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Biology

हीट ब्लॉक का उपयोग करके ज़ोप्लांकटन के लिए थर्मल सीमा निर्धारण

Published: November 18, 2022 doi: 10.3791/64762
Automatic Translation
1, 1, 1
1Biology Department, Swarthmore College

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल एक स्थिर और रैखिक थर्मल ढाल उत्पन्न करने के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध घटकों के उपयोग को दर्शाता है। इस तरह के ढाल का उपयोग तब प्लवक जीवों, विशेष रूप से अकशेरुकी लार्वा की ऊपरी थर्मल सीमा निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है।

Abstract

प्रजातियों के वितरण की भविष्यवाणी करने के लिए थर्मल सीमा और चौड़ाई का व्यापक रूप से उपयोग किया गया है। जैसा कि वैश्विक तापमान में वृद्धि जारी है, यह समझना कि अनुकूलन के साथ थर्मल सीमा कैसे बदलती है और यह जीवन चरणों और आबादी के बीच कैसे भिन्न होती है, भविष्य के वार्मिंग के लिए प्रजातियों की भेद्यता निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है। अधिकांश समुद्री जीवों में जटिल जीवन चक्र होते हैं जिनमें प्रारंभिक प्लवक चरण शामिल होते हैं। जबकि इन छोटे प्रारंभिक विकास चरणों (दसियों से सैकड़ों माइक्रोन) की थर्मल सीमा को निर्धारित करने से विकास संबंधी बाधाओं की पहचान करने में मदद मिलती है, यह प्रक्रिया लक्ष्य जीवों के छोटे आकार, बड़ी बेंच स्पेस की आवश्यकता और उच्च प्रारंभिक निर्माण लागत के कारण चुनौतीपूर्ण हो सकती है। यहां, एक सेटअप जो छोटे वॉल्यूम (एमएल से दसियों एमएल) की ओर अग्रसर है, प्रस्तुत किया गया है। यह सेटअप एक स्थिर और रैखिक थर्मल ढाल उत्पन्न करने के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध घटकों को जोड़ता है। सेटअप के उत्पादन विनिर्देशों, साथ ही जीवित बनाम मृत व्यक्तियों को पेश करने और गणना करने और घातक तापमान की गणना करने की प्रक्रियाएं भी प्रस्तुत की गई हैं।

Introduction

थर्मल सहिष्णुता जीवों के अस्तित्व और कार्य 1,2 के लिए महत्वपूर्ण है। चूंकि ग्रह मानवजनित कार्बन उत्सर्जन के कारण गर्म होता रहता है, इसलिए थर्मलसीमाओं के निर्धारण और आवेदन पर ध्यान दिया जा रहा है। विभिन्न समापन बिंदु, जैसे मृत्यु दर, विकसित करने में विफलता, और गतिशीलता की हानि, ऊपरी और निचले थर्मल सीमादोनों को निर्धारित करने के लिए उपयोग किया गया है। इन थर्मल सीमाओं को अक्सर एक जीव के थर्मल आला के लिए प्रॉक्सी माना जाता है। इस जानकारी का उपयोग उन प्रजातियों की पहचान करने के लिए किया जाता है जो ग्लोबल वार्मिंग के लिए अधिक संवेदनशील हैं, साथ ही भविष्य की प्रजातियों के वितरण और परिणामस्वरूप प्रजातियों के इंटरैक्शन 3,5,6,7 की भविष्यवाणी करते हैं। हालांकि, थर्मल सीमा निर्धारित करना, विशेष रूप से छोटे प्लवक जीवों के लिए, चुनौतीपूर्ण हो सकता है।

प्लवक जीवों के लिए, विशेष रूप से समुद्री अकशेरुकी जीवों के लार्वा चरणों के लिए, थर्मल सीमा को क्रोनिक एक्सपोजर के माध्यम से निर्धारित किया जा सकता है। क्रोनिक एक्सपोजर कई तापमानों पर लार्वा को दिनों से हफ्तों तक पालने और उस तापमान का निर्धारण करके प्राप्त किया जाता है जिस पर लार्वा उत्तरजीविता और / या विकास दर 8,9,10 कम हो जाती है। हालांकि, यह दृष्टिकोण समय लेने वाला है और लार्वा पालन में बड़े इनक्यूबेटर और अनुभव की आवश्यकता होती है (समुद्री अकशेरुकी लार्वा की खेती के लिए एक अच्छे परिचय के लिए संदर्भ11 देखें)।

वैकल्पिक रूप से, थर्मल तनाव के तीव्र जोखिम का उपयोग थर्मल सीमा निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। अक्सर, इस निर्धारण दृष्टिकोण में तापमान-नियंत्रित शुष्क स्नान12,13,14 में लार्वा के साथ छोटी शीशियों को रखना, पीसीआर थर्मल साइकलर्स15,16 में थर्मल ग्रेडिएंट फ़ंक्शन का लाभ उठाना, या ग्लास शीशियों / माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों को बड़े एल्यूमीनियम ब्लॉकों के सिरों पर लागू हीटिंग और कूलिंग द्वारा उत्पन्न थर्मल ग्रेडिएंट के साथ डालना शामिल है, जिसमें शीशियां17, जिसमें शीशियां फिट होती हैं। 18,19. विशिष्ट शुष्क स्नान एक एकल तापमान उत्पन्न करते हैं; इसलिए, तापमान की एक श्रृंखला में प्रदर्शन का आकलन करने के लिए कई इकाइयों को एक साथ संचालित किया जाना चाहिए। थर्मल साइकिलर्स एक ढाल उत्पन्न करते हैं लेकिन केवल एक छोटे से नमूना मात्रा (120 μL) को समायोजित करते हैं और सावधानीपूर्वक जोड़तोड़ की आवश्यकता होती है। थर्मल साइकिलर्स के समान, बड़े एल्यूमीनियम ब्लॉक रैखिक और स्थिर तापमान ग्रेडिएंट बनाते हैं। दोनों दृष्टिकोणों को 50% प्रतिशत आबादी(एलटी 50)12,20,21 के लिए घातक तापमान की गणना करने के लिए लॉजिस्टिक या प्रोबिट रिग्रेशन के साथ जोड़ा जा सकता है। हालांकि, उपयोग किए गए एल्यूमीनियम ब्लॉक ~ 100 सेमी लंबे थे; यह आकार एक बड़े प्रयोगशाला स्थान और छेद को ड्रिल करने के लिए विशेष कंप्यूटर संख्यात्मक नियंत्रण मिलिंग मशीनों तक पहुंच की मांग करता है। लक्ष्य तापमान को बनाए रखने के लिए दो शोध-ग्रेड पानी के स्नान का उपयोग करने के साथ, सेटअप को इकट्ठा करने की वित्तीय लागत अधिक है।

