을 표시했습니다(그림 7F). CRISPR 통합은 태반의 세 하위 영역 모두에서 발견되었으며, 접합 영역의 가장 명확한 표시가 있습니다(그림 7E). dCas9-3xNLS-VP64 표지의 형광 강도는 플라스미드 처리된 태반에 걸쳐 다양했으며, 이는 일부가 다른 태반보다 플라스미드를 더 높게 발현하고 표지의 정확한 위치/범위에 변화가 있었지만 표지는 일반적으로 모든 하위 영역에 존재했습니다. dCas9-3xNLS-VP64 표지의 위치를 확인하기 위해 해면영양모세포를 표적으로 하는 Prl8a8 FISH 표지를 수행하여 중간 접합 하위 영역을 표지했습니다(그림 7G,H). 이것은 dCas9-3xNLS-VP64에 대해 라벨링된 섹션의 "자매" 슬라이드에서 동일한 태반의 인접 섹션에서 수행되었습니다. 예상한 바와 같이, Prl8a8 표지에 의해 지시된 구조는 IGF1-OE와 처리되지 않은 태반 사이에서 유사하였다. 낙엽 및 미로 영역은 빨간색 접합 영역을 둘러싸고 있는 파란색 핵(DAPI) 표시로 식별할 수 있습니다(그림 7G,H). dCas9-3xNLS-VP64의 FISH 표지는 플라스미드가 3개의 하위 영역 모두에 삽입되었음을 명확히 했으며, 이는 Prl8a8 표지로 확인되었습니다. FISH 표지의 결과는 IGF-1 활성화 플라스미드의 혼입이 성공적이었고, 플라스미드가 처리되지 않은 태반으로 이동하지 않았음을 확인하였다.
그림 1: 프로토콜의 개략도. (A) 수술 절차의 단순화된 개략도. 기술의 주요 단계를 연대순으로 정렬합니다. (B) 자궁 뿔 내에서 조작된 태반 간격의 예를 보여주는 개략도. 두 패널 모두 BioRender.com 로 만들어졌습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 자궁 개복술 절차. (A-B) 수술 준비 중, (A) 댐의 면도된 복부 및 (B) 요오드 용액으로 코팅된 면도된 부위. (C-F) 수술 부위에서 (C) 복부 피부에 ~2cm 절개 및 (D) 복막에 ~2cm 절개; 내장이 보입니다. (E) 절개 부위를 통해 자궁 뿔을 조작합니다. 자궁 뿔이 보입니다. (F) 완전히 노출된 자궁 뿔을 멸균 수술용 드레이프 위에 놓습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: E12.5 태반에 CRISPR 플라스미드 주입. (A,B) 자궁 뿔 내 배아와 태반의 방향. (A) 낙엽, 태아 영역 및 배아를 보여주는 표시된 자궁 뿔의 비스듬한 모습. 점선은 주사 부위가 있어야 하는 위치를 나타냅니다. (B) 패널 A의 라벨이 없는 자궁 뿔. (씨, 디) 태반의 주사 부위에 삽입 된 마이크로 피펫의 측면도. D는 탈락, FZ는 태아 영역, E는 배아, 점선은 주사 부위 위치를 나타냅니다. (D) 패널 C에서 마이크로피펫 삽입의 표지되지 않은 이미지. (E,에프) 주입 후 태반의 염료의 측면도. (E) 가시광선 염료를 포함하는 CRIPSR 플라스미드가 주입된 태반과 주입되지 않은 태반을 표시하는 자궁 뿔의 라벨이 붙은 이미지. (F) 패널 E에 있는 자궁 뿔의 레이블이 없는 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: CRISPR 플라스미드 주입 후 E12.5 태반의 전기천공법. (A) 자궁 뿔에 있는 태반의 평면도. 양극 및 음극 전기천공 패들에는 라벨이 붙어 있으며 흰색 화살표는 주입 부위의 위치를 나타냅니다. (B) 태반의 전기천공에 대한 비스듬한 보기. (C) 태반의 전기천공의 측면도. (D-F) 패널 A, B 및 C의 단순화된 개요입니다. 