Summary
הפרוטוקול הנוכחי ממחיש את השימוש ברכיבים זמינים מסחרית ליצירת שיפוע תרמי יציב וליניארי. לאחר מכן ניתן להשתמש בשיפוע כזה כדי לקבוע את הגבול התרמי העליון של אורגניזמים פלנקטוניים, במיוחד זחלים חסרי חוליות.
Abstract
מגבלות תרמיות ורוחב נעשה שימוש נרחב כדי לחזות את תפוצת המינים. ככל שהטמפרטורה העולמית ממשיכה לעלות, הבנת האופן שבו הגבול התרמי משתנה עם התאקלמות וכיצד הוא משתנה בין שלבי החיים והאוכלוסיות היא חיונית לקביעת פגיעותם של מינים להתחממות עתידית. לרוב האורגניזמים הימיים יש מחזורי חיים מורכבים הכוללים שלבים פלנקטוניים מוקדמים. בעוד שכימות הגבול התרמי של שלבי התפתחות מוקדמים קטנים אלה (עשרות עד מאות מיקרונים) מסייע בזיהוי צווארי בקבוק התפתחותיים, תהליך זה יכול להיות מאתגר בשל גודלם הקטן של אורגניזמי המטרה, דרישת שטח ספסל גדול ועלות ייצור ראשונית גבוהה. כאן מוצג מערך המיועד לנפחים קטנים (מ"ל עד עשרות מ"ל). מערך זה משלב רכיבים הזמינים באופן מסחרי ליצירת שיפוע תרמי יציב וליניארי. כמו כן מוצגים מפרטי הייצור של המערך, כמו גם נהלים להצגה וספירה של אנשים חיים לעומת מתים וחישוב טמפרטורה קטלנית.
Introduction
סובלנות תרמית היא המפתח להישרדותם ולתפקודם של אורגניזמים 1,2. ככל שכדור הארץ ממשיך להתחמם עקב פליטות פחמן אנתרופוגניות, תשומת לב גוברת מוקדשת לקביעה וליישום של מגבלות תרמיות3. נקודות קצה שונות, כגון תמותה, אי התפתחות ואובדן ניידות, שימשו לקביעת גבולות תרמיים עליונים ותחתונים4. גבולות תרמיים אלה נחשבים לעתים קרובות פרוקסי עבור נישה תרמית של אורגניזם. מידע זה משמש בתורו לזיהוי מינים פגיעים יותר להתחממות כדור הארץ, כמו גם לחיזוי תפוצת מינים עתידיים ואינטראקציות המינים הנובעות מכך 3,5,6,7. עם זאת, קביעת גבולות תרמיים, במיוחד עבור אורגניזמים פלנקטוניים קטנים, יכולה להיות מאתגרת.
עבור אורגניזמים פלנקטוניים, במיוחד שלבי הזחלים של חסרי חוליות ימיים, ניתן לקבוע את הגבול התרמי באמצעות חשיפה כרונית. חשיפה כרונית מושגת על ידי גידול זחלים במספר טמפרטורות במשך ימים עד שבועות וקביעת הטמפרטורה שבה הזחלים שורדים ו/או קצב התפתחותי מפחיתים 8,9,10. עם זאת, גישה זו גוזלת זמן רב למדי ודורשת אינקובטורים גדולים וניסיון בגידול זחלים (ראה הפניה11 למבוא טוב לגידול זחלים חסרי חוליות ימיים).
לחלופין, ניתן להשתמש בחשיפה חריפה ללחץ תרמי כדי לקבוע גבולות תרמיים. לעתים קרובות, גישת קביעה זו כוללת הצבת בקבוקונים קטנים עם זחלים באמבטיות יבשות מבוקרות טמפרטורה 12,13,14, מינוף פונקציות שיפוע תרמי במחזורים תרמייםPCR 15,16, או הצבת בקבוקוני זכוכית / צינורות מיקרוצנטריפוגה לאורך שיפוע תרמי שנוצר על ידי חימום וקירור מיושמים בקצוות של בלוקי אלומיניום גדולים עם חורים שבהם הבקבוקונים מתאימים להתכרבל 17, 18,19. אמבטיות יבשות טיפוסיות מייצרות טמפרטורה אחת; לפיכך, יש להפעיל יחידות מרובות בו זמנית כדי להעריך את הביצועים בטווח טמפרטורות. מחזורים תרמיים מייצרים שיפוע אך מכילים רק נפח דגימה קטן (120 μL) ודורשים מניפולציות זהירות. בדומה למחזורים תרמיים, בלוקי אלומיניום גדולים יוצרים שיפועי טמפרטורה ליניאריים ויציבים. שתי הגישות יכולות להיות משולבות עם רגרסיה לוגיסטית או פרוביט כדי לחשב את הטמפרטורה הקטלנית עבור 50% אחוז מהאוכלוסייה (LT50)12,20,21. עם זאת, בלוקים אלומיניום בשימוש היו ~ 100 ס"מ אורך; גודל זה דורש שטח מעבדה גדול וגישה למכונות כרסום ממוחשבות מיוחדות לבקרה נומרית כדי לקדוח את החורים. יחד עם שימוש בשני אמבטיות מים ברמה מחקרית כדי לשמור על טמפרטורת היעד, העלות הכספית של הרכבת ההתקנה היא גבוהה.