इसलिए, इस काम का उद्देश्य व्यावसायिक रूप से उपलब्ध भागों के साथ एक स्थिर, रैखिक तापमान ढाल उत्पन्न करने के लिए एक वैकल्पिक साधन विकसित करना है। इस तरह के उत्पाद में एक छोटा पदचिह्न होना चाहिए और प्लवक जीवों के लिए तीव्र थर्मल तनाव जोखिम प्रयोगों के लिए आसानी से उपयोग किया जाना चाहिए। यह प्रोटोकॉल ज़ोप्लांकटन के साथ विकसित किया गया है जो लक्ष्य जीवों के रूप में आकार में <1 मिमी है, और इस प्रकार, इसे 1.5 या 2 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब के उपयोग के लिए अनुकूलित किया गया था। बड़े अध्ययन जीवों को एल्यूमीनियम ब्लॉकों में उपयोग किए जाने वाले 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों और बढ़े हुए छेदों से बड़े कंटेनरों की आवश्यकता होगी।

प्रयोगात्मक तंत्र को अधिक सुलभ बनाने के अलावा, इस काम का उद्देश्य डेटा प्रोसेसिंग पाइपलाइन को सरल बनाना है। जबकि वाणिज्यिक सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर लॉजिस्टिक या प्रोबिट रिग्रेशन का उपयोग करके एलटी50 की गणना करने के लिए दिनचर्या प्रदान करता है, लाइसेंसिंग लागत गैर-तुच्छ है। इसलिए, एक आसान-से-उपयोग स्क्रिप्ट जो ओपन-सोर्स सांख्यिकीय कार्यक्रम आर22 पर निर्भर करती है, डेटा विश्लेषण को अधिक सुलभ बना देगी।

यह प्रोटोकॉल दिखाता है कि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध भागों के साथ एक कॉम्पैक्ट हीट ब्लॉक कैसे बनाया जा सकता है और उनकी ऊपरी थर्मल सीमा निर्धारित करने के लिए तीव्र गर्मी तनाव के लिए ज़ोप्लांकटन (रेत डॉलर डेंडरस्टर एक्ससेंट्रिकस के लार्वा) को उजागर करने के लिए लागू किया जा सकता है।

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Protocol

1. हीट ब्लॉक का निर्माण

  1. 120 वी, 100 डब्ल्यू स्ट्रिप हीटर को रिओस्टैट में वायर करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  2. 6 x 10 ग्रिड में 60 छेद ड्रिल करके एल्यूमीनियम के 20.3 सेमी x 15.2 सेमी x 5 सेमी (x 2 इंच में 8) ब्लॉक तैयार करें ( सामग्री की तालिका देखें)। सुनिश्चित करें कि छेद दोनों दिशाओं में केंद्र से केंद्र तक 2 सेमी तक फैले हुए हैं। प्रत्येक व्यास में 1.1 सेमी और 4.2 सेमी गहरा होना चाहिए (चित्र 1)।
    नोट: एक मिलिंग मशीन पर ड्रिलिंग करें या उच्च गति स्टील ड्रिल बिट्स के साथ ड्रिल प्रेस करें। हीटिंग तत्व और शीतलन तत्व दोनों को 15.2 सेमी x 5 सेमी सतहों की संपर्क सतह को यथासंभव कवर करने के लिए चुना गया था।
  3. तापमान नियंत्रक जांच के आकार से मेल खाते हुए, 1 और2 कॉलम और 9वें और 10वें कॉलम के बीच 20.3 सेमी x 5 सेमी सतहों में से एक पर दो अतिरिक्त छेद ड्रिल करें (सामग्री की तालिका देखें)।
  4. तत्वों को जगह में रखने और पूर्ण गर्मी ब्लॉक को इन्सुलेट करने के लिए 1.2 सेमी (0.5 इंच) स्पष्ट ऐक्रेलिक शीट ( सामग्री की तालिका देखें) से एक केस बनाएं। हीटिंग तत्व के पिछले हिस्से को इन्सुलेट करने के लिए ऐक्रेलिक की दो परतों का उपयोग करें (चित्रा 1)।
  5. अंतिम असेंबली में, हीटिंग तत्व से ब्लॉक में और ब्लॉक से शीतलन तत्व तक गर्मी चालकता को अधिकतम करने के लिए थर्मल पेस्ट ( सामग्री की तालिका देखें) लागू करें।

2. थर्मल ग्रेडिएंट सेटिंग्स का निर्धारण

  1. मछलीघर चिलर को टाइगॉन ट्यूबिंग के साथ कनेक्ट करें ( सामग्री की तालिका देखें)। आवश्यकतानुसार फोम पाइप इन्सुलेशन के साथ ट्यूबिंग को इन्सुलेट करें।
  2. एल्यूमीनियम ब्लॉक के किनारे छेद में थर्मोस्टेट जांच डालें। सुनिश्चित करें कि जांच 1 हीटिंग तत्व के पास स्थित है।
  3. सभी मिल्ड छेदों (कुल 60 ट्यूब) में नल के पानी के साथ ब्रिम (1.5 एमएल) से भरे माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों को रखें।
  4. तापमान नियंत्रक चालू करें और जांच के स्टॉप हीटिंग तापमान को 1 से 35-37 डिग्री सेल्सियस और जांच 2 से 21.5-22.5 डिग्री सेल्सियस सेट करें।
    नोट: प्रस्तावित थर्मोस्टेट में दो आउटलेट हैं जो स्वतंत्र रूप से काम करते हैं; इस विशेष उपयोग मामले में गर्म तापमान को विनियमित करने के लिए केवल जांच 1 का उपयोग किया जाता है। इसलिए, प्रोब 2 के तापमान को कम अंत तापमान पर सेट करें।
  5. हीटिंग तत्व को चालू करने के लिए रिओस्टैट को घुमाएं और इसे मध्यम पर सेट करें।
  6. मछलीघर चिलर चालू करें और चिलर तापमान को 15 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें।
  7. जांचें कि ब्लॉक एक छोर पर गर्म है और 10 मिनट के बाद दूसरे पर ठंडा है।
    सावधानी: हीटिंग तत्व के उजागर छोर गर्म हो सकते हैं; उन्हें मत छुओ।
  8. प्रत्येक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब के अंदर तापमान की जांच के-टाइप इलेक्ट्रोड ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ थर्मोकपल का उपयोग करके हर 10 मिनट बाद। तापमान ~ 60 मिनट के बाद स्थिर हो जाएगा और रैखिक दिखाई देगा (चित्रा 2)।
  9. आवश्यकतानुसार तापमान नियंत्रक और पानी के स्नान की सेटिंग्स को बदलकर समापन बिंदुओं के मूल्यों को समायोजित करें।

3. थर्मल एक्सपोजर और जीवित: मृत गणना

नोट: तापमान ढाल के लिए वांछित सेटिंग्स निर्धारित होने के बाद चरण 2 को छोड़ा जा सकता है।

