Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Mus In Vivo placenta riktad CRISPR-manipulation

Published: April 14, 2023 doi: 10.3791/64760
Automatic Translation
1,2,3, 2,3, 1,2,3,4
1Interdisciplinary Graduate Program in Genetics, University of Iowa, 2Department of Psychiatry, Carver College of Medicine, University of Iowa, 3Iowa Neuroscience Institute, Carver College of Medicine, University of Iowa, 4Hawk-IDDRC, University of Iowa

Summary

Här beskrivs en tidsspecifik metod för att effektivt manipulera kritiska utvecklingsvägar i musens moderkaka in vivo. Detta utförs genom injektion och elektroporering av CRISPR-plasmider i moderkakan hos dräktiga moderdjur på embryonal dag 12,5.

Abstract

Placentan är ett viktigt organ som reglerar och upprätthåller däggdjursutveckling i livmodern. Placentan är ansvarig för överföring av näringsämnen och avfall mellan modern och fostret och produktion och leverans av tillväxtfaktorer och hormoner. Placenta genetiska manipuleringar hos möss är avgörande för att förstå placentans specifika roll i prenatal utveckling. Placentaspecifika Cre-uttryckande transgena möss har varierande effektivitet, och andra metoder för placenta genmanipulation kan vara användbara alternativ. Denna artikel beskriver en teknik för att direkt förändra placentagenuttryck med hjälp av CRISPR-genmanipulation, som kan användas för att modifiera uttrycket av riktade gener. Med hjälp av ett relativt avancerat kirurgiskt tillvägagångssätt genomgår gravida mödrar en laparotomi på embryonal dag 12,5 (E12,5), och en CRISPR-plasmid levereras av en glasmikropipett i de enskilda placentorna. Plasmiden elektroporeras omedelbart efter varje injektion. Efter moderkakans återhämtning kan moderkakan och embryona fortsätta utvecklas fram till bedömningen vid en senare tidpunkt. Utvärderingen av moderkakan och avkomman efter användning av denna teknik kan bestämma rollen som tidsspecifik placentafunktion i utvecklingen. Denna typ av manipulation kommer att möjliggöra en bättre förståelse för hur placenta genetik och funktion påverkar fostrets tillväxt och utveckling i flera sjukdomssammanhang.

Introduction

Placentan är ett viktigt organ som är involverat i fostrets utveckling. Placentans huvudroll är att tillhandahålla väsentliga faktorer och reglera överföringen av näringsämnen och avfall till och från fostret. Däggdjursplacenta består av både foster- och modervävnad, som utgör gränssnittet mellan foster och moder, och därmed genetiken hos både moder- och fostrets påverkansfunktion1. Genetiska anomalier eller nedsatt funktion hos moderkakan kan drastiskt förändra fostrets utveckling. Tidigare forskning har visat att placentagenetik och utveckling är förknippade med den förändrade utvecklingen av specifika organsystem hos fostret. Särskilt avvikelser i moderkakan är kopplade till förändringar i fostrets hjärna, hjärta och kärlsystem 2,3,4,5.

Transporten av hormoner, tillväxtfaktorer och andra molekyler från moderkakan till fostret spelar en viktig roll i fostrets utveckling6. Det har visats att förändring av placentaproduktionen av specifika molekyler kan förändra neurodevelopment. Maternal inflammation kan öka produktionen av serotonin genom att förändra tryptofan (TRP) metaboliskt genuttryck i moderkakan, vilket därefter skapar en ansamling av serotonin i fostrets hjärna7. Andra studier har funnit placenta abnormiteter tillsammans med hjärtfel. Avvikelser i moderkakan tros bidra till medfödda hjärtfel, den vanligaste fosterskadan hos människor8. En ny studie har identifierat flera gener som har liknande cellulära vägar i både moderkakan och hjärtat. Om de störs kan dessa vägar orsaka defekter i båda organen9. Defekterna i moderkakan kan förvärra medfödda hjärtfel. Placentagenetikens och funktionens roll på utvecklingen av specifika fosterorgansystem är ett framväxande studieområde.

Möss har hemokorial placenta och andra egenskaper hos mänskliga placentor, vilket gör dem mycket användbara modeller för att studera mänsklig sjukdom1. Trots placentans betydelse saknas det för närvarande riktade genetiska manipulationer in vivo. Dessutom finns det för närvarande fler alternativ tillgängliga för knockouts eller knockdowns än överuttryck eller gain-of-function-manipulationer i placenta10. Det finns flera transgena Cre-uttryckande linjer för placentaspecifik manipulation, var och en i olika trofoblastlinjer vid olika tidpunkter. Dessa inkluderar Cyp19-Cre, Ada/Tpbpa-Cre, PDGFRα-CreER och Gcm1-Cre11,12,13,14. Även om dessa Cre-transgener är effektiva, kanske de inte kan manipulera vissa gener vid specifika tidpunkter. En annan vanlig metod för att antingen knockout eller överuttrycka placentagenuttryck är införandet av lentivirala vektorer i blastocystkulturen, vilket orsakar en trofoblastspecifik genetisk manipulation15,16. Denna teknik möjliggör en robust förändring i placentagenuttrycket tidigt i utvecklingen. Användningen av RNA-interferens in vivo har utnyttjats sparsamt i moderkakan. Införandet av shRNA-plasmider kan utföras på samma sätt som CRIPSR-tekniken som beskrivs i detta dokument. Detta har gjorts vid E13.5 för att framgångsrikt minska PlGF-uttrycket i moderkakan, med effekter på avkommans hjärnkärl17.

Förutom tekniker som främst används för knockout eller knockdown, induceras överuttryck vanligen med adenovirus eller införandet av ett exogent protein. De tekniker som används för överuttryck har varierande framgångsgrad och har mestadels utförts senare under graviditeten. För att undersöka rollen av insulinliknande tillväxtfaktor 1 (IGF-1) i placentafunktionen utfördes en adenoviralmedierad placentagenöverföring för att inducera överuttryck av IGF-1-genen 18,19. Detta utfördes sent i musdräktighet på E18.5 via direkt placentainjektion. För att tillhandahålla ytterligare alternativ och kringgå eventuella misslyckanden av etablerade placenta genetiska manipulationer, såsom Cre-Lox-kombinationsfel, adenovirusens möjliga toxicitet och off-target-effekterna av shRNA, kan in vivo direkt CRISPR-manipulation av moderkakan användas20,21,22. Denna modell utvecklades för att ta itu med bristen på överuttrycksmodeller och för att skapa en modell med flexibilitet.

Denna teknik är baserad på Lecuyer et al., där shRNA- och CRISPR-plasmider riktades direkt in vivo mot musplacenta för att förändra PlGF-uttryck 17. Denna teknik kan användas för att direkt förändra placenta genuttryck med hjälp av CRISPR-manipulation vid flera tidpunkter; för detta arbete valdes E12.5. Placentan har mognat vid denna tidpunkt och är tillräckligt stor för att manipulera, vilket möjliggör införandet av en specifik CRISPR-plasmid på E12.5, vilket kan ha en betydande inverkan på fostrets utveckling från mitten till sen graviditet23,24. Till skillnad från transgena metoder, men liknande virala induktioner eller RNA-interferens, möjliggör denna teknik överuttryck eller knockout vid vissa tidpunkter med hjälp av ett relativt avancerat kirurgiskt tillvägagångssätt, vilket undviker eventuell försämrad placentation eller embryonal dödlighet från tidigare förändringar. Eftersom endast ett fåtal placenta tar emot experimentell plasmid eller kontrollplasmid i en kull, möjliggör tillvägagångssättet två typer av interna kontroller. Dessa kontroller är de som injiceras och elektroporeras med lämplig kontrollplasmid och de som inte får någon direkt manipulation. Denna teknik optimerades för att skapa ett överuttryck av IGF-1-genen i musmoderkakan via en synergistisk aktiveringsmediator (SAM) CRISPR-plasmid. IGF-1-genen valdes, eftersom IGF-1 är ett viktigt tillväxthormon som levereras till fostret som främst produceras i moderkakan före födseln25,26. Denna nya placenta-riktade CRISPR-teknik kommer att möjliggöra direkt manipulation för att definiera sambandet mellan placentafunktion och fosterutveckling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla procedurer utfördes i enlighet med och överensstämmelse med federala bestämmelser och University of Iowa policy och godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee.