לכן, עבודה זו שואפת לפתח אמצעי חלופי ליצירת שיפוע טמפרטורה יציב וליניארי עם חלקים זמינים מסחרית. מוצר כזה חייב להיות בעל טביעת רגל קטנה ואמור להיות מסוגל לשמש בקלות לניסויים בחשיפה ללחץ תרמי חריף עבור אורגניזמים פלנקטוניים. פרוטוקול זה פותח עם זואופלנקטון שגודלו <1 מ"מ כאורגניזמים מטרה, ולכן הוא הותאם לשימוש בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 או 2 מ"ל. אורגניזמים מחקריים גדולים יותר ידרשו מכולות גדולות יותר מצינורות המיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל המשמשים וחורים מוגדלים בגושי האלומיניום.
בנוסף להפיכת מנגנון הניסוי לנגיש יותר, עבודה זו נועדה לפשט את צינור עיבוד הנתונים. בעוד שתוכנה סטטיסטית מסחרית מספקת שגרות לחישוב LT50 באמצעות רגרסיה לוגיסטית או פרוביט, עלות הרישוי אינה טריוויאלית. לכן, סקריפט קל לשימוש המסתמך על תוכנית הסטטיסטיקה בקוד פתוח R22 יהפוך את ניתוח הנתונים לנגיש יותר.
פרוטוקול זה מראה כיצד ניתן לייצר גוש חום קומפקטי עם חלקים זמינים מסחרית וליישם אותו על חשיפת זואופלנקטון (זחלי דנדרסטר אקסצנטריקוס של דולר החול) ללחץ חום חריף כדי לקבוע את הגבול התרמי העליון שלהם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ייצור בלוק החום
- תוחבים את מחמם הרצועות 120 V, 100 W לראוסטט (ראו טבלת חומרים).
- הכן את גוש האלומיניום בגודל 20.3 ס"מ x 15.2 ס"מ x 5 ס"מ (8 אינץ' x 5 אינץ' x 2 אינץ') על-ידי קידוח 60 חורים ברשת של 6 x 10 (ראה טבלת חומרים). ודא שהחורים מרווחים 2 ס"מ מהמרכז למרכז בשני הכיוונים. כל אחד מהם צריך להיות בקוטר 1.1 ס"מ ובעומק 4.2 ס"מ (איור 1).
הערה: בצע את הקידוח במכונת כרסום או במכבש מקדחה עם מקדחי פלדה במהירות גבוהה. גוף החימום וגוף הקירור נבחרו שניהם כדי לכסות כמה שיותר ממשטח המגע של המשטחים בגודל 15.2 ס"מ על 5 ס"מ. - קדחו שני חורים נוספים על אחד המשטחים בגודל 20.3 ס"מ על 5 ס"מ בין העמודהראשון והשני לבין העמודה ה-9 וה-10, בהתאם לגודל של בדיקות בקר הטמפרטורה (ראו טבלת חומרים).
- בנה מארז מיריעות אקריליות שקופות בקוטר 1.2 ס"מ (ראו טבלת חומרים) כדי להחזיק את האלמנטים במקומם ולבודד את בלוק החום שהושלם. השתמשו בשתי שכבות של אקריליק כדי לבודד את הצד האחורי של גוף החימום (איור 1).
- בהרכבה הסופית, יש למרוח משחה תרמית (ראו טבלת חומרים) כדי למקסם את מוליכות החום מגוף החימום לתוך הבלוק ומהבלוק לגוף הקירור.
2. קביעת הגדרות שיפוע תרמי
- חבר את אמבט המים / צ'ילר האקווריום עם צינורות טייגון (ראה טבלת חומרים). יש לבודד את הצינורות בבידוד צינורות קצף לפי הצורך.
- הכנס את בדיקת התרמוסטט לחורים בצד בלוק האלומיניום. ודא כי בדיקה 1 ממוקם ליד גוף החימום.
- הניחו צינורות מיקרוצנטריפוגה מלאים עד אפס מקום (1.5 מ"ל) במי ברז בכל החורים הטחונים (60 צינורות בסך הכל).
- הפעל את בקר הטמפרטורה והגדר את טמפרטורת החימום של הבדיקה 1 עד 35-37 מעלות צלזיוס ובדיקה 2 עד 21.5-22.5 מעלות צלזיוס.
הערה: לתרמוסטט המוצע יש שני שקעים הפועלים באופן עצמאי; רק בדיקה 1 משמשת לוויסות הטמפרטורה החמה במקרה שימוש מסוים זה. לכן, הגדר את הטמפרטורה של בדיקה 2 לזו של הטמפרטורה הנמוכה. - סובבו את הריאוסטט כדי להפעיל את גוף החימום והגדירו אותו לבינוני.
- הפעל את צ'ילר אמבט המים / אקווריום והגדר את טמפרטורת הצ'ילר ל -15 מעלות צלזיוס.
- בדוק כי הבלוק הוא חם בצד אחד וקריר בצד השני לאחר 10 דקות.
התראה: הקצוות החשופים של גוף החימום יכולים להיות חמים; אל תיגע בהם. - בדוק את הטמפרטורה בתוך כל צינור מיקרוצנטריפוגה באמצעות צמד תרמי עם אלקטרודה מסוג K (ראו טבלת חומרים) כל 10 דקות לאחר מכן. הטמפרטורה תתייצב לאחר ~60 דקות ותיראה ליניארית (איור 2).
- התאם את ערכי נקודות הקצה על ידי שינוי ההגדרות של בקר הטמפרטורה ואמבט המים לפי הצורך.