양극과 음극 패들은 라벨이 붙어 있고, P는 태반이고, E는 배아이고, 라벨이 붙지 않은 영역은 자궁입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : 복부 피부와 복막의 봉합. (A) 수술 완료 후 자궁 뿔이 복부로 돌아왔습니다. 복부 피부와 복막 절개가 보입니다. (B) 복막 절개가 완전히 봉합되었습니다. (C) 복부 피부 절개 부위를 완전히 봉합합니다. (D) 복부 피부 봉합사에 조직 접착제 도포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 일반 절차 결과. (A) 수술 후 2일 후 E14.5에서 수집된 수술 후 배아 생존율. 처리되지 않은 배아에 비해 조작된 그룹에서 생존율의 현저한 감소가 관찰되었다(Mann-Whitney U 테스트: 처리되지 않은 대 Cas9 대조군, p = 0.0077; 미처리 대 작용 대조군, p = 0.0330; 및 미처리 대 IGF1-OE, p = 0.0032). 조작된 그룹의 생존에서 유의한 차이는 관찰되지 않았습니다(일원 ANOVA, p = 0.9454). 각 포인트는 단일 한배로부터의 생존율을 나타낸다(처리되지 않은 n=22, Cas9 대조군 n=9, Act대조군 n=13, 및 IGF1-OEn=22리터). (B) E14.5에서 생존한 배아의 태반 무게(단방향 ANOVA, p = 0.1436)(처리되지 않은 n = 138, Cas9 대조군 n = 15, Act 대조군 n = 20 및 IGF1-OE n = 36 태반). (C) 가짜 개복술을 받았거나 실험적(Exp) 태반 조작을 받은 댐에서 볼 수 있는 E13.5 및 E14.5의 수술 후 댐 무게 변화. 수술 후 댐의 무게 변화의 두 그룹 사이에는 유의미한 차이가 없습니다(짝을 이루지 않은 t-테스트: E13.5 p=0.5452 및 E14.5 p=0.2493)(가짜 댐 n=3 및 Exp 댐 n=10). 모든 오차 막대는 SEM을 나타냅니다. (D-F) 태반이 여전히 부착된 양막에서 괴사된 후 E14.5 배아의 이미지. (F) 맨 오른쪽 모서리의 눈금 막대는 3.75mm를 나타냅니다. (G-I) 배아의 비스듬한 이미지와 해당 태반의 평면도. (I) 맨 오른쪽 모서리의 눈금 막대는 3.75mm를 나타냅니다. (D-I) 모든 치료 그룹 레이블은 이미지 아래에 나열됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: E14.5 태반의 발현 및 CRISPR 혼입 분석. (A) E14.5 대조군 및 IGF1-OE 태반에서 IGF-1 발현의 qPCR 분석. 18s 발현으로 정규화된 IGF-1 발현의 현저한 증가가 IGF1-OE 태반에서 관찰되었다 (Welch's t-test, p=0.0302) (대조군 n=15 및 IGF1-OEn=20 태반). (B) E14.5 대조군 및 IGF1-OE 태반에서 IGF-1 단백질 수준의 ELISA. IGF-1 수준의 현저한 증가가 대조군 수준 (Welch's t-test, p = 0.0469)과 비교하여 IGF1-OE 태반에서 관찰되었다 (대조군 n = 13 및 IGF1-OE n = 15 태반). (c) IGF-1 SAM 플라스미드로부터의 BLAST 서열의 qPCR 분석. BLAST의 발현은 IGF1-OE 태반에서만 발견되었고, 처리되지 않은 태반에서는 발현이 없거나 확인되지 않았다 (처리되지 않은 n = 4 및 IGF1-OE n = 9 태반). (d) Cas9 대조군 플라스미드에서 CRISPR GFP 서열의 qPCR 분석. 플라스미드의 발현은 대조군 태반에서 발견되었고, 35/위양성 결과 이상의 CT 값은 처리되지 않은 샘플에서 발견되었습니다(처리되지 않은 n = 4 및 대조군 = 5 태반). 점선은 35CT에서 거짓 양성 임계값을 나타냅니다. 각 데이터 포인트는 하나의 태반에서 가져온 것입니다. 모든 오차 막대는 SEM을 나타냅니다. (EH) 10 μm 두께에서 E14.5 태반 절편의 형광 in situ hybridization. (E) 처리되지 않은 IGF1-OE 태반 절편 및 (F) 빨간색으로 표시된 dCas9-3xNLS-VP64 프로브가 있는 태반 절편. 적색 신호는 IGF1-OE 태반에만 존재합니다. 녹색 신호는 태반 하위 영역을 식별하는 데 사용되는 자가형광입니다. (G) 중간 접합 영역의 해면영양모세포를 식별하기 위해 빨간색으로 표시된 Prl8a8 프로브가 있는 처리되지 않은 및 (H) IGF1-OE 태반 섹션. 파란색의 DAPI는 해당 접합 영역을 둘러싸고 있는 낙엽 및 미로 영역을 보여 줍니다. (H) 맨 오른쪽 모서리에 있는 눈금 막대는 2mm를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충표 1: 본 연구에 사용된 프라이머. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
태반은 태아 성장의 일차적 조절인자이며, 앞서 언급했듯이 태반 유전자 발현 또는 기능의 변화는 태아 발달에 상당한 영향을 미칠 수 있다6. 여기에 설명된 프로토콜은 비교적 진보된 외과적 접근법을 사용하여 마우스 태반의 표적 생체 내 CRISPR 조작을 수행하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술은 추가 연구에 사용할 수 있는 생존 가능한 배아와 해당 태반의 상당한 수확량을 허용합니다(그림 6A, B). 이 기술을 통해 E14.5에서 태반 IGF-1을 성공적으로 과발현할 수 있었습니다(그림 7A,B). 사용된 플라스미드는 삽입된 플라스미드가 조작된 태반에 남아 있고 처리되지 않은 인접한 태반에는 존재하지 않았기 때문에 특이성을 나타냈습니다(그림 7C,D). IGF-1 활성화 플라스미드의 공간적 분포는 dCas9-3xNLS-VP64 및 Prl8a8에 대한 FISH에 의해 확인되었으며, 이는 활성화 플라스미드가 IGF1-OE 태반의 3개의 서브영역에 존재하고 처리되지 않은 태반의 임의의 서브영역에는 존재하지 않는다는 것을 입증하였다(도 7E-H). 이 기술은 이전 기술로는 불가능할 수 있는 방식으로 태반 유전자 발현을 변경하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술을 사용하면 태반 유전자 발현 및 기능이 여러 맥락에서 태아 발달에 미치는 영향을 더 잘 이해할 수 있습니다.
산모 및 태아 결과에 대한 이 절차의 성공을 최적화하기 위해 주입 및 전기천공 설정과 사용된 재료를 포함하여 여러 매개변수 변경의 효과를 조사했습니다. 댐 생존율과 회복율을 높이기 위해 수술 기간이 길수록 생존율이 현저히 감소하기 때문에 마취 시간이 1시간을 초과해서는 안 되는 것으로 나타났습니다. 마취 시간이 약 2 시간에 도달하면 생존 가능성이 20 % 미만으로 급격히 감소하는데, 이는 이소 플루란 하에서 연장 된 시간의 부정적인 영향으로 인한 것일 수 있습니다. 마취 시간 외에 산모 사망으로 이어진 수술의 가장 흔한 합병증은 피부와 복막 절개를 하는 동안 복막을 제대로 막지 못한 것이었습니다. 복막이 제대로 막히지 않으면 장이 손상되어 수술 후 며칠 안에 사망에 이를 수 있습니다. 자궁이 노출되는 시간도 댐과 배아의 생존에 영향을 미칩니다. 성공적인 실험에서 자궁이 노출된 평균 시간은 약 15분이었습니다. 30분 이상 노출되면 흡수가 증가하고 산모의 질병이 발생할 수 있습니다. 노출 된 자궁 및 기타 노출 된 장기 (종종 내장)는 촉촉하게 유지해야하지만 식염수가 너무 많으면 동물을 식힐 수 있습니다. 노출 된 장기를 주기적으로 습윤시킬 때는 1mL 미만의 멸균 식염수를 사용해야합니다.
주입 및 전기 천공의 매개변수는 배아 생존에 큰 영향을 미쳤습니다. 주입 부피는 약 4.5μL를 초과해서는 안 되며, 이로 인해 재흡수가 발생했습니다. 주입 시간과 압력은 생존을 극대화하는 데 중요합니다. 주입 시간은 0.5초에서 1.5초 사이로 설정해야 하지만 0.8초가 최적으로 보입니다. 압력은 1-8.5psi 사이로 설정해야 합니다. 낮은 주사 시간과 높은 주입 PSI 수준에서 낮은 배아 생존율이 나타났습니다. 또한 마이크로피펫이 너무 뭉툭하면 배아 생존력이 감소할 수 있으며 용액도 종종 마이크로피펫 밖으로 누출되는 것으로 관찰되었습니다. 주사를 시각화하는 데 사용되는 염료의 유형은 생존에 영향을 줄 수 있습니다. 메틸렌 블루는 이러한 목적으로 사용될 때 산모의 사망으로 이어졌지만 여과된 패스트 그린 염료 용액은 산모의 건강에 부정적인 영향을 미치지 않았습니다. 전기천공 설정은 생체 내 이전 전기천공 연구를 기반으로 권장되는 제조업체 설정에서 최적화되었습니다 33. Electroporation은 가장 큰 손상을 입히고 배아 생존을 감소시키는 조작으로 밝혀졌습니다. 권장되는 생체 내 배아 전기천공 설정은 CRISPR 효율을 최대화하기 위해 4개의 펄스를 제안하지만, 더 높은 생존율을 위해서는 2개의 펄스가 권장됩니다33. 네 번의 펄스가 거의 모든 배아를 재흡수시키는 것으로 밝혀졌습니다. 두 개의 펄스로 CRISPR 효율을 유지하면서 생존율을 높일 수 있었습니다. 전기천공 패들의 크기는 배아 생존에도 큰 영향을 미쳤습니다. 5mm electroporation paddles는 권장 설정과 함께 사용할 때 거의 완전한 흡수를 유도하는 것으로 나타났습니다. 실제로, 3 mm electroporation paddles는 제조사 가이드에서 권장하고 있으며, 배아 생존율을 현저히 증가시킨다33. 또한 많은 전기 천공 패들이 특정 펄스 수명을 가지고 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 이 최대로 사용 된 후에는 품질이 저하 될 수 있습니다. 이것은 맥박 동안 패들과 태반 사이에 작은 흰색 거품이 형성되지 않으면 확인할 수 있습니다. electroporation 패들 voltage는 전압계를 사용하여 예상 전압을 생성하는지 확인할 수 있습니다.tage.
이 연구는 몇 가지 면에서 제한적입니다. 이 기술은 시간에 따라 다르며 E10.5 이전과 E16.5 이전에 가장 잘 수행될 수 있습니다. 이는 E10.5 이전에는 태반이 너무 작았고 E16.5 이후에는 플라스미드가 원하는 효과를 생성하기에 충분한 시간을 갖지 못할 수 있기 때문입니다. 이 기간은 이 기술이 생쥐를 대상으로 한 특정 유형의 연구에 더 적합하다는 것을 의미합니다. 이 기술은 E12.5가 뇌 내의 많은 구조에 대한 신경 발생의 결정적인 시기에 속하기 때문에 신경 발달을 연구하는 데 유용합니다34. 이 기술은 E8.535에서 일어나는 신경판 형성과 같은 발달 초기 단계의 태반 영향을 연구하는 데 유용하지 않을 수 있습니다. 녹아웃 CRISPR 플라스미드의 결과는 현재 알려져 있지 않습니다. 유전자 발현 감소에 대한 이 방법의 적용은 유전자의 과발현/활성화만이 입증되었기 때문에 추가 조사가 필요합니다. 그럼에도 불구하고 이 기술은 녹아웃 CRISPR 플라스미드의 삽입에도 성공할 것으로 예상됩니다.
이 기술은 또한 유전자 변형 태반 조직(36)의 1차 배양을 수행할 수 있는 가능성을 허용할 수 있다. CRISPRi 및 CRISPRa와 같이 사용되는 CRISPR의 유형에 따라 1차 배양을 사용하여 구조 연구를 수행할 수 있습니다(37,38). 이 기술은 또한 태반 유전적 및 기능적 이상과 자손의 문제 사이의 연관성을 추가로 탐구하는 데 사용될 수 있습니다. 특히, 이전 연구에서는 태반 특이적 게놈 위험 점수와 정신분열증 위험 사이에 유의미한 상관관계가 있음을 발견했습니다39. 이 연구는 동물 모델에서 탐구되지 않은 정신분열증 발달에 역할을 할 수 있는 많은 태반 유전자를 확인했습니다. 이 기술은 이러한 유형 및 기타 유형에 대한 추가 연구에 적합합니다.