1. Djur och djurhållning

  1. Håll djuren i en 12 timmars dagsljuscykel med mat och vatten ad libitum.
  2. Använd CD-1 honmöss i åldern 8-15 veckor. Använd närvaron av en kopulatorisk plugg för att identifiera E0.5.
  3. På E0.5, ensam hus de gravida dammarna.

2. Kalibrering av mikropipetten

OBS: Kalibreringen av mikropipetten bör utföras före operationen när så är möjligt.

  1. Innan mikropipetten tillverkas och kalibreras, späd alla plasmider till rekommenderad koncentration (0,1 μg/μl) i DNasfritt vatten. Blanda plasmiden med lämpligt utspätt Fast Green-färgämne (1 μg/μl i PBS) (slutlig plasmidkoncentration: 0,06 μg/μl).
  2. Dra mikropipetter med 10 cm glaskapillärer med en ytterdiameter på 1,5 mm och en innerdiameter på 0,86 mm med en mikropipettavdragare.
  3. Bryt försiktigt av spetsen på en mikropipett (2-3 mm) med sterila pincett.
  4. Ladda mikropipetten i en mikrokapillärspets fäst vid en mikroinjektor. Se till att mikroinjektorn är ansluten till mikroinjektionsmaskinen och att det finns tillräckliga kvävehalter för att kalibrera mikropipetten.
  5. När mikropipetten är ansluten till mikroinjektorn, ladda den med Fast Green-färglösningen för att utföra kalibreringen (1 μg / μL i PBS). Kalibrera mikropipetten för att injicera en volym på ca 3,5 μl. Töm ("rensa") mikropipetten som förberedelse för laddning av plasmidlösningarna enligt nedan.
    OBS: Varje mikropipett kommer att vara något annorlunda. För att undvika att skada moderkakan under injektionen bör injektionstiden ställas in mellan 0,5-1,5 s. Trycket bör ställas in mellan 1-8,5 psi. Kalibrera varje mikropipett separat; Om mikropipetten inte kan kalibreras inom dessa parametrar ska den inte användas.

3. Kirurgi (figur 1A)

OBS: För att förbereda, rengör ytorna på både preparatet och kirurgiska områden med 70% etanol. Placera en absorberande underplatta i beredningsområdet. I operationsområdet, placera en värmedyna ner och placera sedan en absorberande underplatta ovanpå detta. Sterilisera alla verktyg före operationen. Tiden dammen är under anestesi bör vara under 1 h.

  1. Bedövning
    1. Administrera 5 mg/kg NSAID (meloxikam) eller annat godkänt smärtstillande medel till den gravida moderdjuret 30 minuter till 1 timme före operation.
    2. Placera den gravida moderdjuret i en induktionskammare fäst vid en isofluranförångare.
    3. Ställ in förångaren på 4% isofluran och 3,5 l/min syre.
    4. När bedövning har bekräftats av bristen på respons på en tåknäpa och en minskad andningsfrekvens, ta bort dammen från induktionskammaren till beredningsområdet.
  2. Kirurgisk förberedelse
    1. I beredningsområdet, placera dammen liggande med en näskon.
    2. Reducera förångaren till 2% isofluran och 3,5 l/min syre medan dammen sitter i noskonen.
    3. Raka dammens buk noggrant och ta bort överflödig päls. Alternativ beläggning av den rakade buken med povidonlösning och 70% etanol tre gånger med sterila bomullsspetsapplikatorer. Applicera slutlig beläggning av povidonlösning. För att förhindra hornhinnetorkning, placera konstgjord tårgel över båda ögonen på moderdjuret (figur 2A, B).
    4. Efter beredning, flytta dammen med näskonen till det angivna operationsområdet.
  3. Uterin laparotomi
    OBS: Använd sterila handskar under hela det kirurgiska ingreppet. Byt handskar om någon icke-steril yta kommer i kontakt.
    1. I operationsområdet, placera dammryggen och säkra näskonen på plats med tejp. Ställ värmedynan under absorbentdynan på 45 °C.
    2. Använd pincett och sax och gör ett snitt på ungefär 2 cm mittlinje genom huden. Använd pincett för att tälta huden och gör ett vertikalt snitt i huden. Efter detta, gör en annan liknande storlek snitt genom bukhinnan för att exponera livmoderhornen. Använd pincett och tält bukhinnan medan du gör det vertikala snittet (figur 2C, D).
      OBS: Underlåtenhet att tälta ordentligt medan du skär bukhinnan kan leda till ett dödligt snitt i tarmarna.
    3. Massera försiktigt livmoderhornen genom snittet genom att trycka på sidorna av buken. Gör detta genom att försiktigt styra livmodern utan verktyg, använd bara fingrarna för att undvika oavsiktlig skada. Placera den exponerade livmodern ovanpå ett sterilt kirurgiskt draperi som täcker moderdjurets buk och håll den fuktig under hela operationen med droppar steril saltlösning, som kan värmas till 30 °C före användning efter behov (figur 2E, F).
      NOTERA: Livmoderhornen kan identifieras på det sätt som beskrivs i Wang et al.27.
    4. När livmodern är exponerad, välj tre par placenta för manipulation.
      OBS: Placentorna kan identifieras enligt beskrivningen av Elmore et al.24. För att maximera embryonernas överlevnad bör högst 6 placenta behandlas. Om det finns färre än 12 embryon närvarande, bör högst 4 placenta injiceras. Välj två intilliggande placenta så att den ena får en kontrollinjektion och den andra tar emot den experimentella plasmiden. Användningen av två intilliggande placenta möjliggör en bättre jämförelse av placenta på liknande platser i livmodern och möjliggör också en ökad överlevnadshastighet. De valda placentaparen väljs slumpmässigt och fördelas över båda livmoderhornen (figur 1B).
    5. Registrera placeringen av placentamanipulationer och organisationen av embryona i livmoderhornen så att embryon och placenta kan identifieras under insamlingen, eftersom en moder kommer att bära både kontroll och experimentellt behandlade placenta / embryon.
  4. Placentainjektion och elektroporering av kontrollplasmiden
    OBS: För att upprätthålla en aseptisk teknik, sterilisera elektroporeringspaddlarna och mikroinjektorn med ett kallt sterilmedel före användning. Byt handskar om någon icke-steril yta kommer i kontakt.
    1. Fyll med hjälp av den kalibrerade mikropipetten en tillräcklig mängd av lämplig kontrollplasmid för tre injektioner. Utför alla injektioner på ett djup av ~ 0,5 mm lateralt i moderkakan mellan decidua (vit) och korsningszon (mörkröd) (figur 3A-F).
    2. Utför injektioner i de tre kontrollplacentorna.
      OBS: Utför alla kontrollplasmidinjektioner före de experimentella injektionerna för att undvika korskontaminering av plasmiderna med mikropipetten. Detta gör det möjligt att använda samma mikropipett, eftersom byte av mikropipetter och kalibreringstid drastiskt ökar operationstiden och minskar dammöverlevnaden.
    3. Utför elektroporering av kontrollplasmidinjicerade placenta inom 2 minuter efter injektionen.
    4. För elektroporering, använd ett par 3 mm paddlar anslutna till en elektroporeringsmaskin. För att säkerställa CRISPR-inkorporeringseffektivitet och livskraften hos embryon, använd följande elektroporeringsinställningar: 2 pulser, 30 V, 30 ms puls, 970 ms puls av, unipolär.
    5. Efter injektion men omedelbart före elektroporering, belägg kontaktställena med steril saltlösning, applicera saltlösningen exakt på de tre platserna på livmoderväggen och paddlarna med en droppare eller spruta.
    6. Tryck försiktigt på elektroporeringspaddlarna på placentans laterala sidor. Placera anodpaddeln över injektionsstället och katoden mitt emot (figur 4A–C).
    7. Tryck på pulsen på elektroporeringsmaskinen och vänta tills de två pulserna är klara innan du tar bort elektroporeringspaddlarna.
      OBS: En liten mängd vitt skum ses ofta mellan paddlarna och moderkakan under pulser. Om detta inte inträffar, kontrollera spänningen från paddlarna med en voltmeter före vidare användning. Om avläsningen på voltmätaren inte matchar elektroporeringsspänningsinställningen fungerar paddlarna inte.
  5. Placentainjektion och elektroporering av den experimentella plasmiden
    1. Följ samma instruktioner från steg 3.4.1. till steg 3.4.2. använda den experimentella plasmiden istället för kontrollplasmiden.
    2. Utför elektroporering av alla tre experimentellt injicerade placenta inom 2 minuter efter injektionen. Detta bör utföras på samma sätt som för dem som injiceras med kontrollplasmiderna. Följ steg 3.4.4. till steg 3.4.7.
  6. Slutförande av operationen
    1. När placentamanipulationen är klar, massera försiktigt livmoderhornen tillbaka inuti bukhålan med endast fingrarna (figur 5A).
    2. Utför först dubbelknutna enkla suturer på bukhinnans skikt med belagda och flätade upplösliga suturer som är 45 cm långa med en 13 mm 3/8c nållegering. Placera suturerna 2-3 mm från varandra (figur 5B).
    3. Efter suturering av bukhinnan, suturera huden med upplösliga suturer. Trippelknut de enkla suturerna 2-3 mm från varandra för att säkerställa att dammen inte kan ångra sutureringen (figur 5C).
    4. När sutureringen är klar, ställ in isofluran på 1 % och syret på 3,5 l/min och applicera vävnadslim på suturerna på huden (figur 5D).
      OBS: Vävnadslim är valfritt men rekommenderas för att förhindra återöppning av snittet på grund av dammtuggning.
    5. När vävnadslimmet har torkat, stäng av förångaren och ta bort dammen från operationsområdet. Placera dammen i en stödjande bur på ryggen.