3. חשיפה תרמית וספירת מתים: מתים
הערה: ניתן להשמיט את שלב 2 לאחר קביעת ההגדרות הרצויות עבור שיפוע הטמפרטורה.
- הפעל את אמבט המים והמחמם המסתובבים והגדר אותם ל -15 °C ו- 37 °C (77 °F), בהתאמה, כדי ליצור שיפוע טמפרטורה מ 19 °C (66 °F) ל 37 °C (77 °F).
- כדי להבטיח שהשיפוע התרמי יהיה ליניארי, הניחו צינורות מיקרוצנטריפוגה מלאים עד אפס מקום (1.5 מ"ל) במי ברז בכל החורים הטחונים (60 צינורות בסך הכל).
- תנו לבלוק החום להגיע לטמפרטורה שנקבעה על ידי המתנה של 45-60 דקות. בדוק את הטמפרטורה בתוך כל צינור microcentrifuge באמצעות thermocouple עם אלקטרודה מסוג K כדי לראות אם הוא הגיע לטמפרטורה הצפויה. שימו לב לטמפרטורות האלה.
- אם אורגניזמי המחקר הם בגודל של >500 מיקרומטר וניתן להעבירם בקלות ממיכל אחד למשנהו (למשל, קופפוד), מלאו צינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל במי ים מסוננים של 750 μL של 0.45 מיקרומטר. לחלופין, אם אורגניזמי המחקר קטנים, מלאו צינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל ב-250 מיקרו-ליטר של מי ים מסוננים בנפח 0.45 מיקרומטר.
הערה: עבור הנתונים המייצגים, נעשה שימוש בזחלים של דולר החול דנדרסטר , שהם 2, 4 ו -6 ימים לאחר ההפריה, (ראה טבלת חומרים). הגודל הממוצע (± S.D., n = 15 לכל גיל) של אנשים אלה היה 152 ± 7 מיקרומטר, 260 ± 17 מיקרומטר ו-292 ± 14 מיקרומטר, בהתאמה. בהתחשב בכך שניתן לרכז זחלים אלה בקלות (שלב 3.5), צינורות המיקרוצנטריפוגה מולאו ב-750 μL של מי ים מסוננים. - רכז את התרבות של אורגניזמים המחקר בסינון הפוך (כלומר, הנח את הרשת במיכל המחזיק את אורגניזמים המחקר והסר מים דרך החלק העליון של הרשת), כך שאורגניזמים המחקר יישארו בתחתית הכוס11.
הערה: רשת ניילון בגודל 30 מיקרומטר שימשה לזחלי חול שנחקרו (ראו טבלת חומרים). - שטפו את דגימת בעלי החיים המרוכזת במי ים מסוננים (למשל, בעת גידול עם פריטי מזון של אצות או כימיקלים אחרים). חזור על הסינון ההפוך פעם נוספת כדי לרכז את דגימת החיה.
- הכניסו מספר ידוע של אורגניזמים בודדים לתוך צינורות המיקרוצנטריפוגה המלאים למחצה. ספרו את האורגניזמים הפלנקטוניים הקטנים תחת מיקרוסקופ מנתח (ראו טבלת חומרים) והעבירו אותם עם פיפטות פסטר מזכוכית.
הערה: מספר האורגניזמים שיש למקם תלוי בגודל; עבור דולרי חול זחל שהיו בגודל של ~ 200 מיקרומטר, 20 פרטים לכל צינור microcentrifuge היה מתאים.
זהירות: פיפטות זכוכית רצויות יותר מפיפטות פלסטיק מכיוון שחלק מהאורגניזמים הפלנקטוניים הם הידרופוביים וידבקו למשטחי פלסטיק. - הוסף מי ים מסוננים של 0.45 מיקרומטר לצינורות המיקרוצנטריפוגה המכילים בעלי חיים עד שהנפח הסופי הוא 1 מ"ל.
- כדי לאפשר לאורגניזמים להתחמם בהדרגה לטמפרטורת הניסוי הרצויה, הכניסו את צינורות המיקרוצנטריפוגה עם בעלי חיים, שהוכנו בשלב 3.7, לתוך בלוק החום החל מהקצה הקר. מניחים זוגות של צינורות מיקרוצנטריפוגה בכל שורה (12 צינורות בסך הכל).
- המתן 10 דקות.
- הזיזו את זוגות צינורות המיקרו-צנטריפוגה שהוכנסו בשלב 3.9 אל החורים הקדוחים הסמוכים עם טמפרטורות חמות יותר. מניחים זוגות נוספים של צינורות מיקרוצנטריפוגה בכל שורה בקצה הקר. כל שורה תכלול כעת ארבעה צינורות. המתן עוד 10 דקות.
- המשך להוסיף צינורות מיקרוצנטריפוגה עם בעלי חיים על ידי הסטת מיקומם מהקצה הקר יותר לקצה החם יותר בזוגות. יש להמתין 10 דקות בין כל משמרת עד שגוש החום יתמלא לחלוטין.
הערה: שלבים 3.9-3.12 נחשבים לשלב עלייה כדי להעלות את הטמפרטורה שחווים אורגניזמי המחקר בהדרגה. - תנו לבעלי החיים לדגור בטמפרטורה המיועדת למשך שעתיים. שלב זה הוא שלב החשיפה לטמפרטורה קבועה של הניסוי.
- בדוק את הטמפרטורה של צינורות microcentrifuge עם thermocouple כל שעה אם תקופת הדגירה עולה על 2 שעות.
הערה: התאם את זמן הדגירה בהתאם לצרכי הניסוי. אם הדגירה ארוכה משעתיים, בדוק את הטמפרטורה של הצינורות במרווחי זמן קבועים עם thermocouple במקרה של כשל ציוד בלתי צפוי. כדי למזער את ההפרעה לאורגניזמי המחקר, הכניסו באופן אקראי שישה צינורות מיקרוצנטריפוגה או יותר מלאים רק במי ים מסוננים לתוך הבלוק לצורך ניטור טמפרטורה.
- בדוק את הטמפרטורה של צינורות microcentrifuge עם thermocouple כל שעה אם תקופת הדגירה עולה על 2 שעות.
- בסוף תקופת הדגירה, מדוד את הטמפרטורה בתוך כל צינור מיקרוצנטריפוגה באמצעות thermocouple עם אלקטרודה מסוג K. שימו לב לטמפרטורות האלה.
- הסר את כל 60 צינורות microcentrifuge עם בעלי חיים והניח אותם מחזיקים מסומנים מראש.
- דגירה של הצינורות (שלב 3.14) בטמפרטורה שנקבעה מראש, כגון טמפרטורת הגידול, למשך שעה אחת, שהיא תקופת ההחלמה.
הערה: תקופת ההחלמה יכולה להיות ספציפית למינים. עבור דולר חול הזחל, טמפרטורת הגידול הייתה 18 מעלות צלזיוס, ולכן הדגימה הונחה בתא סביבתי. יש לעיין בספרות הרלוונטית ו/או לערוך ניסוי כדי לוודא שספירת המתים החיים לא הושפעה מאורך תקופת ההחלמה. בנתונים המייצגים, מספר בעלי החיים החיים לאחר שעה היה זהה לאחר 12 או 24 שעות של התאוששות. - כדי למנות את חלקו של אורגניזם המחקר החי לאחר החשיפה התרמית, העבירו את תכולתו של צינור מיקרוצנטריפוגה בודד לצלחת פטרי בקוטר 35 מ"מ באמצעות פיפטה מזכוכית.
- שימו לב למספר היחסי של פרטים שעדיין פעילים (חיים) ואלה שתפסו שחייה או התמוססו (מתים) תחת מיקרוסקופ מנתח. ודא שהמספר הכולל של הפרטים שנצפו שווה למספר הפרטים שהוכנסו לצינורות בשלב 3.7. בדוק את הצד של צינורות microcentrifuge וצלחת פטרי עבור אנשים אם המספרים אינם תואמים.
4. חישוב LT50
- צור טבלת נתונים בתבנית CSV עם הכותרות הבאות לפחות: משתנה קיבוץ של תחומי עניין, טמפרטורת הצינור ב- °C, מספר הפרטים החיים ומספר האנשים המתים.
הערה: עבור הנתונים המייצגים, משתנה העניין המקבץ מוחלף בגיל מכיוון שהמטרה היא להשוות בין קבוצות גיל. - כדי להתאים את הנתונים עם רגרסיה לוגיסטית, השתמש במודל ליניארי כללי עם התפלגות בינומית. קובץ קידוד משלים 1 מציג סקריפט לדוגמה באמצעות תוכנת הקוד הפתוח R22.
- כדי לקבוע את הגבול התרמי העליון החציוני (LT 50), חשב את ערך המנבא (כלומר, הטמפרטורה) שבו50% מהאנשים שרדו. קובץ קידוד משלים 2 מציג סקריפט לדוגמה המשתמש בפונקציה dose.p מ- MASS23 ב- R22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מטרת פרוטוקול זה היא לקבוע את הגבול התרמי העליון של זואופלנקטון. לשם כך, יש צורך בשיפוע תרמי יציב וליניארי. ההגדרה המוצעת הצליחה ליצור שיפוע תרמי שנע בין 14 °C ל-40 °C על-ידי הגדרת טמפרטורת אמבט המים ל-8°C והמחמם ל-39°C (איור 2A). ניתן לצמצם ולהזיז את שיפוע הטמפרטורה על-ידי שינוי ערכי נקודות הקצה. שיפוע תרמי עם טווח צר יותר (19 °C (19 °F) עד 37 °C (77 °F) נוצר גם על ידי הגדרת התנור ל 37 °C (76 °F) ואת אמבט המים ל 15 °C (65 °F). הטמפרטורה בבלוק מתייצבת תוך 45 דקות עד שעה מההתקנה (איור 2B).
כדי להמחיש את היישום של פרוטוקול זה על זואופלנקטון, נבדק השינוי בגבול התרמי העליון, שצוין על ידי LT50, באמצעות אונטוגניה בזחלים של דולרי החול (Dendraster excentricus). דולרי חול גרביד הושגו באופן מסחרי (ראו טבלת חומרים). שחרור הגמטות היה מושרה על ידי הזרקת 0.5-1 מ"ל של 0.35 M אשלגן כלורי. הביצים שנאספו נשטפו דרך רשת ניילון של 63 מיקרומטר עם מי ים מסוננים של 0.45 מיקרומטר. הזרע נאסף יבש ונשמר על קרח. הביציות הופרו ב~104 זרעונים למ"ל. תרבויות גן נפוצות נוצרו עם גמטות משלושה זכרים ושלוש נקבות בחמישה פרטים למ"ל. תרביות זחלים אלה נשמרו במי ים מסוננים עם מליחות של 32 psu ב 18 מעלות צלזיוס תחת מחזור אור:חושך 12:12 עם שינוי מים מלא כל יומיים.