  1. 19.5 डिग्री सेल्सियस से 37 डिग्री सेल्सियस तक तापमान ढाल उत्पन्न करने के लिए, पुन: परिसंचारी पानी स्नान और हीटर चालू करें और उन्हें क्रमशः 15 डिग्री सेल्सियस और 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें।
  2. यह सुनिश्चित करने के लिए कि थर्मल ढाल रैखिक है, सभी मिल्ड छेदों (कुल 60 ट्यूब) में नल के पानी के साथ ब्रिम (1.5 एमएल) से भरे माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों को रखें।
  3. हीट ब्लॉक को 45-60 मिनट इंतजार करके निर्धारित तापमान तक पहुंचने दें। के-टाइप इलेक्ट्रोड के साथ थर्मोकपल का उपयोग करके प्रत्येक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब के अंदर तापमान की जांच करें कि क्या यह अपेक्षित तापमान तक पहुंच गया है। इन तापमानों पर ध्यान दें।
  4. यदि अध्ययन जीव आकार में >500 μm हैं और आसानी से एक कंटेनर से दूसरे में स्थानांतरित किए जा सकते हैं (उदाहरण के लिए, एक कोपपॉड), तो 0.45 μm फ़िल्टर किए गए समुद्री जल के 750 μL के साथ 1.5 mL माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब भरें। वैकल्पिक रूप से, यदि अध्ययन जीव छोटे हैं, तो 0.45 μm फ़िल्टर किए गए समुद्री जल के 250 μL के साथ 1.5 mL माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब भरें।
    नोट: प्रतिनिधि डेटा के लिए, रेत डॉलर डेंडस्टर एक्ससेंट्रिक के लार्वा, जो निषेचन के बाद 2, 4 और 6 दिन हैं, का उपयोग किया गया था ( सामग्री की तालिका देखें)। इन व्यक्तियों का औसत (± एसडी, एन = 15 प्रत्येक आयु के लिए) आकार क्रमशः 152 ± 7 μm, 260 ± 17 μm, और 292 ± 14 μm था। यह देखते हुए कि इन लार्वा को आसानी से केंद्रित किया जा सकता है (चरण 3.5), माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों को फ़िल्टर किए गए समुद्री जल के 750 μL से भरा गया था।
  5. रिवर्स फ़िल्टरिंग के साथ अध्ययन जीवों की संस्कृति पर ध्यान केंद्रित करें (यानी, अध्ययन जीवों को पकड़ने वाले कंटेनर में जाल रखें और जाल के शीर्ष के माध्यम से पानी निकालें), ताकि अध्ययन जीव बीकर11 के तल में रहें।
    नोट: अध्ययन किए गए लार्वा रेत डॉलर के लिए एक 30 μm नायलॉन जाल का उपयोग किया गया था ( सामग्री की तालिका देखें)।
  6. फ़िल्टर किए गए समुद्री जल के साथ केंद्रित जानवर के नमूने को कुल्ला करें (उदाहरण के लिए, अल्गल खाद्य पदार्थों या अन्य रसायनों के साथ खेती करते समय)। पशु नमूने को केंद्रित करने के लिए रिवर्स फ़िल्टरिंग को एक बार फिर दोहराएं।
  7. आधे भरे माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में व्यक्तिगत जीवों की एक ज्ञात संख्या रखें। एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत छोटे प्लवक जीवों की गणना करें (सामग्री की तालिका देखें) और उन्हें ग्लास पाश्चर पिपेट के साथ स्थानांतरित करें।
    नोट: जगह पर जीवों की संख्या आकार पर निर्भर है; लार्वा रेत डॉलर के लिए जो आकार में ~ 200 μm थे, प्रति माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 20 व्यक्ति उपयुक्त थे।
    सावधानी: ग्लास पिपेट प्लास्टिक पिपेट की तुलना में अधिक वांछनीय हैं क्योंकि कुछ प्लवक जीव हाइड्रोफोबिक हैं और प्लास्टिक की सतहों से चिपके रहेंगे।
  8. जानवरों वाले माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में 0.45 μm फ़िल्टर किए गए समुद्री जल को जोड़ें जब तक कि अंतिम मात्रा 1 एमएल न हो।
  9. जीवों को धीरे-धीरे वांछित प्रयोगात्मक तापमान तक गर्म करने की अनुमति देने के लिए, चरण 3.7 में तैयार जानवरों के साथ माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों को ठंडे अंत से शुरू होने वाले गर्मी ब्लॉक में रखें। प्रत्येक पंक्ति (कुल 12 ट्यूब) पर माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों के जोड़े रखें।
  10. 10 मिनट प्रतीक्षा करें।
  11. चरण 3.9 पर डाले गए माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों के जोड़े को गर्म तापमान के साथ आसन्न ड्रिल किए गए छेदों में ले जाएं। ठंडे छोर पर प्रत्येक पंक्ति में माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों के अतिरिक्त जोड़े रखें। प्रत्येक पंक्ति में अब चार ट्यूब होंगे। 10 मिनट और प्रतीक्षा करें।
  12. जानवरों के साथ माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों को जोड़ना जारी रखें, उनकी स्थिति को ठंडे छोर से गर्म छोर तक जोड़े में स्थानांतरित करके। प्रत्येक शिफ्ट के बीच 10 मिनट प्रतीक्षा करें जब तक कि हीट ब्लॉक पूरी तरह से भर न जाए।
    नोट: चरण 3.9-3.12 को अध्ययन जीवों द्वारा अनुभव किए गए तापमान को धीरे-धीरे बढ़ाने के लिए एक रैंपिंग-अप चरण माना जाता है।
  13. जानवरों को 2 घंटे के लिए निर्दिष्ट तापमान पर सेने दें। यह चरण प्रयोग का निरंतर तापमान जोखिम चरण है।
    1. यदि इनक्यूबेशन अवधि 2 घंटे से अधिक है तो हर घंटे थर्मोकपल के साथ माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों के तापमान की जांच करें।
      नोट: प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के आधार पर इनक्यूबेशन समय समायोजित करें। यदि इनक्यूबेशन 2 घंटे से अधिक लंबा है, तो अप्रत्याशित उपकरण विफलता के मामले में थर्मोकपल के साथ नियमित समय अंतराल पर ट्यूबों के तापमान की जांच करें। अध्ययन जीवों में गड़बड़ी को कम करने के लिए, तापमान की निगरानी के लिए ब्लॉक में केवल फ़िल्टर किए गए समुद्री जल से भरे छह या अधिक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों को यादृच्छिक रूप से रखें।
  14. इनक्यूबेशन अवधि के अंत में, के-टाइप इलेक्ट्रोड के साथ थर्मोकपल का उपयोग करके प्रत्येक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब के अंदर तापमान को मापें। इन तापमानों पर ध्यान दें।
  15. जानवरों के साथ सभी 60 माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों को हटा दें और उन्हें पूर्व-लेबल धारकों में रखें।
  16. ट्यूबों (चरण 3.14) को पूर्व निर्धारित तापमान पर इनक्यूबेट करें, जैसे कि पालन का तापमान, 1 घंटे के लिए, जो वसूली अवधि है।
    नोट: पुनर्प्राप्ति अवधि प्रजाति-विशिष्ट हो सकती है। लार्वा रेत डॉलर के लिए, पालन का तापमान 18 डिग्री सेल्सियस था, और इस प्रकार नमूना एक पर्यावरण कक्ष में रखा गया था। प्रासंगिक साहित्य से परामर्श करें और / या यह सुनिश्चित करने के लिए एक परीक्षण प्रयोग करें कि जीवित:मृत गिनती वसूली अवधि की लंबाई से प्रभावित नहीं हुई थी। प्रतिनिधि डेटा में, 1 घंटे के बाद जीवित जानवरों की संख्या वसूली के 12 या 24 घंटे के बाद के समान थी।
  17. थर्मल एक्सपोजर के बाद जीवित अध्ययन जीव के अनुपात की गणना करने के लिए, ग्लास पिपेट का उपयोग करके 35 मिमी पेट्री डिश पर एक व्यक्तिगत माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब की सामग्री को स्थानांतरित करें।
  18. उन व्यक्तियों की सापेक्ष संख्या का निरीक्षण करें और नोट करें जो अभी भी सक्रिय (जीवित) हैं और जिन्होंने एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत तैराकी या भंग (मृत) को जब्त कर लिया है। सुनिश्चित करें कि देखे गए व्यक्तियों की कुल संख्या चरण 3.7 में ट्यूबों में रखे गए व्यक्तियों की संख्या के बराबर है। यदि संख्याएं मेल नहीं खाती हैं तो व्यक्तियों के लिए माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब और पेट्री डिश के किनारे की जांच करें।