4. Vård och övervakning efter operation

  1. Låt den dräktiga moderdjuret återhämta sig i en ren bur under övervakning i minst 30 minuter för att säkerställa att inga omedelbara komplikationer av operationen uppstår. Observera tills det är helt ambulerande och kan vända på fötterna utan hjälp. Ensam hus dammen efter operationen.
  2. Följ den institutionella postoperativa vården och övervakningen fram till embryosamlingen. Anteckna dammens vikt och övervaka suturerna och snittplatsen dagligen.

5. E14.5 placenta samling

  1. På E14.5, bedöva dammen djupt med en ketamin / xylazincocktail (1 mg / ml ketamin och 0,1 mg / ml xylazin) och förflytta sedan dammen cerviskt.
  2. Gör ett V-format snitt i dammens buk med sax och ta bort livmodern. Lägg omedelbart på en 5 cm petriskål på is. Ta försiktigt bort embryot och motsvarande placenta från livmodern med pincett.
    OBS: Håll ett register över embryots plats och motsvarande placenta i livmoderhornen för att avgöra vilken som fick direkt manipulation under operationen.
  3. Anteckna placentavikterna. Använd RNAse-fria pincett och rakhyvlar, skär placentan i hälften ner i mittlinjen. Lägg hälften i 4 % PFA vid 4 °C. Skär den återstående halvan på mitten igen och förvara de återstående två fjärdedelarna vid −80 °C i två rör, ett med RNA-lagringsreagens.
    OBS: Embryon och andra modervävnader kan förvaras från samlingen vid −80 °C för framtida bruk.

6. Analys av placenta genuttryck

  1. Använd den fjärdedel av moderkakan som lagrats vid −80 °C i RNA-lagringsreagens.
  2. Bearbeta placentorna för qPCR enligt beskrivningen i Elser et al. med hjälp av Trizol-metoden för RNA-isolering, en spektrofotometer för RNA-koncentration, ett cDNA-synteskit och qPCR med SYBR Green Master Mix28. I stället för Turbo DNAfree kit DNAse som refereras i Elser et al., använd ett RNAcleanup kit efter Trizol RNA-isoleringen för att säkerställa att proverna inte innehåller föroreningar28.
    Läs säkerhetsdatabladet (MSDS) för Trizol och använd det i en kemisk dragskåp.
  3. Bedöm plasmidinsättningen av kontrollplasmiden med GFP-primrar och av den experimentella plasmiden med BLAST-primrar (primrar listade i kompletterande tabell 1). Använd CT-värdet för att bestämma närvaron av plasmiden.
    CT-värden över 35 är falska positiva, och endast de under 35 bör betraktas som en positiv indikator på att plasmiden framgångsrikt infördes.
  4. Bedöm IGF-1 placentauttryck normaliserat till hushållningsgenen 18s (primers listade i kompletterande tabell 1). Använd ddCT-metoden för att beräkna vikningsförändringen och beräkna sedan den normaliserade vikningsförändringen för experimentproverna till den genomsnittliga vikningsförändringen för kontrollproverna.

7. Analys av placentaproteinnivå

  1. Använd den fjärdedel av moderkakan som har förvarats vid −80 °C. Homogenisera vävnaden i en buffertlösning gjord av 11,5 mM Tris HCl, 5 mM MgCl2 och 10 mM proteashämmare idiH2O med ett slutligt pH på 7,4. Använd en handhållen homogenisator och stöt för att bryta upp vävnaden.
    Anmärkning: Provet bör inte överstiga 10 % av buffertens volym.
  2. Späd de homogeniserade proverna i bufferten vid 1:12 så att de ligger inom det detekterbara intervallet för ett kit med bicinkonsyraanalys (BCA). Utför BCA-analysen enligt tillverkarens instruktioner och kvantifiera det totala proteinet med hjälp av en plattläsare.
  3. Efter att ha utfört BCA-analysen, normalisera alla prover till samma totala proteinkoncentration på 2 mg / ml för IGF-1 ELISA, som görs i Gumusoglu et al.29.
  4. Utför IGF-1 ELISA enligt tillverkarens instruktioner, och kvantifiera IGF-1 proteinnivåer med en plattläsare med hjälp av en standard koncentrationskurva.

8. Spatial CRIPSR-verifiering med fluorescerande in situ-hybridiseringsmärkning

  1. När placentahalvorna har fixerats korrekt i 4 % PFA vid 4 °C i 1–3 dagar, flytta dem till 20 % sackaros vid 4 °C innan de fryses in i optimal skärtemperatur (OCT).
  2. Skär de OCT-inbäddade placentahalvorna i en kryostat med −20 °C i sektioner av 10 μm och placera dem på objektglas som ska märkas. Dela placentahalvorna så att alla tre underregionerna är synliga. Förvara objektglasen vid −80 °C tills de används för in situ-hybridisering .
  3. Utför fluorescens in situ hybridisering (FISH) märkning enligt tillverkarens protokoll. Hybridisera en bild med en dCas9-3xNLS-VP64-sond och en andra "syster" -bild av samma placenta med en Prl8a8-sond.
    OBS: dCas9-3xNLS-VP64-sonden detekterar närvaron av överuttrycksplasmiden. Prl8a8-sonden belyser spongiotrofoblaster i korsningszonen, vilket gör att placentans delregioner kan identifieras. Dessa två sonder är märkta på separata "syster" -glas för att undvika störningar av flerkanalig fluorescens med den gröna autofluorescensen i placentorna.
  4. Märk båda proberna med detektionsfärgen (Opal 620). När du har slutfört tillverkarens protokoll för FISH, applicera DAPI-monteringsmedium och placera ett täckglas på bilden. Försegla täckglaset med klart nagellack.
  5. Avbilda objektglasen på ett upprätt sammansatt fluorescensmikroskop och bearbeta dem med hjälp av ett lämpligt bildbehandlingsprogram. Här användes programvaran CellSens.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Resultat av allmänna förfaranden (figur 6)
I studien fanns tre manipulerade grupper. Dessa inkluderade placenta injicerade med en allmän CRISPR Cas9-kontrollplasmid (Cas9 Control), en aktiveringskontroll CRISPR-plasmid (Act Control) eller en IGF-1 SAM-aktiveringsplasmid (Igf1-OE). Cas9-kontrollen är bättre lämpad för knockoutplasmider och aktiveringskontrollen är bättre lämpad för överuttrycks-/aktiveringsplasmider. För att bedöma de livskraftsförändringar som orsakas av manipulering av moderkakan via injektion och elektroporering analyserades embryoöverlevnaden inom kullen på E14.5 (figur 6A). Denna tidpunkt valdes eftersom andra studier som har utfört in vivo-insättning av CRISPR-plasmider med hjälp av elektroporering har visat att uttrycksförändringar kan uppnås inom 8-22 h30,31,32. Insamling vid E14.5 gör att CRISPR-plasmiden cirka 48 timmar kan integreras och aktivera en ökning av genuttrycket. Det visade sig att kirurgisk manipulation av dammen påverkade överlevnaden för alla embryon, men embryon associerade med de manipulerade placentorna som genomgick injektion och elektroporering hade signifikant minskat överlevnaden. Överlevnaden för de obehandlade embryona (i samma kull men inte utsatt för riktad manipulation) minskade från 100% överlevnad till i genomsnitt 79,05%. Det fanns en signifikant minskning av överlevnaden hos de manipulerade embryona, med en genomsnittlig överlevnad på 55,56%. Ingen signifikant skillnad hittades mellan de tre manipulerade grupperna.