ככל שהתפתחו דולרי חול זחליים, הגבול התרמי העליון גדל מ-28.6 °C (± 0.02 °C S.E) ביומיים לאחר ההפריה ל-28.8 °C (± 0.02 °C S.E) ב-4 ימים לאחר ההפריה ו-29.3 °C (± 0.02 °C S.E) ב-6 ימים לאחר ההפריה (איור 3). גבולות תרמיים עליונים אלה מציעים לחול לחיות בתוך הגבול התרמי שלהם במהלך טמפרטורת פני הים הממוצעת בקיץ של ~ 20 מעלות צלזיוס או נמוך יותר לאורך חוף האוקיינוס השקט. עם זאת, עם העלייה בתדירות ובעוצמה של גלי חום ימיים, הטמפרטורה המקסימלית ממשיכה לעלות. טמפרטורת שיא של 26.4 מעלות צלזיוס נרשמה בדרום קליפורניה בייט באוגוסט 2018 (Fumo et al.24). בהתחשב בכך שמין זה מתרבה באביב ובקיץ, הניצולים של שלב החיים המוקדם שלהם צפויים להצטמצם במהלך אירועים קיצוניים אלה. הניצולים החזויים יפחתו ב-10% כאשר הטמפרטורה תגיע ל-26.5 מעלות צלזיוס.
השוואות זוגיות באמצעות מבחן היחס שפותח על ידי Wheeler et al.25 מצביעות על כך שהטמפרטורה הקטלנית החציונית הייתה שונה באופן משמעותי בין שלוש קבוצות הגיל (p < 0.001). שלבים מוקדמים יותר (גסטרולה ומנסרות מוקדמות בנות יומיים) היו רגישים יותר ללחץ תרמי מאשר זחלים מבוגרים יותר. תצפית זו מציעה כי הגבול התרמי שהוסק מנקודת זמן אחת של התפתחות אינו מייצג את אותו מין לאורך כל תולדות חייו.
איור 1: דיאגרמה מסומנת של גוש החום. (A) מבט מלמעלה של ההתקנה עם כל הרכיבים המחוברים. (ב,ד) מיקום וחיבורים למסופי החימום. (ג,ה) מיקום מחליף החום (elemenet קירור) ואת צינורות הקשורים לאמבט המים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: שינויי טמפרטורה בבלוק החום במשך שעה אחת עם נקודות קצה שנקבעו ל-15 ו-37 מעלות צלזיוס . (A) שיפוע ליניארי הושג תוך שעה. שינוי בהגדרות נקודת הקצה משנה את טווח הטמפרטורות, והטווח הגדול ביותר היה בין 14 °C (66 °F) ל-40 °C (70 °F). (B) הפרש הטמפרטורות בין שורות משוכפלות היה זניח (<0.8 מעלות צלזיוס); נתונים משתי שורות משוכפלות שורטטו עבור כל הגדרה ב- (B). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: ניצולים של דולרי חול זחליים (Dendraster excentricus) בטווח טמפרטורות של 19 עד 37 מעלות צלזיוס דרך אונטוגניה (2, 4 ו-6 ימים לאחר ההפריה [dpf]). כל נתון מייצג את שיעור הזחלים ששרדו דגירה של שעתיים בטמפרטורה הספציפית ולאחריה תקופת התאוששות של שעה. רגרסיה לוגיסטית בוצעה באמצעות המודל הליניארי הכללי עם התפלגות בינומית בתוכנה הסטטיסטית R. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
קובץ קידוד משלים 1: סקריפט R ליצירת עקומות לוגיסטיות עבור ערכת הנתונים עם דוגמה שלב אחר שלב. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ קידוד משלים 2: סקריפט R ליצירת הערכות LT50 . אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה מספק גישה נגישה וניתנת להתאמה אישית כדי לקבוע את הגבולות התרמיים של אורגניזמים פלנקטון קטנים באמצעות חשיפה תרמית חריפה. העיצוב בן 10 הגומות ונקודות הקצה הגמישות לטמפרטורה, הנשלטות על ידי אמבט המים בקצה התחתון והמחמם בקצה העליון, מאפשרים לקבוע LT50 בדייקנות. באמצעות גישה זו, ניתן היה לזהות הבדל בגבול התרמי שהוא <1 מעלות צלזיוס (איור 3). גישה זו מספקת קביעה מהירה של גבולות תרמיים (בשעות) עבור מגוון מינים, והערכים שהתקבלו יושמו על מודלים של התפלגות מינים מרובים 2,21. עם זאת, חשוב לציין כי חשיפה חריפה ככל הנראה מספקת הערכת סובלנות תרמית שונה בהשוואה לחשיפה כרונית 8,26.
אחד היתרונות העיקריים של העיצוב הנוכחי הוא ש-10 טיפולי טמפרטורה ושישה שכפולים כלולים בתוך טביעת רגל קטנה (20.3 ס"מ על 15.2 ס"מ x 5 ס"מ). בפרסומים קודמים שהשתמשו בגישת שיפוע תרמי דומה לקביעת גבולות תרמיים נעשה שימוש במוטות אלומיניום גדולים יותר (180 ס"מ x 10 ס"מ x 6 ס"מ ב-27, 91 ס"מ × 25 ס"מ × 15 ס"מב-10 ו-60 ס"מ x 20 ס"מב-17). בעוד אמבטיות יבשות שמחזיקות טמפרטורה אחת הן קטנות יותר (למשל, 18.5 ס"מ על 18.5 ס"מ x 2.5 ס"מ) ומציעות שכפולים מרובים, נדרשות מספר יחידות (יותר מארבע) כדי ליצור עקומת ביצועים הכוללת טמפרטורות מרובות, או שיש לחזור על הניסויים לאורך זמן מה שעלול לגרום לגורמים מבלבלים. תכנון בלוק החום מפחית הן את עלות הייצור והן את דרישות המקום. ניתן להשלים את הייצור עם מכבש מקדחה, או שחוקרים ללא גישה מיידית למכונת כרסום יכולים לבחור בשירותי עיבוד CNC מסחריים. השימוש בחלקים הזמינים מסחרית שולט עוד יותר בעלות הייצור. אם ניתן להשתמש באמבט חימום / קירור קיים או בצ'ילרים לאקווריום, העלות הנותרת של החלקים מסתכמת בפחות מ-350 דולר. אחרת, ניתן לרכוש צ'ילרים לאקווריום למיכל דגים של 10 גלון (~ 35 ליטר) תמורת <150 דולר.
ניתן לשנות את העיצוב הנוכחי כך שיתאים לצרכי החוקר. אם אורגניזמי המטרה גדולים יותר בגודלם, בקבוקוני scintillation הם מיכלים חלופיים טובים, וחורים גדולים יותר יידרשו. עם זאת, בלוק האלומיניום ניתן להסרה בעיצוב הנוכחי, כך שניתן ליצור ולהחליף בלוקים מרובים כך שיתאימו לצרכי הניסוי. אם מטרת הניסוי היא לקבוע גבול תרמי נמוך יותר או להתמקד באורגניזמים קוטביים, הצבת בלוקי מים מצננים בשני הקצוות של בלוק האלומיניום הראשי מתאימה יותר.
בדומה למחקרים אחרים על זואופלנקטון, הפרוטוקול הנוכחי אינו כולל שלב קירורהדרגתי 20,27. חוקרים יכולים לשקול להסיר את צינורות המיקרוצנטריפוגה בזוגות ולהזיז אותם במורד שיפוע הטמפרטורה (כלומר, היפוך שלבים 3.9-3.12) כדי להשיג קירור הדרגתי אם אורגניזמי המחקר שלהם רגישים לירידה פתאומית בטמפרטורה.
התועלת של הגדרה זו יכולה להיות מופחתת על ידי מספר גורמים, כלומר הבחירה של (1) הגדרות הטמפרטורה של נקודת הקצה, (2) משך החשיפה וההתאוששות, ו-3) המדד המשמש לקביעת המצב הבינומי (חי לעומת מת; מפותח לעומת לא מפותח). כדי להתמודד עם מגבלות פוטנציאליות אלה, מומלץ מאוד לבצע בדיקות מקדימות.
מכיוון שהרגרסיה הלוגיסטית מניחה התפלגות בינומית, עדיפות נקודות קצה עם 100% הישרדות ותמותה. עבור אורגניזמים ימיים, טווח התחלה סביר יהיה טמפרטורת פני הים השנתית הממוצעת של אתר האיסוף בתוספת 10-15 מעלות צלזיוס. לאחר מכן ניתן לצמצם את טווח הטמפרטורות שנחקר לאחר ניסוי ראשוני כזה, שכן ככל שהפרש הטמפרטורות בין החורים קטן יותר, כך ההערכה LT50 מכווננת יותר.
משך החשיפה וההתאוששות הם ספציפיים למין. לדוגמה, Kuo et al.27 אפשרו לוולקים צעירים (Nucella canaliculata) להתאושש במשך 24 שעות, בעוד האמונד ואחרים אפשרו לקיפודים סגולים של זחלים (Stronglylocentrotus purprtaus) שעה אחת להחלמה. אפשר לערוך ניסוי קצר כדי לקבוע אם ספירת המתים החיים שונה בין תקופות ההחלמה. בהתאם להגדרה של המצב הבינומי שנבחר (למשל, חי לעומת מת), ייתכן שלא יהיה צורך בזמן ההחלמה. אם מטרת הניסוי היא לבחון אם תהליכים התפתחותיים, כגון ביקוע וגסטרולציה, מתרחשים בטווח של טמפרטורות. במילים אחרות, המצב הבינומי המשמש במודל יפותח לעומת 8,19,21 שלא פותח. יש להוסיף לדגימות מקבעים כגון 4% פרפורמלדהיד בתקופת החשיפה התרמית ללא זמן החלמה.
כדי להבטיח ספירה מדויקת וקביעה של מצב בינומי (חי לעומת מת; מפותח לעומת לא מפותח), מומלץ לספור את הדגימות לאחר זמן ההחלמה בסדר אקראי כדי למנוע הטיות צופות פוטנציאליות. אם יש מספיק כוח אדם, חוקרים שונים יכולים לספור שורות משוכפלות ולהשוות את התוצאות שלהן. לחלופין, אנשים יכולים לספור שוב ושוב תת-קבוצה קטנה של הדגימות ולבדוק אם המספרים עקביים.
מגבלה פוטנציאלית נוספת היא היעדר אומדן שגיאות של LT50 מדגימות עצמאיות29. שיטת ניתוח הנתונים הנוכחית מספקת רווח בר-סמך של 95% לאורך העקומה הלוגיסטית המותאמת (קובץ קידוד משלים 1) ושגיאת תקן של LT50 (קובץ קידוד משלים 2). גבולות שגיאה אלה נוצרים מתהליך התאמת העקומה, ולא באמצעות מדידות מרובות של פרטים מאוכלוסיית המדגם. בהתחשב בכך שלתכנון בלוק החום הנוכחי יש שש שורות, ניתן להתאים נתונים מכל שורה כדי ליצור שש הערכות LT50 ולקבל את הערכות השגיאה מבוססות התצפית.
לסיכום, מוצגת גישה נגישה לקביעת גבולות תרמיים חריפים שניתן ליישם על מגוון רחב של זואופלנקטון. ניתן להשתמש במערך זה כדי לקבוע את הגבולות התרמיים של אורגניזמים שונים ולאתר שלבי התפתחות פגיעים. מידע זה יכול לסייע בשיפור החיזוי של ביצועי אורגניזמים ואינטראקציות קהילתיות פוטנציאליות לנוכח שינויי האקלים העולמיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגוד עניינים להצהיר.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי קרן המחקר הפקולטית של מכללת סוורת'מור [KC] ומלגת רוברט ריינולדס ולוסינדה לואיס '70 מחקר קיץ עבור BJ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 µm membrane filter | VWR | 74300-042 | |
| ½” Acrylic sheet | McMaster-Carr | 8560K266 | Used to construct a ridged case with sufficient insulation. |
| 1 mL syringe | VWR | 76290-420 | |
| 2 Channel 7 Thermocouple Types Datalogger | Omega Engineering | HH506A | Can be replaced with any thermometer that will fit inside a microcentrifuge tube |
| Automatic pipette | Ranin | ||
| Bolt- and Clamp-Mount Strip Heater with 430 Stainless Steel Sheath, 120V AC, 1-1/2" Wide, 100W |
McMaster-Carr | 3619K32 | |
| Crystal Sea Bioassay Mix | Pentair | CM2B | Use to make aritifical seawater |
| Denraster excentricus | M-Rep | Sand dollars from California | |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ645 | |
| DIYhz Aluminum Water Cooling Block, Liquid Water Cooler Heat Sink System for PC Computer CPU Graphics Radiator Heatsink Endothermic Head Silver(40 mm x 120 mm x 12 mm) | Amazon | Connects to water bath and used to cool one end of the block. | |
| Easy-to-Machine MIC6 Cast Aluminum Sheet 2" thick 8" x 8" | McMaster-Carr | 86825K953 | Machined to 2" x 6" x 8" with 60 equally spaced holes (11 mm dia., 42 mm depth) with two addition holes drilled in one side for thermostat probes. |
| Economical Flexible Polyethylene Foam Pipe Insulation | McMaster-Carr | 4530K121 | Covers the plastic tubing between chiller and block to reduce heat loss. Can be omitted if temperature range is close to room temperature |
| EVERSECU 72w 110-240v Aquarium Water Chiller Warmer/Cooler Temperature Controller for Fish Shrimp Tank Marine Coral Reef Tank Below 20 L/30 L Aquarium Chiller | Amazon | Can be used in place of the lab-grade water bath | |
| Example with larval sand dollar | |||
| GENNEL 100 g Silver Silicone Thermal Conductive Compound Grease Paste For GPU CPU IC LED Ovens Cooling | Amazon | Improves the thermal conductance between the block and the heating and cooling elements. | |
| Inkbird WiFi Reptile Thermostat Temperature Controller with 2 Probes and 2 Outlets, IPT-2CH Reptiles Heat Mat Thermostat (Max 250 W per Outlet) | Amazon | Monitors hot and cold ends. Maintains hot end in range | |
| Lauda Ecoline Silver Air-Cooled Refrigerated Circulators | VWR | 89202-386 | Can be replaced with an aquarium chiller |
| Microcentrifuge Tubes | VWR | 76019-014 | If larger animals are used, scanilation vials (VWR 66022-004) is a good alternative |
| Nitex mesh filter | Self made | Used hot glue to attached Nitex mesh to 1/2" PVC tubing | |
| Pasteur pipette | VWR | 14673-010 | |
| Potassium Chloride (0.35 M) | Millpore-Sigma | P3911-500G | |
| R statistical software. | The R Project for Statistical Computing | ||
| Syringe needle | VWR | 89219-346 | Depending on size of target organism gague 14 and 16 can be used |
| Tygon Tubing | McMaster-Carr | 5233K65 | Adjust to match the chiller and block used |
| Zoo Med Repti Temp Rheostat | Chewy.com | Rated to 150 W and rewired to feed directly into the heating element. Used to control rate of heat output |
References
- Dowd, W. W., King, F. A., Denny, M. W. Thermal variation, thermal extremes and the physiological performance of individuals. Journal of Experimental Biology. 218 (12), 1956-1967 (2015).
- García, F. C., Bestion, E., Warfield, R., Yvon-Durocher, G. Changes in temperature alter the relationship between biodiversity and ecosystem functioning. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (43), 10989-10994 (2018).
- Sinclair, B. J., et al. Can we predict ectotherm responses to climate change using thermal performance curves and body temperatures. Ecology Letters. 19 (11), 1372-1385 (2016).
- Lutterschmidt, W. I., Hutchison, V. H. The critical thermal maximum: history and critique. Canadian Journal of Zoology. 75 (10), 1561-1574 (1997).
- Bennett, J. M., et al. The evolution of critical thermal limits of life on Earth. Nature Communications. 12 (1), 1198 (2021).
- Sunday, J. M., Bates, A. E., Dulvy, N. K. Thermal tolerance and the global redistribution of animals. Nature Climate Change. 2 (9), 686-690 (2012).
- Deutsch, C. A., et al. Impacts of climate warming on terrestrial ectotherms across latitude. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (18), 6668-6672 (2008).
- Collin, R., Chan, K. Y. K. The sea urchin Lytechinus variegatus lives close to the upper thermal limit for early development in a tropical lagoon. Ecology and Evolution. 6 (16), 5623-5634 (2016).
- Wang, W., Ding, M. -w, Li, X. -x, Wang, J., Dong, Y. -w Divergent thermal sensitivities among different life stages of the pulmonate limpet Siphonaria japonica. Marine Biology. 164 (6), 1-10 (2017).
- Mak, K. K. -Y., Chan, K. Y. K. Interactive effects of temperature and salinity on early life stages of the sea urchin Heliocidaris crassispina. Marine Biology. 165 (3), 1-11 (2018).
- Strathmann, R. R. Culturing larva of marine invertebrates. Developmental Biology of the Sea Urchin and Other Marine Invertebrates. , Humana Press. Totowa, NJ. 1-25 (2014).
- Stillman, J. H., Somero, G. N. A comparative analysis of the upper thermal tolerance limits of Eastern Pacific porcelain crabs, Genus Petrolisthes: Influences of latitude, vertical Zonation, acclimation, and phylogeny. Physiological and Biochemical Zoology. 73 (2), 200-208 (2000).
- Sasaki, M. C., Dam, H. G. Integrating patterns of thermal tolerance and phenotypic plasticity with population genetics to improve understanding of vulnerability to warming in a widespread copepod. Global Change Biology. 25 (12), 4147-4164 (2019).
- Sasaki, M. C., Dam, H. G. Genetic differentiation underlies seasonal variation in thermal tolerance, body size, and plasticity in a short-lived copepod. Ecology and Evolution. 10 (21), 12200-12210 (2020).
- Kelly, M. W., Sanford, E., Grosberg, R. K. Limited potential for adaptation to climate change in a broadly distributed marine crustacean. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 279 (1727), 349-356 (2012).
- Rivera, H. E., Chen, C. -Y., Gibson, M. C., Tarrant, A. M. Plasticity in parental effects confers rapid larval thermal tolerance in the estuarine anemone Nematostella vectensis. Journal of Experimental Biology. 224 (5), 236745 (2021).
- Sewell, M. A., Young, C. M. Temperature limits to fertilization and early development in the tropical sea urchin Echinometra lucunter. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 236 (2), 291-305 (1999).
- Walther, K., Crickenberger, S. E., Marchant, S., Marko, P. B., Moran, A. L. Thermal tolerance of larvae of Pollicipes elegans, a marine species with an antitropical distribution. Marine Biology. 160 (10), 2723-2732 (2013).
- Byrne, M., Gall, M. L., Campbell, H., Lamare, M. D., Holmes, S. P. Staying in place and moving in space: contrasting larval thermal sensitivity explains distributional changes of sympatric sea urchin species to habitat warming. Global Change Biology. 28 (9), 3040-3053 (2022).
- Zippay, M. L., Hofmann, G. E. Physiological tolerances across latitudes: thermal sensitivity of larval marine snails (Nucella spp). Marine Biology. 157 (4), 707-714 (2010).
- Collin, R., Rebolledo, A. P., Smith, E., Chan, K. Y. K. Thermal tolerance of early development predicts the realized thermal niche in marine ectotherms. Functional Ecology. 35 (8), 1679-1692 (2021).
- R Core Team. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. , Vienna, Austria. https://www.R-project.org/ (2021).
- Venables, W. N., Ripley, B. D. Modern Applied Statistics with S-PLUS. Fourth edn. , Springer. (2002).
- Fumo, J. T., et al. Contextualizing marine heatwaves in the southern California bight under anthropogenic climate change. Journal of Geophysical Research: Oceans. 125 (5), (2020).
- Wheeler, M. W., Park, R. M., Bailer, A. J. Comparing median lethal concentration values using confidence interval overlap or ratio tests. Environmental Toxicology and Chemistry: An International Journal. 25 (5), 1441-1444 (2006).
- Kingsolver, J. G., MacLean, H. J., Goddin, S. B., Augustine, K. E. Plasticity of upper thermal limits to acute and chronic temperature variation in Manduca sexta larvae. Journal of Experimental Biology. 219 (9), 1290-1294 (2016).
- Kuo, E. S. L., Sanford, E. Geographic variation in the upper thermal limits of an intertidal snail: implications for climate envelope models. Marine Ecology Progress Series. 388, 137-146 (2009).
- Hammond, L. M., Hofmann, G. E. Thermal tolerance of Strongylocentrotus purpuratus early life history stages: mortality, stress-induced gene expression and biogeographic patterns. Marine biology. 157 (12), 2677-2687 (2010).
- Sasaki, M., Dam, H. G. Global patterns in copepod thermal tolerance. Journal of Plankton Research. 43 (4), 598-609 (2021).