태반의 CRISPR 변형을 통해 얻은 지식은 다양한 생물 의학 응용 분야로 번역될 수 있습니다. 태반의 특정 유전자 발현이 태아 발달에 어떤 영향을 미칠 수 있는지 확인하는 연구는 이러한 이상을 치료할 수 있는 태반 표적 약리학적 개입을 만드는 데 사용될 수 있습니다. 태아를 직접 표적으로 하는 치료는 어렵고 위험할 수 있습니다40,41. 태반은 치료를 위해 더 접근하기 쉬운 표적입니다. 태아기에 수정할 수 있는 심장이나 뇌의 발달 문제의 경우 직접적인 심장 또는 뇌 조작이 위험합니다. 이러한 위험은 태반 중재술로 피할 수 있는데, 이는 더 그럴듯하고 태반에 의해 부분적으로 제공되는 분자 환경이 중요할 수 있는 신경 발달 장애에 대한 예방 전략으로 이어질 수 있다5. 이 기술은 태반 장애와 관련이 있는 선천성 심장병과 같은 질병을 치료하는 데에도 활용될 수 있다9. 선천성 심장병은 흔한 선천적 결함이므로 태반 중재술의 가능성은 상당한 영향을 미칠 수 있다8. 태반은 많은 기능을 가지고 있기 때문에 이 기술은 여러 질병에 대한 중재 개발을 발전시키는 데 사용될 수 있습니다. 전반적으로, 이 태반 표적 기술은 태아 발달의 여러 영역에 대한 태반 유전학 및 기능의 영향에 대한 이해를 높이는 데 사용될 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 R01 MH122435, NIH T32GM008629 및 NIH T32GM145441과 같은 자금 출처를 인정합니다. 저자는 수술실과 장비를 사용한 아이오와 대학의 Val Sheffield 박사와 Calvin Carter 박사의 연구실, 현미경 검사에 도움을 준 Eric Van Otterloo 박사, Nandakumar Narayanan 박사, Matthew Weber 박사에게 감사를 표합니다. 저자는 또한 파일럿 수술에 도움을 준 Sara Maurer 박사, Maya Evans 및 Sreelekha Kundu에게 감사를 표합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml Tubes | USA Scientific Inc | 1615-5500 | |
| 4% Paraformeldhyde (PFA) in PBS | Thermo Fisher Scientific | J61899.AP | |
| 96 Well plate | Cornings | 3598 | For BCA kit |
| Absorbent Underpads | Fisher Scientific | 14-206-62 | |
| Activation Control Plasmid | Santa Cruz Biotechnology | sc-437275 | Dnase-free water provided for dilution |
| AMV Reverse Transcriptase | New England Biolabs | M0277L | Use for cDNA synthesis |
| Anesthetic Gas Vaporizor | Vetamac | VAD-601TT | VAD-compact vaporizer |
| Artifical Tear Gel | Akorn | NDC 59399-162-35 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | Protein quantification |
| Biovortexer | Bellco Glass, Inc. | 198050000 | Hand-held tissue homogenizer |
| CellSens Software | Olympus | V4.1.1 | Image processing to FISH images. |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | EP022628168 | Plate centrifuge |
| Chloroform | Thermo Fisher Scientific | J67241-AP | RNA isolation |
| Cotton Tipped Applicators | ProAdvantage | 77100 | Sterilize before use |
| CRISPR/Cas9 Control Plasmid | Santa Cruz Biotechnology | sc-418922 | Dnase-free water provided for dilution |
| CryoStat | Leica | CM1950 | |
| Dissection Microscope | Leica | M125 C | Used for post-necroscopy imaging |
| Dissolvable Sutures | Med Vet International | J385H | |
| Distilled Water | Gibco | 15230162 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Thermo fisher Scientific | 14190144 | (-) Calcium; (-) Magnesium |
| ECM 830 Electro Electroporator (Electroporation Machine) | BTX Harvard Apparatus | 45-0662 | Generator only |
| Electric Razor | Wahl | CL9990 | Kent Scientific |
| Electroporation paddles/Tweezertrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0487 | 3 mm diameter paddles; wires included |
| Embedding Cassette: 250 PK | Grainger | 21RK94 | Placenta embedding cassettes |
| Ethanol | Thermo Fisher Scientific | 268280010 | |
| F-Air Canisters | Penn Veterinary Supply Inc | BIC80120 | Excess isoflurane filter |
| Fast Green Dye FCF | Sigma | F7252-5G | Dissolve to 1 μg/ml and filter; protect from light |
| Filter-based microplate photometer (plate reader) | Fisher Scientific | 14377576 | Can be used for BCA and ELISA |
| Forceps | VWR | 82027-386 | Fine tips, straight, serrated |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma Aldrich | HT501128 | |
| Glass Capillaries - Borosilicate Glass (Micropipette) | Sutter Instrument | B150-86-10 | O.D.: 1.5 mm, I.D.: 0.86 mm, 10 cm length |
| Halt Protease and Phosphotase inhibitor cocktail (100x) | Thermo Scientific | 1861281 | Protein homogenization buffer |
| Heating Pad | Thermotech | S766D | Digitial Moist Heating Pad |
| Hemostats | VWR | 10806-188 | Fully surrated jaw; curved |
| Hot Water Bath | Fisher Scientific | 20253 | Isotemp 205 |
| Igf-1 SAM Plasmid (m1) | Santa Cruz Biotechnology | sc-421056-ACT | Dnase-free water provided for dilution |
| Induction Chamber | Vetamac | 941443 | No specific liter size required |
| Isoflurane | Piramal Pharma Limited | NDC 66794-013-25 | |
| Isoproponal/2-Proponal | Fisher Scientific | A451-4 | RNA isolation |
| Ketamine HCl 100mg/ml | Akorn | NDC 59399-114-10 | |
| MgCl2/Magneisum Chloride | Sigma Aldrich | 63069-100ML | 1M. Protein homogenization buffer |
| MicroAmp™ Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode | Fisher Scientific | 4309849 | Barcoded plates not required |
| Microcapillary Tip | Eppendorf | 5196082001 | Attached to BTX Microinjector |
| Microinjector | BTX Harvard Apparatus | 45-0766 | Stainless Steel Pipette Holder, 130 mm Length, for 1 to 1.5 mm Pipettes |
| Microject 1000A (Injection Machine) | BTX Harvard Apparatus | 45-0751 | MicroJect 1000A Plus System |
| Micropipette Puller Model P-97 | Sutter Instrument | P-97 | Flaming/Brown type micropipette puller |
| Microplate Mixer (Plate Shaker) | scilogex | 822000049999 | |
| Mouse/Rat IGF-I/IGF-1 Quantikine ELISA Kit | R & D Systems | MG100 | |
| Needles | BD - Becton, Dickson, and Company | 305106 | 30 Gx 1/2 (0.3 mm x 13 mm) |
| Nitrogen Tank | Linde | 7727-37-9 | Any innert gas |
| Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drug (NSAID) | Norbrook Laboratories Limited | NDC 55529-040-10 | Analesgic such as Meloxicam |
| Nose Cone | Vetamac | 921609 | 9-14 mm |
| Opal 620 detection dye | Akoya Biosciences | SKU FP1495001KT | Used for FISH |
| Optimal Cutting Temperature (O.C.T) Compound | Sakura | 4583 | |
| Oxygen Tank | Linde | 7782 - 44 - 7 | Medical grade oxygen |
| Pestles | USA Scientific Inc | 14155390 | |
| Povidone-Iodine Solution, 5% | Avrio Health L.P. | NDC 67618-155-16 | |
| Power SYBR™ Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4367659 | Use for qPCR |
| Random Hexamers (Random Primers) | New England Biolabs | S1330S | Use for cDNA synthesis |
| Razor Blade | Grainger | 26X080 | |
| RNA Cleanup Kit & Concentrator | Zymo Research | R1013 | |
| RNALater | Thermo Fisher Scientific | AM7021 | |
| RNAscope kit v.2.5 | Advanced Cells Diagnostics | 323100 | Contains all reagents required for fluorescent in situ hybridization. Probes sold separately. |
| RNAscope™ Probe- Mm-Prl8a8-C2 | Advanced Cells Diagnostics | 528641-C2 | |
| RNAscope™ Probe- Vector-dCas9-3xNLS-VP64 | Advanced Cells Diagnostics | 527421 | |
| Roto-Therm Mini | Benchmark | R2020 | Dry oven for in situ hybridization |
| Scissors | VWR | 82027-578 | Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4¹/? |
| Sodium Chloride (Saline) | Hospra | NDC 0409-4888-03 | Sterile, 0.9% |
| Sodium Citrate, Trisodium Salt, Dihydrate, [Citric Acid, Trisodium Dihydrate] | Research Product International | 03-04-6132 | |
| Sodium Hydroxide 1N Concentrate, Fisher Chemical | Fisher Scientific | SS277 | Protein homogenization buffer |
| Steamer | Bella | B00DPX8UBA | |
| Sterile Surgical Drape | Busse | 696 | Sterilize before use |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Surgipath Cover Glass 24x60 | Leica | 3800160 | |
| Syringes | BD - Becton, Dickson, and Company | 309659 | BD Luer Slip Tip Syringe sterile, single use, 1 mL |
| Thermo Scientific™ Invitrogen™ Nanodrop™ One Spectrophotometer with WiFi and Qubit™ 4 Fluorometer | Fisher Scientific | 13-400-525 | This configuration comes with Qubit 4 fluorometer. Qubit quantification not required. |
| Tissue Adhesive | 3M | 1469SB | VetBond |
| Tris HCl | Thermo Fisher Scientific | 15568025 | 1M. Protein homogenization buffer |
| TRIzol™ Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | RNA isolation |
| TSA Buffer Pack | Advanced Cells Diagnostics | 322810 | Used to dilute Opal 620 detection dye |
| Universal F-Circuit | Vetamac | 40200 | Attached to vaporizer and vaporizer accessories |
| Upright Compound Fluorescence Microscope | Olympus | BX61VS | Used for FISH imaging |
| Vectorshield with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Coverslip mounting media |
| ViiA™ 7 Real-Time PCR System with 384-Well Block | Thermo Fisher Scientific | 4453536 | This is for SYBR 384-well block detection. TaqMan and/or smaller blocks available |
| Wet n Wild Nail Polish Wild Shine, Clear Nail Protector, Nail Color | Amazon | C450B | |
| Xylazine 20mg/ml | Anased | 343730_RX |
References
- Cross, J. C., et al. Genes, development and evolution of the placenta. Placenta. 24 (2-3), 123-130 (2003).
- Perez-Garcia, V., et al. Placentation defects are highly prevalent in embryonic lethal mouse mutants. Nature. 555 (7697), 463-468 (2018).
- Rosenfeld, C. S.
- Maslen, C. L.
- Kundu, S., Maurer, S. V., Stevens, H. E. Future horizons for neurodevelopmental disorders: Placental mechanisms. Frontiers in Pediatrics. 9, 653230 (2021).
- Woods, L., Perez-Garcia, V., Hemberger, M. Regulation of placental development and its impact on fetal growth-new insights from mouse models. Frontiers in Endocrinology. 9, 570 (2018).
- Goeden, N., et al. Maternal Inflammation disrupts fetal neurodevelopment via increased placental output of serotonin to the fetal brain. Journal of Neuroscience. 36 (22), 6041-6049 (2016).
- vander Bom, T., et al. The changing epidemiology of congenital heart disease. Nature Reviews Cardiology. 8 (1), 50-60 (2011).
- Wilson, R. L., et al. Analysis of commonly expressed genes between first trimester fetal heart and placenta cell types in the context of congenital heart disease. Scientific Reports. 12 (1), 10756 (2022).
- Renaud, S. J., Karim Rumi, M. A., Soares, M. J. Review: Genetic manipulation of the rodent placenta. Placenta. 32, S130-S135 (2011).
- Wenzel, P. L., Leone, G. Expression of Cre recombinase in early diploid trophoblast cells of the mouse placenta. Genesis. 45 (3), 129-134 (2007).
- Zhou, C. C., et al. Targeted expression of Cre recombinase provokes placental-specific DNA recombination in transgenic mice. PLoS One. 7 (2), e29236 (2012).
- Wattez, J. S., Qiao, L., Lee, S., Natale, D. R. C., Shao, J. The platelet-derived growth factor receptor alpha promoter-directed expression of cre recombinase in mouse placenta. Developmental Dynamics. 248 (5), 363-374 (2019).
- Nadeau, V., et al. Map2k1 and Map2k2 genes contribute to the normal development of syncytiotrophoblasts during placentation. Development. 136 (8), 1363-1374 (2009).
- Chakraborty, D., Muto, M., Soares, M. J. Ex vivo trophoblast-specific genetic manipulation using lentiviral delivery. BioProtocol. 7 (24), e2652 (2017).
- Okada, Y., et al. Complementation of placental defects and embryonic lethality by trophoblast-specific lentiviral gene transfer. Nature Biotechnology. 25 (2), 233-237 (2007).
- Lecuyer, M., et al. a placental marker of fetal brain defects after in utero alcohol exposure. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 44 (2017).
- Jones, H. N., Crombleholme, T., Habli, M. Adenoviral-mediated placental gene transfer of IGF-1 corrects placental insufficiency via enhanced placental glucose transport mechanisms. PLoS One. 8 (9), e74632 (2013).
- Jones, H., Crombleholme, T., Habli, M. Regulation of amino acid transporters by adenoviral-mediated human insulin-like growth factor-1 in a mouse model of placental insufficiency in vivo and the human trophoblast line BeWo in vitro. Placenta. 35 (2), 132-138 (2014).
- Song, A. J., Palmiter, R. D. Detecting and avoiding problems when using the Cre-lox system. Trends in Genetics. 34 (5), 333-340 (2018).
- Chuah, M. K., Collen, D., VandenDriessche, T.
- Evers, B., et al. CRISPR knockout screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).
- Rossant, J., Cross, J. C. Placental development: Lessons from mouse mutants. Nature Reviews Genetics. 2 (7), 538-548 (2001).
- Elmore, S. A., et al. Histology atlas of the developing mouse placenta. Toxicologic Pathology. 50 (1), 60-117 (2022).
- Sferruzzi-Perri, A. N., Sandovici, I., Constancia, M., Fowden, A. L. Placental phenotype and the insulin-like growth factors: Resource allocation to fetal growth. The Journal of Physiology. 595 (15), 5057-5093 (2017).
- Agrogiannis, G. D., Sifakis, S., Patsouris, E. S., Konstantinidou, A. E. Insulin-like growth factors in embryonic and fetal growth and skeletal development (Review). Molecular Medicine Reports. 10 (2), 579-584 (2014).
- Wang, L., Jiang, H., Brigande, J. V. Gene transfer to the developing mouse inner ear by in vivo electroporation. Journal of Visualized Experiments. (64), e3653 (2012).
- Elser, B. A., et al. Combined maternal exposure to cypermethrin and stress affect embryonic brain and placental outcomes in mice. Toxicological Sciences. 175 (2), 182-196 (2020).
- Gumusoglu, S. B., et al. Chronic maternal interleukin-17 and autism-related cortical gene expression, neurobiology, and behavior. Neuropsychopharmacology. 45 (6), 1008-1017 (2020).
- Liu, F., Huang, L. Electric gene transfer to the liver following systemic administration of plasmid DNA. Gene Therapy. 9 (16), 1116-1119 (2002).
- Kalli, C., Teoh, W. C., Leen, E. Introduction of genes via sonoporation and electroporation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 818, 231-254 (2014).
- Wu, W., et al. Efficient in vivo gene editing using ribonucleoproteins in skin stem cells of recessive dystrophic epidermolysis bullosa mouse model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (7), 1660-1665 (2017).
- Nakamura, H. Electroporation and Sonoporation in Developmental Biology. , Springer. Tokyo, Japan. (2009).
- Bond, A. M., et al. Differential timing and coordination of neurogenesis and astrogenesis in developing mouse hippocampal subregions. Brain Sciences. 10 (12), 909 (2020).
- Kojima, Y., Tam, O. H., Tam, P. P. Timing of developmental events in the early mouse embryo. Seminars in Cell & Developmental Biology. 34, 65-75 (2014).
- Pennington, K. A., Schlitt, J. M., Schulz, L. C. Isolation of primary mouse trophoblast cells and trophoblast invasion assay. Journal of Visualized Experiments. (59), e3202 (2012).
- Mandegar, M. A., et al. CRISPR Interference efficiently induces specific and reversible gene silencing in human iPSCs. Cell Stem Cell. 18 (4), 541-553 (2016).
- Dai, Z., et al. Inducible CRISPRa screen identifies putative enhancers. Journal of Genetics and Genomics. 48 (10), 917-927 (2021).
- Ursini, G., et al. Placental genomic risk scores and early neurodevelopmental outcomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. (7), e2019789118 (2021).
- Smajdor, A.
- Antiel, R. M. Ethical challenges in the new world of maternal-fetal surgery. Seminars in Perinatology. 40 (4), 227-233 (2016).