För att bestämma om signifikanta bruttoförändringar inträffade i de manipulerade placentorna registrerades placentavikten. Det fanns ingen signifikant skillnad i någon grupps placentavikt (figur 6B), och det grova utseendet på placentan och embryot var oförändrat. Representativa postnekroskopibilder togs på ett dissektionsmikroskop vid insamling på E14.5. Bilder togs av moderkakan/embryon från olika behandlingsgrupper, alla inom samma kull. Det fanns ingen märkbar skada eller förändring i fenotypiskt utseende i någon behandlingsgrupp varken i fostersäcken eller det exponerade embryot och dess motsvarande placenta (figur 6D-I). Även om inga grova skillnader sågs i morfologin hos de manipulerade grupperna med användning av en IGF-1-aktiveringsplasmid, kan detta inte vara sant för andra experimentella plasmider som riktar sig mot andra gener som mer väsentligt kan påverka viktiga tillväxt- och funktionsregulatorer i moderkakan eller embryot. Inga skillnader hittades i något mått mellan placentorna Cas9 Control och Act Control. Därför kombinerades dessa två grupper och kallades Con eller Controls för alla analyser. Dessa resultat visar att manipulation av placenta in utero på E12.5 med hjälp av denna teknik orsakar en minskning av embryoöverlevnaden, men det finns fortfarande betydande livskraft. Resultaten visar också att placentatillväxten totalt sett inte påverkas signifikant, eftersom det inte fanns någon signifikant viktförändring mellan de manipulerade och obehandlade placentorna. Detta visar att den föreslagna tekniken kan möjliggöra överlevnad av friska och livskraftiga CRISPR-manipulerade placenta och deras motsvarande embryon.

Förändring av modervikt registrerades varje dag efter operationen före embryoinsamling på E14.5 (figur 6C). Operationen ägde rum på E12.5, så alla dammviktförändringar listas i förhållande till vikten på E12.5. De experimentella (Exp) dammarna genomgick placentamanipulation, medan skendammar genomgick anestesi och en laparotomi av liknande varaktighet utan placentamanipulation. Många dräktiga moderdjur uppvisade en liten minskning eller ingen viktförändring dagen efter ingreppet (E13.5). Detta berodde sannolikt på stört ätande under och kort efter operationen. De flesta dammar visade ökad vikt på E14.5, men ibland observerades fortfarande en viktminskning. Spårning av moderns modervikt efter operationen möjliggjorde övervakning av embryoöverlevnad. Variation mellan de dräktiga moderdjurens vikt efter operationen var vanlig och tydde inte på att alla behandlade embryon förlorades. Det fanns inga signifikanta skillnader i viktförändringar efter operationen i bluffen jämfört med experimentella dammar. Detta visar att dammens välbefinnande i allmänhet bevarades efter införandet av CRISPR-plasmiderna i moderkakan. Sammantaget visar detta att även om denna kirurgiska teknik kan orsaka en minskning av embryons livskraft, ger den fortfarande en betydande andel friska avkommor som kan användas för studien.

Analys av uttryck och CRISPR-inkorporering i E14.5-placenta (figur 7)
För att avgöra om den cellulära insättningen av IGF-1-aktiveringsplasmiden lyckades överuttrycka IGF-1 utfördes qPCR. Som förväntat visade qPCR en signifikant ökning av IGF-1-uttryck i IGF1-OE-placentorna jämfört med kontrollplacentorna när vikningsförändringen normaliserades till 18s-uttryck (Welchs t-test, p = 0,0302) (figur 7A). För att avgöra om IGF-1-proteinnivåerna förändrades utfördes en ELISA på moderkakan från alla grupper. I överensstämmelse med qPCR visade ELISA-bedömningen av E14.5-placentan en signifikant ökning av IGF-1-proteinnivåerna i IGF1-OE-placentorna jämfört med kontrollplacentorna (Welchs t-test, p = 0,0469) (figur 7B). qPCR och ELISA visade att överuttrycksplasmiden framgångsrikt ökade IGF-1-genuttrycket respektive IGF-1-proteinproduktionen.

För att säkerställa att tillförseln av plasmiden var specifik för de manipulerade placentorna utfördes qPCR för den specifika IGF-1-aktiveringsplasmiden och CRISPR Cas9 Control-plasmiden . Dessa qPCR utfördes på både de manipulerade placentorna och de obehandlade placentorna som låg intill de injicerade. De qPCR-primrar som används för att bedöma aktiveringsplasmiduttrycket riktade sig mot en sekvens av BLAST-plasmiden, som är en del av aktiveringssystemet (figur 7C). De obehandlade placentorna visade ingen närvaro av BLAST-plasmiden (cykeltröskeln [CT] obestämd, märkt som 40 på diagrammet), och Igf1-OE-placentorna visade en CT runt 30. Den qPCR som utfördes för att bedöma kontrollplasmiduttrycket riktade sig mot en sekvens från den infogade GFP-genen (figur 7D). De obehandlade placentorna visade CT-värden över 35, troligen orsakade av primerdimerisering, eftersom dessa värden ligger utanför ett förväntat uttrycksområde. Kontrollerna visade ett CT-värde på cirka 30. Dessa qPCR fungerar som en kvalitetskontroll för att visa det förväntade överuttrycket av IGF-1 eller brist på sådant och att plasmiderna endast finns i de förväntade manipulerade placentorna.

Rumslig verifiering av IGF-1-aktiveringsplasmiden utfördes med placentasektioner. Placentas som fixerades och frystes i OCT-förening snittades seriellt vid 10 μm på objektglas så att alla lager var synliga. Glasen frystes sedan vid -80 ° C tills de användes för FISH-märkning. För att verifiera var i moderkakan IGF-1 CRISPR-aktiveringsplasmiden införlivades användes en dCas9-3xNLS-VP64-sond med röd fluorescerande märkning. Denna sond riktar sig mot en funktionell komponent i aktiveringssystemet. Grön autofluorescens användes för att demonstrera subregionerna i placenta-gränssnittet mellan moder och foster (figur 7E, F). Ingen dCas9-3xNLS-VP64 detekterades i de obehandlade placentorna, eftersom de inte hade behandlats med CRISPR-manipulation (figur 7E). Som förväntat visade IGF1-OE-placentorna märkning för dCas9-3xNLS-VP64, som visas i rött (figur 7F). CRISPR-inkorporering hittades i alla tre delregionerna i moderkakan, med den tydligaste märkningen av korsningszonen (figur 7E). Fluorescensintensiteten för dCas9-3xNLS-VP64-märkningen varierade över de plasmidbehandlade placentorna, vilket indikerar att vissa uttryckte plasmiden högre än andra, och det fanns variationer i märkningens exakta plats / omfattning, men märkning var generellt närvarande i alla underregioner. För att bekräfta placeringen av dCas9-3xNLS-VP64-märkningen utfördes Prl8a8 FISH-märkning riktad mot spongiotrofoblaster för att märka den mellersta korsningsunderregionen (figur 7G,H). Detta utfördes i angränsande sektioner från samma placenta på en "syster" -bild av sektionerna som var märkta för dCas9-3xNLS-VP64. Som förväntat var strukturen indikerad av Prl8a8-märkning liknande mellan IGF1-OE och obehandlade placentor. Decidua och labyrintzonen kunde identifieras med de blå kärnorna (DAPI) som omger den röda korsningszonen (figur 7G, H). FISH-märkningen av dCas9-3xNLS-VP64 klargjorde att plasmiden infördes i alla tre underregionerna, och detta bekräftades med Prl8a8-märkning. Resultaten av FISH-märkningen bekräftade att införlivandet av IGF-1-aktiveringsplasmiden var framgångsrik och plasmiden migrerade inte till obehandlade placentor.

