Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Isı Bloğu Kullanarak Zooplankton için Termal Sınırların Belirlenmesi

Published: November 18, 2022 doi: 10.3791/64762
Automatic Translation
1, 1, 1
1Biology Department, Swarthmore College

Summary

Mevcut protokol, kararlı ve doğrusal bir termal gradyan oluşturmak için ticari olarak temin edilebilen bileşenlerin kullanımını göstermektedir. Bu gradyan daha sonra planktonik organizmaların, özellikle omurgasız larvaların üst termal sınırını belirlemek için kullanılabilir.

Abstract

Termal sınırlar ve genişlik, tür dağılımını tahmin etmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Küresel sıcaklık yükselmeye devam ettikçe, termal sınırın iklimlendirme ile nasıl değiştiğini ve yaşam aşamaları ile popülasyonlar arasında nasıl değiştiğini anlamak, türlerin gelecekteki ısınmaya karşı savunmasızlığını belirlemek için hayati öneme sahiptir. Çoğu deniz organizması, erken planktonik aşamaları içeren karmaşık yaşam döngülerine sahiptir. Bu küçük erken gelişim aşamalarının (onlarca ila yüzlerce mikron) termal sınırını ölçmek, gelişimsel darboğazları belirlemeye yardımcı olurken, bu süreç, hedef organizmaların küçük boyutu, büyük tezgah alanı gereksinimi ve yüksek ilk üretim maliyeti nedeniyle zor olabilir. Burada, küçük hacimlere (mL'den onlarca mL'ye) yönelik bir kurulum sunulmaktadır. Bu kurulum, kararlı ve doğrusal bir termal gradyan oluşturmak için ticari olarak temin edilebilen bileşenleri birleştirir. Kurulumun üretim şartnamelerinin yanı sıra canlı ve ölü bireyleri tanıtmak ve numaralandırmak ve ölümcül sıcaklığı hesaplamak için prosedürler de sunulmaktadır.

Introduction

Termal tolerans, organizmaların hayatta kalmasının ve fonksiyonunun anahtarıdır 1,2. Gezegen antropojenik karbon emisyonları nedeniyle ısınmaya devam ettikçe, termal sınırların belirlenmesine ve uygulanmasına giderek daha fazla dikkat edilmektedir3. Mortalite, gelişme başarısızlığı ve hareketlilik kaybı gibi çeşitli sonlanım noktaları, hem üst hem de alt termal sınırları belirlemek için kullanılmıştır4. Bu termal sınırlar genellikle bir organizmanın termal nişi için bir vekil olarak kabul edilir. Bu bilgi, küresel ısınmaya karşı daha savunmasız olan türleri tanımlamanın yanı sıra gelecekteki tür dağılımını ve ortaya çıkan tür etkileşimlerini tahmin etmek için kullanılır 3,5,6,7. Bununla birlikte, özellikle küçük planktonik organizmalar için termal sınırların belirlenmesi zor olabilir.

Planktonik organizmalar için, özellikle deniz omurgasızlarının larva aşamaları için, termal sınır kronik maruz kalma yoluyla belirlenebilir. Kronik maruziyet, larvaların günler ila haftalar boyunca çeşitli sıcaklıklarda yetiştirilmesi ve larva hayatta kalma ve / veya gelişim hızının 8,9,10 azaldığı sıcaklığın belirlenmesiyle elde edilir. Bununla birlikte, bu yaklaşım oldukça zaman alıcıdır ve larva yetiştiriciliğinde büyük inkübatörler ve deneyim gerektirir (deniz omurgasız larvalarının kültürlenmesine iyi bir giriş için referans11'e bakınız).

Alternatif olarak, termal strese akut maruz kalma, termal sınırları belirlemek için kullanılabilir. Genellikle, bu belirleme yaklaşımı, larvalı küçük şişelerin sıcaklık kontrollü kuru banyolarayerleştirilmesini içerir 12,13,14, PCR termal döngüleyiciler15,16'daki termal gradyan fonksiyonlarından yararlanmayı veya cam şişeler / mikrosantrifüj tüplerini, şişelerin sıkıca oturduğu deliklere sahip büyük alüminyum blokların uçlarına uygulanan ısıtma ve soğutma ile üretilen bir termal gradyan boyunca koymayı içerir 17, 18,19. Tipik kuru banyolar tek bir sıcaklık üretir; Bu nedenle, bir dizi sıcaklıktaki performansı değerlendirmek için birden fazla ünite aynı anda çalıştırılmalıdır. Termal döngüleyiciler bir gradyan üretir, ancak yalnızca küçük bir numune hacmini (120 μL) barındırır ve dikkatli manipülasyonlar gerektirir. Termal döngüleyicilere benzer şekilde, büyük alüminyum bloklar doğrusal ve kararlı sıcaklık gradyanları oluşturur. Her iki yaklaşım da, nüfusun% 50'si için ölümcül sıcaklığı hesaplamak için lojistik veya probit regresyonu ile birleştirilebilir (LT50)12,20,21. Bununla birlikte, kullanılan alüminyum bloklar ~ 100 cm uzunluğundaydı; Bu boyut, büyük bir laboratuvar alanı ve delikleri delmek için özel bilgisayarlı sayısal kontrollü freze makinelerine erişim gerektirir. Hedef sıcaklığı korumak için iki araştırma sınıfı su banyosu kullanmanın yanı sıra, kurulumu monte etmenin finansal maliyeti yüksektir.

Bu nedenle, bu çalışma, ticari olarak temin edilebilen parçalarla kararlı, doğrusal bir sıcaklık gradyanı oluşturmak için alternatif bir araç geliştirmeyi amaçlamaktadır. Böyle bir ürün küçük bir ayak izine sahip olmalı ve planktonik organizmalar için akut termal strese maruz kalma deneyleri için kolayca kullanılabilmelidir. Bu protokol, hedef organizmalar olarak <1 mm büyüklüğünde zooplankton ile geliştirilmiştir ve bu nedenle 1.5 veya 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünün kullanımı için optimize edilmiştir. Daha büyük çalışma organizmaları, kullanılan 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerinden daha büyük kaplara ve alüminyum bloklardaki büyütülmüş deliklere ihtiyaç duyacaktır.

Deney aparatını daha erişilebilir hale getirmenin yanı sıra, bu çalışma veri işleme boru hattını basitleştirmeyi amaçlamaktadır. Ticari istatistik yazılımı, lojistik veya probit regresyonunu kullanarak LT50'yi hesaplamak için rutinler sağlarken, lisanslama maliyeti önemsiz değildir. Bu nedenle, açık kaynaklı istatistik programı R22'ye dayanan kullanımı kolay bir komut dosyası, veri analizini daha erişilebilir hale getirecektir.

Bu protokol, kompakt bir ısı bloğunun ticari olarak temin edilebilen parçalarla nasıl üretilebileceğini ve üst termal sınırlarını belirlemek için zooplanktonları (kum doları Dendraster excentricus'un larvaları) akut ısı stresine maruz bırakmak için nasıl uygulanabileceğini göstermektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Isı bloğunun imalatı

  1. 120 V, 100 W şerit ısıtıcıyı reostat'a bağlayın (bkz.
  2. 20,3 cm x 15,2 cm x 5 cm (8 inç x 5 inç x 2 inç) alüminyum bloğunu, 6 x 10 ızgarada 60 delik açarak hazırlayın (bkz. Deliklerin her iki yönde de merkezden merkeze 2 cm aralıklı olduğundan emin olun. Her biri 1,1 cm çapında ve 4,2 cm derinliğinde olmalıdır (Şekil 1).
    NOT: Delme işlemini bir freze makinesinde veya yüksek hızlı çelik matkap uçlarına sahip matkap presinde gerçekleştirin. Isıtma elemanı ve soğutma elemanı, 15,2 cm x 5 cm'lik yüzeylerin temas yüzeyinin mümkün olduğunca çoğunu kapsayacak şekilde seçildi.
  3. 1. ve 2. kolon ile 9. ve 10. kolon arasındaki 20,3 cm x 5cm'lik yüzeylerden birinde, sıcaklık kontrolörü problarının boyutuyla eşleşen iki ek delik açın (bkz.
  4. Hem elemanları yerinde tutmak hem de tamamlanan ısı bloğunu yalıtmak için 1,2 cm (0,5 inç) şeffaf akrilik levhalardan ( Malzeme Tablosuna bakınız) bir kasa oluşturun. Isıtma elemanının arka tarafını yalıtmak için iki kat akrilik kullanın (Şekil 1).
  5. Son montajda, ısıtma elemanından bloğa ve bloktan soğutma elemanına ısı iletkenliğini en üst düzeye çıkarmak için termal macun uygulayın (bkz.

2. Termal gradyan ayarlarının belirlenmesi

  1. Su banyosunu/akvaryum soğutucusunu Tygon boruya bağlayın (bkz. Boruyu gerektiğinde köpük boru yalıtımı ile yalıtın.
  2. Termostat probunu alüminyum bloğun yanındaki deliklere yerleştirin. Prob 1'in ısıtma elemanının yanına yerleştirildiğinden emin olun.
  3. Ağzına kadar doldurulmuş mikrosantrifüj tüplerini (1,5 mL) musluk suyuyla tüm frezelenmiş deliklere (toplam 60 tüp) yerleştirin.
  4. Sıcaklık kontrol cihazını açın ve prob 1 ila 35-37 ° C ve prob 2 ila 21.5-22.5 ° C'nin durma ısıtma sıcaklığını ayarlayın.
    NOT: Önerilen termostatın bağımsız olarak çalışan iki çıkışı vardır; Bu özel kullanım durumunda sıcak sıcaklığı düzenlemek için sadece prob 1 kullanılır. Bu nedenle, prob 2'nin sıcaklığını düşük uç sıcaklığına ayarlayın.
  5. Isıtma elemanını açmak için reostat döndürün ve ortasına ayarlayın.
  6. Su banyosunu/akvaryum soğutucusunu açın ve soğutucu sıcaklığını 15 °C'ye ayarlayın.
  7. Bloğun bir ucunda sıcak ve diğer ucunda serin olup olmadığını 10 dakika sonra kontrol edin.
    DİKKAT: Isıtma elemanının açıkta kalan uçları sıcak olabilir; onlara dokunmayın.
  8. Her bir mikrosantrifüj tüpünün içindeki sıcaklığı, daha sonra her 10 dakikada bir K-tipi elektrotlu bir termokupl kullanarak kontrol edin (Malzeme Tablosuna bakınız). Sıcaklık ~ 60 dakika sonra stabilize olacak ve doğrusal görünecektir (Şekil 2).
  9. Sıcaklık kontrol cihazının ve su banyosunun ayarlarını gerektiği gibi değiştirerek uç noktaların değerlerini ayarlayın.

3. Termal maruz kalma ve canlı: ölü numaralandırma

NOT: Adım 2, sıcaklık gradyanı için istenen ayarlar belirlendikten sonra atlanabilir.

  1. Devridaim suyu banyosunu ve ısıtıcıyı açın ve 19,5 ° C ila 37 ° C arasında bir sıcaklık gradyanı oluşturmak için sırasıyla 15 ° C ve 37 ° C'ye ayarlayın.
  2. Termal gradyanın doğrusal olmasını sağlamak için, ağzına kadar (1,5 mL) doldurulmuş mikrosantrifüj tüplerini tüm frezelenmiş deliklere (toplam 60 tüp) musluk suyuyla yerleştirin.
  3. Isı bloğunun 45-60 dakika bekleyerek ayarlanan sıcaklığa ulaşmasına izin verin. Beklenen sıcaklığa ulaşıp ulaşmadığını görmek için K tipi elektrotlu bir termokupl kullanarak her bir mikrosantrifüj tüpünün içindeki sıcaklığı kontrol edin. Bu sıcaklıklara dikkat edin.
  4. Çalışma organizmaları >500 μm boyutlarındaysa ve bir kaptan diğerine kolayca aktarılabiliyorsa (örneğin, bir kopepod), 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünü 750 μL 0.45 μm filtrelenmiş deniz suyu ile doldurun. Alternatif olarak, çalışma organizmaları küçükse, 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünü 250 μL 0.45 μm filtrelenmiş deniz suyu ile doldurun.
    NOT: Temsili veriler için, döllenmeden 2, 4 ve 6 gün sonra olan kum doları Dendraster eksantriklerinin larvaları kullanılmıştır (bkz. Bu bireylerin ortalama (± S.D., n = her yaş için 15) büyüklüğü sırasıyla 152 ± 7 μm, 260 ± 17 μm ve 292 ± 14 μm idi. Bu larvaların kolayca konsantre edilebileceği göz önüne alındığında (adım 3.5), mikrosantrifüj tüpleri 750 μL filtrelenmiş deniz suyu ile doldurulmuştur.
  5. Çalışma organizmalarının kültürünü ters filtreleme ile yoğunlaştırın (yani, ağı çalışma organizmalarını tutan kaba yerleştirin ve ağın üstünden suyu çıkarın), böylece çalışma organizmaları beherin dibinde kalır11.
    NOT: İncelenen larva kumu dolarları için 30 μm naylon ağ kullanılmıştır (bakınız Malzeme Tablosu).
  6. Konsantre hayvan numunesini filtrelenmiş deniz suyuyla durulayın (örneğin, alg gıda maddeleri veya diğer kimyasallarla kültürlenirken). Hayvan numunesini konsantre etmek için ters filtrelemeyi bir kez daha tekrarlayın.
  7. Yarı dolu mikrosantrifüj tüplerine bilinen sayıda bireysel organizma yerleştirin. Küçük planktonik organizmaları diseksiyon mikroskobu altında sayın (bakınız Malzeme Tablosu) ve bunları cam Pasteur pipetlerle aktarın.
    NOT: Yerleştirilecek organizmaların sayısı boyuta bağlıdır; ~ 200 μm büyüklüğünde larva kum dolarları için, mikrosantrifüj tüpü başına 20 kişi uygundu.
    DİKKAT: Cam pipetler, bazı planktonik organizmalar hidrofobik olduğundan ve plastik yüzeylere yapışacağından plastik pipetlerden daha çok arzu edilir.
  8. Son hacim 1 mL olana kadar hayvanları içeren mikrosantrifüj tüplerine 0,45 μm filtrelenmiş deniz suyu ekleyin.
  9. Organizmaların istenen deneysel sıcaklığa kademeli olarak ısınmasına izin vermek için, 3.7. adımda hazırlanan hayvanlarla birlikte mikrosantrifüj tüplerini soğuk uçtan başlayarak ısı bloğuna yerleştirin. Her sıraya mikrosantrifüj tüp çiftleri yerleştirin (toplam 12 tüp).
  10. 10 dakika bekleyin.
  11. Adım 3.9'da yerleştirilen mikrosantrifüj boru çiftlerini, daha sıcak sıcaklıklara sahip bitişik delinmiş deliklere taşıyın. Soğuk uçtaki her sıraya ek mikrosantrifüj tüp çiftleri yerleştirin. Artık her satırda dört tüp olacak. 10 dakika daha bekleyin.
  12. Hayvanlarla birlikte mikrosantrifüj tüpleri eklemeye devam edin, konumlarını soğuk uçtan daha sıcak uca çiftler halinde kaydırın. Isı bloğu tamamen dolana kadar her vardiya arasında 10 dakika bekleyin.
    NOT: Adım 3.9-3.12, çalışma organizmalarının yaşadığı sıcaklığı kademeli olarak artırmak için bir yükseltme aşaması olarak kabul edilir.
  13. Hayvanların 2 saat boyunca belirlenen sıcaklıkta kuluçkaya yatmasına izin verin. Bu adım, deneyin sabit sıcaklığa maruz kalma aşamasıdır.
    1. Kuluçka süresi 2 saati aşarsa, mikrosantrifüj tüplerinin sıcaklığını her saat başı bir termokupl ile kontrol edin.
      NOT: Kuluçka süresini deneysel ihtiyaçlara göre ayarlayın. Kuluçka 2 saatten uzunsa, öngörülemeyen ekipman arızası durumunda tüplerin sıcaklığını düzenli aralıklarla bir termokupl ile kontrol edin. Çalışma organizmalarındaki rahatsızlığı en aza indirmek için, sıcaklık izleme için bloğa sadece filtrelenmiş deniz suyuyla doldurulmuş altı veya daha fazla mikrosantrifüj tüpünü rastgele yerleştirin.
  14. Kuluçka süresinin sonunda, her bir mikrosantrifüj tüpünün içindeki sıcaklığı, K-tipi elektrotlu bir termokupl kullanarak ölçün. Bu sıcaklıklara dikkat edin.
  15. 60 mikrosantrifüj tüpünün tümünü hayvanlarla çıkarın ve önceden etiketlenmiş tutuculara yerleştirin.
  16. Tüpleri (adım 3.14), yetiştirme sıcaklığı gibi önceden belirlenmiş sıcaklıkta, iyileşme süresi olan 1 saat boyunca inkübe edin.
    NOT: İyileşme süresi türe özgü olabilir. Larva kum doları için, yetiştirme sıcaklığı 18 ° C idi ve böylece numune bir çevre odasına yerleştirildi. İlgili literatüre danışın ve / veya canlı: ölü sayısının iyileşme süresinin uzunluğundan etkilenmediğinden emin olmak için bir deneme deneyi yapın. Temsili verilerde, 1 saatten sonra yaşayan hayvan sayısı, 12 veya 24 saatlik iyileşmeden sonra olduğu gibi aynıydı.
  17. Termal maruziyetten sonra canlı olan çalışma organizmasının oranını numaralandırmak için, bireysel bir mikrosantrifüj tüpünün içeriğini bir cam pipet kullanarak 35 mm'lik bir Petri kabına aktarın.
  18. Hala aktif (canlı) olan ve diseksiyon mikroskobu altında yüzmeyi ele geçiren veya çözünen (ölü) bireylerin göreceli sayısını gözlemleyin ve not edin. Gözlemlenen toplam birey sayısının, adım 3.7'de tüplere yerleştirilen birey sayısına eşit olduğundan emin olun. Sayılar eşleşmiyorsa, mikrosantrifüj tüplerinin ve Petri kabının yan tarafını kontrol edin.

4. LT50'nin hesaplanması

  1. En azından aşağıdaki başlıkları içeren CSV formatında bir veri tablosu oluşturun: ilgilenilen değişkeni gruplandırma, tüpün °C cinsinden sıcaklığı, yaşayan bireylerin sayısı ve ölen bireylerin sayısı.
    NOT: Temsili veriler için, amaç yaş grupları arasında karşılaştırma yapmak olduğundan, ilgi alanı gruplandırma değişkeni yaş ile değiştirilir.
  2. Verileri lojistik regresyonla eşleştirmek için, binom dağılımına sahip genelleştirilmiş doğrusal bir model kullanın. Ek Kodlama Dosyası 1 , açık kaynaklı yazılım R22'yi kullanan örnek bir örnek komut dosyası gösterir.
  3. Medyan üst termal sınırı (LT 50) belirlemek için, bireylerin%50'sinin hayatta kaldığı öngörücü değeri (yani sıcaklık) hesaplayın. Ek Kodlama Dosyası 2, R 22'deki MASS23'ten dose.p işlevini kullanan örnek bir komut dosyası gösterir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu protokolün amacı, zooplanktonun üst termal sınırını belirlemektir. Bunu yapmak için, kararlı ve doğrusal bir termal gradyana ihtiyaç vardır. Önerilen kurulum, su banyosu sıcaklığını 8 ° C'ye ve ısıtıcıyı 39 ° C'ye ayarlayarak 14 ° C ila 40 ° C arasında değişen bir termal gradyan üretebildi (Şekil 2A). Sıcaklık gradyanı, uç nokta değerleri değiştirilerek daraltılabilir ve kaydırılabilir. Isıtıcıyı 37 °C'ye ve su banyosunu 15 °C'ye ayarlayarak daha dar bir aralığa (19 °C ila 37 °C) sahip bir termal gradyan da üretildi. Bloktaki sıcaklık, kurulumdan sonraki 45 dakika ila 1 saat içinde stabilize olur (Şekil 2B).

Bu protokolün zooplanktona uygulanmasını göstermek için, LT50 ile belirtilen üst termal sınırdaki değişim, kum dolarının larvalarındaki ontojeni yoluyla (Dendraster excentricus) incelenmiştir. Gravid kum dolarları ticari olarak elde edilmiştir (bakınız Malzeme Tablosu). Gametlerin salınımı 0.5-1 mL 0.35 M potasyum klorür enjekte edilerek indüklendi. Toplanan yumurtalar, 0.45 μm filtrelenmiş deniz suyu ile 63 μm naylon ağ ile durulandı. Sperm kuru toplandı ve buz üzerinde tutuldu. Yumurtalar mL başına ~ 104 spermde döllendi. Ortak bahçe kültürleri, mL başına beş kişide üç erkek ve üç dişiden gametlerle yaratılmıştır. Bu larva kültürleri, filtrelenmiş deniz suyunda, 12: 12 ışık: karanlık döngüsü altında 18 ° C'de 32 psu tuzluluk ile tutuldu ve her geçen gün tam su değişimi yapıldı.

Larva kum dolarları geliştikçe, üst termal sınır döllenme sonrası 2 günde 28.6 ° C'den (± 0.02 ° C SE) döllenme sonrası 4 günde 28.8 ° C'ye (± 0.02 ° C SE) ve döllenmeden sonraki 6 günde 29.3 ° C'ye (± 0.02 ° C SE) yükselmiştir (Şekil 3). Bu üst termal sınırlar, Pasifik kıyısı boyunca ~ 20 ° C veya daha düşük ortalama yaz deniz yüzeyi sıcaklığı sırasında kum dolarlarının termal sınırları içinde yaşadığını göstermektedir. Bununla birlikte, deniz ısı dalgalarının sıklığının ve yoğunluğunun artmasıyla, maksimum sıcaklık yükselmeye devam eder. Ağustos 2018'de Güney Kaliforniya Bight'te 26.4 ° C'lik bir tepe sıcaklığı kaydedildi (Fumo ve ark.24). Bu türün ilkbahar ve yaz aylarında çoğaldığı göz önüne alındığında, erken yaşam evrelerinin hayatta kalmasının bu aşırı olaylar sırasında azalması muhtemeldir. Tahmin edilen hayatta kalma, sıcaklık 26.5 ° C'ye ulaştığında% 10 oranında azalacaktır.

Wheeler ve ark.25 tarafından geliştirilen oran testini kullanan çift yönlü karşılaştırmalar, medyan öldürücü sıcaklığın üç yaş grubu arasında anlamlı derecede farklı olduğunu göstermektedir (p < 0.001). Daha erken evreler (gastrula ve 2 günlük erken prizmalar) yaşlı larvalardan daha fazla termal strese duyarlıydı. Bu gözlem, tek bir gelişim noktasından çıkarılan termal sınırın, yaşam tarihi boyunca bu türün temsilcisi olmadığını göstermektedir.

Figure 1
Şekil 1: Isı bloğunun etiketli diyagramı. (A) Tüm bileşenler bağlıyken kurulumun üstten görünümü. (B,D) Isıtıcı terminalleri için yerleştirme ve bağlantılar. (C,E) Isı eşanjörünün (soğutma elemenet) ve ilgili boruların su banyosuna yerleştirilmesi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Uç noktaları 15 ve 37 °C'ye ayarlanmış ısı bloğunda 1 saatin üzerindeki sıcaklık değişimleri . (A) 1 saat içinde doğrusal bir gradyan elde edildi. Uç nokta ayarlarının değiştirilmesi sıcaklık aralığını değiştirir ve en büyük aralık 14 °C ila 40 °C arasındadır. (B) Çoğaltma sıraları arasındaki sıcaklık farkı ihmal edilebilir düzeydeydi (<0,8 °C); iki çoğaltma satırındaki veriler, (B) içindeki her ayar için çizilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Larva kum dolarının (Dendraster excentricus) ontojeni boyunca 19 ila 37 ° C sıcaklık aralığında hayatta kalması (döllenmeden 2, 4 ve 6 gün sonra [dpf]). Her veri, belirli bir sıcaklıkta 2 saatlik bir inkübasyondan ve ardından 1 saatlik bir iyileşme periyodundan kurtulan larvaların oranını temsil eder. İstatistiksel yazılım R'de binom dağılımına sahip genelleştirilmiş doğrusal model kullanılarak lojistik bir regresyon gerçekleştirildi .

Ek Kodlama Dosyası 1: Adım adım bir örnekle veri kümesi için lojistik eğriler oluşturmak üzere bir R betiği. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Kodlama Dosyası 2: LT50 tahminleri oluşturmak için bir R komut dosyası. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu protokol, akut termal maruziyet yoluyla küçük plankton organizmalarının termal sınırlarını belirlemek için erişilebilir ve özelleştirilebilir bir yaklaşım sağlar. Alt uçtaki su banyosu ve üst uçtaki ısıtıcı tarafından kontrol edilen 10 delikli tasarım ve esnek sıcaklık uç noktaları, LT50'nin hassas bir şekilde belirlenmesini sağlar. Bu yaklaşım kullanılarak, termal sınırda <1 °C olan bir fark tespit edilebilir (Şekil 3). Bu yaklaşım, çeşitli türler için termal sınırların (saat cinsinden) hızlı bir şekilde belirlenmesini sağlar ve elde edilen değerler birden fazla tür dağılım modeline uygulanmıştır 2,21. Bununla birlikte, akut maruziyetin, kronik maruziyet 8,26 ile karşılaştırıldığında muhtemelen farklı bir termal tolerans tahmini sağladığını belirtmek önemlidir.

Mevcut tasarımın en büyük avantajlarından biri, 10 sıcaklık işleminin ve altı kopyanın küçük bir ayak izi (20,3 cm x 15,2 cm x 5 cm) içine dahil edilmesidir. Termal sınırları belirlemek için benzer bir termal gradyan yaklaşımı kullanan önceki yayınlarda daha büyük alüminyum çubuklar kullanılmıştır (27'de 180 cm x 10 cm x 6 cm, 25 cm × 10'da 15 cm ve17'de 60 cm x20 cm'×91 cm) Tek bir sıcaklığa sahip kuru banyolar daha küçüktür (örneğin, 18,5 cm x 18,5 cm x 2,5 cm) ve birden fazla kopya sunarken, birden fazla sıcaklık içeren bir performans eğrisi oluşturmak için birkaç birim (dörtten fazla) gereklidir veya deneylerin zaman içinde tekrarlanması gerekir, bu da kafa karıştırıcı faktörlere neden olabilir. Isı bloğu tasarımı hem imalat maliyetini hem de alan gereksinimlerini azaltır. İmalat bir matkap presi ile tamamlanabilir veya bir freze makinesine anında erişimi olmayan araştırmacılar ticari CNC işleme hizmetlerini tercih edebilir. Ticari olarak temin edilebilen parçaların kullanımı, üretim maliyetini daha da kontrol eder. Mevcut bir ısıtma / soğutma suyu banyosu veya akvaryum soğutucuları kullanılabiliyorsa, parçaların kalan maliyeti 350 $ 'dan azdır. Aksi takdirde, 10 galonluk (~ 35 L) bir balık tankı için akvaryum soğutucuları < $ 150 karşılığında satın alınabilir.

Mevcut tasarım, araştırmacının ihtiyaçlarına uyacak şekilde değiştirilebilir. Hedef organizmaların boyutu daha büyükse, parıltı şişeleri iyi alternatif kaplardır ve daha büyük delikler gerekecektir. Bununla birlikte, alüminyum blok mevcut tasarımda çıkarılabilir, bu nedenle deneysel ihtiyaçlara uyacak şekilde birden fazla blok yapılabilir ve değiştirilebilir. Deneyin amacı daha düşük bir termal sınır belirlemek veya kutupsal organizmalara odaklanmaksa, ana alüminyum bloğun her iki ucuna soğutma suyu blokları yerleştirmek daha uygundur.

Zooplankton ile ilgili diğer çalışmalara benzer şekilde, mevcut protokol kademeli bir soğutma fazı20,27 içermemektedir. Araştırmacılar, mikrosantrifüj tüplerini çiftler halinde çıkarmayı ve çalışma organizmaları ani bir sıcaklık düşüşüne duyarlıysa, kademeli soğutma elde etmek için bunları sıcaklık gradyanından aşağı kaydırmayı (yani, 3.9-3.12 adımlarını tersine çevirmeyi) düşünebilirler.

Bu kurulumun faydası, (1) uç nokta sıcaklık ayarları, (2) maruz kalma ve iyileşme süresi ve 3) binom durumunu belirlemek için kullanılan metriğin seçimi (canlı ve ölü; gelişmiş ve gelişmemiş) gibi çeşitli faktörlerle azaltılabilir. Bu potansiyel sınırlamaları ele almak için, ön test şiddetle tavsiye edilir.

Lojistik regresyon binom dağılımını varsaydığı için %100 sağkalım ve mortaliteye sahip sonlanım noktaları tercih edilir. Deniz organizmaları için makul bir başlangıç aralığı, toplama alanının yıllık ortalama deniz yüzeyi sıcaklığı artı 10-15 ° C olacaktır. Daha sonra, böyle bir ilk denemeden sonra araştırılan sıcaklık aralığı daraltılabilir, çünkü delikler arasındaki sıcaklık farkı ne kadar küçük olursa, LT50 tahmini o kadar ince ayarlanır.

Maruz kalma ve iyileşme süresi türe özgüdür. Örneğin, Kuo ve ark.27, genç whelks'in (Nucella canaliculata) 24 saat boyunca iyileşmesine izin verirken, Hammond ve ark.28, larva mor kestanelerinin (Stronglylocentrotus purprtaus) iyileşme için 1 saat izin verdi. Canlı:ölü sayısının iyileşme dönemleri arasında farklılık gösterip göstermediğini belirlemek için kısa bir deney yapılabilir. Seçilen binom durumunun tanımına bağlı olarak (örneğin, canlı ve ölü), iyileşme süresi gerekli olmayabilir. Deneyin amacı, bölünme ve gastrulasyon gibi gelişimsel süreçlerin bir dizi sıcaklıkta gerçekleşip gerçekleşmediğini test etmekse. Başka bir deyişle, modelde kullanılan binom durumu, geliştirilmemiş 8,19,21'e karşı geliştirilecektir. %4 paraformaldehit gibi fiksatörler, termal maruz kalma döneminde numunelere herhangi bir iyileşme süresi olmadan eklenmelidir.

Binom durumunun doğru sayımını ve belirlenmesini sağlamak için (canlı ve ölü; gelişmiş ve gelişmemiş), potansiyel gözlemci önyargılarından kaçınmak için örneklerin iyileşme süresinden sonra rastgele sırayla sayılması önerilir. Yeterli personel varsa, farklı araştırmacılar çoğaltılan satırları sayabilir ve sonuçlarını karşılaştırabilir. Alternatif olarak, bireyler örneklerin küçük bir alt kümesini tekrar tekrar sayabilir ve sayıların tutarlı olup olmadığını kontrol edebilir.

Bir diğer potansiyel sınırlama, LT50'nin bağımsız örneklerden hata tahmininin yapılmamasıdır29. Mevcut veri analizi yöntemi, takılı lojistik eğri boyunca %95'lik bir güven aralığı (Ek Kodlama Dosyası 1) ve LT50'nin standart bir hatasını (Ek Kodlama Dosyası 2) sağlar. Bu hata sınırları, örnek popülasyondaki bireylerin çoklu ölçümleriyle değil, eğri uydurma sürecinden üretilir. Mevcut ısı bloğu tasarımının altı sıraya sahip olduğu göz önüne alındığında, altı LT50 tahmini oluşturmak ve gözleme dayalı hata tahminlerini elde etmek için her satırdan veri sığdırılabilir.

Özetle, çok çeşitli zooplanktonlara uygulanabilecek akut termal sınırların belirlenmesinde erişilebilir bir yaklaşım sunulmaktadır. Bu kurulum, çeşitli organizmaların termal sınırlarını belirlemek ve savunmasız olan gelişim aşamalarını belirlemek için kullanılabilir. Bu bilgi, küresel iklim değişikliği karşısında organizma performansının ve potansiyel topluluk etkileşimlerinin tahminini iyileştirmeye yardımcı olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların beyan edecek çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgments

Bu çalışma, Swarthmore College [KC] Fakülte Araştırma Fonu ve BJ için Robert Reynolds ve Lucinda Lewis '70 Yaz Araştırma Bursu tarafından desteklenmektedir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45 µm membrane filter VWR 74300-042
½” Acrylic sheet McMaster-Carr 8560K266 Used to construct a ridged case with sufficient insulation.
1 mL syringe VWR 76290-420
2 Channel 7 Thermocouple Types Datalogger Omega Engineering HH506A Can be replaced with any thermometer that will fit inside a microcentrifuge tube
Automatic pipette  Ranin 
Bolt- and Clamp-Mount Strip Heater
with 430 Stainless Steel Sheath, 120V AC, 1-1/2" Wide, 100W		 McMaster-Carr 3619K32
Crystal Sea Bioassay Mix Pentair CM2B Use to make aritifical seawater 
Denraster excentricus M-Rep  Sand dollars from California 
Dissecting microscope  Nikon  SMZ645
DIYhz Aluminum Water Cooling Block, Liquid Water Cooler Heat Sink System for PC Computer CPU Graphics Radiator Heatsink Endothermic Head Silver(40 mm x 120 mm x 12 mm) Amazon Connects to water bath and used to cool one end of the block.
Easy-to-Machine MIC6 Cast Aluminum Sheet 2" thick 8" x 8"  McMaster-Carr 86825K953 Machined to 2" x 6" x 8" with 60 equally spaced holes (11 mm dia., 42 mm depth) with two addition holes drilled in one side for thermostat probes.
Economical Flexible Polyethylene Foam Pipe Insulation McMaster-Carr 4530K121 Covers the plastic tubing between chiller and block to reduce heat loss. Can be omitted if temperature range is close to room temperature 
EVERSECU 72w 110-240v Aquarium Water Chiller Warmer/Cooler Temperature Controller for Fish Shrimp Tank Marine Coral Reef Tank Below 20 L/30 L Aquarium Chiller Amazon Can be used in place of the lab-grade water bath 
Example with larval sand dollar 
GENNEL 100 g Silver Silicone Thermal Conductive Compound Grease Paste For GPU CPU IC LED Ovens Cooling Amazon Improves the thermal conductance between the block and the heating and cooling elements.
Inkbird WiFi Reptile Thermostat Temperature Controller with 2 Probes and 2 Outlets, IPT-2CH Reptiles Heat Mat Thermostat (Max 250 W per Outlet) Amazon Monitors hot and cold ends. Maintains hot end in range
Lauda Ecoline Silver Air-Cooled Refrigerated Circulators VWR 89202-386 Can be replaced with an aquarium chiller 
Microcentrifuge Tubes VWR 76019-014 If larger animals are used, scanilation vials (VWR 66022-004) is a good alternative 
Nitex mesh filter  Self made Used hot glue to attached Nitex mesh to 1/2" PVC tubing 
Pasteur pipette VWR 14673-010
Potassium Chloride (0.35 M)  Millpore-Sigma P3911-500G
R statistical software.  The R Project for Statistical Computing
Syringe needle VWR 89219-346 Depending on size of target organism gague 14 and 16 can be used
Tygon Tubing  McMaster-Carr 5233K65 Adjust to match the chiller and block used 
Zoo Med Repti Temp Rheostat Chewy.com Rated to 150 W and rewired to feed directly into the heating element. Used to control rate of heat output

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dowd, W. W., King, F. A., Denny, M. W. Thermal variation, thermal extremes and the physiological performance of individuals. Journal of Experimental Biology. 218 (12), 1956-1967 (2015).
  2. García, F. C., Bestion, E., Warfield, R., Yvon-Durocher, G. Changes in temperature alter the relationship between biodiversity and ecosystem functioning. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (43), 10989-10994 (2018).
  3. Sinclair, B. J., et al. Can we predict ectotherm responses to climate change using thermal performance curves and body temperatures. Ecology Letters. 19 (11), 1372-1385 (2016).
  4. Lutterschmidt, W. I., Hutchison, V. H. The critical thermal maximum: history and critique. Canadian Journal of Zoology. 75 (10), 1561-1574 (1997).
  5. Bennett, J. M., et al. The evolution of critical thermal limits of life on Earth. Nature Communications. 12 (1), 1198 (2021).
  6. Sunday, J. M., Bates, A. E., Dulvy, N. K. Thermal tolerance and the global redistribution of animals. Nature Climate Change. 2 (9), 686-690 (2012).
  7. Deutsch, C. A., et al. Impacts of climate warming on terrestrial ectotherms across latitude. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (18), 6668-6672 (2008).
  8. Collin, R., Chan, K. Y. K. The sea urchin Lytechinus variegatus lives close to the upper thermal limit for early development in a tropical lagoon. Ecology and Evolution. 6 (16), 5623-5634 (2016).
  9. Wang, W., Ding, M. -w, Li, X. -x, Wang, J., Dong, Y. -w Divergent thermal sensitivities among different life stages of the pulmonate limpet Siphonaria japonica. Marine Biology. 164 (6), 1-10 (2017).
  10. Mak, K. K. -Y., Chan, K. Y. K. Interactive effects of temperature and salinity on early life stages of the sea urchin Heliocidaris crassispina. Marine Biology. 165 (3), 1-11 (2018).
  11. Strathmann, R. R. Culturing larva of marine invertebrates. Developmental Biology of the Sea Urchin and Other Marine Invertebrates. , Humana Press. Totowa, NJ. 1-25 (2014).
  12. Stillman, J. H., Somero, G. N. A comparative analysis of the upper thermal tolerance limits of Eastern Pacific porcelain crabs, Genus Petrolisthes: Influences of latitude, vertical Zonation, acclimation, and phylogeny. Physiological and Biochemical Zoology. 73 (2), 200-208 (2000).
  13. Sasaki, M. C., Dam, H. G. Integrating patterns of thermal tolerance and phenotypic plasticity with population genetics to improve understanding of vulnerability to warming in a widespread copepod. Global Change Biology. 25 (12), 4147-4164 (2019).
  14. Sasaki, M. C., Dam, H. G. Genetic differentiation underlies seasonal variation in thermal tolerance, body size, and plasticity in a short-lived copepod. Ecology and Evolution. 10 (21), 12200-12210 (2020).
  15. Kelly, M. W., Sanford, E., Grosberg, R. K. Limited potential for adaptation to climate change in a broadly distributed marine crustacean. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 279 (1727), 349-356 (2012).
  16. Rivera, H. E., Chen, C. -Y., Gibson, M. C., Tarrant, A. M. Plasticity in parental effects confers rapid larval thermal tolerance in the estuarine anemone Nematostella vectensis. Journal of Experimental Biology. 224 (5), 236745 (2021).
  17. Sewell, M. A., Young, C. M. Temperature limits to fertilization and early development in the tropical sea urchin Echinometra lucunter. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 236 (2), 291-305 (1999).
  18. Walther, K., Crickenberger, S. E., Marchant, S., Marko, P. B., Moran, A. L. Thermal tolerance of larvae of Pollicipes elegans, a marine species with an antitropical distribution. Marine Biology. 160 (10), 2723-2732 (2013).
  19. Byrne, M., Gall, M. L., Campbell, H., Lamare, M. D., Holmes, S. P. Staying in place and moving in space: contrasting larval thermal sensitivity explains distributional changes of sympatric sea urchin species to habitat warming. Global Change Biology. 28 (9), 3040-3053 (2022).
  20. Zippay, M. L., Hofmann, G. E. Physiological tolerances across latitudes: thermal sensitivity of larval marine snails (Nucella spp). Marine Biology. 157 (4), 707-714 (2010).
  21. Collin, R., Rebolledo, A. P., Smith, E., Chan, K. Y. K. Thermal tolerance of early development predicts the realized thermal niche in marine ectotherms. Functional Ecology. 35 (8), 1679-1692 (2021).
  22. R Core Team. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. , Vienna, Austria. https://www.R-project.org/ (2021).
  23. Venables, W. N., Ripley, B. D. Modern Applied Statistics with S-PLUS. Fourth edn. , Springer. (2002).
  24. Fumo, J. T., et al. Contextualizing marine heatwaves in the southern California bight under anthropogenic climate change. Journal of Geophysical Research: Oceans. 125 (5), (2020).
  25. Wheeler, M. W., Park, R. M., Bailer, A. J. Comparing median lethal concentration values using confidence interval overlap or ratio tests. Environmental Toxicology and Chemistry: An International Journal. 25 (5), 1441-1444 (2006).
  26. Kingsolver, J. G., MacLean, H. J., Goddin, S. B., Augustine, K. E. Plasticity of upper thermal limits to acute and chronic temperature variation in Manduca sexta larvae. Journal of Experimental Biology. 219 (9), 1290-1294 (2016).
  27. Kuo, E. S. L., Sanford, E. Geographic variation in the upper thermal limits of an intertidal snail: implications for climate envelope models. Marine Ecology Progress Series. 388, 137-146 (2009).
  28. Hammond, L. M., Hofmann, G. E. Thermal tolerance of Strongylocentrotus purpuratus early life history stages: mortality, stress-induced gene expression and biogeographic patterns. Marine biology. 157 (12), 2677-2687 (2010).
  29. Sasaki, M., Dam, H. G. Global patterns in copepod thermal tolerance. Journal of Plankton Research. 43 (4), 598-609 (2021).

Tags

Biyoloji Sayı 189 ölümcül sıcaklık kritik termal maksimum üst termal sınırlar küresel ısınma ısı stresi deniz omurgasız larvaları
Isı Bloğu Kullanarak Zooplankton için Termal Sınırların Belirlenmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chan, K. Y. K., Jorgensen, B. K.,… More

Chan, K. Y. K., Jorgensen, B. K., Scoma, S. Thermal Limits Determination for Zooplankton Using a Heat Block. J. Vis. Exp. (189), e64762, doi:10.3791/64762 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter