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Genetics

विवो प्लेसेंटल लक्षित CRISPR हेरफेर में माउस

Published: April 14, 2023 doi: 10.3791/64760
Automatic Translation
1,2,3, 2,3, 1,2,3,4
1Interdisciplinary Graduate Program in Genetics, University of Iowa, 2Department of Psychiatry, Carver College of Medicine, University of Iowa, 3Iowa Neuroscience Institute, Carver College of Medicine, University of Iowa, 4Hawk-IDDRC, University of Iowa

Summary

यहां हम विवो में माउस प्लेसेंटा में महत्वपूर्ण विकास मार्गों में प्रभावी ढंग से हेरफेर करने के लिए एक समय-विशिष्ट विधि का वर्णन करते हैं। यह भ्रूण के दिन 12.5 पर गर्भवती बांधों के प्लेसेंटा में सीआरआईएसपीआर प्लास्मिड के इंजेक्शन और इलेक्ट्रोपोरेशन के माध्यम से किया जाता है।

Abstract

प्लेसेंटा एक आवश्यक अंग है जो गर्भाशय में स्तनधारी विकास को नियंत्रित और बनाए रखता है। प्लेसेंटा मां और भ्रूण के बीच पोषक तत्वों और कचरे के हस्तांतरण और विकास कारकों और हार्मोन के उत्पादन और वितरण के लिए जिम्मेदार है। प्रसवपूर्व विकास में प्लेसेंटा की विशिष्ट भूमिका को समझने के लिए चूहों में प्लेसेंटल आनुवंशिक जोड़तोड़ महत्वपूर्ण हैं। प्लेसेंटल-विशिष्ट क्रे-व्यक्त ट्रांसजेनिक चूहों की अलग-अलग प्रभावशीलता होती है, और प्लेसेंटल जीन हेरफेर के लिए अन्य तरीके उपयोगी विकल्प हो सकते हैं। यह पेपर सीआरआईएसपीआर जीन हेरफेर का उपयोग करके प्लेसेंटल जीन अभिव्यक्ति को सीधे बदलने की तकनीक का वर्णन करता है, जिसका उपयोग लक्षित जीन की अभिव्यक्ति को संशोधित करने के लिए किया जा सकता है। अपेक्षाकृत उन्नत शल्य चिकित्सा दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए, गर्भवती बांधों को भ्रूण के दिन 12.5 (ई 12.5) पर लैप्रोटॉमी से गुजरना पड़ता है, और एक सीआरआईएसपीआर प्लास्मिड को एक ग्लास माइक्रोपिपेट द्वारा व्यक्तिगत प्लेसेंटा में पहुंचाया जाता है। प्रत्येक इंजेक्शन के तुरंत बाद प्लास्मिड को इलेक्ट्रोपोरेट किया जाता है। बांध की वसूली के बाद, प्लेसेंटा और भ्रूण बाद के समय में मूल्यांकन तक विकास जारी रख सकते हैं। इस तकनीक के उपयोग के बाद प्लेसेंटा और संतान ों का मूल्यांकन विकास में समय-विशिष्ट प्लेसेंटल फ़ंक्शन की भूमिका निर्धारित कर सकता है। इस प्रकार का हेरफेर इस बात की बेहतर समझ के लिए अनुमति देगा कि प्लेसेंटल जेनेटिक्स और फ़ंक्शन कई रोग संदर्भों में भ्रूण के विकास और विकास को कैसे प्रभावित करते हैं।

Introduction

प्लेसेंटा भ्रूण के विकास में शामिल एक आवश्यक अंग है। प्लेसेंटा की मुख्य भूमिका आवश्यक कारक प्रदान करना और भ्रूण से पोषक तत्वों और कचरे के हस्तांतरण को विनियमित करना है। स्तनधारी प्लेसेंटा भ्रूण और मातृ ऊतक दोनों से बने होते हैं, जो भ्रूण-मातृ इंटरफ़ेस बनाते हैं, और इस प्रकार, मां और भ्रूण दोनों के आनुवंशिकी कार्य कोप्रभावित करते हैं। आनुवंशिक विसंगतियां या प्लेसेंटा का बिगड़ा हुआ कार्य भ्रूण के विकास को काफी बदल सकता है। पिछले काम से पता चला है कि प्लेसेंटल जेनेटिक्स और विकास भ्रूण में विशिष्ट अंग प्रणालियों के परिवर्तित विकास से जुड़े हैं। विशेष रूप से, प्लेसेंटा में असामान्यताएं भ्रूण के मस्तिष्क, हृदय और संवहनी प्रणाली 2,3,4,5 में परिवर्तन से जुड़ी हुई हैं।

गर्भनाल से भ्रूण तक हार्मोन, विकास कारक और अन्य अणुओं का परिवहन भ्रूणके विकास में एक प्रमुख भूमिका निभाता है। यह दिखाया गया है कि विशिष्ट अणुओं के प्लेसेंटल उत्पादन को बदलने से न्यूरोडेवलपमेंट बदल सकता है। मातृ सूजन प्लेसेंटा में ट्रिप्टोफैन (टीआरपी) चयापचय जीन अभिव्यक्ति को बदलकर सेरोटोनिन के उत्पादन को बढ़ा सकती है, जो बाद में भ्रूणके मस्तिष्क में सेरोटोनिन का संचय बनाती है। अन्य अध्ययनों में हृदय दोषों के साथ प्लेसेंटल असामान्यताएं पाई गई हैं। प्लेसेंटा में असामान्यताओं को जन्मजात हृदय दोषों में योगदान करने के लिए माना जाता है, जो मनुष्यों में सबसे आम जन्म दोषहै। हाल के एक अध्ययन ने कई जीनों की पहचान की है जिनके प्लेसेंटा और हृदय दोनों में समान सेलुलर मार्ग हैं। यदि बाधित होता है, तो ये मार्ग दोनों अंगों में दोष पैदा करसकते हैं। प्लेसेंटा में दोष जन्मजात हृदय दोषों को बढ़ा सकते हैं। विशिष्ट भ्रूण अंग प्रणाली के विकास पर प्लेसेंटल जेनेटिक्स और फ़ंक्शन की भूमिका अध्ययन का एक उभरता हुआ क्षेत्र है।

चूहों में हेमोकोरियल प्लेसेंटा और मानव प्लेसेंटा की अन्य विशेषताएं होती हैं, जो उन्हें मानव रोग1 का अध्ययन करने के लिए अत्यधिक उपयोगी मॉडल बनाती हैं। प्लेसेंटा के महत्व के बावजूद, वर्तमान में विवो आनुवंशिक जोड़तोड़ में लक्षित की कमी है। इसके अलावा, प्लेसेंटा10 में ओवरएक्प्रेशन या गेन-ऑफ-फंक्शन जोड़तोड़ की तुलना में नॉकआउट या वध के लिए वर्तमान में अधिक विकल्प उपलब्ध हैं। प्लेसेंटल-विशिष्ट हेरफेर के लिए कई ट्रांसजेनिक क्रे-व्यक्त लाइनें हैं, प्रत्येक अलग-अलग समय बिंदुओं पर अलग-अलग ट्रोफोब्लास्ट वंशावली में। इनमें Cyp19-Cre, Ada/Tpbpa-Cre, PDGFRa-CreER, और Gcm1-Cre 11,12,13,14 शामिल हैं। जबकि ये क्रे ट्रांसजेन कुशल हैं, वे विशिष्ट समय बिंदुओं पर कुछ जीनों में हेरफेर करने में सक्षम नहीं हो सकते हैं। प्लेसेंटल जीन अभिव्यक्ति को नॉकआउट या ओवरएक्सप्रेस करने के लिए आमतौर पर इस्तेमाल की जाने वाली एक और विधि ब्लास्टोसिस्ट संस्कृति में लेंटिवायरल वैक्टर का सम्मिलन है, जो ट्रोफोब्लास्ट-विशिष्ट आनुवंशिक हेरफेर15,16 का कारण बनता है। यह तकनीक विकास में प्लेसेंटल जीन अभिव्यक्ति में एक मजबूत बदलाव की अनुमति देती है। विवो में आरएनए हस्तक्षेप का उपयोग प्लेसेंटा में विरल रूप से उपयोग किया गया है। एसएचआरएनए प्लास्मिड का सम्मिलन इस पेपर में वर्णित सीआरआईपीएसआर तकनीक के समान किया जा सकता है। यह प्लेसेंटा में पीएलजीएफ अभिव्यक्ति को सफलतापूर्वक कम करने के लिए ई 13.5 पर किया गया है, जिसमें संतान मस्तिष्क वाहिका17 पर प्रभाव पड़ता है।

मुख्य रूप से नॉकआउट या वध के लिए उपयोग की जाने वाली तकनीकों के अलावा, उत्प्रेरण अतिवृद्धि आमतौर पर एडेनोवायरस या बहिर्जात प्रोटीन के सम्मिलन के साथ की जाती है। ओवरएक्प्रेशन के लिए उपयोग की जाने वाली तकनीकों में सफलता की दर अलग-अलग होती है और ज्यादातर गर्भावस्था में बाद में प्रदर्शन किया जाता है। प्लेसेंटल फ़ंक्शन में इंसुलिन जैसे विकास कारक 1 (आईजीएफ -1) की भूमिका की जांच करने के लिए, आईजीएफ -1 जीन18,19 के ओवरएक्प्रेशन को प्रेरित करने के लिए एक एडेनोवायरल-मध्यस्थता प्लेसेंटल जीन ट्रांसफर किया गया था। यह सीधे प्लेसेंटल इंजेक्शन के माध्यम से ई 18.5 पर माउस गर्भधारण में देर से किया गया था। अतिरिक्त विकल्प प्रदान करने और स्थापित प्लेसेंटल आनुवंशिक जोड़तोड़ की संभावित विफलताओं को दरकिनार करने के लिए, जैसे कि क्रे-लॉक्स संयोजन विफलताएं, एडेनोवायरस की संभावित विषाक्तता, और एसएचआरएनए के ऑफ-टारगेट प्रभाव, प्लेसेंटा के विवो डायरेक्ट सीआरआईएसपीआर हेरफेर में20,21,22 का उपयोग किया जा सकता है। यह मॉडल ओवरएक्प्रेशन मॉडल की कमी को दूर करने और लचीलेपन के साथ एक मॉडल बनाने के लिए विकसित किया गया था।

यह तकनीक लेक्यूयर एट अल के काम पर आधारित है, जिसमें पीएलजीएफ अभिव्यक्ति17 को बदलने के लिए एसएचआरएनए और सीआरआईएसपीआर प्लास्मिड को सीधे विवो से माउस प्लेसेंटा में लक्षित किया गया था। इस तकनीक का उपयोग कई समय बिंदुओं पर सीआरआईएसपीआर हेरफेर का उपयोग करके प्लेसेंटल जीन अभिव्यक्ति को सीधे बदलने के लिए किया जा सकता है; इस काम के लिए, E12.5 का चयन किया गया था। प्लेसेंटा इस बिंदु तक परिपक्व हो गया है और हेरफेर करने के लिए काफी बड़ा है, जिससे ई 12.5 पर एक विशिष्ट सीआरआईएसपीआर प्लास्मिड के सम्मिलन की अनुमति मिलती है, जो मध्य से देर तक गर्भावस्था23,24 तक भ्रूण के विकास पर महत्वपूर्ण प्रभाव डाल सकता है। ट्रांसजेनिक दृष्टिकोण के विपरीत, लेकिन वायरल प्रेरण या आरएनए हस्तक्षेप के समान, यह तकनीक अपेक्षाकृत उन्नत शल्य चिकित्सा दृष्टिकोण का उपयोग करके विशेष समय बिंदुओं पर ओवरएक्प्रेशन या नॉकआउट की अनुमति देती है, इस प्रकार पहले के परिवर्तनों से संभावित बिगड़ा हुआ प्लेसेंटाशन या भ्रूण घातकता से बचती है। चूंकि केवल कुछ प्लेसेंटा एक कूड़े के भीतर प्रयोगात्मक या नियंत्रण प्लास्मिड प्राप्त करते हैं, इसलिए दृष्टिकोण दो प्रकार के आंतरिक नियंत्रणों की अनुमति देता है। ये नियंत्रण वे हैं जिन्हें उचित नियंत्रण प्लास्मिड के साथ इंजेक्ट और इलेक्ट्रोपोरेट किया जाता है और जिन्हें कोई प्रत्यक्ष हेरफेर नहीं मिलता है। इस तकनीक को एक सहक्रियात्मक सक्रियण मध्यस्थ (एसएएम) सीआरआईएसपीआर प्लास्मिड के माध्यम से माउस प्लेसेंटा में आईजीएफ -1 जीन के ओवरएक्प्रेशन बनाने के लिए अनुकूलित किया गया था। IGF-1 जीन को चुना गया था, क्योंकि IGF-1 भ्रूण को दिया जाने वाला एक आवश्यक विकास हार्मोन है जो मुख्य रूप से जन्मसे पहले प्लेसेंटा में उत्पन्न होता है। यह नई प्लेसेंटल-लक्षित सीआरआईएसपीआर तकनीक प्लेसेंटल फ़ंक्शन और भ्रूण के विकास के बीच संबंध को परिभाषित करने में मदद करने के लिए प्रत्यक्ष हेरफेर की अनुमति देगी।

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Protocol

सभी प्रक्रियाओं को संघीय नियमों और आयोवा विश्वविद्यालय नीति के अनुपालन में किया गया था और संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. पशु और पशुपालन

  1. जानवरों को भोजन और पानी के साथ 12 घंटे के दिन के उजाले चक्र में रखें।
  2. 8-15 सप्ताह की आयु के सीडी -1 मादा चूहों का उपयोग करें। E0.5 की पहचान करने के लिए एक मैथुन प्लग की उपस्थिति का उपयोग करें।
  3. E0.5 पर, अकेले गर्भवती बांधों को घर दें।

2. माइक्रोपिपेट का अंशांकन

नोट: माइक्रोपिपेट का अंशांकन संभव होने पर सर्जरी से पहले किया जाना चाहिए।

  1. माइक्रोपिपेट बनाने और कैलिब्रेट करने से पहले, सभी प्लास्मिड को DNase-मुक्त पानी में अनुशंसित एकाग्रता (0.1 μg / μL) तक पतला करें। प्लास्मिड को उचित रूप से पतला फास्ट ग्रीन डाई (पीबीएस में 1 μg / μL) (अंतिम प्लास्मिड एकाग्रता: 0.06 μg / μL) के साथ मिलाएं।
  2. माइक्रोपिपेट पुलर के साथ 1.5 मिमी के बाहरी व्यास और 0.86 मिमी के आंतरिक व्यास के साथ 10 सेमी ग्लास केशिकाओं का उपयोग करके माइक्रोपिपेट खींचें।
  3. बाँझ बल के साथ एक माइक्रोपिपेट (2-3 मिमी) की नोक को सावधानीपूर्वक तोड़ दें।
  4. माइक्रोपिपेट को माइक्रोइंजेक्टर से जुड़े माइक्रोकेशिका टिप में लोड करें। सुनिश्चित करें कि माइक्रोइंजेक्टर माइक्रोइंजेक्शन मशीन से जुड़ा हुआ है और माइक्रोपिपेट को कैलिब्रेट करने के लिए नाइट्रोजन के पर्याप्त स्तर हैं।
  5. एक बार माइक्रोपिपेट माइक्रोइंजेक्टर से जुड़ा होने के बाद, अंशांकन करने के लिए इसे फास्ट ग्रीन डाई समाधान के साथ लोड करें (पीबीएस में 1 μg / μL)। माइक्रोपिपेट को लगभग 3.5 μL की मात्रा इंजेक्ट करने के लिए कैलिब्रेट करें।
    नोट: प्रत्येक माइक्रोपिपेट थोड़ा अलग होगा। इंजेक्शन के दौरान प्लेसेंटा को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए, इंजेक्शन का समय 0.5-1.5 सेकंड के बीच सेट किया जाना चाहिए। दबाव 1-8.5 पीएसआई के बीच सेट किया जाना चाहिए। प्रत्येक माइक्रोपिपेट को अलग से कैलिब्रेट करें; यदि माइक्रोपिपेट को इन मापदंडों के भीतर कैलिब्रेट नहीं किया जा सकता है, तो इसका उपयोग नहीं किया जाना चाहिए।

3. सर्जरी (चित्रा 1 ए)

नोट: तैयार करने के लिए, 70% इथेनॉल के साथ तैयारी और शल्य चिकित्सा क्षेत्रों दोनों की सतहों को साफ करें। तैयारी क्षेत्र में एक शोषक अंडरपैड रखें। सर्जरी क्षेत्र में, एक हीटिंग पैड नीचे रखें, और फिर इसके शीर्ष पर एक शोषक अंडरपैड रखें। सर्जरी से पहले सभी उपकरणों को स्टरलाइज़ करें। एनेस्थीसिया के तहत बांध का समय 1 घंटे से कम होना चाहिए।

  1. एनेस्थेटाइजेशन
    1. सर्जरी से 30 मिनट से 1 घंटे पहले गर्भवती बांध को एनएसएआईडी (मेलॉक्सिकैम) या एक अन्य अनुमोदित एनाल्जेसिक के 5 मिलीग्राम / किग्रा का प्रशासन करें।
    2. गर्भवती बांध को एक आइसोफ्लुरेन वेपोराइज़र से जुड़े प्रेरण कक्ष में रखें।
    3. वेपोराइज़र को 4% आइसोफ्लुरेन और 3.5 एल / मिन ऑक्सीजन पर सेट करें।
    4. एक बार जब पैर की अंगुली की चुटकी और कम श्वास दर की प्रतिक्रिया की कमी से एनेस्थेटाइजेशन की पुष्टि हो जाती है, तो बांध को प्रेरण कक्ष से तैयारी क्षेत्र में हटा दें।
  2. सर्जरी की तैयारी
    1. तैयारी क्षेत्र में, बांध को नाक शंकु के साथ लापरवाह रखें।
    2. जब बांध नाक शंकु में हो तो वेपोराइज़र को 2% आइसोफ्लुरेन और 3.5 एल / मिनट ऑक्सीजन तक कम करें।
    3. बांध के पेट को अच्छी तरह से शेव करें और अतिरिक्त फर को हटा दें। बाँझ कपास-टिंप एप्लीकेटर्स का उपयोग करके पोविडोन घोल और 70% इथेनॉल के साथ तीन बार मुंडा पेट को वैकल्पिक कोटिंग करें। पोविडोन घोल का अंतिम कोट लागू करें। कॉर्नियल सूखने से रोकने के लिए, बांध की दोनों आंखों पर कृत्रिम आंसू जेल रखें (चित्रा 2 ए, बी)।
    4. तैयारी के बाद, नाक शंकु के साथ बांध को निर्दिष्ट सर्जरी क्षेत्र में ले जाएं।
  3. गर्भाशय लैप्रोटॉमी
    नोट: सर्जिकल प्रक्रिया के दौरान बाँझ दस्ताने का उपयोग करें। यदि किसी भी गैर-बाँझ सतह से संपर्क किया जाता है तो दस्ताने बदलें।
    1. सर्जरी क्षेत्र में, बांध को लापरवाह रखें, और टेप के साथ नाक शंकु को सुरक्षित करें। अवशोषक पैड के नीचे हीटिंग पैड को 45 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें।
    2. बल और कैंची का उपयोग करके, त्वचा के माध्यम से अनुमानित 2 सेमी मध्य रेखा चीरा लगाएं। त्वचा को तम्बू करने के लिए बल का उपयोग करें, और त्वचा में एक ऊर्ध्वाधर चीरा लगाएं। इसके बाद, गर्भाशय के सींगों को उजागर करने के लिए पेरिटोनियम के माध्यम से एक और समान आकार का चीरा लगाएं। बल का उपयोग करके, ऊर्ध्वाधर चीरा बनाते समय पेरिटोनियम को तम्बू करें (चित्रा 2 सी, डी)।
      नोट: पेरिटोनियम को इंजेक्शन देते समय ठीक से तम्बू करने में विफलता से आंतों का घातक चीरा हो सकता है।
    3. पेट के किनारों पर दबाकर चीरे के माध्यम से गर्भाशय के सींगों की धीरे-धीरे मालिश करें। आकस्मिक चोट से बचने के लिए केवल उंगलियों का उपयोग करके, उपकरणों के बिना गर्भाशय को सावधानीपूर्वक मार्गदर्शन करके ऐसा करें। खुले गर्भाशय को बांध के पेट को कवर करने वाले एक बाँझ सर्जिकल ड्रेप के शीर्ष पर रखें और इसे बाँझ खारा की बूंदों के साथ सर्जरी के दौरान नम रखें, जिसे आवश्यकतानुसार उपयोग करने से पहले 30 डिग्री सेल्सियस तक गर्म किया जा सकता है (चित्रा 2 ई, एफ)।
      नोट: गर्भाशय के सींग ों को वांग एट अल .27 में वर्णित के रूप में पहचाना जा सकता है।
    4. एक बार गर्भाशय उजागर हो जाने के बाद, हेरफेर के लिए प्लेसेंटा के तीन जोड़े का चयन करें।
      नोट: प्लेसेंटा को एल्मोर एट अल .24 द्वारा वर्णित के रूप में पहचाना जा सकता है। भ्रूण के अस्तित्व को अधिकतम करने के लिए, 6 से अधिक प्लेसेंटा का इलाज नहीं किया जाना चाहिए। यदि 12 से कम भ्रूण मौजूद हैं, तो 4 से अधिक प्लेसेंटा इंजेक्ट नहीं किया जाना चाहिए। दो आसन्न प्लेसेंटा का चयन करें ताकि एक को नियंत्रण इंजेक्शन मिले और दूसरे को प्रयोगात्मक प्लास्मिड प्राप्त हो। दो आसन्न प्लेसेंटा का उपयोग गर्भाशय में समान स्थानों में प्लेसेंटा की बेहतर तुलना करने की अनुमति देता है और जीवित रहने की बढ़ी हुई दर को भी सक्षम बनाता है। चयनित प्लेसेंटल जोड़े को यादृच्छिक रूप से चुना जाता है और गर्भाशय के दोनों सींगों (चित्रा 1 बी) में स्थान दिया जाता है।
    5. गर्भाशय के सींगों के भीतर भ्रूण के प्लेसेंटल जोड़तोड़ और संगठन के स्थान को रिकॉर्ड करें ताकि संग्रह के दौरान भ्रूण और प्लेसेंटा की पहचान की जा सके, क्योंकि एक बांध नियंत्रण और प्रयोगात्मक रूप से उपचारित प्लेसेंटा / भ्रूण दोनों को ले जाएगा।
  4. प्लेसेंटल इंजेक्शन और नियंत्रण प्लास्मिड का इलेक्ट्रोपोरेशन
    नोट: एक सड़न रोकनेवाला तकनीक को बनाए रखने के लिए, उपयोग करने से पहले एक ठंडे स्टेरिलेंट के साथ इलेक्ट्रोपोरेशन पैडल और माइक्रोइंजेक्टर को निष्फल करें। यदि किसी भी गैर-बाँझ सतह से संपर्क किया जाता है तो दस्ताने बदलें।
    1. कैलिब्रेटेड माइक्रोपिपेट का उपयोग करके, तीन इंजेक्शन के लिए उपयुक्त नियंत्रण प्लास्मिड की पर्याप्त मात्रा लोड करें। सभी इंजेक्शन ~ 0.5 मिमी की गहराई पर प्लेसेंटा में निर्णायक (सफेद) और जंक्शनल ज़ोन (गहरे लाल) (चित्रा 3 ए-एफ) के बीच करते हैं।
    2. तीन नियंत्रण प्लेसेंटा में इंजेक्शन करें।
      नोट: माइक्रोपिपेट के साथ प्लास्मिड के क्रॉस-संदूषण से बचने के लिए प्रयोगात्मक इंजेक्शन से पहले सभी नियंत्रण प्लास्मिड इंजेक्शन करें। यह एक ही माइक्रोपिपेट का उपयोग करने की अनुमति देगा, क्योंकि माइक्रोपिपेट और अंशांकन समय बदलने से सर्जरी का समय काफी बढ़ जाता है और बांध के अस्तित्व में कमी आती है।
    3. इंजेक्शन के 2 मिनट के भीतर नियंत्रण प्लास्मिड-इंजेक्शन प्लेसेंटा का इलेक्ट्रोपोरेशन करें।
    4. इलेक्ट्रोपोरेशन के लिए, इलेक्ट्रोपोरेशन मशीन से जुड़े 3 मिमी पैडल की एक जोड़ी का उपयोग करें। सीआरआईएसपीआर निगमन दक्षता और भ्रूण की व्यवहार्यता सुनिश्चित करने के लिए, निम्नलिखित इलेक्ट्रोपोरेशन सेटिंग्स का उपयोग करें: 2 दालें, 30 वी, 30 एमएस पल्स, 970 एमएस पल्स ऑफ, एकध्रुवीय।
    5. इंजेक्शन के बाद लेकिन इलेक्ट्रोपोरेशन से तुरंत पहले, बाँझ खारा के संपर्क के स्थानों को कोट करें, गर्भाशय की दीवार पर तीन साइटों पर खारा और ड्रॉपर या सिरिंज के साथ पैडल को ठीक से लागू करें।
    6. प्लेसेंटा के पार्श्व किनारों पर इलेक्ट्रोपोरेशन पैडल को धीरे से दबाएं। एनोड पैडल को इंजेक्शन साइट और कैथोड के ठीक विपरीत रखें (चित्रा 4 ए-सी)।
    7. इलेक्ट्रोपोरेशन मशीन पर पल्स दबाएं, और इलेक्ट्रोपोरेशन पैडल को हटाने से पहले दो दालों के पूरा होने की प्रतीक्षा करें।
      नोट: दालों के दौरान पैडल और प्लेसेंटा के बीच अक्सर सफेद फोम की एक छोटी मात्रा देखी जाती है। यदि ऐसा नहीं होता है, तो आगे के उपयोग से पहले वोल्टमीटर के साथ पैडल से वोल्टेज की जांच करें। यदि वोल्टमीटर पर रीडिंग इलेक्ट्रोपोरेशन वोल्टेज सेटिंग से मेल नहीं खाती है, तो पैडल गैर-कार्यात्मक हैं।
  5. प्रायोगिक प्लास्मिड का प्लेसेंटल इंजेक्शन और इलेक्ट्रोपोरेशन
    1. चरण 3.4.1 से समान निर्देशों का पालन करें। चरण 3.4.2 के लिए। नियंत्रण प्लास्मिड के बजाय प्रयोगात्मक प्लास्मिड का उपयोग करना।
    2. इंजेक्शन के 2 मिनट के भीतर सभी तीन प्रयोगात्मक इंजेक्शन प्लेसेंटा का इलेक्ट्रोपोरेशन करें। यह उसी तरह से किया जाना चाहिए जैसे कि नियंत्रण प्लास्मिड के साथ इंजेक्शन दिए गए लोगों के लिए। चरण 3.4.4 का पालन करें। चरण 3.4.7 के लिए।
  6. सर्जरी का पूरा होना
    1. एक बार प्लेसेंटल हेरफेर पूरा हो जाने के बाद, केवल उंगलियों का उपयोग करके पेट की गुहा के अंदर गर्भाशय के सींगों को धीरे से मालिश करें (चित्रा 5 ए)।
    2. सबसे पहले, पेरीटोनियम परत पर डबल-गाँठ वाले एकल सीवन का प्रदर्शन करें, जिसमें लेपित और चोटी वाली घुलने योग्य सीवन का उपयोग किया जाता है जो 13 मिमी 3/8 सी सुई मिश्र धातु के साथ 45 सेमी लंबे होते हैं। सीवन को 2-3 मिमी अलग रखें (चित्रा 5 बी)।
    3. पेरिटोनियम परत को ट्यूरिंग करने के बाद, त्वचा को घुलने योग्य सीवन के साथ सीवन करें। एकल सीवन को 2-3 मिमी की दूरी पर तीन बार बांधें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि बांध ट्यूरिंग को पूर्ववत नहीं कर सकता है (चित्र 5 सी)।
    4. एक बार ट्यूरिंग पूरी हो जाने के बाद, आइसोफ्लुरेन को 1% और ऑक्सीजन को 3.5 एल / मिनट पर सेट करें, और त्वचा पर सीवन पर ऊतक चिपकने वाला लागू करें (चित्रा 5 डी)।
      नोट: ऊतक चिपकने वाला वैकल्पिक है लेकिन बांध चबाने के कारण चीरा के फिर से खुलने को रोकने के लिए अनुशंसित है।
    5. जब ऊतक चिपकने वाला सूख गया है, तो वेपोराइज़र बंद कर दें, और सर्जरी क्षेत्र से बांध को हटा दें। बांध को उसकी पीठ पर एक सहायक पिंजरे में रखें।

4. सर्जरी के बाद की देखभाल और निगरानी

  1. गर्भवती बांध को कम से कम 30 मिनट के लिए पर्यवेक्षण के तहत एक साफ पिंजरे में ठीक होने दें ताकि सर्जरी की कोई तत्काल जटिलता न हो। तब तक निरीक्षण करें जब तक कि यह पूरी तरह से एम्बुलेटरी न हो जाए और सहायता के बिना अपने पैरों पर पलट सकता है। सर्जरी के बाद अकेले ही बांध का निर्माण करें।
  2. भ्रूण संग्रह तक संस्थागत पोस्ट-ऑपरेटिव देखभाल और निगरानी का पालन करें। बांध के वजन को रिकॉर्ड करें, और रोजाना सीवन और चीरा साइट की निगरानी करें।

5. ई 14.5 प्लेसेंटल संग्रह

  1. E14.5 पर, केटामाइन / ज़ाइलेज़िन कॉकटेल (1 मिलीग्राम / एमएल केटामाइन और 0.1 मिलीग्राम / एमएल ज़ायलज़िन) के साथ बांध को गहराई से एनेस्थेटाइज करें, और फिर बांध को निष्क्रिय कर दें।
  2. कैंची से बांध के पेट में वी-आकार का चीरा लगाएं, और गर्भाशय को हटा दें। बर्फ पर 5 सेमी पेट्री डिश पर तुरंत रखें। बल का उपयोग करके, गर्भाशय से भ्रूण और संबंधित प्लेसेंटा को सावधानीपूर्वक हटा दें।
    नोट: गर्भाशय के सींगों में भ्रूण के स्थान और संबंधित प्लेसेंटा का रिकॉर्ड रखें ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि सर्जरी के दौरान प्रत्यक्ष हेरफेर कौन प्राप्त हुआ।
  3. प्लेसेंटल वजन रिकॉर्ड करें। आरएनए-फ्री फोर्सऔर रेजर का उपयोग करके, प्लेसेंटा को मध्य रेखा के आधे हिस्से में काट लें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 4% पीएफए में एक आधा डालें। शेष आधे को फिर से आधे में काट लें, और शेष दो तिमाहियों को दो ट्यूबों में -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें, एक आरएनए भंडारण अभिकर्मक के साथ।
    नोट: भ्रूण और अन्य मातृ ऊतकों को भविष्य के उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रह से संग्रहीत किया जा सकता है।

6. प्लेसेंटल जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण

  1. आरएनए भंडारण अभिकर्मक में -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत प्लेसेंटा के चौथाई का उपयोग करें।
  2. आरएनए अलगाव के लिए ट्राइज़ोल विधि, आरएनए एकाग्रता के लिए एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर, एक सीडीएनए संश्लेषण किट और एसवाईबीआर ग्रीन मास्टर मिक्स28 के साथ क्यूपीसीआर का उपयोग करके क्यूपीसीआर के लिए प्लेसेंटा को संसाधित करें। एलसर एट अल में संदर्भित टर्बो डीएनएफ्री किट डीएनएस के स्थान पर, ट्राइज़ोल आरएनए अलगाव के बाद एक आरएनएक्लीनअप किट का उपयोग करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि नमूनों में दूषित पदार्थनहीं हैं।
    नोट: Trizol के लिए सामग्री सुरक्षा डेटा शीट (MSDS) पढ़ें, और इसे रासायनिक फ्यूम हुड में उपयोग करें।
  3. जीएफपी प्राइमरों के साथ नियंत्रण प्लास्मिड के प्लास्मिड सम्मिलन का आकलन करें और ब्लास्ट प्राइमरों ( पूरक तालिका 1 में सूचीबद्ध प्राइमर) के साथ प्रयोगात्मक प्लास्मिड का आकलन करें। प्लास्मिड की उपस्थिति निर्धारित करने के लिए सीटी मान का उपयोग करें।
    नोट: 35 से ऊपर सीटी मान गलत सकारात्मक हैं, और केवल 35 से कम लोगों को एक सकारात्मक संकेतक माना जाना चाहिए कि प्लास्मिड सफलतापूर्वक डाला गया था।
  4. आईजीएफ -1 प्लेसेंटल अभिव्यक्ति का आकलन हाउसकीपिंग जीन 18 एस (पूरक तालिका 1 में सूचीबद्ध प्राइमर) के लिए सामान्यीकृत है। फोल्ड परिवर्तन की गणना करने के लिए डीडीसीटी विधि का उपयोग करें, और फिर प्रयोगात्मक नमूनों के सामान्यीकृत गुना परिवर्तन की गणना नियंत्रण नमूनों के औसत गुना परिवर्तन के लिए करें।

7. प्लेसेंटल प्रोटीन स्तर विश्लेषण

  1. प्लेसेंटा के चौथाई का उपयोग करें जिसे -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया है। ऊतक को 7.4 के अंतिम पीएच के साथ डीआईएच 2 ओ में 11.5 एमएम ट्रिस एचसीएल, 5 एमएम एमजीसीएल2, और 10 एमएम प्रोटीज अवरोधक से बने बफर समाधान में समरूप करें। ऊतक को तोड़ने के लिए एक हैंडहेल्ड होमोजिनाइज़र और मूसल का उपयोग करें।
    नोट: नमूना बफर की मात्रा के 10% से अधिक नहीं होना चाहिए।
  2. 1:12 पर बफर में होमोजिनाइज्ड नमूनों को पतला करें, ताकि वे एक बिसिनकोनिक एसिड परख (बीसीए) किट की पता लगाने योग्य सीमा के भीतर हों। निर्माता के निर्देशों के अनुसार बीसीए परख करें, और प्लेट रीडर का उपयोग करके कुल प्रोटीन की मात्रा निर्धारित करें।
  3. बीसीए परख करने के बाद, आईजीएफ -1 एलिसा के लिए 2 मिलीग्राम / एमएल की समान कुल प्रोटीन एकाग्रता के लिए सभी नमूनों को सामान्य करें, जैसा कि गुमुसोग्लू एट अल .29 में किया गया था।
  4. निर्माता के निर्देशों के अनुसार IGF-1 एलिसा निष्पादित करें, और मानक एकाग्रता वक्र का उपयोग करके प्लेट रीडर के साथ IGF-1 प्रोटीन के स्तर की मात्रा निर्धारित करें।

8. फ्लोरोसेंट इन सीटू संकरण लेबलिंग का उपयोग करके स्थानिक सीआरआईपीएसआर सत्यापन।

  1. प्लेसेंटल हिस्सों को 1-3 दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 4% पीएफए में उचित रूप से तय करने के बाद, उन्हें इष्टतम काटने के तापमान (ओसीटी) यौगिक में फ्रीज करने से पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर 20% सुक्रोज में ले जाएं।
  2. क्रमिक रूप से ओसीटी-एम्बेडेड प्लेसेंटा को -20 डिग्री सेल्सियस क्रायोस्टैट में 10 μm वर्गों में विभाजित करें, और उन्हें लेबल करने के लिए स्लाइड पर रखें। प्लेसेंटा को आधा करें ताकि सभी तीन उपक्षेत्र दिखाई दें। स्लाइड्स को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें जब तक कि सीटू संकरण के लिए उपयोग न किया जाए।
  3. निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करते हुए सीटू संकरण (फिश) लेबलिंग में प्रतिदीप्ति करें। एक स्लाइड को dCas9-3xNLS-VP64 प्रोब के साथ हाइब्रिड करें और Prl8a8 प्रोब के साथ उसी प्लेसेंटा की दूसरी "बहन" स्लाइड करें।
    नोट: dCas9-3xNLS-VP64 जांच ओवरएक्प्रेशन प्लास्मिड की उपस्थिति का पता लगाता है। Prl8a8 जांच जंक्शन क्षेत्र के स्पोंजियोट्रोफोब्लास्ट पर प्रकाश डालती है, जो प्लेसेंटा के उप-क्षेत्रों को पहचानने योग्य होने की अनुमति देती है। प्लेसेंटा में हरे रंग के ऑटोफ्लोरेसेंस के साथ मल्टी-चैनल फ्लोरेसेंस के हस्तक्षेप से बचने के लिए इन दो जांचों को अलग-अलग "बहन" स्लाइड पर लेबल किया जाता है।
  4. डिटेक्शन डाई (ओपल 620) के साथ दोनों जांच ों को लेबल करें। फिश के लिए निर्माता के प्रोटोकॉल को पूरा करने के बाद, डीएपीआई माउंटिंग माध्यम लागू करें, और स्लाइड पर एक कवरस्लिप रखें। कवरस्लिप को स्पष्ट नेल पॉलिश के साथ सील करें।
  5. एक ईमानदार यौगिक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप पर स्लाइड ्स की छवि बनाएं, और उन्हें एक उपयुक्त छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके संसाधित करें। यहां, सेलसेन्स सॉफ्टवेयर का उपयोग किया गया था।

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Representative Results

सामान्य प्रक्रिया परिणाम (चित्रा 6)।
अध्ययन में, तीन हेरफेर समूह थे। इनमें प्लेसेंटा को एक सामान्य सीआरआईएसपीआर कैस 9 कंट्रोल प्लास्मिड (सीएएस 9 कंट्रोल), एक सक्रियण नियंत्रण सीआरआईएसपीआर प्लास्मिड (एक्ट कंट्रोल), या आईजीएफ -1 एसएएम सक्रियण प्लास्मिड (आईजीएफ 1-ओई) के साथ इंजेक्ट किया गया था। कैस 9 नियंत्रण नॉकआउट प्लास्मिड के लिए बेहतर अनुकूल है, और सक्रियण नियंत्रण ओवरएक्प्रेशन / सक्रियण प्लास्मिड के लिए बेहतर अनुकूल है। इंजेक्शन और इलेक्ट्रोपोरेशन के माध्यम से प्लेसेंटा में हेरफेर करने के कारण होने वाले व्यवहार्यता परिवर्तनों का आकलन करने के लिए, कूड़े के भीतर भ्रूण के अस्तित्व का विश्लेषण ई 14.5 (चित्रा 6 ए) पर किया गया था। इस टाइमपॉइंट को अन्य अध्ययनों के रूप में चुना गया था जिन्होंने इलेक्ट्रोपोरेशन का उपयोग करके सीआरआईएसपीआर प्लास्मिड के विवो सम्मिलन में प्रदर्शन किया है, जिससे पता चला है कि अभिव्यक्ति परिवर्तन 8-22 घंटे30,31,32 के भीतर प्राप्त किए जा सकते हैं। ई 14.5 पर संग्रह सीआरआईएसपीआर प्लास्मिड को जीन अभिव्यक्ति में वृद्धि को एकीकृत और सक्रिय करने के लिए लगभग 48 घंटे की अनुमति देता है। यह पाया गया कि बांध के सर्जिकल हेरफेर ने सभी भ्रूणों के अस्तित्व को प्रभावित किया, लेकिन इंजेक्शन और इलेक्ट्रोपोरेशन से गुजरने वाले हेरफेर प्लेसेंटा से जुड़े भ्रूण ने अस्तित्व को काफी कम कर दिया था। अनुपचारित भ्रूण की जीवित रहने की दर (एक ही कूड़े में लेकिन लक्षित हेरफेर से नहीं गुजर रही है) 100% जीवित रहने से घटकर औसतन 79.05% हो गई थी। हेरफेर भ्रूण के अस्तित्व में उल्लेखनीय कमी आई, जिसमें औसत जीवित रहने की दर 55.56% थी। तीन हेरफेर समूहों के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं पाया गया।

यह निर्धारित करने के लिए कि क्या हेरफेर प्लेसेंटा में महत्वपूर्ण सकल परिवर्तन हुए हैं, प्लेसेंटल वजन दर्ज किया गया था। किसी भी समूह के प्लेसेंटल वजन (चित्रा 6 बी) में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था, और प्लेसेंटा और भ्रूण की सकल उपस्थिति अपरिवर्तित थी। प्रतिनिधि पोस्ट-नेक्रोस्कोपी छवियों को ई 14.5 पर संग्रह में विच्छेदन माइक्रोस्कोप पर लिया गया था। विभिन्न उपचार समूहों से प्लेसेंटा / भ्रूण की छवियां ली गईं, सभी एक ही कूड़े के भीतर। एमनियोटिक थैली या उजागर भ्रूण और इसके संबंधित प्लेसेंटा (चित्रा 6 डी-आई) में किसी भी उपचार समूहों में फेनोटाइपिक उपस्थिति में कोई उल्लेखनीय क्षति या परिवर्तन नहीं था। जबकि आईजीएफ -1 सक्रियण प्लास्मिड के उपयोग के साथ हेरफेर समूहों की आकृति विज्ञान में कोई सकल अंतर नहीं देखा गया था, यह अन्य जीनों को लक्षित करने वाले अन्य प्रयोगात्मक प्लास्मिड के बारे में सच नहीं हो सकता है जो प्लेसेंटा या भ्रूण के आवश्यक विकास और कार्य नियामकों को अधिक महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित कर सकते हैं। कैस 9 नियंत्रण और अधिनियम नियंत्रण प्लेसेंटा के बीच किसी भी माप में कोई अंतर नहीं पाया गया। इसलिए, इन दो समूहों को संयुक्त किया गया और सभी विश्लेषणों के लिए कॉन या नियंत्रण के रूप में संदर्भित किया गया। इन परिणामों से पता चलता है कि इस तकनीक का उपयोग करके E12.5 पर गर्भाशय में प्लेसेंटा का हेरफेर भ्रूण के अस्तित्व में कमी का कारण बनता है, लेकिन अभी भी महत्वपूर्ण व्यवहार्यता है। परिणाम यह भी दर्शाते हैं कि प्लेसेंटल विकास समग्र रूप से महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित नहीं होता है, क्योंकि हेरफेर और अनुपचारित प्लेसेंटा के बीच वजन में कोई महत्वपूर्ण बदलाव नहीं हुआ था। यह दर्शाता है कि प्रस्तावित तकनीक स्वस्थ और व्यवहार्य सीआरआईएसपीआर-मैनिपुलेटेड प्लेसेंटा और उनके संबंधित भ्रूण के अस्तित्व की अनुमति दे सकती है।

ई 14.5 (चित्रा 6 सी) पर भ्रूण संग्रह से पहले सर्जरी के बाद प्रत्येक दिन बांध के वजन में परिवर्तन दर्ज किया गया था। सर्जरी ई 12.5 पर हुई थी, इसलिए सभी बांध के वजन में परिवर्तन ई 12.5 पर वजन के सापेक्ष सूचीबद्ध हैं। प्रायोगिक (एक्सपी) बांधों में प्लेसेंटल हेरफेर किया गया, जबकि शाम बांधों को एनेस्थीसिया और समान अवधि के लैप्रोटॉमी से गुजरना पड़ा, जिसमें कोई प्लेसेंटल हेरफेर नहीं था। कई गर्भवती बांधों ने प्रक्रिया के अगले दिन वजन में मामूली कमी या कोई बदलाव नहीं दिखाया (ई 13.5); यह सर्जरी के दौरान और बाद में थोड़े समय के लिए बाधित खाने के कारण होने की संभावना थी। अधिकांश बांधों ने E14.5 पर वजन में वृद्धि दिखाई, लेकिन कभी-कभी, वजन में कमी अभी भी देखी गई थी। सर्जरी के बाद मातृ बांध वजन की ट्रैकिंग ने भ्रूण के अस्तित्व की निगरानी के लिए अनुमति दी। सर्जरी के बाद गर्भवती बांधों के वजन के बीच भिन्नता आम थी और यह संकेत नहीं दिया कि सभी उपचारित भ्रूण खो गए थे। शाम बनाम प्रयोगात्मक बांधों में सर्जरी के बाद के वजन में बदलाव में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था। यह दर्शाता है कि प्लेसेंटा में सीआरआईएसपीआर प्लास्मिड के सम्मिलन के बाद बांध की भलाई आम तौर पर संरक्षित थी। कुल मिलाकर, इससे पता चलता है कि जबकि यह सर्जिकल तकनीक भ्रूण की व्यवहार्यता में कमी का कारण बन सकती है, फिर भी यह स्वस्थ संतान का एक महत्वपूर्ण प्रतिशत पैदा करती है जिसका उपयोग अध्ययन के लिए किया जा सकता है।

ई 14.5 प्लेसेंटा में अभिव्यक्ति और सीआरआईएसपीआर निगमन का विश्लेषण (चित्रा 7)।
यह निर्धारित करने के लिए कि क्या IGF-1 सक्रियण प्लास्मिड का सेलुलर सम्मिलन IGF-1 को अतिरंजित करने के लिए सफल था, QPCR किया गया था। जैसा कि अपेक्षित था, क्यूपीसीआर ने आईजीएफ 1-ओई प्लेसेंटा बनाम नियंत्रण प्लेसेंटा में आईजीएफ -1 अभिव्यक्ति में उल्लेखनीय वृद्धि दिखाई, जब फोल्ड परिवर्तन को 18 एस अभिव्यक्ति (वेल्च के टी-टेस्ट, पी = 0.0302) (चित्रा 7 ए) में सामान्यीकृत किया गया था। यह निर्धारित करने के लिए कि क्या IGF-1 प्रोटीन के स्तर में बदलाव किया गया था, सभी समूहों से प्लेसेंटा पर एक एलिसा किया गया था। क्यूपीसीआर के अनुरूप, ई 14.5 प्लेसेंटा के एलिसा मूल्यांकन ने आईजीएफ 1-ओई प्लेसेंटा बनाम नियंत्रण प्लेसेंटा (वेल्च के टी-टेस्ट, पी = 0.0469) में आईजीएफ -1 प्रोटीन के स्तर में उल्लेखनीय वृद्धि दिखाई (चित्रा 7 बी)। क्यूपीसीआर और एलिसा ने दिखाया कि ओवरएक्प्रेशन प्लास्मिड ने क्रमशः आईजीएफ -1 जीन अभिव्यक्ति और आईजीएफ -1 प्रोटीन उत्पादन में सफलतापूर्वक वृद्धि की।

यह सुनिश्चित करने के लिए कि प्लास्मिड की डिलीवरी हेरफेर प्लेसेंटा के लिए विशिष्ट थी, क्यूपीसीआर को विशिष्ट आईजीएफ -1 सक्रियण प्लास्मिड और सीआरआईएसपीआर कैस 9 कंट्रोल प्लास्मिड के लिए किया गया था। ये क्यूपीसीआर मैनिपुलेटेड प्लेसेंटा और अनुपचारित प्लेसेंटा दोनों पर किए गए थे जो इंजेक्शन के निकट थे। सक्रियण प्लास्मिड अभिव्यक्ति का आकलन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले क्यूपीसीआर प्राइमरों ने ब्लास्ट प्लास्मिड के एक अनुक्रम को लक्षित किया, जो सक्रियण प्रणाली (चित्रा 7 सी) का हिस्सा है। अनुपचारित प्लेसेंटा ने ब्लास्ट प्लास्मिड (चक्र सीमा [सीटी] अनिर्धारित, ग्राफ पर 40 के रूप में लेबल) की कोई उपस्थिति नहीं दिखाई, और आईजीएफ 1-ओई प्लेसेंटा ने 30 के आसपास सीटी दिखाया। नियंत्रण प्लास्मिड अभिव्यक्ति का आकलन करने के लिए किए गए क्यूपीसीआर ने सम्मिलित जीएफपी जीन (चित्रा 7 डी) से एक अनुक्रम को लक्षित किया। अनुपचारित प्लेसेंटा ने 35 से अधिक सीटी मान दिखाए, संभवतः प्राइमर डिमराइजेशन के कारण, क्योंकि ये मान अभिव्यक्ति की अपेक्षित सीमा से बाहर हैं। नियंत्रण ने लगभग 30 का सीटी मान दिखाया। ये क्यूपीसीआर आईजीएफ -1 के अपेक्षित ओवरएक्प्रेशन या इसकी कमी को प्रदर्शित करने के लिए एक गुणवत्ता जांच के रूप में काम करते हैं और यह कि प्लास्मिड केवल अपेक्षित हेरफेर प्लेसेंटा में मौजूद हैं।

आईजीएफ -1 सक्रियण प्लास्मिड का स्थानिक सत्यापन प्लेसेंटल वर्गों का उपयोग करके किया गया था। ओसीटी यौगिक में तय और जमे हुए प्लेसेंटा को क्रमिक रूप से स्लाइड पर 10 μm पर वर्गीकृत किया गया था ताकि सभी परतें दिखाई दें। स्लाइड्स को तब -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज किया गया था जब तक कि फिश लेबलिंग के लिए उपयोग नहीं किया जाता था। यह सत्यापित करने के लिए कि प्लेसेंटा के भीतर IGF-1 CRISPR सक्रियण प्लास्मिड को कहां शामिल किया गया था, लाल फ्लोरोसेंट लेबलिंग के साथ एक dCas9-3xNLS-VP64 जांच का उपयोग किया गया था। यह जांच सक्रियण प्रणाली के एक कार्यात्मक घटक को लक्षित करती है। ग्रीन ऑटोफ्लोरेसेंस का उपयोग प्लेसेंटल मातृ-भ्रूण इंटरफ़ेस (चित्रा 7 ई, एफ) के उप-क्षेत्रों को प्रदर्शित करने के लिए किया गया था। अनुपचारित प्लेसेंटा में कोई dCas9-3xNLS-VP64 नहीं पाया गया था, क्योंकि उन्हें CRISPR हेरफेर (चित्रा 7E) के साथ इलाज नहीं किया गया था। जैसा कि अपेक्षित था, IGF1-OE प्लेसेंटा ने dCas9-3xNLS-VP64 के लिए लेबलिंग प्रदर्शित की, जैसा कि लाल रंग में देखा गया है (चित्रा 7F)। सीआरआईएसपीआर निगमन प्लेसेंटा के सभी तीन उप-क्षेत्रों में पाया गया था, जिसमें जंक्शनल ज़ोन (चित्रा 7 ई) की सबसे स्पष्ट लेबलिंग थी। डीसीएएस 9-3एक्सएनएलएस-वीपी 64 लेबलिंग की प्रतिदीप्ति तीव्रता प्लास्मिड-उपचारित प्लेसेंटा में भिन्न होती है, यह दर्शाता है कि कुछ ने प्लास्मिड को दूसरों की तुलना में अधिक उच्च व्यक्त किया, और लेबलिंग के सटीक स्थान / सीमा में भिन्नताएं थीं, लेकिन लेबलिंग आम तौर पर सभी उपक्षेत्रों में मौजूद थी। dCas9-3xNLS-VP64 लेबलिंग के स्थान की पुष्टि करने के लिए, Prl8a8 फिश लेबलिंग स्पंजियोट्रोफोब्लास्ट्स को लक्षित करने के लिए मध्य जंक्शन उपक्षेत्र (चित्रा 7 G, H) को लेबल करने के लिए किया गया था। यह उसी प्लेसेंटा से आसन्न वर्गों में उन वर्गों की "बहन" स्लाइड पर किया गया था जिन्हें डीसीएएस 9-3एक्सएनएलएस-वीपी 64 के लिए लेबल किया गया था। जैसा कि अपेक्षित था, Prl8a8 लेबलिंग द्वारा इंगित संरचना IGF1-OE और अनुपचारित प्लेसेंटा के बीच समान थी। निर्णायक और भूलभुलैया क्षेत्र को लाल जंक्शन क्षेत्र (चित्रा 7 जी, एच) के आसपास नीले नाभिक (डीएपीआई) लेबलिंग द्वारा पहचाना जा सकता है। dCas9-3xNLS-VP64 के फिश लेबलिंग ने स्पष्ट किया कि प्लास्मिड को सभी तीन उपक्षेत्रों में डाला गया था, और इसकी पुष्टि Prl8a8 लेबलिंग के साथ की गई थी। फिश लेबलिंग के परिणामों ने पुष्टि की कि आईजीएफ -1 सक्रियण प्लास्मिड का समावेश सफल रहा, और प्लास्मिड अनुपचारित प्लेसेंटा में माइग्रेट नहीं हुआ।

Figure 1
चित्रा 1: प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध । (ए) शल्य चिकित्सा प्रक्रिया का सरलीकृत योजनाबद्ध। तकनीक के प्रमुख चरणों का कालानुक्रमिक क्रम। (बी) योजनाबद्ध गर्भाशय के सींगों के भीतर हेरफेर प्लेसेंटा स्पेसिंग का एक उदाहरण प्रदर्शित करता है। दोनों पैनल BioRender.com के साथ बनाए गए थे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: गर्भाशय लैप्रोटॉमी प्रक्रिया। (ए-बी) सर्जरी की तैयारी के दौरान, (ए) एक बांध का मुंडा पेट, और (बी) आयोडीन समाधान के साथ लेपित शेव किया गया क्षेत्र। (C-F) सर्जरी क्षेत्र में, (सी) पेट की त्वचा में ~ 2 सेमी चीरा, और (डी) पेरिटोनियम में ~ 2 सेमी चीरा; आंतें दिखाई देती हैं। (ई) चीरा स्थल के माध्यम से गर्भाशय के सींगों में हेरफेर करना। गर्भाशय के सींग दिखाई दे रहे हैं। (एफ) पूरी तरह से उजागर गर्भाशय के सींगों को बाँझ सर्जिकल ड्रेप पर रखा जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: ई 12.5 प्लेसेंटा में सीआरआईएसपीआर प्लास्मिड का इंजेक्शन । (ए, बी) गर्भाशय के सींगों के भीतर भ्रूण और प्लेसेंटा का अभिविन्यास। (ए) एक लेबल गर्भाशय सींग का तिरछा दृश्य जो निर्णायक, भ्रूण क्षेत्र और एक भ्रूण को दर्शाता है। डैश्ड लाइन दर्शाती है कि इंजेक्शन साइट कहां होनी चाहिए। (बी) पैनल ए से एक बिना लेबल वाला गर्भाशय सींग। (C, D) प्लेसेंटा में इंजेक्शन साइट में डाले गए माइक्रोपिपेट का साइड व्यू। डी निर्णायक है, एफजेड भ्रूण क्षेत्र है, ई भ्रूण है, और धराशायी रेखा इंजेक्शन साइट स्थान का प्रतिनिधित्व करती है। (डी) पैनल सी से माइक्रोपिपेट सम्मिलन की अनलेबल छवि। (E, F) इंजेक्शन के बाद प्लेसेंटा में डाई का साइड व्यू। (ई) एक गर्भनाल प्रदर्शित करने वाले गर्भाशय के सींग की लेबल की गई छवि जिसे सीआरआईपीएसआर प्लास्मिड के साथ इंजेक्ट किया गया है जिसमें एक दृश्यमान डाई और एक प्लेसेंटा है जिसे इंजेक्शन नहीं दिया गया है। (एफ) पैनल ई में गर्भाशय के सींग की अनलेबल छवि। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: सीआरआईएसपीआर प्लास्मिड के इंजेक्शन के बाद ई 12.5 प्लेसेंटा का इलेक्ट्रोपोरेशन। (ए) गर्भाशय के सींग में प्लेसेंटा का शीर्ष दृश्य। एनोड और कैथोड इलेक्ट्रोपोरेशन पैडल को लेबल किया जाता है, और सफेद तीर इंजेक्शन साइट के स्थान को इंगित करता है। (बी) प्लेसेंटा के इलेक्ट्रोपोरेशन का तिरछा दृश्य। (सी) प्लेसेंटा के इलेक्ट्रोपोरेशन का साइड व्यू। (D-F) पैनल ए, बी और सी की सरलीकृत रूपरेखा। एनोड और कैथोड पैडल को लेबल किया जाता है, पी प्लेसेंटा है, ई भ्रूण है, और बिना लेबल वाला क्षेत्र गर्भाशय है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: पेट की त्वचा और पेरिटोनियम का ट्यूरिंग । (ए) सर्जरी के पूरा होने के बाद गर्भाशय के सींग पेट में लौट आए। पेट की त्वचा और पेरिटोनियम चीरे दिखाई दे रहे हैं। (बी) पेरिटोनियम चीरा पूरी तरह से सूज गया। (सी) पेट की त्वचा का चीरा पूरी तरह से सूज गया। (डी) पेट की त्वचा के सीवन पर चिपकने वाला ऊतक का अनुप्रयोग। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: सामान्य प्रक्रिया परिणाम। (ए) सर्जरी के बाद भ्रूण की जीवित रहने की दर ई 14.5 पर एकत्र की गई, प्रक्रिया के 2 दिन बाद। अनुपचारित भ्रूण (मैन-व्हिटनी यू परीक्षण: अनुपचारित बनाम कैस 9 नियंत्रण, पी = 0.0077; अनुपचारित बनाम अधिनियम नियंत्रण, पी = 0.0330; और अनुपचारित बनाम IGF1-OE, p = 0.0032)। हेरफेर किए गए समूहों (एक-तरफ़ा एनोवा, पी = 0.9454) के अस्तित्व में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं देखा गया। प्रत्येक बिंदु एक ही कूड़े से जीवित रहने के प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करता है (अनुपचारित एन = 22, कैस 9 नियंत्रण एन = 9, एक्ट कंट्रोल एन = 13, और आईजीएफ 1-ओई एन = 22 कूड़े)। (बी) ई 14.5 पर जीवित भ्रूण का प्लेसेंटल वजन (एक-तरफा एनोवा, पी = 0.1436) (अनुपचारित एन = 138, कैस 9 कंट्रोल एन = 15, एक्ट कंट्रोल एन = 20, और आईजीएफ 1-ओई एन = 36 प्लेसेंटा)। (ग) ई13.5 और ई14.5 पर सर्जरी के बाद बांध के वजन में परिवर्तन उन बांधों में देखा गया जो दिखावटी लैप्रोटॉमी प्रक्रिया से गुजरे थे या प्रायोगिक (एक्सपी) प्लेसेंटल हेरफेर से गुजरे थे। सर्जरी के बाद बांधों के वजन में परिवर्तन के दो समूहों के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं देखा जाता है (अप्रकाशित टी-परीक्षण: E13.5 p = 0.5452 और E14.5 p = 0.2493) (शाम बांध n = 3 और Exp बांध n = 10)। (डी-एफ) एम्नियोटिक थैली में नेक्रोस्कोपी के बाद ई 14.5 भ्रूण की छवियों का प्रतिनिधित्व करती है, जिसमें प्लेसेंटा अभी भी जुड़ा हुआ है। (एफ) दूर-दाएं कोने में स्केल बार भ्रूण की 3.75 मिमी (जी-आई) तिरछी छवि और संबंधित प्लेसेंटा के शीर्ष दृश्य का प्रतिनिधित्व करता है। (I) दूर-दाएं कोने में स्केल बार 3.75 मिमी का प्रतिनिधित्व करता है। (D-I) सभी उपचार समूह लेबल छवियों के नीचे सूचीबद्ध हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्र 7: E14.5 प्लेसेंटा में अभिव्यक्ति और CRISPR निगमन का विश्लेषण। (A) E14.5 नियंत्रण और IGF1-OE प्लेसेंटा में IGF-1 अभिव्यक्ति का QPCR विश्लेषण। IGF1-OE प्लेसेंटा (वेल्च का टी-टेस्ट, p = 0.0302) (नियंत्रण n = 15 और IGF1-OE n = 20 प्लेसेंटा) में IGF-1 अभिव्यक्ति में सामान्यीकृत 18s अभिव्यक्ति में उल्लेखनीय वृद्धि देखी गई। (बी) ई 14.5 नियंत्रण और आईजीएफ 1-ओई प्लेसेंटा में आईजीएफ -1 प्रोटीन के स्तर का एलिसा। IGF-1 के स्तर में नियंत्रण स्तरों की तुलना में IGF1-OE प्लेसेंटा में उल्लेखनीय वृद्धि देखी गई (वेल्च का टी-टेस्ट, पी = 0.0469) (नियंत्रण एन = 13 और IGF1-OE n = 15 प्लेसेंटा)। (सी) आईजीएफ -1 एसएएम प्लास्मिड से ब्लास्ट अनुक्रम का क्यूपीसीआर विश्लेषण। ब्लास्ट की अभिव्यक्ति केवल IGF1-OE प्लेसेंटा में पाई गई थी, और अनुपचारित प्लेसेंटा (अनुपचारित n = 4 और IGF1-OE n = 9 प्लेसेंटा) में कोई अनिर्धारित अभिव्यक्ति नहीं पाई गई थी। (डी) सीआरआईएसपीआर कैस 9 नियंत्रण प्लास्मिड से जीएफपी अनुक्रम का क्यूपीसीआर विश्लेषण। प्लास्मिड की अभिव्यक्ति नियंत्रण प्लेसेंटा में पाई गई थी, और अनुपचारित नमूनों (अनुपचारित एन = 4 और नियंत्रण = 5 प्लेसेंटा) में 35/झूठे सकारात्मक परिणाम से अधिक सीटी मान पाए गए थे। डैश ्ड लाइन 35 सीटी पर झूठी सकारात्मक सीमा का प्रतिनिधित्व करती है। प्रत्येक डेटा बिंदु एक प्लेसेंटा से है। सभी त्रुटि पट्टियाँ 10 μm मोटाई पर E14.5 प्लेसेंटल वर्गों के सीटू संकरण में SEM. (E-H) फ्लोरेसेंस का प्रतिनिधित्व करती हैं। (ई) अनुपचारित और (एफ) आईजीएफ 1-ओई प्लेसेंटा सेक्शन जिसमें डीसीएएस 9-3एक्सएनएलएस-वीपी 64 जांच लाल रंग में लेबल किया गया है। लाल संकेत केवल IGF1-OE प्लेसेंटा में मौजूद है। ग्रीन सिग्नल ऑटोफ्लोरेसेंस है जिसका उपयोग प्लेसेंटल उपक्षेत्रों की पहचान करने में मदद करने के लिए किया जाता है। (जी) अनुपचारित और (एच) आईजीएफ 1-ओई प्लेसेंटा सेक्शन जिसमें मध्य जंक्शन क्षेत्र के स्पोंजियोट्रोफोब्लास्ट की पहचान करने के लिए लाल रंग में लेबल किया गया पीआरएल 8 ए 8 जांच है। नीले रंग में DAPI निर्णायक और भूलभुलैया क्षेत्रों को दर्शाता है जो उस जंक्शन क्षेत्र को घेरते हैं। (H) दूर-दाएं कोने में स्केल बार 2 मिमी का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक तालिका 1: इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले प्राइमर। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

प्लेसेंटा भ्रूण के विकास का एक प्राथमिक नियामक है, और जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, प्लेसेंटल जीन अभिव्यक्ति या कार्य में परिवर्तन भ्रूण के विकासको काफी प्रभावित कर सकता है। यहां उल्लिखित प्रोटोकॉल का उपयोग अपेक्षाकृत उन्नत सर्जिकल दृष्टिकोण का उपयोग करके माउस प्लेसेंटा के विवो सीआरआईएसपीआर हेरफेर में लक्षित प्रदर्शन करने के लिए किया जा सकता है। यह तकनीक व्यवहार्य भ्रूण और उनके संबंधित प्लेसेंटा की एक महत्वपूर्ण उपज की अनुमति देती है जिसका उपयोग आगे के अध्ययन के लिए किया जा सकता है (चित्रा 6 ए, बी)। इस तकनीक ने हमें ई 14.5 (चित्रा 7 ए, बी) पर प्लेसेंटल आईजीएफ -1 को सफलतापूर्वक ओवरएक्सप्रेस करने की अनुमति दी। उपयोग किए गए प्लास्मिड ने विशिष्टता दिखाई, क्योंकि डाले गए प्लास्मिड हेरफेर प्लेसेंटा में बने रहे और आसन्न अनुपचारित प्लेसेंटा (चित्रा 7 सी, डी) में मौजूद नहीं थे। IGF-1 सक्रियण प्लास्मिड के स्थानिक वितरण की पुष्टि फिश द्वारा dCas9-3xNLS-VP64 और Prl8a8 के लिए की गई थी, जिससे पता चला कि सक्रियण प्लास्मिड IGF1-OE प्लेसेंटा के तीन उप-क्षेत्रों में मौजूद था और अनुपचारित प्लेसेंटा के किसी भी उप-क्षेत्र में नहीं था (चित्रा 7E-H)। इस तकनीक का उपयोग प्लेसेंटल जीन अभिव्यक्ति को उन तरीकों से बदलने के लिए किया जा सकता है जो पिछली तकनीकों के साथ संभव नहीं हो सकते हैं। इस तकनीक का उपयोग कई संदर्भों में भ्रूण के विकास पर प्लेसेंटल जीन अभिव्यक्ति और कार्य के प्रभाव की अधिक समझ के लिए अनुमति देगा।

मातृ और भ्रूण के परिणामों के लिए इस प्रक्रिया की सफलता को अनुकूलित करने के लिए, कई मापदंडों को बदलने के प्रभावों का पता लगाया गया था, जिसमें इंजेक्शन और इलेक्ट्रोपोरेशन सेटिंग्स, साथ ही उपयोग की जाने वाली सामग्री भी शामिल थी। बांध के अस्तित्व और वसूली को बढ़ाने के लिए, यह पाया गया कि संज्ञाहरण के तहत समय 1 घंटे से अधिक नहीं होना चाहिए, क्योंकि लंबी सर्जरी की अवधि ने अस्तित्व को काफी कम कर दिया है। यदि संज्ञाहरण के तहत समय लगभग 2 घंटे तक पहुंच जाता है, तो जीवित रहने की संभावना नाटकीय रूप से 20% से नीचे के स्तर तक कम हो जाती है, संभवतः आइसोफ्लुरेन के तहत विस्तारित समय के नकारात्मक प्रभावों के कारण। संज्ञाहरण के तहत समय के अलावा, सर्जरी की सबसे आम जटिलता जो मातृ मृत्यु का कारण बनती है, वह त्वचा और पेरिटोनियम चीरे लगाते समय पेरिटोनियम को ठीक से तम्बू करने में विफलता थी। यदि पेरिटोनियम को ठीक से तम्बू नहीं किया जाता है, तो आंतें घायल हो सकती हैं, जो सर्जरी के बाद के दिनों में मृत्यु का कारण बन सकती हैं। गर्भाशय के उजागर होने का समय बांध और भ्रूण के अस्तित्व को भी प्रभावित करता है। सफल प्रयोगों में गर्भाशय के उजागर होने का औसत समय लगभग 15 मिनट था; 30 मिनट से अधिक एक्सपोजर से पुनरुत्थान और संभावित मातृ बीमारी में वृद्धि हो सकती है। उजागर गर्भाशय और किसी भी अन्य उजागर अंगों (अक्सर आंतों) को नम रखा जाना चाहिए, लेकिन बहुत अधिक खारा जानवर को ठंडा कर सकता है; समय-समय पर उजागर अंगों को नम करते समय, बाँझ खारा के 1 मिलीलीटर से कम का उपयोग किया जाना चाहिए।

इंजेक्शन और इलेक्ट्रोपोरेशन के मापदंडों ने भ्रूण के अस्तित्व को बहुत प्रभावित किया। इंजेक्शन की मात्रा लगभग 4.5 μL से अधिक नहीं होनी चाहिए, क्योंकि इसके परिणामस्वरूप पुनरुत्थान होता है। जीवित रहने को अधिकतम करने के लिए इंजेक्शन का समय और दबाव महत्वपूर्ण हैं; इंजेक्शन का समय 0.5 एस और 1.5 एस के बीच सेट किया जाना चाहिए, हालांकि 0.8 एस इष्टतम दिखाई दिया। दबाव 1-8.5 पीएसआई के बीच सेट किया जाना चाहिए। कम इंजेक्शन समय और उच्च इंजेक्शन पीएसआई स्तर के साथ कम भ्रूण जीवित रहने की दर देखी गई। यह भी देखा गया कि यदि माइक्रोपिपेट बहुत कुंद था, तो भ्रूण की व्यवहार्यता में कमी हो सकती है, और समाधान भी अक्सर माइक्रोपिपेट से बाहर निकल जाएगा। इंजेक्शन की कल्पना करने के लिए उपयोग की जाने वाली डाई का प्रकार अस्तित्व को प्रभावित कर सकता है। इस उद्देश्य के लिए उपयोग किए जाने पर मेथिलीन ब्लू ने मातृ मृत्यु का कारण बना, लेकिन एक फ़िल्टर किए गए फास्ट ग्रीन डाई समाधान ने मातृ स्वास्थ्य पर कोई नकारात्मक प्रभाव नहीं दिखाया। विवो33 में पिछले इलेक्ट्रोपोरेशन अध्ययनों के आधार पर अनुशंसित निर्माता सेटिंग्स से इलेक्ट्रोपोरेशन सेटिंग्स को अनुकूलित किया गया था। इलेक्ट्रोपोरेशन को हेरफेर पाया गया जिसने सबसे अधिक नुकसान पहुंचाया और भ्रूण के अस्तित्व में कमी आई। विवो भ्रूण इलेक्ट्रोपोरेशन सेटिंग्स में अनुशंसित सीआरआईएसपीआर दक्षता को अधिकतम करने के लिए चार दालों का सुझाव दिया जाता है, लेकिन उच्च जीवित रहने की दर33 के लिए दो दालों की सिफारिश की जाती है। यह पाया गया कि चार दालों ने लगभग सभी भ्रूणों को पुनर्जीवित कर दिया। सीआरआईएसपीआर दक्षता को बनाए रखते हुए दो दालों ने व्यवहार्यता बढ़ाने की अनुमति दी। इलेक्ट्रोपोरेशन पैडल के आकार ने भ्रूण के अस्तित्व को भी काफी प्रभावित किया। यह पाया गया कि अनुशंसित सेटिंग्स के साथ उपयोग किए जाने पर 5 मिमी इलेक्ट्रोपोरेशन पैडल ने लगभग पूर्ण पुनरुत्थान का नेतृत्व किया। दरअसल, निर्माता के गाइड में 3 मिमी इलेक्ट्रोपोरेशन पैडल की सिफारिश की जाती है और भ्रूण व्यवहार्यता33 में काफी वृद्धि होती है। यह भी ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि कई इलेक्ट्रोपोरेशन पैडल में कुछ पल्स जीवन होते हैं। इस अधिकतम उपयोग के बाद, गुणवत्ता में कमी देखी जा सकती है। यह पहचाना जा सकता है यदि नाड़ी के दौरान पैडल और प्लेसेंटा के बीच एक छोटे सफेद फोम का गठन नहीं होता है। इलेक्ट्रोपोरेशन पैडल वोल्टेज को वोल्टमीटर का उपयोग करके जांचा जा सकता है ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि यह अपेक्षित वोल्टेज का उत्पादन कर रहा है या नहीं।

यह अध्ययन कुछ मायनों में सीमित है। यह तकनीक समय-विशिष्ट है और संभवतः E10.5 से पहले और E16.5 से बाद में सबसे अच्छा प्रदर्शन नहीं किया जाता है। यह ई 10.5 से पहले प्लेसेंटा के बहुत छोटा होने के कारण है, और ई 16.5 के बाद, प्लास्मिड के पास वांछित प्रभाव उत्पन्न करने के लिए पर्याप्त समय नहीं हो सकता है। इस समय सीमा का मतलब है कि यह तकनीक चूहों में विशिष्ट प्रकार के अध्ययनों के लिए बेहतर अनुकूल है। यह तकनीक न्यूरोडेवलपमेंट का अध्ययन करने के लिए उपयोगी है, क्योंकि ई 12.5 मस्तिष्क34 के भीतर कई संरचनाओं के लिए न्यूरोजेनेसिस के एक महत्वपूर्ण समय के भीतर आता है। यह तकनीक विकास के शुरुआती चरणों पर प्लेसेंटल प्रभावों का अध्ययन करने के लिए उपयोगी नहीं हो सकती है, जैसे कि तंत्रिका प्लेट गठन, जो ई 8.535 पर होता है। नॉकआउट सीआरआईएसपीआर प्लास्मिड के परिणाम इस समय ज्ञात नहीं हैं; जीन अभिव्यक्ति में कमी के लिए इस विधि के आवेदन को आगे की जांच की आवश्यकता है क्योंकि केवल जीन के ओवरएक्प्रेशन / सक्रियण का प्रदर्शन किया गया है। इसके बावजूद, यह अनुमान लगाया जाता है कि यह तकनीक नॉकआउट सीआरआईएसपीआर प्लास्मिड के सम्मिलन के लिए भी सफल होगी।

यह तकनीक आनुवंशिक रूप से संशोधित प्लेसेंटल ऊतक36 की प्राथमिक संस्कृति करने की संभावना के लिए भी अनुमति दे सकती है। CRISPR के प्रकार के आधार पर, जैसे CRISPRI और CRISPRA, एक प्राथमिक संस्कृति का उपयोग बचाव अध्ययनकरने के लिए किया जा सकता है। इस तकनीक का उपयोग प्लेसेंटल आनुवंशिक और कार्यात्मक असामान्यताओं और संतानों में समस्याओं के बीच संबंधों का पता लगाने के लिए भी किया जा सकता है। विशेष रूप से, एक पिछले अध्ययन में प्लेसेंटल-विशिष्ट जीनोमिक जोखिम स्कोर और स्किज़ोफ्रेनिया जोखिम39 के बीच एक महत्वपूर्ण सहसंबंध पाया गया। इस अध्ययन ने कई प्लेसेंटल जीनों की पहचान की जो स्किज़ोफ्रेनिया के विकास में भूमिका निभा सकते हैं जिन्हें पशु मॉडल में नहीं खोजा गया है। यह तकनीक इस प्रकार और अन्य के आगे के अध्ययन के लिए खुद को उधार देती है।

प्लेसेंटा के सीआरआईएसपीआर संशोधन से प्राप्त ज्ञान को विभिन्न बायोमेडिकल अनुप्रयोगों की एक श्रृंखला में अनुवादित किया जा सकता है। अध्ययन जो यह पहचानते हैं कि प्लेसेंटा में विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति भ्रूण के विकास को कैसे प्रभावित कर सकती है, का उपयोग प्लेसेंटल-लक्षित औषधीय हस्तक्षेप बनाने के लिए किया जा सकता है जो इन असामान्यताओं का इलाज कर सकते हैं। भ्रूण को सीधे लक्षित उपचार मुश्किल और खतरनाक हो सकता है40,41. प्लेसेंटा उपचार के लिए एक अधिक सुलभ लक्ष्य है। हृदय या मस्तिष्क में विकास संबंधी समस्याओं के मामले में जो प्रसवपूर्व रूप से संशोधित हो सकते हैं, प्रत्यक्ष हृदय या मस्तिष्क हेरफेर उच्च जोखिम है। इस तरह के जोखिम को प्लेसेंटल हस्तक्षेप से बचा जा सकता है, जो अधिक प्रशंसनीय है और न्यूरोडेवलपमेंटल विकारों के लिए निवारक रणनीतियों को जन्म दे सकता है, जिसके लिए आणविक वातावरण, जो प्लेसेंटा द्वारा प्रदान किया जाता है, महत्वपूर्ण हो सकता है। इस तकनीक का उपयोग जन्मजात हृदय रोग जैसी बीमारियों के इलाज के लिए भी किया जा सकता है, जिसे प्लेसेंटलविकारों से जोड़ा गया है। चूंकि जन्मजात हृदय रोग एक सामान्य जन्म दोष है, इसलिए प्लेसेंटल हस्तक्षेप उपचार की संभावना कामहत्वपूर्ण प्रभाव हो सकता है। चूंकि प्लेसेंटा के कई कार्य हैं, इसलिए इस तकनीक का उपयोग कई बीमारियों के लिए हस्तक्षेप के विकास को आगे बढ़ाने के लिए किया जा सकता है। कुल मिलाकर, इस प्लेसेंटल लक्षित तकनीक का उपयोग भ्रूण के विकास के कई क्षेत्रों पर प्लेसेंटल जेनेटिक्स और फ़ंक्शन के प्रभाव की समझ को आगे बढ़ाने के लिए किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

लेखक निम्नलिखित वित्त पोषण स्रोतों को स्वीकार करते हैं: R01 MH122435, NIH T32GM008629, और NIH T32GM145441। लेखक ों ने आयोवा विश्वविद्यालय में डॉ वैल शेफ़ील्ड और डॉ केल्विन कार्टर की प्रयोगशालाओं को उनके सर्जरी कक्ष और उपकरणों के उपयोग के लिए धन्यवाद दिया, साथ ही डॉ एरिक वैन ओटरलू, डॉ नंदकुमार नारायणन और डॉ मैथ्यू वेबर को माइक्रोस्कोपी के साथ उनकी सहायता के लिए धन्यवाद दिया। लेखक ों ने पायलट सर्जरी के साथ उनकी सहायता के लिए डॉ सारा मौरर, माया इवांस और श्रीलेखा कुंडू को भी धन्यवाद दिया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 ml Tubes USA Scientific Inc 1615-5500
4% Paraformeldhyde (PFA) in PBS Thermo Fisher Scientific J61899.AP
96 Well plate Cornings 3598 For BCA kit
Absorbent Underpads Fisher Scientific 14-206-62
Activation Control Plasmid Santa Cruz Biotechnology sc-437275 Dnase-free water provided for dilution
AMV Reverse Transcriptase New England Biolabs M0277L Use for cDNA synthesis
Anesthetic Gas Vaporizor Vetamac VAD-601TT VAD-compact vaporizer
Artifical Tear Gel Akorn NDC 59399-162-35
BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific 23227 Protein quantification
Biovortexer Bellco Glass, Inc. 198050000 Hand-held tissue homogenizer
CellSens Software Olympus V4.1.1 Image processing to FISH images.
Centrifuge 5810 Eppendorf EP022628168 Plate centrifuge
Chloroform Thermo Fisher Scientific J67241-AP RNA isolation
Cotton Tipped Applicators ProAdvantage 77100 Sterilize before use
CRISPR/Cas9 Control Plasmid Santa Cruz Biotechnology sc-418922 Dnase-free water provided for dilution
CryoStat Leica CM1950
Dissection Microscope Leica M125 C Used for post-necroscopy imaging
Dissolvable Sutures Med Vet International J385H
Distilled Water Gibco 15230162
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) Thermo fisher Scientific 14190144 (-) Calcium; (-) Magnesium
ECM 830 Electro Electroporator (Electroporation Machine) BTX Harvard Apparatus 45-0662 Generator only
Electric Razor Wahl CL9990 Kent Scientific
Electroporation paddles/Tweezertrodes BTX Harvard Apparatus 45-0487 3 mm diameter paddles; wires included
Embedding Cassette: 250 PK Grainger 21RK94 Placenta embedding cassettes
Ethanol Thermo Fisher Scientific 268280010
F-Air Canisters Penn Veterinary Supply Inc BIC80120 Excess isoflurane filter
Fast Green Dye FCF Sigma F7252-5G Dissolve to 1 μg/ml and filter; protect from light
Filter-based microplate photometer (plate reader) Fisher Scientific 14377576 Can be used for BCA and ELISA
Forceps VWR 82027-386 Fine tips, straight, serrated
Formalin solution, neutral buffered, 10% Sigma Aldrich HT501128
Glass Capillaries - Borosilicate Glass (Micropipette) Sutter Instrument B150-86-10 O.D.: 1.5 mm, I.D.: 0.86 mm, 10 cm length
Halt Protease and Phosphotase inhibitor cocktail (100x) Thermo Scientific 1861281 Protein homogenization buffer
Heating Pad Thermotech S766D Digitial Moist Heating Pad
Hemostats VWR 10806-188 Fully surrated jaw; curved
Hot Water Bath Fisher Scientific 20253 Isotemp 205
Igf-1 SAM Plasmid (m1) Santa Cruz Biotechnology sc-421056-ACT Dnase-free water provided for dilution
Induction Chamber Vetamac 941443 No specific liter size required
Isoflurane Piramal Pharma Limited NDC 66794-013-25
Isoproponal/2-Proponal Fisher Scientific A451-4 RNA isolation
Ketamine HCl 100mg/ml Akorn NDC 59399-114-10
MgCl2/Magneisum Chloride Sigma Aldrich 63069-100ML 1M. Protein homogenization buffer
MicroAmp™ Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode Fisher Scientific 4309849 Barcoded plates not required
Microcapillary Tip Eppendorf 5196082001 Attached to BTX Microinjector
Microinjector BTX Harvard Apparatus 45-0766 Stainless Steel Pipette Holder, 130 mm Length, for 1 to 1.5 mm Pipettes
Microject 1000A (Injection Machine) BTX Harvard Apparatus 45-0751 MicroJect 1000A Plus System
Micropipette Puller Model P-97 Sutter Instrument P-97 Flaming/Brown type micropipette puller
Microplate Mixer (Plate Shaker) scilogex 822000049999
Mouse/Rat IGF-I/IGF-1 Quantikine ELISA Kit R & D Systems MG100
Needles BD - Becton, Dickson, and Company 305106 30 Gx 1/2 (0.3 mm x 13 mm)
Nitrogen Tank Linde 7727-37-9 Any innert gas
Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drug (NSAID) Norbrook Laboratories Limited NDC 55529-040-10 Analesgic such as Meloxicam
Nose Cone Vetamac 921609 9-14 mm
Opal 620 detection dye Akoya Biosciences SKU FP1495001KT Used for FISH
Optimal Cutting Temperature (O.C.T) Compound Sakura 4583
Oxygen Tank Linde 7782 - 44 - 7 Medical grade oxygen
Pestles USA Scientific Inc 14155390
Povidone-Iodine Solution, 5% Avrio Health L.P. NDC 67618-155-16
Power SYBR™ Green PCR Master Mix Thermo Fisher Scientific 4367659 Use for qPCR
Random Hexamers (Random Primers) New England Biolabs S1330S Use for cDNA synthesis
Razor Blade Grainger 26X080
RNA Cleanup Kit & Concentrator Zymo Research R1013
RNALater Thermo Fisher Scientific AM7021
RNAscope kit v.2.5 Advanced Cells Diagnostics 323100 Contains all reagents required for fluorescent in situ hybridization. Probes sold separately.
RNAscope™ Probe- Mm-Prl8a8-C2 Advanced Cells Diagnostics  528641-C2
RNAscope™ Probe- Vector-dCas9-3xNLS-VP64 Advanced Cells Diagnostics 527421
Roto-Therm Mini Benchmark R2020 Dry oven for in situ hybridization
Scissors VWR 82027-578 Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4¹/?
Sodium Chloride (Saline) Hospra NDC 0409-4888-03 Sterile,  0.9%
Sodium Citrate, Trisodium Salt, Dihydrate, [Citric Acid, Trisodium Dihydrate] Research Product International 03-04-6132
Sodium Hydroxide 1N Concentrate, Fisher Chemical Fisher Scientific SS277 Protein homogenization buffer
Steamer Bella B00DPX8UBA
Sterile Surgical Drape Busse 696 Sterilize before use
Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
Surgipath Cover Glass 24x60 Leica 3800160
Syringes BD - Becton, Dickson, and Company 309659 BD Luer Slip Tip Syringe sterile, single use, 1 mL
Thermo Scientific™ Invitrogen™ Nanodrop™ One Spectrophotometer with WiFi and Qubit™ 4 Fluorometer Fisher Scientific 13-400-525 This configuration comes with Qubit 4 fluorometer.  Qubit quantification not required.
Tissue Adhesive 3M 1469SB VetBond
Tris HCl Thermo Fisher Scientific 15568025 1M. Protein homogenization buffer
TRIzol™ Reagent Thermo Fisher Scientific 15596018 RNA isolation
TSA Buffer Pack Advanced Cells Diagnostics 322810 Used to dilute Opal 620 detection dye
Universal F-Circuit Vetamac 40200 Attached to vaporizer and vaporizer accessories
Upright Compound Fluorescence Microscope Olympus BX61VS Used for FISH imaging
Vectorshield with DAPI Vector Laboratories H-1200 Coverslip mounting media
ViiA™ 7 Real-Time PCR System with 384-Well Block Thermo Fisher Scientific 4453536 This is for SYBR 384-well block detection.  TaqMan and/or smaller blocks available
Wet n Wild Nail Polish Wild Shine, Clear Nail Protector, Nail Color Amazon C450B
Xylazine 20mg/ml Anased 343730_RX

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References

  1. Cross, J. C., et al. Genes, development and evolution of the placenta. Placenta. 24 (2-3), 123-130 (2003).
  2. Perez-Garcia, V., et al. Placentation defects are highly prevalent in embryonic lethal mouse mutants. Nature. 555 (7697), 463-468 (2018).
  3. Rosenfeld, C. S. The placenta-brain-axis. Journal of Neuroscience Research. 99 (1), 271-283 (2021).
  4. Maslen, C. L. Recent advances in placenta-heart interactions. Frontiers in Physiology. 9, 735 (2018).
  5. Kundu, S., Maurer, S. V., Stevens, H. E. Future horizons for neurodevelopmental disorders: Placental mechanisms. Frontiers in Pediatrics. 9, 653230 (2021).
  6. Woods, L., Perez-Garcia, V., Hemberger, M. Regulation of placental development and its impact on fetal growth-new insights from mouse models. Frontiers in Endocrinology. 9, 570 (2018).
  7. Goeden, N., et al. Maternal Inflammation disrupts fetal neurodevelopment via increased placental output of serotonin to the fetal brain. Journal of Neuroscience. 36 (22), 6041-6049 (2016).
  8. vander Bom, T., et al. The changing epidemiology of congenital heart disease. Nature Reviews Cardiology. 8 (1), 50-60 (2011).
  9. Wilson, R. L., et al. Analysis of commonly expressed genes between first trimester fetal heart and placenta cell types in the context of congenital heart disease. Scientific Reports. 12 (1), 10756 (2022).
  10. Renaud, S. J., Karim Rumi, M. A., Soares, M. J. Review: Genetic manipulation of the rodent placenta. Placenta. 32, S130-S135 (2011).
  11. Wenzel, P. L., Leone, G. Expression of Cre recombinase in early diploid trophoblast cells of the mouse placenta. Genesis. 45 (3), 129-134 (2007).
  12. Zhou, C. C., et al. Targeted expression of Cre recombinase provokes placental-specific DNA recombination in transgenic mice. PLoS One. 7 (2), e29236 (2012).
  13. Wattez, J. S., Qiao, L., Lee, S., Natale, D. R. C., Shao, J. The platelet-derived growth factor receptor alpha promoter-directed expression of cre recombinase in mouse placenta. Developmental Dynamics. 248 (5), 363-374 (2019).
  14. Nadeau, V., et al. Map2k1 and Map2k2 genes contribute to the normal development of syncytiotrophoblasts during placentation. Development. 136 (8), 1363-1374 (2009).
  15. Chakraborty, D., Muto, M., Soares, M. J. Ex vivo trophoblast-specific genetic manipulation using lentiviral delivery. BioProtocol. 7 (24), e2652 (2017).
  16. Okada, Y., et al. Complementation of placental defects and embryonic lethality by trophoblast-specific lentiviral gene transfer. Nature Biotechnology. 25 (2), 233-237 (2007).
  17. Lecuyer, M., et al. a placental marker of fetal brain defects after in utero alcohol exposure. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 44 (2017).
  18. Jones, H. N., Crombleholme, T., Habli, M. Adenoviral-mediated placental gene transfer of IGF-1 corrects placental insufficiency via enhanced placental glucose transport mechanisms. PLoS One. 8 (9), e74632 (2013).
  19. Jones, H., Crombleholme, T., Habli, M. Regulation of amino acid transporters by adenoviral-mediated human insulin-like growth factor-1 in a mouse model of placental insufficiency in vivo and the human trophoblast line BeWo in vitro. Placenta. 35 (2), 132-138 (2014).
  20. Song, A. J., Palmiter, R. D. Detecting and avoiding problems when using the Cre-lox system. Trends in Genetics. 34 (5), 333-340 (2018).
  21. Chuah, M. K., Collen, D., VandenDriessche, T. Biosafety of adenoviral vectors. Current Gene Therapy. 3 (6), 527-543 (2003).
  22. Evers, B., et al. CRISPR knockout screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).
  23. Rossant, J., Cross, J. C. Placental development: Lessons from mouse mutants. Nature Reviews Genetics. 2 (7), 538-548 (2001).
  24. Elmore, S. A., et al. Histology atlas of the developing mouse placenta. Toxicologic Pathology. 50 (1), 60-117 (2022).
  25. Sferruzzi-Perri, A. N., Sandovici, I., Constancia, M., Fowden, A. L. Placental phenotype and the insulin-like growth factors: Resource allocation to fetal growth. The Journal of Physiology. 595 (15), 5057-5093 (2017).
  26. Agrogiannis, G. D., Sifakis, S., Patsouris, E. S., Konstantinidou, A. E. Insulin-like growth factors in embryonic and fetal growth and skeletal development (Review). Molecular Medicine Reports. 10 (2), 579-584 (2014).
  27. Wang, L., Jiang, H., Brigande, J. V. Gene transfer to the developing mouse inner ear by in vivo electroporation. Journal of Visualized Experiments. (64), e3653 (2012).
  28. Elser, B. A., et al. Combined maternal exposure to cypermethrin and stress affect embryonic brain and placental outcomes in mice. Toxicological Sciences. 175 (2), 182-196 (2020).
  29. Gumusoglu, S. B., et al. Chronic maternal interleukin-17 and autism-related cortical gene expression, neurobiology, and behavior. Neuropsychopharmacology. 45 (6), 1008-1017 (2020).
  30. Liu, F., Huang, L. Electric gene transfer to the liver following systemic administration of plasmid DNA. Gene Therapy. 9 (16), 1116-1119 (2002).
  31. Kalli, C., Teoh, W. C., Leen, E. Introduction of genes via sonoporation and electroporation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 818, 231-254 (2014).
  32. Wu, W., et al. Efficient in vivo gene editing using ribonucleoproteins in skin stem cells of recessive dystrophic epidermolysis bullosa mouse model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (7), 1660-1665 (2017).
  33. Nakamura, H. Electroporation and Sonoporation in Developmental Biology. , Springer. Tokyo, Japan. (2009).
  34. Bond, A. M., et al. Differential timing and coordination of neurogenesis and astrogenesis in developing mouse hippocampal subregions. Brain Sciences. 10 (12), 909 (2020).
  35. Kojima, Y., Tam, O. H., Tam, P. P. Timing of developmental events in the early mouse embryo. Seminars in Cell & Developmental Biology. 34, 65-75 (2014).
  36. Pennington, K. A., Schlitt, J. M., Schulz, L. C. Isolation of primary mouse trophoblast cells and trophoblast invasion assay. Journal of Visualized Experiments. (59), e3202 (2012).
  37. Mandegar, M. A., et al. CRISPR Interference efficiently induces specific and reversible gene silencing in human iPSCs. Cell Stem Cell. 18 (4), 541-553 (2016).
  38. Dai, Z., et al. Inducible CRISPRa screen identifies putative enhancers. Journal of Genetics and Genomics. 48 (10), 917-927 (2021).
  39. Ursini, G., et al. Placental genomic risk scores and early neurodevelopmental outcomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. (7), e2019789118 (2021).
  40. Smajdor, A. Ethical challenges in fetal surgery. Journal of Medical Ethics. 37 (2), 88-91 (2011).
  41. Antiel, R. M. Ethical challenges in the new world of maternal-fetal surgery. Seminars in Perinatology. 40 (4), 227-233 (2016).

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जेनेटिक्स इश्यू 194 प्लेसेंटा माउस सीआरआईएसपीआर इंसुलिन जैसे विकास कारक 1 इलेक्ट्रोपोरेशन ओवरएक्प्रेशन विकास
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