4. एलटी50 की गणना

  1. सीएसवी प्रारूप में कम से कम निम्नलिखित हेडर के साथ एक डेटा तालिका उत्पन्न करें: रुचि के चर को समूहीकृत करना, डिग्री सेल्सियस में ट्यूब का तापमान, जीवित व्यक्तियों की संख्या, और मृत व्यक्तियों की संख्या।
    नोट: प्रतिनिधि डेटा के लिए, ब्याज के समूह चर को उम्र से बदल दिया जाता है क्योंकि लक्ष्य आयु समूहों के बीच तुलना करना है।
  2. लॉजिस्टिक रिग्रेशन के साथ डेटा फिट करने के लिए, द्विपद वितरण के साथ एक सामान्यीकृत रैखिक मॉडल का उपयोग करें। पूरक कोडिंग फ़ाइल 1 ओपन-सोर्स सॉफ़्टवेयर आर22 का उपयोग करके एक उदाहरण नमूना स्क्रिप्ट दिखाता है।
  3. औसत ऊपरी थर्मल सीमा (एलटी50) निर्धारित करने के लिए, प्रेडिक्टर मान (यानी, तापमान) की गणना करें जिस पर 50% व्यक्ति बच गए। पूरक कोडिंग फ़ाइल 2 आर 22 में MASS23 से फ़ंक्शन डोज.पी का उपयोग करके एक उदाहरण स्क्रिप्ट दिखातीहै।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य ज़ोप्लांकटन की ऊपरी थर्मल सीमा निर्धारित करना है। ऐसा करने के लिए, एक स्थिर और रैखिक थर्मल ढाल की आवश्यकता होती है। प्रस्तावित सेटअप पानी के स्नान के तापमान को 8 डिग्री सेल्सियस और हीटर को 39 डिग्री सेल्सियस (चित्रा 2 ए) तक सेट करके 14 डिग्री सेल्सियस से 40 डिग्री सेल्सियस तक थर्मल ढाल उत्पन्न करने में सक्षम था। समापन बिंदु मानों को बदलकर तापमान ढाल को संकुचित और स्थानांतरित किया जा सकता है। हीटर को 37 डिग्री सेल्सियस और पानी के स्नान को 15 डिग्री सेल्सियस पर सेट करके एक संकीर्ण सीमा (19 डिग्री सेल्सियस से 37 डिग्री सेल्सियस) के साथ एक थर्मल ढाल भी उत्पन्न किया गया था। ब्लॉक में तापमान सेटअप के 45 मिनट से 1 घंटे के भीतर स्थिर हो जाता है (चित्रा 2 बी)।

ज़ोप्लांकटन के लिए इस प्रोटोकॉल के आवेदन को स्पष्ट करने के लिए, एलटी50 द्वारा इंगित ऊपरी थर्मल सीमा में परिवर्तन, रेत डॉलर (डेंडस्टर एक्ससेंट्रिकस) के लार्वा में ऑन्टोजेनी के माध्यम से जांच की गई थी। ग्रेविड रेत डॉलर व्यावसायिक रूप से प्राप्त किए गए थे ( सामग्री की तालिका देखें)। युग्मकों की रिहाई 0.35 एम पोटेशियम क्लोराइड के 0.5-1 एमएल को इंजेक्ट करके प्रेरित की गई थी। एकत्र किए गए अंडों को 0.45 μm फ़िल्टर किए गए समुद्री जल के साथ 63 μm नायलॉन जाल के माध्यम से धोया गया था। शुक्राणु को सूखा एकत्र किया गया और बर्फ पर रखा गया। अंडे ~ 104 शुक्राणु प्रति एमएल पर निषेचित किए गए थे। सामान्य उद्यान संस्कृतियों को प्रति एमएल पांच व्यक्तियों पर तीन पुरुषों और तीन महिलाओं से युग्मकों के साथ बनाया गया था। इन लार्वा संस्कृतियों को फ़िल्टर किए गए समुद्री जल में 12:12 प्रकाश: अंधेरे चक्र के तहत 18 डिग्री सेल्सियस पर 32 पीएसयू की लवणता के साथ रखा गया था, जिसमें हर दूसरे दिन पूर्ण जल परिवर्तन होता था।

जैसे-जैसे लार्वा रेत डॉलर विकसित हुए, ऊपरी थर्मल सीमा निषेचन के 2 दिनों के बाद 28.6 डिग्री सेल्सियस (± 0.02 डिग्री सेल्सियस एसई) से बढ़कर निषेचन के बाद 4 दिनों में 28.8 डिग्री सेल्सियस (± 0.02 डिग्री सेल्सियस एसई) और निषेचन के बाद 6 दिनों में 29.3 डिग्री सेल्सियस (± 0.02 डिग्री सेल्सियस एसई) हो गई (चित्रा 3)। ये ऊपरी थर्मल सीमाएं बताती हैं कि प्रशांत तट के साथ ~ 20 डिग्री सेल्सियस या उससे कम के औसत ग्रीष्मकालीन समुद्र की सतह के तापमान के दौरान रेत डॉलर अपनी थर्मल सीमा के भीतर रहते हैं। हालांकि, समुद्री हीटवेव की बढ़ती आवृत्ति और तीव्रता के साथ, अधिकतम तापमान में वृद्धि जारी है। अगस्त 2018 में दक्षिणी कैलिफोर्निया बिगहट में 26.4 डिग्री सेल्सियस का चरम तापमान दर्ज किया गया था (फ्यूमो एट अल.24)। यह देखते हुए कि यह प्रजाति वसंत और गर्मियों में प्रजनन करती है, इन चरम घटनाओं के दौरान उनके प्रारंभिक जीवन चरण की उत्तरजीविता कम होने की संभावना है। तापमान 26.5 डिग्री सेल्सियस तक पहुंचने पर अनुमानित उत्तरजीविता 10% कम हो जाएगी।