Figure 1
Figur 1: Schematisk beskrivning av protokollet . (A) Förenklad schematisk bild av det kirurgiska ingreppet. Kronologisk ordning över de viktigaste stegen i tekniken. (B) Schematisk som visar ett exempel på manipulerat placentaavstånd i livmoderhornen. Båda panelerna skapades med BioRender.com. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Förfarande för livmoderlaparotomi. (A-B) Under förberedelse av operationen, (A) den rakade buken på en moder och (B) det rakade området belagt med jodlösning. (C-F) I operationsområdet, (C) ett ~ 2 cm snitt i bukhuden och (D) ett ~ 2 cm snitt i bukhinnan; Tarmarna är synliga. (E) Manipulera livmoderhornen genom snittstället. Livmoderhorn är synliga. (F) Helt exponerade livmoderhorn placerade på ett sterilt kirurgiskt draperi. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Injektion av CRISPR-plasmider i E12.5-placentor. (A,B) Orientering av embryon och moderkakan i livmoderhornen. (A) Sned vy av ett märkt livmoderhorn som visar decidua, fosterzoner och ett embryo. Den streckade linjen representerar var injektionsstället ska vara. B) Ett omärkt livmoderhorn från panel A. (C,D) Sidovy av mikropipetten som sätts in i injektionsstället i moderkakan. D är decidua, FZ är fosterzonerna, E är embryot och den streckade linjen representerar injektionsställets plats. (D) Omärkt bild av införandet av mikropipett från panel C. (E,F) Sidovy av färgämne i moderkakan efter injektion. E) Märkt bild av ett livmoderhorn som visar en moderkaka som har injicerats med en CRIPSR-plasmid som innehåller ett synligt färgämne och en placenta som inte har injicerats. (F) Omärkt bild av livmoderhornet i panel E. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Elektroporering av E12,5 placenta efter injektion av CRISPR-plasmider. (A) Ovanifrån av placenta i ett livmoderhorn. Anod- och katodelektroporeringspaddlarna är märkta och den vita pilen anger injektionsställets placering. (B) Sned vy av elektroporering av en placenta. (C) Sidovy av elektroporering av en placenta. (D-F) Förenklad disposition av panelerna A, B och C. Anod- och katodpaddlarna är märkta, P är moderkakan, E är embryot och det omärkta området är livmodern. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: Suturering av bukhud och bukhinnan . (A) Livmoderhorn återvände till buken efter avslutad operation. Bukhud och bukhinnan snitt är synliga. (B) Peritoneum snitt helt suturerad. (C) Snitt av bukhuden helt suturerat. (D) Applicering av vävnadslim på suturer i bukhuden. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 6
Figur 6: Allmänna procedurresultat. (A) Embryoöverlevnad efter operation samlad på E14.5, 2 dagar efter proceduren. En signifikant minskning av överlevnaden observerades i de manipulerade grupperna jämfört med de obehandlade embryona (Mann-Whitney U-test: Obehandlad vs. Cas9-kontroll, p = 0,0077; Obehandlad kontra Act Control, p = 0,0330; och Obehandlad jämfört med IGF1-OE, p = 0,0032). Inga signifikanta skillnader observerades i överlevnaden för de manipulerade grupperna (enkelriktat ANOVA, p = 0,9454). Varje punkt representerar överlevnadsprocenten från en enda kull (Obehandlad n = 22, Cas9 Control n = 9, Act Control n = 13 och IGF1-OE n = 22 kullar). (B) Placentavikt hos de överlevande embryona på E14.5 (enkelriktad ANOVA, p = 0,1436) (Obehandlad n = 138, Cas9 Control n = 15, Act Control n = 20 och IGF1-OE n = 36 placentor). (C) Förändringar av dammens vikt efter operationen på E13.5 och E14.5 som ses hos moderdjur som genomgick en falsk laparotomiprocedur eller genomgick experimentell (Exp) placentamanipulation. Ingen signifikant skillnad ses mellan de två grupperna av moderdjurs viktförändringar efter operationen (oparade t-tester: E13,5 p = 0,5452 och E14,5 p = 0,2493) (Sham dams n = 3 och Exp dammar n = 10). Alla felstaplar representerar SEM. (D-F) Bilder av E14.5-embryon efter nekroskopi i fostersäcken med moderkakan fortfarande fäst. (F) Skalstapeln längst till höger representerar 3,75 mm. (G-I) Sned bild av embryot och ovanifrån av motsvarande placenta. (I) Skalstapeln längst till höger representerar 3,75 mm. (D-I) Alla etiketter för behandlingsgrupper listas under bilderna. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 7
Figur 7: Analys av uttryck och CRISPR-inkorporering i E14.5-placentor. (A) qPCR-analys av IGF-1-uttryck i E14.5-kontroll och IGF1-OE-placentor. En signifikant ökning av IGF-1-uttryck normaliserat till 18s-uttryck observerades i IGF1-OE-placentorna (Welchs t-test, p = 0,0302) (kontroll n = 15 och IGF1-OE n = 20 placentor). (B) ELISA av IGF-1-proteinnivåer i E14.5-kontroll och IGF1-OE-placentor. En signifikant ökning av IGF-1-nivåer observerades i IGF1-OE-placentorna jämfört med kontrollnivåer (Welchs t-test, p = 0,0469) (kontroll n = 13 och IGF1-OE n = 15 placentor.) c) qPCR-analys av BLAST-sekvensen från IGF-1 SAM-plasmiden. Uttrycket av BLAST hittades endast i IGF1-OE-placentan, och inget / obestämt uttryck hittades i de obehandlade placentorna (Obehandlad n = 4 och IGF1-OE n = 9 placentor). (D) qPCR-analys av GFP-sekvensen från CRISPR Cas9-kontrollplasmiden. Uttryck av plasmiden hittades i kontrollplacentorna och CT-värden över 35/falskt positiva resultat hittades i de obehandlade proverna (obehandlad n = 4 och kontroll = 5 placentor). Den streckade linjen representerar det falska positiva tröskelvärdet vid 35 CT. Varje datapunkt är från en placenta. Alla felstaplar representerar SEM. (E-H) fluorescens in situ hybridisering av E14.5 placenta sektioner vid 10 μm tjocklek. (E) Obehandlade och (F) IGF1-OE placenta sektioner med en dCas9-3xNLS-VP64 sond märkt i rött. Den röda signalen finns endast i IGF1-OE-placentan. Den gröna signalen är autofluorescens som används för att identifiera placenta-underregionerna. (G) Obehandlade och (H) IGF1-OE placenta sektioner med en Prl8a8 sond märkt i rött för att identifiera spongiotrofoblaster i den mellersta korsningszonen. DAPI i blått visar decidua och labyrintzoner som omger den korsningszonen. (H) Skalstapeln längst till höger representerar 2 mm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Kompletterande tabell 1: Primers som används i denna studie. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Placentan är en primär regulator för fostrets tillväxt, och som tidigare nämnts kan förändringar i placenta genuttryck eller funktion väsentligt påverka fostrets utveckling6. Protokollet som beskrivs här kan användas för att utföra en riktad in vivo CRISPR-manipulation av musmoderkakan med hjälp av ett relativt avancerat kirurgiskt tillvägagångssätt. Denna teknik möjliggör ett betydande utbyte av livskraftiga embryon och deras motsvarande placenta som kan användas för vidare studier (figur 6A, B). Denna teknik gjorde det möjligt för oss att framgångsrikt överuttrycka placenta IGF-1 på E14.5 (figur 7A, B). De plasmider som användes visade specificitet, eftersom de införda plasmiderna förblev i de manipulerade placentorna och inte fanns i de intilliggande obehandlade placentorna (figur 7C,D). Den rumsliga fördelningen av IGF-1-aktiveringsplasmiden bekräftades av FISH för dCas9-3xNLS-VP64 och Prl8a8, vilket visade att aktiveringsplasmiden var närvarande i de tre underregionerna av IGF1-OE-placentorna och inte i några underregioner av de obehandlade placentorna (figur 7E-H). Denna teknik kan användas för att förändra placenta genuttryck på sätt som kanske inte är möjliga med tidigare tekniker. Användningen av denna teknik kommer att möjliggöra en större förståelse för påverkan av placenta genuttryck och funktion på fostrets utveckling i flera sammanhang.

