Summary
임신 확립은 복잡한 배아와 자궁 누화를 포함하는 역동적인 과정입니다. 이러한 과정에 대한 산모의 자궁 환경의 정확한 기여는 여전히 활발한 조사 영역으로 남아 있습니다. 여기에서는 이러한 연구 질문을 해결하기 위해 생체 내 동물 모델을 설계하는 데 도움이 되는 자세한 프로토콜이 제공됩니다.
Abstract
임신이 성립되려면 생존 가능한 배반포가 수용성 자궁 내막(자궁내막)과 성공적으로 상호 작용하여 착상 및 태반 형성을 촉진하고 지속적인 임신을 가능하게 해야 합니다. 배아 결함으로 인한 임신 성공의 한계는 잘 알려져 있으며 최근 수십 년 동안 체외 수정(IVF) 및 보조 생식 기술의 등장으로 크게 극복되었습니다. 그러나 아직까지 이 분야는 부적절하게 수용되는 자궁내막으로 인한 한계를 극복하지 못하여 IVF 성공률이 정체되었습니다. 난소와 자궁내막 기능은 밀접하게 얽혀 있는데, 난소에서 생성되는 호르몬이 자궁내막의 월경 주기를 담당하기 때문입니다. 따라서 설치류 임신 모델을 사용할 때 관찰 된 결과가 난소 또는 자궁 결손으로 인한 것인지 확인하기 어려울 수 있습니다. 이를 극복하기 위해 배아 이식 또는 인공 탈락술을 통해 난소 절제술 마우스 모델을 개발하여 임신에 대한 자궁 특이적 기여도를 연구할 수 있도록 했습니다. 이 기사는 난소 절제술을 수행하는 방법에 대한 지침을 제공하고 건강한 기증자로부터 배아 이식 후 성공적인 인공 탈락 또는 임신을 지원하기 위해 외인성 호르몬을 공급하는 다양한 기술에 대한 통찰력을 제공합니다. 이러한 기술에는 피하 주사, 서방성 펠릿 및 삼투압 미니 펌프가 포함됩니다. 각 방법의 주요 장점과 단점에 대해 논의하여 연구자가 특정 연구 질문에 가장 적합한 연구 설계를 선택할 수 있도록 합니다.
Introduction
최근 수십 년 동안 보조 생식 기술의 사용이 증가함에 따라 임신에 대한 많은 장벽이 극복되어 많은 부부가 불임 문제에도 불구하고 가정을 꾸릴 수 있게 되었습니다1. 난모세포 또는 정자 결손은 종종 체외 수정 또는 세포질 내 정자 주입을 사용하여 우회할 수 있습니다. 그러나 자궁 및 자궁내막 수용성과 관련된 문제는 생식 가능성의 파악하기 어려운 "블랙박스"로 남아 있다2.
임신은 고품질 배아가 수용성 자궁 내막 (자궁 내막)과 성공적으로 상호 작용할 때 확립됩니다. 월경 주기에 임신이 성공할 확률은 약 30%로 낮습니다.3,4. 임신 성공 사례 중 임신 20주가 지난 임신의 경우 50%-60%만이 진행되며, 임신 20주가 지나지 않은 임신의 75%는 착상 실패로 인해 발생한다3. 1990년대 후반으로 거슬러 올라가는 이러한 수치에도 불구하고 이 분야는 아직 부적절하게 수용되는 자궁내막으로 인한 한계를 극복하지 못했습니다. 이로 인해 최근 몇 년 동안 IVF 성공률이 정체되고 때로는 감소했습니다 5,6.
설명할 수 없는 불임이 있는 여성은 종종 수용성 창이 변위되거나 알 수 없는 이유로 수용성을 달성할 수 없습니다. 최근에, 자궁내막 수용성 어레이가 개발되었는데, 이는 배아 이식 시기를 개인의 수용성 창에 맞추기 위한 목적으로 수백 개의 유전자의 발현을 평가한다 7,8,9. 그러나 이 분야는 착상 과정이 완료된 후 나타나는 임신 합병증의 발병기전에 대한 이해가 여전히 부족합니다.
여성 생식 기관은 매우 역동적이며 엄격한 호르몬 조절하에 있습니다. 시상하부-뇌하수체-생식선(HPG) 축은 난포 성숙, 에스트로겐 및 프로게스테론 활성을 포함한 난소 주기의 측면을 조절하는 황체 형성 호르몬과 난포 자극 호르몬의 방출을 조절합니다. 차례로, 자궁 생리주기는 에스트로겐과 프로게스테론10,11에 의해 조절됩니다. 따라서 자궁 생물학적 기전을 연구하는 것은 난소의 영향으로 복잡합니다. 예를 들어, 암 치료가 자궁에 어떤 영향을 미칠 수 있는지 연구할 때 관찰된 자궁 표현형(예: 임신 손실 또는 월경 무주기성)이 자궁에 대한 직접적인 손상의 결과인지 또는 난소 손상으로 인한 결과인지 구별하기 어려울 수 있습니다.
생식력을 종합적으로 이해하려면 임신에 대한 자궁 기여도를 특성화해야 합니다. 중요한 것은 이러한 이해가 난소 통제 하에서 자궁 기능을 넘어 확장되어야 한다는 것입니다. 이것은 인간에게서 연구 할 수 없습니다. 따라서 동물 모델이 자주 사용됩니다. 따라서 난소 절제술(OVX)은 일반적으로 연구자들이 호르몬을 외인성으로 공급하여 설치류 발정 주기(월경 주기와 유사)를 조절할 수 있도록 하는 데 사용됩니다. 또한, OVX는 난소 영향과 독립적으로 자궁 반응을 연구할 수 있도록 한다12. 그러나 OVX 후 호르몬이 즉시 공급되지 않으면 결국 폐경 표현형이 발생하므로 연구자들이 신중하게 고려해야 합니다.
OVX는 설치류 모델 13,14,15,16,17에서 자주 사용되며 적절한 훈련 후에 수행하기가 비교적 쉽습니다. 방법은 난소 단독 또는 난소와 난관이 제거되었는지 여부와 동물의 나이에 따라 다릅니다 (성인, 순환 동물은 표면에 황체가 보이는 더 큰 난소를 가지고 있으므로 난소를 시각화하기가 더 쉽습니다). 이와 유사하게, 호르몬 보충 방법에는 피하 주사14, 서방성 펠릿 15, 삼투압 미니 펌프18, 난소 이식술 등 여러 가지가 있다.
이 기사에서는 난소 절제술을 수행하고 피하 주사, 서방성 펠릿 및 삼투압 미니 펌프를 포함한 세 가지 유형의 호르몬 보충제를 준비하는 방법에 대한 자세한 지침을 제공합니다. OVX에 이어 외인성 호르몬 보충(배아 이식 및 인공 탈락)의 이점을 얻는 실험적 종점에 대해 두 가지 세부 프로토콜이 제공됩니다. 이 기사에서는 특히 임신 및 불임 연구 분야에서 자궁에 미치는 영향을 분리하기 위한 연구를 수행하는 방법에 대해 연구자를 안내하는 것을 목표로 각 접근 방식의 강점과 약점에 대해 설명합니다.
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Protocol
모든 동물은 온도 조절이 가능한 높은 장벽 시설(Monash University Animal Research Laboratory)에 수용되었으며 무료 음식과 물 접근이 가능하며 12시간 명암 주기가 있습니다. 모든 절차는 모나쉬 동물 연구 플랫폼 윤리 위원회(#21908, 17971)의 승인에 따라 수행되었으며, 동물 관리 및 사용에 대한 국가 보건 및 의료 연구 위원회 실행 강령에 따라 수행되었습니다.
1. 수술 준비
- 절차에 필요한 모든 수술 도구, 거즈 및 종이 타월을 121°C에서 유지 시간 30분, 건조 시간 30분으로 경질/건조 제품 주기로 오토클레이브합니다.
- 수술 작업실을 위한 멸균 벤치 패드를 배치하고 진통제를 준비합니다.
- 멸균 식염수에 카프로펜을 1mg/ml로 희석하고 부피바카인을 멸균 식염수에 0.5%(w/v) 용액으로 희석합니다.
- 3.5mL 케이지 물병에 400mL의 멜록시캄을 추가합니다.
- 회복 케이지의 열 패드를 미리 예열하고 열 램프를 설치하여 회복 중인 동물에게 간접 조명을 비춥니다.
- 헤어 네트, 안면 마스크, 가운 및 장갑을 포함하여 모든 적절한 PPE를 착용했는지 확인하십시오.
- 에탄올 오염을 방지하기 위해 장갑에 정기적으로 에탄올을 뿌리고 동물이나 수술 도구를 다루기 전에 장갑을 증발시키는 등 좋은 멸균 기술을 연습하십시오.
2. 난소 절제술 시행
- 이소플루란이 있는 가스 마취기를 사용하여 유속이 3L/min으로 설정된 5% 이소플루란에서 5-4분 동안 유도 상자를 미리 채웁니다.
- 마우스를 인덕션 박스 안에 넣고 의식을 잃으면 노즈 콘으로 옮기고 이소플루란 기화기를 ~0.4%로 설정하여 유속을 2.5L/min으로 줄입니다.
참고: 나머지 절차에 사용되는 이소플루란의 비율은 마우스 균주, 연령 및 치료(예: 화학 요법)에 대한 노출에 따라 다르며 각 개별 동물의 호흡 패턴에 대한 면밀한 평가를 기반으로 조정해야 합니다. 호흡 패턴은 규칙적인 복식 호흡으로 유지되어야 합니다. 빠른 흉부 호흡은 깊은 수술 평면에 도달하지 않았거나 유지되지 않았 음을 나타낼 수 있습니다. 이 경우 이소플루란 기화기 백분율을 조정하십시오.tage 필요에 따라. - 튜브를 짜서 눈 윤활제를 넉넉히 바르고 눈을 부드럽게 두드려줍니다.
- 척추의 직감과 아래 작은 (2cm x 2cm) 영역을 면도하십시오.
- 1mg/mL의 희석액에서 5mg/kg 카르프로펜을 목 부분에 피하 투여합니다.
- 마우스의 등 발가락을 꼬집어 발가락 꼬집음 반사로 마취 깊이를 테스트합니다. 발가락 꼬집음 반응이 없으면 동물은 깊은 수술면에 있으며 절차를 계속할 수 있습니다.
- 수술 부위에 베타딘을 바르고 수술용 드레이프(2cm x 2cm 창을 잘라낸 거즈)로 덮습니다.
- 쥐 이빨 집게를 사용하여 등 앞부분의 피부를 위로 당기고 ~5mm 세로 절개를 합니다.
알림: 동물의 등에 있는 이 높이의 피부 절개는 동물이 클립을 제거하고 클립 수리가 필요할 가능성을 줄이기 위해 수술용 클립 배치에 가장 좋습니다. - 뭉툭한 집게를 사용하여 밑에 있는 근육층에서 피부를 뭉툭하게 해부하여 신장을 향해 한쪽으로 이동합니다.
- 신장, 난소 및 난소 지방 패드를 근육 벽을 통해 시각적으로 식별합니다.
참고: 신장은 짙은 빨간색으로 나타나고 지방 패드는 밝은 흰색으로 나타나며 눈에 띄면 난소는 지방 패드 내의 작은 분홍색 점처럼 보입니다. - 집게를 사용하여 근육층을 잡고 들어 올립니다. 날카로운 수술용 가위로 ~0.5-1cm 절개를 합니다. 집게로 근육 벽을 계속 잡고 가위에서 뭉툭한 집게로 변경하여 절개를 통해 난소 지방 패드를 당깁니다.
- 구부러진 바늘 홀더를 사용하여 자궁 뿔의 말단부에 있는 난소와 난관 아래에 고정합니다.
참고: 또는 난소만 제거하고 난관을 그대로 둘 수 있습니다. 그러나 난소와 난관의 구별을 정확하게 시각화하려면 해부 현미경이 필요합니다. - 가위 또는 메스로 난소를 제거하십시오. 과도한 출혈을 피하기 위해 30초 동안 계속 클램핑하십시오.
- 클램프를 제거하고 필요한 경우 멸균 거즈로 두드리십시오.
- 근벽 절개를 닫으려면 집게를 사용하여 절개 부위의 상단을 들어 올려 절개 부위가 자연스럽게 함께 당겨지도록 합니다.
- 실크 봉합사(크기 3-0)를 사용하여 외과 의사의 매듭으로 절개한 근육벽을 봉합합니다.
- 바늘을 부착하지 않고 1mL 주사기를 사용하여 부피바카인 2-3방울을 국소적으로 바르고 반대쪽에서 2.9-2.17단계를 반복합니다.
- 피부 절개를 닫으려면 거즈를 사용하여 과도한 부피바카인의 건조 부위를 두드리고 피부의 양면을 함께 누릅니다.
- 1-2 개의 7mm 수술 클립을 적용하여 치유 과정의 일부로 부어 오를 수있는 공간을 확보하십시오.
- 마우스를 복구 케이지로 이동하고 15분 동안 자세히 모니터링합니다.
알림: 동물은 빨리 깨어나야 합니다. 정상적인 흉부 호흡 패턴에 대해 호흡을 면밀히 모니터링하십시오.
3. 호르몬 준비 : 피하 주사
- 에스트라디올의 1mg/mL 원액을 만드십시오.
- 0.001g(1mg)의 에스트라디올 분말을 1.5mL 멸균 튜브에 계량합니다.
- 튜브에 100% 에탄올 1mL를 넣고 몇 초 동안 소용돌이칩니다.
알림: 에탄올은 눈에 보이는 에스트라디올 분말 조각으로 투명하게 유지됩니다. - 에탄올 증발을 방지하기 위해 튜브를 필름으로 감쌉니다.
- 튜브를 알루미늄 호일로 감싸고 밤새 로커에 올려 에스트라디올 분말을 완전히 녹입니다.
- 이 1mg/mL 육수를 참기름에 희석하여 원하는 최종 농도로 희석합니다.
참고: 인공 탈락 전에 프라이밍을 위해 3일 동안 100ng의 용량이 필요하며 프로게스테론을 투여할 때 25ng의 추가 저용량이 필요합니다. 이것은 프로게스테론 수용체 발현을 조절하는 피드백 루프와 싸우기 위한 것입니다. 배아 이식의 경우, 4일째 배아 이식 전 1일과 3일에 100ng을 2회 투여해야 합니다. 배아 이식시 25ng의 저용량도 필요합니다. - 오일에 필요한 양의 에스트라디올을 1mL 주사기에 넣은 후 바늘 끝 26G을 붙입니다.
- 필요한 빈도로 적절한 용량을 피하 주사합니다(스크러프 또는 옆구리, 배아 이식 또는 인공 탈락 전 프라이밍을 위한 100ng/100μL 또는 25ng/100μL).
알림: 오일은 점성이 매우 높으므로 바늘을 제거하기 전에 천천히 주입하고 몇 초 동안 일시 중지하십시오. 이렇게 하면 주입 부위에서 누출되는 오일의 양이 최소화됩니다.
- 프로게스테론 200mg/mL 원액을 만듭니다.
- 프로게스테론 분말 0.4g(400mg)을 5mL 멸균 튜브에 넣습니다.
- 튜브에 100% 에탄올 2mL를 넣고 몇 초 동안 소용돌이칩니다.
알림: 에탄올은 흰색이 됩니다. - 3.1.3-3.1.4단계를 반복합니다.
- 참기름에 200mg/mL 육수를 원하는 최종 농도로 희석합니다.
참고: 배아 이식을 지원하려면 매일 2mg의 용량이 필요합니다. - 3.1.6-3.1.7단계에서와 같이 적절한 용량(예: 임신 지원을 위해 매일 2mg/100μL)을 피하 주사합니다.
4. 호르몬 준비: 서방성 펠릿
- 층류 또는 클래스 II 생물 안전 후드의 표면을 가로질러 호일을 놓습니다.
- 모든 장비(장갑, 페트리 접시, 1mL 주사기, 미세 집게)를 후드에 놓고 20분 동안 UV를 켭니다.
알림: 후드 내부에 실런트가 있는 상태에서 UV가 설정되므로 켜지 마십시오. - 실라스틱 튜브를 100% 에탄올로 세척하고 후드에서 자연 건조시킵니다. 건조되면 튜브를 따라 ~1cm 길이를 표시하고 메스로 자릅니다.
- 주사기에서 플런저를 제거하고 ~200μL의 실런트를 짜냅니다. 플런저를 교체하고 주사기에서 소량의 실런트를 빼냅니다.
- 튜브의 한쪽 끝에 소량의 실런트를 바르고 장갑을 낀 손가락으로 부드럽게 펴줍니다.
- 밤새 또는 후드 내부의 자외선에서 20-30분 동안 건조시키십시오.
- 멸균 된 페트리 접시에 적절한 양의 프로게스테론을 붓습니다. 집게를 사용하여 알약을 프로게스테론 분말에 퍼서 펠릿을 채웁니다.
- 후드 표면에 있는 펠릿의 밀봉된 끝을 두드려 프로게스테론을 응축시킵니다. 또는 멸균 된 집게의 끝을 사용하여 프로게스테론을 채우십시오. 더 많은 실런트를 위한 충분한 공간을 확보하십시오.
- 3.4-3.5단계에 설명된 대로 열린 끝을 실런트로 밀봉합니다.
- 프로게스테론 알갱이가 들어있는 페트리 접시를 호일로 싸서 빛으로부터 보호하십시오.
- 37°C에서 1% 숯이 제거된 FCS(cs-FCS: PBS)에서 배양하여 피하 삽입 전에 최소 72시간 동안 펠릿을 활성화합니다.
알림: 펠릿은 미리 밀봉된 단일 끝으로 대량으로 만들 수 있습니다. 그러나 매번 신선한 프로게스테론을 사용하여 채워야 합니다. 프로게스테론으로 채우기 전에 미리 만들어진 펠릿이 UV 살균되었는지 확인하십시오. 펠릿은 6-10일 동안 ~500μg/일을 분비하며, 이는 프로게스테론 수용체 활성을 4-5일 이상 유지하기 위해 추가 저용량 에스트로겐 주사가 필요할 수 있지만 인공 탈락 및 배아 이식 절차를 충분히 지원합니다. 10일이 지나면 대체 프로게스테론 펠릿이 필요할 수 있습니다.
5. 호르몬 준비: 삼투압 미니 펌프
- 수용액에서 원하는 농도의 프로게스테론을 준비하고 적절한 미니 삼투압 펌프 모델을 선택하십시오( 재료 표 참조).
참고: 섹션 7(실험 절차: 배아 이식)의 경우 12일 동안 2mg/일의 분만이 필요합니다. 따라서 동물 당 ~ 28 μL의 멸균 수에 100 mg의 프로게스테론을 녹입니다 (특정 부피에 대한 제조업체의 지침을 따르십시오). 연속 희석이 필요할 수 있습니다. 섹션 8 (실험 절차 : 인공 탈락)의 경우 3 일 동안 하루 500 μg의 전달이 필요합니다. 따라서 동물 당 1,500 μg의 프로게스테론을 ~ 100 μL의 멸균수에 용해시킵니다. 충전 절차 중에 손실된 부피를 설명하기 위해 추가 용액을 준비하십시오. - 장비 (장갑, 보푸라기가 적은 물티슈, 페트리 접시, 멸균 식염수, 1mL 주사기, 소형 계량 보트, 호일 및 0.01g까지 정확한 저울)를 클래스 II 생물 안전 후드 내에 설정한 다음 20분 동안 UV를 켭니다.
- 호르몬 용액을 1mL 주사기에 넣은 다음 멸균 충전 튜브를 부착하여 기포가 없는지 조심스럽게 확인합니다.
- 펌프와 유량 감속재를 멸균 계량 보트 내에서 계량합니다.
- 더 이상 갈 수 없을 때까지 펌프 상단의 구멍을 통해 충전 튜브를 삽입합니다.
- 펌프를 똑바로 잡고 주사기의 플런저를 천천히 밀어 튜브를 채웁니다.
알림: 급속 충전은 펌프에 기포가 유입될 수 있으므로 피해야 합니다. - 용액이 펌프 상단에서 넘치면 충전 튜브를 부드럽게 제거하고 멸균된 낮은 보푸라기 물티슈로 여분의 용액을 닦아냅니다.
- 더 이상 갈 수 없을 때까지 펌프 상단의 구멍을 통해 유량 감속재를 삽입합니다. 완전히 들어가면 펌프와 유량 감속재를 함께 단단히 누릅니다.
- 유량 감속재가 제자리에 있는 상태에서 채워진 펌프의 무게를 잰다.
참고: 5.3단계와 5.8단계에서 얻은 중량의 차이는 로드된 용액의 순중량을 제공합니다(즉, 0.1g 증가 = 100μL 첨가된 용액). - 채워진 펌프를 멸균 식염수로 채워진 멸균 페트리 접시에 넣습니다.
- 모든 펌프가 채워지면 페트리 접시를 호일로 싸서 37°C 인큐베이터에 넣어 최소 4-6시간 동안(또는 사용할 준비가 될 때까지) 프라이밍합니다.
6. 외과 절차: 피하 호르몬 펠릿 및 미니 펌프 삽입
- 섹션 1(수술 준비)에 따라 해당 부위를 준비합니다.
- 2.1-2.3 단계에 따라 동물을 마취하십시오.
- 목덜미의 작은 부분(~1cm x 1cm)을 면도합니다.
- 1mg/mL의 희석액에서 5mg/kg 카르프로펜을 다리 옆구리에 피하 투여합니다.
- 발가락 핀치 반사를 테스트합니다. 반사가 없다면, 동물은 깊은 수술면에 있으며, 수술을 시작할 수 있습니다.
- 수술 부위에 베타딘을 바르고 수술용 드레이프(2cm x 2cm 창을 잘라낸 거즈)로 덮습니다.
- 쥐 이빨 집게를 사용하여 목의 긁힌 부분(실제 목덜미와 등의 직감 사이의 중간)의 피부를 위쪽으로 당기고 ~5mm 세로 절개를 합니다.
- 뭉툭한 집게를 사용하여 뭉툭한 피부는 밑에 있는 근육층에서 아래쪽 방향으로 해부합니다.
알림: 삼투압 미니 펌프 삽입의 경우 펌프가 동물의 움직임을 제한하거나 절개 부위를 누르지 않도록 동물의 한쪽을 따라 주머니를 만듭니다. - 호르몬 펠릿 또는 미니 펌프를 위한 충분한 공간이 만들어지면 멸균 집게를 사용하여 펠릿 또는 미니 펌프를 집어 들고 둔기 해부로 만든 피하 주머니에 넣습니다.
- 피부 절개 부위를 닫으려면 펠릿 또는 미니 펌프가 수술용 클립으로 손상되지 않도록 주머니에 충분히 멀리 떨어져 있는지 확인하십시오.
- 국소적으로 단계 2.17에 의하여 부피바카인을 적용하십시오.
- 하나의 수술 클립으로 상처를 봉합하십시오. 마우스를 복구 케이지로 이동하고 15분 동안 자세히 모니터링합니다. 이것은 짧은 절차이기 때문에 동물은 몇 분 안에 걸을 수 있어야 합니다.
7. 실험 절차: 배아 이식
- 난소 절제술 동물의 경우, 배아 이식 3일 전에 에스트라디올 100ng/100μL를 피하 주사하여 호르몬 프라임(3.1단계).
- 배아 이식 하루 전, 2mg/100μL 메드록시프로게스테론 아세테이트를 피하 주사하여 동물에게 호르몬 프라이밍을 합니다(3.2단계).
- 섹션 1(수술 준비)에 따라 해당 부위를 준비합니다.
- 2.1-2.3 단계에 따라 동물을 마취하십시오.
- 2.4-2.10 단계에 따라 절차를 시작합니다.
- 해부 현미경으로 26G 바늘 끝으로 자궁 내 주사 지점을 만듭니다.
- 5개의 배반포를 M2 배지 드롭에 피펫팅한 다음 이를 자궁 뿔로 옮깁니다.
- 절개 근육벽을 닫으려면 집게를 사용하여 절개 부위의 상단을 들어 올려 절개 부위가 자연스럽게 모이도록 합니다.
- 실크 봉합사를 사용하여 외과 의사의 매듭으로 근육 벽 부위를 닫습니다. 부피바카인 방울을 국소적으로 바르십시오.
- 다른 쪽에서 7.5-7.8단계를 반복합니다.
- 피부 절개를 닫으려면 거즈를 사용하여 과도한 부피바카인의 건조 부위를 두드리고 피부의 양면을 함께 누릅니다.
- 1-2 개의 수술 클립을 적용하여 치유 과정의 일부로 부어 오를 공간을 확보하십시오.
참고: 동물이 난소 절제술을 받은 경우 배아 이식 시 외인성 호르몬이 필요합니다. 프로게스테론 (2mg)을 피하 주사하거나 피하 프로게스테론 펠렛 또는 삼투압 미니 펌프를 삽입하십시오. 과도한 프로게스테론을 퇴치하기 위해 배아 이식 시 저용량(25ng/100μL) 에스트로겐을 피하 주사해야 합니다. - 마우스를 조심스럽게 복구 케이지로 옮기고 15분 동안 면밀히 모니터링합니다.
알림: 동물은 빨리 깨어나야 합니다. 정상적인 흉부 호흡 패턴에 대해 호흡을 면밀히 모니터링하십시오.
8. 실험 절차 : 인공 탈락
- 인공 탈락 8일 전에 섹션 3(호르몬 준비: 피하 주사)에 따라 1일, 2일 및 3일에 100ng/100μL 에스트라디올로 동물을 호르몬 프라이밍합니다.
- 인공 탈락 2일 전에 섹션 3(호르몬 준비: 피하 주사)에 따라 7일, 8일 및 9일에 5ng/100μL 에스트라디올로 동물을 호르몬 프라이밍합니다.
알림: 최종 주사는 인공 탈락 절차 전에 최소 3시간(최대 4시간) 전에 이루어져야 합니다. - 인공 탈락 2일 전에 섹션 4, 섹션 5 및 섹션 8에 따라 피하 프로게스테론 펠릿 또는 미니 삼투압 펌프(500μg/일)를 사용하는 호르몬 프라임 동물.
- 섹션 1(수술 준비)에 따라 해당 부위를 준비합니다.
- 2.1-2.2 단계에 따라 동물을 마취하십시오.
- 발가락 핀치 반사로 마취의 깊이를 테스트하십시오. 발가락 꼬집음 반응이 없으면 동물은 깊은 수술면에 있으며 절차를 계속할 수 있습니다.
- 마우스를 엎드린 자세로 놓고 꼬리를 들어 올린 다음 직경 6mm의 검경을 질에 천천히 삽입합니다.
- 마취 코 원뿔에 동물의 코를 유지하면서 동물의 하체를 비 지배적 인 손의 첫 번째와 두 번째 손가락 사이에 놓습니다. 엄지손가락을 사용하여 꼬리를 부드럽게 위로 밀어 질 입구가 보이도록 합니다.
- 비수술적 배아 이식 팁(20μL 피펫에 부착)을 사용하여 참기름 20μL를 하나의 자궁 뿔에 옮깁니다.
- 질 입구와 피펫 수평을 유지하면서 팁을 질에 삽입하고 자궁 경부를 통해 자궁 경엽에 삽입합니다. 팁이 자궁 뿔에 들어가면 팁을 자궁 내막 표면에 부드럽게 대고 (위의 핸들링 기술을 사용하는 경우이 움직임이 두 번째 손가락에 대해 느껴짐) 천천히 오일을 배출합니다.
알림: 피펫 플런저를 누른 상태로 유지하고 모든 오일이 분산될 때까지 10초 동안 기다린 다음 플런저를 누른 상태에서 전사 팁을 천천히 제거합니다.
- 질 입구와 피펫 수평을 유지하면서 팁을 질에 삽입하고 자궁 경부를 통해 자궁 경엽에 삽입합니다. 팁이 자궁 뿔에 들어가면 팁을 자궁 내막 표면에 부드럽게 대고 (위의 핸들링 기술을 사용하는 경우이 움직임이 두 번째 손가락에 대해 느껴짐) 천천히 오일을 배출합니다.
- 질에서 검경을 제거하십시오.
- 마우스를 복구 케이지로 조심스럽게 옮기고 15분 동안 면밀히 모니터링합니다.
알림: 동물들은 빨리 깨어나야 합니다. 정상적인 흉부 호흡 패턴에 대해 호흡을 면밀히 모니터링하십시오. - 동물의 취급을 제한하고 시술 후 96 시간 동안 조용한 환경에 보관하십시오.
알림: 시끄러운 소음이나 명암 주기의 급격한 변화는 절차의 성공에 영향을 미칩니다. 조직 절개시 탈락 성공 정도는 자궁 중량 대 체중의 비율로 측정 할 수 있습니다. 인공 탈락 절차는 80 %의 성공률을 보입니다. 따라서 탈락에 실패한 동물을 제외하고, 실험의 표본 크기를 선택할 때 이를 고려하십시오.
9. 수술 절차: 수술 후 회복, 모니터링 및 클립 수리
- 동물들이 집 케이지로 돌려보내기 전에 밤새 반쯤 켜진 열 패드를 회복하도록 합니다.
- 수술 후 5 일 동안 매일 동물을 모니터링하고 상처 부위에 감염 징후가 있는지 세심한주의를 기울입니다.
- 필요한 경우 클립 복구를 수행합니다.
- 섹션 1(수술 준비)에 따라 해당 부위를 준비합니다.
- 2.1-2.3 단계에 따라 동물을 마취하십시오.
- 클립이 아직 있는 경우 클립 제거기를 사용하여 기존 클립을 제거합니다.
- 2.19-2.21 단계에 따라 새 수술 클립을 적용합니다.
- 9.3.1-9.3.3 단계에 따라 수술 후 7일 후 또는 동물이 다음에 마취 상태일 때(예: 배아 이식, 인공 탈락 절차 또는 수술 후 피하 주사) 수술 클립을 제거합니다.
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Representative Results
잘 특성화된 인공 탈락화 모델이 이 프로토콜 문서에 설명되어 있습니다(그림 1A). 여기서, 젊은 성인 암컷 마우스(8주령)는 섹션 1 및 섹션 2에 기재된 바와 같이 외과적 난소 절제술을 받았다. 이어서, 마우스를 2주 동안 쉬게 하여 내인성 난소 호르몬이 섹션 3-7 및 섹션 9에 기재된 바와 같이 외인성 호르몬으로 지지되기 전에 소멸되도록 하였다. 참기름의 질내 주사에 의해 인공 탈락을 유도한 다음, 동물을 섹션 9에 기재된 바와 같이 조직 수집까지 쉬게 하였다. 본 연구에서는 일반적으로 사용되는 마우스 균주인 C57BL6/J 마우스에서 인공 탈락을 수행했습니다. 조직 채취 시 체중을 기록하고 자궁을 해부하고 잘 다듬은 후 무게를 잰다(그림 1B). 탈락 반응의 정도는 자궁 중량을 체중의 비율로 표현하여 기록하였다. 이 연구에서, C57BL6/J 마우스의 80%가 탈락한 반면(0.01012 ± 0.001515, n=15), 동물 자궁의 20%는 탈락하지 않았다(0.002108 ± 0.0001764, n=3)(도 1C).
그림 1: 개략도 및 대표 결과. (A) 마우스 모델에서 실험적으로 인공 탈락을 유도하기 위한 개략적인 타임라인. 약어: OVX = 난소 절제술; E2 = 에스트라디올(100ng 1-3일, 5ng 7-9일); P4 = 프로게스테론. 참고: 여기에 제시된 결과를 생성하기 위해 P4 펠릿이 사용되었습니다. 프로게스테론 전달을 위한 대체 방법에는 매일 피하 주사와 미니 삼투압 펌프가 있습니다. (B) 젊은 성인 C57BL6/J 마우스의 탈락화되지 않은(ND) 및 탈락된(D) 자궁의 대표 이미지. 눈금 막대 = 5mm.(C) 탈락되지 않은 동물과 탈락한 동물의 자궁 무게 대 체중(UW:BW) 비율 비교. 데이터는 SEM± 평균입니다. 만-휘트니 검정, **p = 0.003; ND: n=3, D:n=15. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 호르몬 전달 방법 | 강점 | 약점 |
| 피하 주사 | 외과 개입이 필요하지 않습니다 | 매일 반복되는 취급 |
| 외과적 훈련이 필요하지 않은 접근 가능한 기술(펠릿 이식과 비교) | 기름의 호르몬은 주사 부위에서 누출 될 수 있으므로 각 동물에 흡수되는 양은 다를 수 있습니다 | |
| 서방형 펠릿 | 매일 취급 할 필요가 없습니다. | 외과적 시술 필요 |
| 집에서 만들 수 있습니다 | 상업적으로 이용 가능하지 않음 | |
| 삼투압 미니 펌프에 대한 합리적인 가격의 대안 | ||
| 작고 동물에 잘 견딘다. | ||
| 삼투압 미니 펌프 | 매일 취급 할 필요가 없습니다. | 외과적 시술 필요 |
| 상용 | 비싼 | |
| 가장 정확한 배송 방법 | 서방형 펠릿보다 훨씬 큼 |
표 1 : 호르몬 전달 방법의 강점과 약점.
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Discussion
이 기사는 OVX를 수행하고 임신과 생식력에 대한 자궁의 기여도를 이해하는 데 중점을 둔 연구를 위해 외인성 호르몬을 제공하는 방법에 대한 단계별 지침을 제공합니다. 배아 이식을 수행하고 인위적으로 탈락을 유도하는 것을 포함하여 이러한 방법의 두 가지 실험적 적용에 대해 두 가지 세부 프로토콜이 제공됩니다.
OVX를 수행하는 것은 처음에는 어려울 수 있지만, 특히 설치류 모델을 처음 접하는 연구자에게는 적절하게 훈련되고 실행되면 비교적 간단한 절차입니다. 절차의 주요 단계에는 마취 상태에서 동물을 면밀히 모니터링하고 난소 조직이 남아 있지 않은지 확인하는 것이 포함됩니다. 일부 모델에서는 난관이 손상되지 않은 채로 남아있을 수 있습니다. 그러나 난관은 풍부한 에스트로겐과 프로게스테론 수용체를 가진 호르몬 반응성 조직이라는 점에 유의해야 한다19. 난소와 난관을 제거하는 수술 프로토콜은 육안으로 완료 할 수 있기 때문에 난소 만 제거하는 것보다 훨씬 간단합니다. 후자의 경우 난소 만 제거하고 난관을 제자리에 두려면 훨씬 더 복잡한 절차이기 때문에 해부 현미경이 필요합니다. 결과적으로, 동물이 해부 현미경 단계와 내부 체벽 봉합과 같은 절차의 다른 부분에 대한 수술 영역 사이를 이동해야 하기 때문에 수술 시간이 연장될 수 있습니다.
여기에 자세히 설명된 진통제 프로토콜은 Monash University 동물 윤리 위원회의 승인을 받은 표준이므로 개별 기관의 윤리 위원회 요구 사항이나 선호도에 따라 다를 수 있습니다. 일반적인 비스테로이드성 항염증제가 탈락 과정을 방해하기 때문에 인공 탈락 절차를 위한 진통제가 제공되지 않았다는 점에 유의해야 합니다. 연구자가 인공 탈락시 진통제를 제공하기를 원한다면이를 고려해야합니다.
본 연구는 OVX 후 난소 호르몬을 보충하기 위한 세 가지 호르몬 전달 방법을 제시하며, 각 방법에는 고유한 강점과 약점이 있습니다(표 1). 오일 중의 호르몬의 피하 주사는 문헌14,16,17에서 일반적이다. 이 기술은 수술 절차가 필요하지 않으므로 설치류 수술이나 가스 마취에 대한 공식적인 교육이 필요하지 않다는 사실을 포함하여 많은 강점을 가지고 있습니다. 따라서 피하 주사는 거의 모든 연구 그룹에서 접근 가능한 옵션입니다. 주사는 또한 저렴하고 수행하기 쉽습니다. 그러나 실제로는 특히 임신 모델에서 몇 가지 제한 사항이 있습니다. OVX 동물에서 임신을 유지하려면 임신을 지원하기 위해 프로게스테론이 함유된 호르몬 보충제를 매일 투여해야 합니다. 태반이 프로게스테론의 주요 공급원이 될 만큼 충분히 발달하면 매일 주사를 중단하는 것이 가능할 수 있지만 여기에 제시된 프로토콜에서는 시도되지 않았습니다. 일화적으로, 기름의 호르몬이 피하 주사 후 주사 부위에서 누출 될 수 있습니다. 부분적으로 이것은 참기름과 같은 점성이 있는 것을 쉽게 분배하는 데 필요한 바늘 크기(26G) 때문일 수 있습니다. 따라서 오일 주입을 수행할 때 이러한 누출을 모니터링하고 기록하여 이를 실험 결과와 연관시켜야 합니다.
서방형 펠릿은 피하 주사보다 바람직합니다., 비용 효율적이고 사내에서 만들기 쉽기 때문에. 그러나 여러 야간 단계가 필요하므로 실험 일정을 계획할 때 고려해야 합니다. 이 펠릿은 매일 약 500 μg을 분비합니다 (세포 배양 배지 및 후속 프로게스테론 ELISA에서 시간 경과 배양 중에 평가 됨). 이것은 위에서 설명한 일일 피하 주사에 비해 농도가 낮으며, 이는 펠렛에서 프로게스테론 전달의 일관성 때문입니다. 앞서 언급했듯이 오일 주입은 주입 부위에서 누출되어 전달되는 전체 농도를 감소시킬 수 있습니다. 이전 연구에서, 이 펠릿은 외과적으로 삽입된 후 최대 10일 동안만 생체 내에서 활성화되었습니다. 따라서 임신 연구에서 임신 중반에 두 번째 펠릿을 삽입해야 하는지 또는 태반이 그 단계까지 임신에 대한 내분비 지원을 충분히 제공할 수 있는지 여부는 불분명합니다. 따라서 이 펠릿은 여기에 제시된 인공 탈락 프로토콜을 포함한 단기 임신 모델과 배아 이식 후 최대 10일까지의 임신 연구에 최적입니다. 서방성 펠릿은 일상적인 동물 취급 및 주사의 필요성을 무효화하지만 일부 저용량 에스트로겐 주사는 프로게스테론 수용체 피드백 루프의 균형을 맞추기 위해 여전히 필요합니다. 이 전략은 이전에20,21에서 사용되었습니다.
마지막으로, 삼투압 미니 펌프는 가장 정확한 호르몬 전달 방법이며 상업적으로 이용 가능하지만 가장 비싼 옵션입니다. 삼투압 미니 펌프는 선택한 모델에 따라 최대 28일 동안 매일 정해진 농도의 호르몬을 전달할 수 있습니다. 서방형 펠릿과 유사하게, 삼투압 미니 펌프는 일상적인 동물 취급의 필요성을 피하지만, 일부 저용량 에스트로겐 주사는 여전히 필요합니다.
여기에 설명된 인공 탈락 프로토콜은 난소 및 배아 영향과 무관하게 임신 초기 이정표를 연구할 수 있습니다. 인간은 모든 월경 주기에서 탈락을 겪는 반면, 설치류는 임신 기간 동안에만 탈락합니다. 따라서 이 모델은 조작 가능한 설치류 모델에서 인간과 유사한 임신 이정표를 연구하는 데 엄청난 가치가 있습니다. 여기에 설명된 절차는 비수술적 배아 이식 장치(NSET)를 사용하여 질과 자궁경부를 통해 참기름을 자궁 뿔로 직접 전달하기 때문에 비교적 비침습적입니다. 이 절차는 다른 방법론보다 덜 침습적이지만 상용 NSET을 사용할 때 비용이 많이 들 수 있습니다. 비교해 보면, 다른 발표된 인공 탈락 모델은 자궁 내 오일 주사를 수행하기 위한 외과적 절차를 필요로 한다17. 이를 위해서는 섹션 1 및 2.1-2.11 단계에서 설명한 것과 유사한 외과 적 설정이 필요합니다. 그러나 이전에 난소 절제술을 받은 동물의 경우 자궁 뿔을 식별하고 노출시키는 것이 더 어려울 수 있습니다. 난소 절제술을 위한 이전 수술 절차에서 형성된 유착도 있을 수 있습니다. 따라서, 탈락을 유도하기 위해 외과적 자궁내 주사를 수행하는 것이 더 비용 효율적일 수 있지만, 수술 및 마취 시간은 NSET를 사용하는 대안보다 실질적으로 더 길다. 상업적으로 이용가능한 NSET에 대한 사내 제조 대안(22 )에 대한 확립된 프로토콜이 있으며, 이는 훨씬 더 비용 효율적이다.
배아 이식 절차가 여기에 설명되어 있지만, 우리는 이전에 이 모델과 마우스의 다른 균주에 걸친 성공률을 발표했습니다14. 또한, 여기에 설명된 배아 이식 방법은 외과적 접근법을 사용하지만, NSET도 이 절차에 통합될 수 있다.
이 분야의 미래 방향에는 임신의 확립 및 유지에 대한 특정 자궁 기여에 초점을 맞춘 연구가 포함되어야합니다. 이 지식은 특발성 불임, 착상 실패 및 임신 합병증에 대한 이해를 높이는 데 중요합니다. 이 분야에 대한 지식을 넓히는 것은 IVF/ICSI 환자의 임상 결과를 개선하고 생물학적 과정으로서의 임신에 대한 이해를 개선하는 데에도 기본이 됩니다.
결론적으로, OVX는 임신과 생식력에 대한 자궁 기여도를 연구하기 위해 동물 모델에 통합될 수 있는 간단한 절차입니다. 미래의 모델은 OVX와 외인성 호르몬 전달을 통합하여 생식력과 임신에 대한 난소 특이적 기여와 자궁 특이적 기여를 비교할 수 있도록 하는 이점을 얻을 것입니다.
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Disclosures
저자는 경쟁적인 재정적 또는 기타 이해 관계를 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작업은 빅토리아 주 정부 운영 인프라 지원과 호주 정부 NHMRC(National Health and Medical Research Council) IRIISS를 통해 가능했습니다. 이 작업은 Monash Reproductive Services Platform에 액세스하기 위해 A.L.W. (Winship-PAG18-0343)에 대한 Monash University 의학, 간호 및 건강 과학 플랫폼 액세스 보조금의 지원을 받았습니다. ALW는 ARC(Australian Research Council)의 DECRA 자금 지원 DE21010037의 지원을 받습니다. JNH와 LRA는 호주 정부 연구 훈련 프로그램 장학금의 지원을 받습니다. L.R.A.는 Monash Graduate Excellence Scholarship의 지원을 받습니다. KJH는 ARC Future Fellowship FT190100265의 지원을 받습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ALZET 1002 mini osmotic pumps | BioScientific | 1002 | Delivers 0.25 µL/h for 14 days. Use for section 7 (Experimental procedure - Embryo transfer). |
| ALZET 1003D mini osmotic pumps | BioScientific | 1003D | Delivers 1 µL/h for 14 days. Use for section 8 (Experimental procedure - Artificial decidualization). |
| ALZET Reflex 7 mm clips | BioScientific | 0009971 | Either Reflex clips or Michel clips can be used for wound closure, depending on preference |
| ALZET Reflex clip applicator | BioScientific | 0009974 | Either Reflex clips or Michel clips can be used for wound closure, depending on preference |
| ALZET Reflex clip remover | BioScientific | 0009976 | Either Reflex clips or Michel clips can be used for wound closure, depending on preference |
| Bupivicaine injection | Pfizer | NA | Stock 0.5%. Use at 0.05% in saline |
| Estradiol | Sigma | E8875 | |
| Meloxicam | Ilium | NA | Active constituent 0.5 mg/mL. Use 3.5 mL per 400 mL cage water bottle, or as your institution's vet prescribes. |
| Michel clips | Daniels | NS-000242 | |
| Multi purpose sealant | Dow Corning | 732 | |
| Non-surgical embryo transfer (NSET) device | ParaTechs | 60010 | Contains 6 mm speculum. Single use only. |
| Progesterone | Sigma | P0130 | Soluble in ethanol. Use for section 3 (Hormone preparation - subcutaneous injection) and section 4 (Hormone preparation - slow-release pellets) |
| Progesterone | Sigma | P7556 | Soluble in water. Use for section 5 (Hormone preparation - osmotic mini pumps) |
| Refresh eye ointment | Allergan | NA | 42.5% w/v liquid paraffin, 57.3% w/v soft white paraffin |
| Rimadyl Carprofen | Zoetis | NA | Stock 50 mg/mL. Use at 1 mg/ml (for 5 mg/kg dose) |
| Rubber tubing | Dow Corning | 508-008 | Washed in 100% ethanol and cut into 1 cm pieces. Inside diameter 1.57 mm ± 0.23 mm; outside diamater 3.18 mm ± 0.23 mm; wall 0.81 mm. |
| Sesame oil | Sigma | S3547 | |
| Sofsilk Silk sutures size 3-0 | Covidien | GS-832 |
References
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