व्हीलर एट अल.25 द्वारा विकसित अनुपात परीक्षण का उपयोग करके जोड़ी-वार तुलना से पता चलता है कि औसत घातक तापमान तीन आयु समूहों (पी < 0.001) के बीच काफी भिन्न था। पहले के चरण (गैस्ट्रुला और शुरुआती प्रिज्म जो 2 दिन पुराने थे) पुराने लार्वा की तुलना में थर्मल तनाव के प्रति अधिक संवेदनशील थे। इस अवलोकन से पता चलता है कि विकास के एक समय बिंदु से ली गई थर्मल सीमा अपने पूरे जीवन इतिहास में उस प्रजाति का प्रतिनिधि नहीं है।

Figure 1
चित्र 1: हीट ब्लॉक का लेबल आरेख. (A) सभी घटकों के साथ सेटअप का शीर्ष दृश्य. (बी, डी) हीटर टर्मिनलों के लिए प्लेसमेंट और कनेक्शन। (C, E) हीट एक्सचेंजर (कूलिंग एलीमेनेट) और पानी के स्नान के लिए संबंधित टयूबिंग का प्लेसमेंट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: 1 घंटे से अधिक गर्मी ब्लॉक में तापमान परिवर्तन जिसमें समापन बिंदु 15 और 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट होते हैं। समापन बिंदु सेटिंग्स में परिवर्तन तापमान सीमा को बदलता है, और सबसे बड़ी सीमा 14 डिग्री सेल्सियस से 40 डिग्री सेल्सियस तक < थी। (बी) में प्रत्येक सेटिंग के लिए दो प्रतिकृति पंक्तियों से डेटा प्लॉट किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: 19 से 37 डिग्री सेल्सियस की तापमान सीमा में लार्वा रेत डॉलर (डेंड्रास्टर एक्ससेंट्रिकस) की उत्तरजीविता (निषेचन के बाद 2, 4, और 6 दिन) तक। प्रत्येक डेटम लार्वा के अनुपात का प्रतिनिधित्व करता है जो विशिष्ट तापमान पर 2 घंटे इनक्यूबेशन से बच गया और उसके बाद 1 घंटे की वसूली अवधि हुई। सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर आर में द्विपद वितरण के साथ सामान्यीकृत रैखिक मॉडल का उपयोग करके एक लॉजिस्टिक रिग्रेशन किया गया था ।

पूरक कोडिंग फ़ाइल 1: चरण-दर-चरण उदाहरण के साथ डेटा सेट के लिए लॉजिस्टिक कर्व्स उत्पन्न करने के लिए एक आर स्क्रिप्ट। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक कोडिंग फ़ाइल 2: एलटी50 अनुमान उत्पन्न करने के लिए एक आर स्क्रिप्ट। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यह प्रोटोकॉल तीव्र थर्मल एक्सपोजर के माध्यम से छोटे प्लवक जीवों की थर्मल सीमाओं को निर्धारित करने के लिए एक सुलभ और अनुकूलन योग्य दृष्टिकोण प्रदान करता है। 10-छेद डिजाइन और लचीले तापमान समापन बिंदु, निचले छोर पर पानी के स्नान और ऊपरी छोर पर हीटर द्वारा नियंत्रित, एलटी50 को सटीकता के साथ निर्धारित करने में सक्षम बनाते हैं। इस दृष्टिकोण का उपयोग करके, थर्मल सीमा में अंतर जो <1 डिग्री सेल्सियस है, का पता लगाया जा सकता है (चित्रा 3)। यह दृष्टिकोण विभिन्न प्रजातियों के लिए थर्मल सीमाओं (घंटों में) का तेजी से निर्धारण प्रदान करता है, और परिणामस्वरूप मूल्यों को कई प्रजातियों के वितरण मॉडल2,21 पर लागू किया गया है। हालांकि, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि क्रोनिक एक्सपोजर 8,26 की तुलना में तीव्र जोखिम संभवतः एक अलग थर्मल सहिष्णुता अनुमान प्रदान करता है।

वर्तमान डिजाइन का एक प्रमुख लाभ यह है कि 10 तापमान उपचार और छह प्रतिकृतियां एक छोटे पदचिह्न (20.3 सेमी x 15.2 सेमी x 5 सेमी) के भीतर शामिल हैं। थर्मल सीमा निर्धारित करने के लिए एक समान थर्मल ढाल दृष्टिकोण का उपयोग करने वाले पिछले प्रकाशनों ने एल्यूमीनियम सलाखों का उपयोग किया जो बड़े थे (27 में 180 सेमी x 10 सेमी x 6 सेमी, 91 सेमी × 25 सेमी ×10 में 15 सेमी, और17 में 60 सेमी x 20 सेमी)। जबकि एक ही तापमान रखने वाले सूखे स्नान छोटे होते हैं (उदाहरण के लिए, 18.5 सेमी x 18.5 सेमी x 2.5 सेमी) और कई प्रतिकृतियां प्रदान करते हैं, प्रदर्शन वक्र उत्पन्न करने के लिए कई इकाइयों (चार से अधिक) की आवश्यकता होती है जिसमें कई तापमान शामिल होते हैं, या प्रयोगों को समय के साथ दोहराया जाना चाहिए जो भ्रामक कारकों को पेश कर सकते हैं। हीट ब्लॉक डिज़ाइन निर्माण लागत और अंतरिक्ष आवश्यकताओं दोनों को कम करता है। निर्माण को ड्रिल प्रेस के साथ पूरा किया जा सकता है, या मिलिंग मशीन तक तत्काल पहुंच के बिना शोधकर्ता वाणिज्यिक सीएनसी मशीनिंग सेवाओं का विकल्प चुन सकते हैं। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध भागों का उपयोग आगे निर्माण लागत को नियंत्रित करता है। यदि कोई मौजूदा हीटिंग / कूलिंग वॉटर बाथ या मछलीघर चिलर का उपयोग कर सकता है, तो भागों की शेष लागत $ 350 से कम है। अन्यथा, 10 गैलन (~ 35 एल) मछली टैंक के लिए मछलीघर चिलर < $ 150 के लिए खरीदा जा सकता है।

शोधकर्ता की जरूरतों को पूरा करने के लिए वर्तमान डिजाइन को संशोधित किया जा सकता है। यदि लक्षित जीव आकार में बड़े हैं, तो सिंटिलेशन शीशियां अच्छे वैकल्पिक कंटेनर हैं, और बड़े छेद की आवश्यकता होगी। उस ने कहा, एल्यूमीनियम ब्लॉक वर्तमान डिजाइन में हटाने योग्य है, इसलिए प्रयोगात्मक आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए कई ब्लॉक बनाए और स्वैप किए जा सकते हैं। यदि प्रयोग का लक्ष्य कम थर्मल सीमा निर्धारित करना या ध्रुवीय जीवों पर ध्यान केंद्रित करना है, तो मुख्य एल्यूमीनियम ब्लॉक के दोनों सिरों पर शीतलन पानी के ब्लॉक रखना अधिक उपयुक्त है।

ज़ोप्लांकटन पर अन्य अध्ययनों के समान, वर्तमान प्रोटोकॉल में क्रमिक शीतलन चरण20,27 शामिल नहीं है। शोधकर्ता माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों को जोड़े में हटाने और उन्हें तापमान ढाल (यानी, चरण 3.9-3.12 को उलटने) से नीचे स्थानांतरित करने पर विचार कर सकते हैं ताकि क्रमिक शीतलन प्राप्त किया जा सके यदि उनके अध्ययन जीव अचानक तापमान में कमी के प्रति संवेदनशील हैं।

इस सेटअप की उपयोगिता को कई कारकों द्वारा कम किया जा सकता है, अर्थात् (1) समापन बिंदु तापमान सेटिंग्स, (2) जोखिम और पुनर्प्राप्ति अवधि, और 3) द्विपद स्थिति (जीवित बनाम मृत; विकसित बनाम गैर-विकसित) निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाने वाला मीट्रिक। इन संभावित सीमाओं को संबोधित करने के लिए, प्रारंभिक परीक्षण अत्यधिक अनुशंसित है।

चूंकि लॉजिस्टिक रिग्रेशन एक द्विपद वितरण मानता है, इसलिए 100% जीवित रहने और मृत्यु दर वाले समापन बिंदुओं को प्राथमिकता दी जाती है। समुद्री जीवों के लिए, एक उचित प्रारंभिक सीमा संग्रह स्थल का औसत वार्षिक समुद्री सतह का तापमान और 10-15 डिग्री सेल्सियस होगा। फिर इस तरह के प्रारंभिक परीक्षण के बाद जांच की गई तापमान सीमा को संकीर्ण किया जा सकता है, क्योंकि छेद के बीच तापमान का अंतर जितना छोटा होता है, एलटी50 अनुमान उतना ही ठीक होता है।

एक्सपोज़र और रिकवरी की अवधि प्रजाति-विशिष्ट है। उदाहरण के लिए, कुओ एट अल .27 ने किशोर व्हेल्क्स (नुसेला कैनालिकुलाटा) को 24 घंटे के लिए ठीक होने की अनुमति दी, जबकि हैमंड एट अल .28 ने लार्वा बैंगनी अर्चिन (जोरदारलोसेंट्रेटस पर्पर्टस) को वसूली के लिए 1 घंटे की अनुमति दी। कोई यह निर्धारित करने के लिए एक छोटा प्रयोग कर सकता है कि क्या जीवित: मृत गिनती वसूली अवधि के बीच भिन्न होती है। चुने गए द्विपद राज्य की परिभाषा के आधार पर (जैसे, जीवित बनाम मृत), पुनर्प्राप्ति समय आवश्यक नहीं हो सकता है। यदि प्रयोग का लक्ष्य यह परीक्षण करना है कि क्या विकास प्रक्रियाएं, जैसे दरार और गैस्ट्रुलेशन, तापमान की एक श्रृंखला में होती हैं। दूसरे शब्दों में, मॉडल में उपयोग की जाने वाली द्विपद अवस्था विकसित की जाएगी जबकिविकसित नहीं की जाएगी 8,19,21। 4% पैराफॉर्मलडिहाइड जैसे फिक्सेटिव को बिना किसी रिकवरी समय के थर्मल एक्सपोजर अवधि में नमूनों में जोड़ा जाना चाहिए।

द्विपद अवस्था (जीवित बनाम मृत; विकसित बनाम गैर-विकसित) की सटीक गणना और निर्धारण सुनिश्चित करने के लिए, संभावित पर्यवेक्षक पूर्वाग्रहों से बचने के लिए यादृच्छिक रूप से वसूली समय के बाद नमूनों की गणना करना उचित है। यदि पर्याप्त कर्मी हैं, तो विभिन्न शोधकर्ता प्रतिकृति पंक्तियों की गणना कर सकते हैं और उनके परिणामों की तुलना कर सकते हैं। वैकल्पिक रूप से, व्यक्ति बार-बार नमूनों के एक छोटे उप-समूह को गिन सकते हैं और जांच सकते हैं कि संख्याएं सुसंगत हैं या नहीं।

एक और संभावित सीमा स्वतंत्र नमूने29 से एलटी50 के त्रुटि आकलन की कमी है। वर्तमान डेटा विश्लेषण विधि फिट किए गए लॉजिस्टिक वक्र (पूरक कोडिंग फ़ाइल 1) के साथ 95% आत्मविश्वास अंतराल और एलटी50 (पूरक कोडिंग फ़ाइल 2) की एक मानक त्रुटि प्रदान करती है। ये त्रुटि सीमाएं वक्र फिटिंग प्रक्रिया से उत्पन्न होती हैं, न कि नमूना आबादी से व्यक्तियों के कई मापों के माध्यम से। वर्तमान हीटब्लॉक डिज़ाइन में छह पंक्तियाँ हैं, कोई भी छह एलटी50 अनुमान उत्पन्न करने और अवलोकन-आधारित त्रुटि अनुमान प्राप्त करने के लिए प्रत्येक पंक्ति से डेटा फिट कर सकता है।

सारांश में, तीव्र थर्मल सीमाओं को निर्धारित करने के लिए एक सुलभ दृष्टिकोण प्रस्तुत किया गया है जिसे विभिन्न प्रकार के ज़ोप्लांकटन पर लागू किया जा सकता है। इस सेटअप का उपयोग विभिन्न जीवों की थर्मल सीमाओं को निर्धारित करने और विकास चरणों को इंगित करने के लिए किया जा सकता है जो कमजोर हैं। यह जानकारी वैश्विक जलवायु परिवर्तन के सामने जीव प्रदर्शन और संभावित सामुदायिक बातचीत की भविष्यवाणी को बेहतर बनाने में मदद कर सकती है।

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Disclosures

लेखकों के पास घोषित करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

यह काम स्वार्थमोर कॉलेज [केसी] के संकाय अनुसंधान कोष और बीजे के लिए रॉबर्ट रेनॉल्ड्स और लुसिंडा लुईस '70 ग्रीष्मकालीन अनुसंधान फैलोशिप द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45 µm membrane filter VWR 74300-042
½” Acrylic sheet McMaster-Carr 8560K266 Used to construct a ridged case with sufficient insulation.
1 mL syringe VWR 76290-420
2 Channel 7 Thermocouple Types Datalogger Omega Engineering HH506A Can be replaced with any thermometer that will fit inside a microcentrifuge tube
Automatic pipette  Ranin 
Bolt- and Clamp-Mount Strip Heater
with 430 Stainless Steel Sheath, 120V AC, 1-1/2" Wide, 100W		 McMaster-Carr 3619K32
Crystal Sea Bioassay Mix Pentair CM2B Use to make aritifical seawater 
Denraster excentricus M-Rep  Sand dollars from California 
Dissecting microscope  Nikon  SMZ645
DIYhz Aluminum Water Cooling Block, Liquid Water Cooler Heat Sink System for PC Computer CPU Graphics Radiator Heatsink Endothermic Head Silver(40 mm x 120 mm x 12 mm) Amazon Connects to water bath and used to cool one end of the block.
Easy-to-Machine MIC6 Cast Aluminum Sheet 2" thick 8" x 8"  McMaster-Carr 86825K953 Machined to 2" x 6" x 8" with 60 equally spaced holes (11 mm dia., 42 mm depth) with two addition holes drilled in one side for thermostat probes.
Economical Flexible Polyethylene Foam Pipe Insulation McMaster-Carr 4530K121 Covers the plastic tubing between chiller and block to reduce heat loss. Can be omitted if temperature range is close to room temperature 
EVERSECU 72w 110-240v Aquarium Water Chiller Warmer/Cooler Temperature Controller for Fish Shrimp Tank Marine Coral Reef Tank Below 20 L/30 L Aquarium Chiller Amazon Can be used in place of the lab-grade water bath 
Example with larval sand dollar 
GENNEL 100 g Silver Silicone Thermal Conductive Compound Grease Paste For GPU CPU IC LED Ovens Cooling Amazon Improves the thermal conductance between the block and the heating and cooling elements.
Inkbird WiFi Reptile Thermostat Temperature Controller with 2 Probes and 2 Outlets, IPT-2CH Reptiles Heat Mat Thermostat (Max 250 W per Outlet) Amazon Monitors hot and cold ends. Maintains hot end in range
Lauda Ecoline Silver Air-Cooled Refrigerated Circulators VWR 89202-386 Can be replaced with an aquarium chiller 
Microcentrifuge Tubes VWR 76019-014 If larger animals are used, scanilation vials (VWR 66022-004) is a good alternative 
Nitex mesh filter  Self made Used hot glue to attached Nitex mesh to 1/2" PVC tubing 
Pasteur pipette VWR 14673-010
Potassium Chloride (0.35 M)  Millpore-Sigma P3911-500G
R statistical software.  The R Project for Statistical Computing
Syringe needle VWR 89219-346 Depending on size of target organism gague 14 and 16 can be used
Tygon Tubing  McMaster-Carr 5233K65 Adjust to match the chiller and block used 
Zoo Med Repti Temp Rheostat Chewy.com Rated to 150 W and rewired to feed directly into the heating element. Used to control rate of heat output

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References

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हीट ब्लॉक का उपयोग करके ज़ोप्लांकटन के लिए थर्मल सीमा निर्धारण
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Chan, K. Y. K., Jorgensen, B. K.,… More

Chan, K. Y. K., Jorgensen, B. K., Scoma, S. Thermal Limits Determination for Zooplankton Using a Heat Block. J. Vis. Exp. (189), e64762, doi:10.3791/64762 (2022).

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