För att optimera framgången för denna procedur för moderns och fostrets resultat undersöktes effekterna av att ändra flera parametrar, inklusive injektions- och elektroporeringsinställningarna, liksom de material som används. För att öka dammens överlevnad och återhämtning fann man att tiden under anestesi inte skulle överstiga 1 h, eftersom längre operationsperioder signifikant minskade överlevnaden. Om tiden under anestesi når cirka 2 timmar minskar sannolikheten för överlevnad dramatiskt till nivåer under 20%, sannolikt på grund av de negativa effekterna av förlängd tid under isofluran. Annat än tiden under anestesi, var den vanligaste komplikationen av kirurgi som ledde till moderns död misslyckandet med att ordentligt tälta bukhinnan medan du gjorde hud- och bukhinnesnitten. Om bukhinnan inte är ordentligt tältad kan tarmarna skadas, vilket kan orsaka dödsfall dagarna efter operationen. Den tid livmodern exponeras påverkar också överlevnaden av moder och embryon. Den genomsnittliga tiden livmodern exponerades i framgångsrika experiment var cirka 15 minuter; Över 30 minuters exponering kan leda till ökad resorption och eventuell sjukdom hos modern. Den exponerade livmodern och andra exponerade organ (ofta tarmar) måste hållas fuktiga, men för mycket saltlösning kan kyla djuret. Vid periodisk fuktning av de exponerade organen bör mindre än 1 ml steril saltlösning användas.

Parametrarna för injektion och elektroporering påverkade i hög grad embryoöverlevnaden. Insprutningsvolymen bör inte överstiga cirka 4,5 μl, eftersom detta resulterade i resorptioner. Injektionstiden och trycket är viktiga för att maximera överlevnaden; Injektionstiden bör ställas in mellan 0,5 s och 1,5 s, även om 0,8 s verkade optimalt. Trycket bör ställas in mellan 1-8,5 psi. Låg embryoöverlevnad sågs med låga injektionstider och höga PSI-nivåer för injektion. Det observerades också att om mikropipetten var för trubbig kunde det finnas en minskning av embryonal livskraft, och lösningen kommer också ofta att läcka ut ur mikropipetten. Den typ av färgämne som används för att visualisera injektionerna kan påverka överlevnaden. Methylenblått ledde till mödradöd när det användes för detta ändamål, men en filtrerad Fast Green-färglösning visade inga negativa effekter på moderns hälsa. Elektroporeringsinställningarna optimerades från de rekommenderade tillverkarinställningarna baserat på tidigare elektroporeringsstudier in vivo33. Elektroporering visade sig vara den manipulation som orsakade mest skada och minskad embryoöverlevnad. De rekommenderade in vivo embryoelektroporeringsinställningarna föreslår fyra pulser för att maximera CRISPR-effektiviteten, men två pulser rekommenderas för en högre överlevnad33. Det visade sig att fyra pulser orsakade nästan alla embryon att resorbera. Två pulser möjliggjorde ökad livskraft samtidigt som CRISPR-effektiviteten bibehölls. Storleken på elektroporeringspaddeln påverkade också embryoöverlevnaden avsevärt. Det visade sig att 5 mm elektroporeringspaddlar ledde till nästan fullständig resorption när de användes med de rekommenderade inställningarna. Faktum är att 3 mm elektroporeringspaddlar rekommenderas i tillverkarens guide och ökar embryots livskraftavsevärt 33. Det är också viktigt att notera att många elektroporeringspaddlar har vissa pulsliv. Efter att de har använts till detta maximala kan en minskning av kvaliteten ses. Detta kan identifieras om det inte bildas ett litet vitt skum mellan paddlarna och moderkakan under en puls. Elektroporeringspaddelspänningen kan kontrolleras med en voltmeter för att avgöra om den producerar den förväntade spänningen.

Denna studie är begränsad på några sätt. Denna teknik är tidsspecifik och utförs troligen bäst tidigast E10.5 och senast E16.5. Detta beror på att moderkakan är för liten före E10.5, och efter E16.5 kanske plasmiden inte har tillräckligt med tid för att producera önskad effekt. Denna tidsram innebär att denna teknik är bättre lämpad för specifika typer av studier på möss. Denna teknik är användbar för att studera neurodevelopment, eftersom E12.5 faller inom en avgörande tid för neurogenes för många strukturer i hjärnan34. Denna teknik kanske inte är användbar för att studera placentapåverkan på de tidiga utvecklingsstadierna, såsom neural plattbildning, som äger rum på E8.535. Resultaten av en knockout CRISPR-plasmid är inte kända vid denna tidpunkt; Tillämpningen av denna metod för minskning av genuttryck behöver undersökas ytterligare eftersom endast överuttryck/aktivering av en gen har påvisats. Trots detta förväntas denna teknik också vara framgångsrik för införandet av en knockout CRISPR-plasmid.

Denna teknik kan också möjliggöra möjligheten att utföra en primär kultur av genetiskt modifierad placentavävnad36. Beroende på vilken typ av CRISPR som används, såsom CRISPRi och CRISPRa, kan en primärkultur användas för att utföra en räddningsstudie37,38. Denna teknik kan också användas för att ytterligare utforska kopplingar mellan placenta genetiska och funktionella avvikelser och problem hos avkomman. Specifikt fann en tidigare studie en signifikant korrelation mellan placentaspecifika genomiska riskpoäng och schizofreni risker39. Denna studie identifierade många placenta gener som kan spela en roll i schizofreni utveckling som inte har undersökts i djurmodeller. Denna teknik lämpar sig för ytterligare studier av denna typ och andra.

Kunskapen från CRISPR-modifiering av moderkakan kan översättas till en rad olika biomedicinska tillämpningar. Studier som identifierar hur specifikt genuttryck i moderkakan kan påverka fostrets utveckling kan användas för att skapa placenta-riktade farmakologiska ingrepp som kan behandla dessa avvikelser. Behandlingar riktade direkt till ett foster kan vara svåra och farliga40,41. Placentan är ett mer tillgängligt mål för behandling. Vid utvecklingsproblem i hjärtat eller hjärnan som kan modifieras prenatalt, är direkt hjärt- eller hjärnmanipulation hög risk. Sådan risk kan undvikas med placentaintervention, vilket är mer troligt och kan leda till förebyggande strategier för utvecklingsneurologiska störningar för vilka den molekylära miljön, som delvis tillhandahålls av moderkakan, kan vara kritisk5. Denna teknik kan också användas för att behandla sjukdomar som medfödd hjärtsjukdom, som har kopplats till placenta störningar9. Eftersom medfödd hjärtsjukdom är en vanlig fosterskada kan möjligheten till en placentainterventionsbehandling ha en betydande inverkan8. Eftersom moderkakan har många funktioner kan denna teknik användas för att främja utvecklingen av interventioner för flera sjukdomar. Sammantaget kan denna placenta riktade teknik användas för att främja förståelsen av påverkan av placenta genetik och funktion på flera områden av fostrets utveckling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Författarna erkänner följande finansieringskällor: R01 MH122435, NIH T32GM008629 och NIH T32GM145441. Författarna tackar Dr. Val Sheffield och Dr. Calvin Carters laboratorier vid University of Iowa för användningen av deras operationsrum och utrustning, liksom Dr. Eric Van Otterloo, Dr. Nandakumar Narayanan och Dr. Matthew Weber för deras hjälp med mikroskopi. Författarna tackar också Dr. Sara Maurer, Maya Evans och Sreelekha Kundu för deras hjälp med pilotoperationerna.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 ml Tubes USA Scientific Inc 1615-5500
4% Paraformeldhyde (PFA) in PBS Thermo Fisher Scientific J61899.AP
96 Well plate Cornings 3598 For BCA kit
Absorbent Underpads Fisher Scientific 14-206-62
Activation Control Plasmid Santa Cruz Biotechnology sc-437275 Dnase-free water provided for dilution
AMV Reverse Transcriptase New England Biolabs M0277L Use for cDNA synthesis
Anesthetic Gas Vaporizor Vetamac VAD-601TT VAD-compact vaporizer
Artifical Tear Gel Akorn NDC 59399-162-35
BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific 23227 Protein quantification
Biovortexer Bellco Glass, Inc. 198050000 Hand-held tissue homogenizer
CellSens Software Olympus V4.1.1 Image processing to FISH images.
Centrifuge 5810 Eppendorf EP022628168 Plate centrifuge
Chloroform Thermo Fisher Scientific J67241-AP RNA isolation
Cotton Tipped Applicators ProAdvantage 77100 Sterilize before use
CRISPR/Cas9 Control Plasmid Santa Cruz Biotechnology sc-418922 Dnase-free water provided for dilution
CryoStat Leica CM1950
Dissection Microscope Leica M125 C Used for post-necroscopy imaging
Dissolvable Sutures Med Vet International J385H
Distilled Water Gibco 15230162
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) Thermo fisher Scientific 14190144 (-) Calcium; (-) Magnesium
ECM 830 Electro Electroporator (Electroporation Machine) BTX Harvard Apparatus 45-0662 Generator only
Electric Razor Wahl CL9990 Kent Scientific
Electroporation paddles/Tweezertrodes BTX Harvard Apparatus 45-0487 3 mm diameter paddles; wires included
Embedding Cassette: 250 PK Grainger 21RK94 Placenta embedding cassettes
Ethanol Thermo Fisher Scientific 268280010
F-Air Canisters Penn Veterinary Supply Inc BIC80120 Excess isoflurane filter
Fast Green Dye FCF Sigma F7252-5G Dissolve to 1 μg/ml and filter; protect from light
Filter-based microplate photometer (plate reader) Fisher Scientific 14377576 Can be used for BCA and ELISA
Forceps VWR 82027-386 Fine tips, straight, serrated
Formalin solution, neutral buffered, 10% Sigma Aldrich HT501128
Glass Capillaries - Borosilicate Glass (Micropipette) Sutter Instrument B150-86-10 O.D.: 1.5 mm, I.D.: 0.86 mm, 10 cm length
Halt Protease and Phosphotase inhibitor cocktail (100x) Thermo Scientific 1861281 Protein homogenization buffer
Heating Pad Thermotech S766D Digitial Moist Heating Pad
Hemostats VWR 10806-188 Fully surrated jaw; curved
Hot Water Bath Fisher Scientific 20253 Isotemp 205
Igf-1 SAM Plasmid (m1) Santa Cruz Biotechnology sc-421056-ACT Dnase-free water provided for dilution
Induction Chamber Vetamac 941443 No specific liter size required
Isoflurane Piramal Pharma Limited NDC 66794-013-25
Isoproponal/2-Proponal Fisher Scientific A451-4 RNA isolation
Ketamine HCl 100mg/ml Akorn NDC 59399-114-10
MgCl2/Magneisum Chloride Sigma Aldrich 63069-100ML 1M. Protein homogenization buffer
MicroAmp™ Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode Fisher Scientific 4309849 Barcoded plates not required
Microcapillary Tip Eppendorf 5196082001 Attached to BTX Microinjector
Microinjector BTX Harvard Apparatus 45-0766 Stainless Steel Pipette Holder, 130 mm Length, for 1 to 1.5 mm Pipettes
Microject 1000A (Injection Machine) BTX Harvard Apparatus 45-0751 MicroJect 1000A Plus System
Micropipette Puller Model P-97 Sutter Instrument P-97 Flaming/Brown type micropipette puller
Microplate Mixer (Plate Shaker) scilogex 822000049999
Mouse/Rat IGF-I/IGF-1 Quantikine ELISA Kit R & D Systems MG100
Needles BD - Becton, Dickson, and Company 305106 30 Gx 1/2 (0.3 mm x 13 mm)
Nitrogen Tank Linde 7727-37-9 Any innert gas
Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drug (NSAID) Norbrook Laboratories Limited NDC 55529-040-10 Analesgic such as Meloxicam
Nose Cone Vetamac 921609 9-14 mm
Opal 620 detection dye Akoya Biosciences SKU FP1495001KT Used for FISH
Optimal Cutting Temperature (O.C.T) Compound Sakura 4583
Oxygen Tank Linde 7782 - 44 - 7 Medical grade oxygen
Pestles USA Scientific Inc 14155390
Povidone-Iodine Solution, 5% Avrio Health L.P. NDC 67618-155-16
Power SYBR™ Green PCR Master Mix Thermo Fisher Scientific 4367659 Use for qPCR
Random Hexamers (Random Primers) New England Biolabs S1330S Use for cDNA synthesis
Razor Blade Grainger 26X080
RNA Cleanup Kit & Concentrator Zymo Research R1013
RNALater Thermo Fisher Scientific AM7021
RNAscope kit v.2.5 Advanced Cells Diagnostics 323100 Contains all reagents required for fluorescent in situ hybridization. Probes sold separately.
RNAscope™ Probe- Mm-Prl8a8-C2 Advanced Cells Diagnostics  528641-C2
RNAscope™ Probe- Vector-dCas9-3xNLS-VP64 Advanced Cells Diagnostics 527421
Roto-Therm Mini Benchmark R2020 Dry oven for in situ hybridization
Scissors VWR 82027-578 Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4¹/?
Sodium Chloride (Saline) Hospra NDC 0409-4888-03 Sterile,  0.9%
Sodium Citrate, Trisodium Salt, Dihydrate, [Citric Acid, Trisodium Dihydrate] Research Product International 03-04-6132
Sodium Hydroxide 1N Concentrate, Fisher Chemical Fisher Scientific SS277 Protein homogenization buffer
Steamer Bella B00DPX8UBA
Sterile Surgical Drape Busse 696 Sterilize before use
Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
Surgipath Cover Glass 24x60 Leica 3800160
Syringes BD - Becton, Dickson, and Company 309659 BD Luer Slip Tip Syringe sterile, single use, 1 mL
Thermo Scientific™ Invitrogen™ Nanodrop™ One Spectrophotometer with WiFi and Qubit™ 4 Fluorometer Fisher Scientific 13-400-525 This configuration comes with Qubit 4 fluorometer.  Qubit quantification not required.
Tissue Adhesive 3M 1469SB VetBond
Tris HCl Thermo Fisher Scientific 15568025 1M. Protein homogenization buffer
TRIzol™ Reagent Thermo Fisher Scientific 15596018 RNA isolation
TSA Buffer Pack Advanced Cells Diagnostics 322810 Used to dilute Opal 620 detection dye
Universal F-Circuit Vetamac 40200 Attached to vaporizer and vaporizer accessories
Upright Compound Fluorescence Microscope Olympus BX61VS Used for FISH imaging
Vectorshield with DAPI Vector Laboratories H-1200 Coverslip mounting media
ViiA™ 7 Real-Time PCR System with 384-Well Block Thermo Fisher Scientific 4453536 This is for SYBR 384-well block detection.  TaqMan and/or smaller blocks available
Wet n Wild Nail Polish Wild Shine, Clear Nail Protector, Nail Color Amazon C450B
Xylazine 20mg/ml Anased 343730_RX

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cross, J. C., et al. Genes, development and evolution of the placenta. Placenta. 24 (2-3), 123-130 (2003).
  2. Perez-Garcia, V., et al. Placentation defects are highly prevalent in embryonic lethal mouse mutants. Nature. 555 (7697), 463-468 (2018).
  3. Rosenfeld, C. S. The placenta-brain-axis. Journal of Neuroscience Research. 99 (1), 271-283 (2021).
  4. Maslen, C. L. Recent advances in placenta-heart interactions. Frontiers in Physiology. 9, 735 (2018).
  5. Kundu, S., Maurer, S. V., Stevens, H. E. Future horizons for neurodevelopmental disorders: Placental mechanisms. Frontiers in Pediatrics. 9, 653230 (2021).
  6. Woods, L., Perez-Garcia, V., Hemberger, M. Regulation of placental development and its impact on fetal growth-new insights from mouse models. Frontiers in Endocrinology. 9, 570 (2018).
  7. Goeden, N., et al. Maternal Inflammation disrupts fetal neurodevelopment via increased placental output of serotonin to the fetal brain. Journal of Neuroscience. 36 (22), 6041-6049 (2016).
  8. vander Bom, T., et al. The changing epidemiology of congenital heart disease. Nature Reviews Cardiology. 8 (1), 50-60 (2011).
  9. Wilson, R. L., et al. Analysis of commonly expressed genes between first trimester fetal heart and placenta cell types in the context of congenital heart disease. Scientific Reports. 12 (1), 10756 (2022).
  10. Renaud, S. J., Karim Rumi, M. A., Soares, M. J. Review: Genetic manipulation of the rodent placenta. Placenta. 32, S130-S135 (2011).
  11. Wenzel, P. L., Leone, G. Expression of Cre recombinase in early diploid trophoblast cells of the mouse placenta. Genesis. 45 (3), 129-134 (2007).
  12. Zhou, C. C., et al. Targeted expression of Cre recombinase provokes placental-specific DNA recombination in transgenic mice. PLoS One. 7 (2), e29236 (2012).
  13. Wattez, J. S., Qiao, L., Lee, S., Natale, D. R. C., Shao, J. The platelet-derived growth factor receptor alpha promoter-directed expression of cre recombinase in mouse placenta. Developmental Dynamics. 248 (5), 363-374 (2019).
  14. Nadeau, V., et al. Map2k1 and Map2k2 genes contribute to the normal development of syncytiotrophoblasts during placentation. Development. 136 (8), 1363-1374 (2009).
  15. Chakraborty, D., Muto, M., Soares, M. J. Ex vivo trophoblast-specific genetic manipulation using lentiviral delivery. BioProtocol. 7 (24), e2652 (2017).
  16. Okada, Y., et al. Complementation of placental defects and embryonic lethality by trophoblast-specific lentiviral gene transfer. Nature Biotechnology. 25 (2), 233-237 (2007).
  17. Lecuyer, M., et al. a placental marker of fetal brain defects after in utero alcohol exposure. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 44 (2017).
  18. Jones, H. N., Crombleholme, T., Habli, M. Adenoviral-mediated placental gene transfer of IGF-1 corrects placental insufficiency via enhanced placental glucose transport mechanisms. PLoS One. 8 (9), e74632 (2013).
  19. Jones, H., Crombleholme, T., Habli, M. Regulation of amino acid transporters by adenoviral-mediated human insulin-like growth factor-1 in a mouse model of placental insufficiency in vivo and the human trophoblast line BeWo in vitro. Placenta. 35 (2), 132-138 (2014).
  20. Song, A. J., Palmiter, R. D. Detecting and avoiding problems when using the Cre-lox system. Trends in Genetics. 34 (5), 333-340 (2018).
  21. Chuah, M. K., Collen, D., VandenDriessche, T. Biosafety of adenoviral vectors. Current Gene Therapy. 3 (6), 527-543 (2003).
  22. Evers, B., et al. CRISPR knockout screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).
  23. Rossant, J., Cross, J. C. Placental development: Lessons from mouse mutants. Nature Reviews Genetics. 2 (7), 538-548 (2001).
  24. Elmore, S. A., et al. Histology atlas of the developing mouse placenta. Toxicologic Pathology. 50 (1), 60-117 (2022).
  25. Sferruzzi-Perri, A. N., Sandovici, I., Constancia, M., Fowden, A. L. Placental phenotype and the insulin-like growth factors: Resource allocation to fetal growth. The Journal of Physiology. 595 (15), 5057-5093 (2017).
  26. Agrogiannis, G. D., Sifakis, S., Patsouris, E. S., Konstantinidou, A. E. Insulin-like growth factors in embryonic and fetal growth and skeletal development (Review). Molecular Medicine Reports. 10 (2), 579-584 (2014).
  27. Wang, L., Jiang, H., Brigande, J. V. Gene transfer to the developing mouse inner ear by in vivo electroporation. Journal of Visualized Experiments. (64), e3653 (2012).
  28. Elser, B. A., et al. Combined maternal exposure to cypermethrin and stress affect embryonic brain and placental outcomes in mice. Toxicological Sciences. 175 (2), 182-196 (2020).
  29. Gumusoglu, S. B., et al. Chronic maternal interleukin-17 and autism-related cortical gene expression, neurobiology, and behavior. Neuropsychopharmacology. 45 (6), 1008-1017 (2020).
  30. Liu, F., Huang, L. Electric gene transfer to the liver following systemic administration of plasmid DNA. Gene Therapy. 9 (16), 1116-1119 (2002).
  31. Kalli, C., Teoh, W. C., Leen, E. Introduction of genes via sonoporation and electroporation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 818, 231-254 (2014).
  32. Wu, W., et al. Efficient in vivo gene editing using ribonucleoproteins in skin stem cells of recessive dystrophic epidermolysis bullosa mouse model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (7), 1660-1665 (2017).
  33. Nakamura, H. Electroporation and Sonoporation in Developmental Biology. , Springer. Tokyo, Japan. (2009).
  34. Bond, A. M., et al. Differential timing and coordination of neurogenesis and astrogenesis in developing mouse hippocampal subregions. Brain Sciences. 10 (12), 909 (2020).
  35. Kojima, Y., Tam, O. H., Tam, P. P. Timing of developmental events in the early mouse embryo. Seminars in Cell & Developmental Biology. 34, 65-75 (2014).
  36. Pennington, K. A., Schlitt, J. M., Schulz, L. C. Isolation of primary mouse trophoblast cells and trophoblast invasion assay. Journal of Visualized Experiments. (59), e3202 (2012).
  37. Mandegar, M. A., et al. CRISPR Interference efficiently induces specific and reversible gene silencing in human iPSCs. Cell Stem Cell. 18 (4), 541-553 (2016).
  38. Dai, Z., et al. Inducible CRISPRa screen identifies putative enhancers. Journal of Genetics and Genomics. 48 (10), 917-927 (2021).
  39. Ursini, G., et al. Placental genomic risk scores and early neurodevelopmental outcomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. (7), e2019789118 (2021).
  40. Smajdor, A. Ethical challenges in fetal surgery. Journal of Medical Ethics. 37 (2), 88-91 (2011).
  41. Antiel, R. M. Ethical challenges in the new world of maternal-fetal surgery. Seminars in Perinatology. 40 (4), 227-233 (2016).

Tags

Genetik utgåva 194 Placenta mus CRISPR insulinliknande tillväxtfaktor 1 elektroporering överuttryck utveckling
Mus <em>In Vivo</em> placenta riktad CRISPR-manipulation
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Carver, A. J., Taylor, R. J.,… More

Carver, A. J., Taylor, R. J., Stevens, H. E. Mouse In Vivo Placental Targeted CRISPR Manipulation. J. Vis. Exp. (194), e64760, doi:10.3791/64760 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter