Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Metoder for å studere livmorbidrag til svangerskapsetablering i en ovariektomert musemodell

Published: April 7, 2023 doi: 10.3791/64763
Automatic Translation
*1,2, *1, 3, 1, *1, *1
1Biomedicine Discovery Institute, Department of Anatomy and Developmental Biology, Monash University, 2Gynaecology Research Centre, Royal Women’s Hospital and Department of Obstetrics and Gynaecology, University of Melbourne, 3The Ritchie Centre, Hudson Institute for Medical Research and Department of Obstetrics and Gynaecology, Monash University
* These authors contributed equally

Summary

Graviditetsetablering er en dynamisk prosess som involverer kompleks embryo- og livmorkrysstale. De nøyaktige bidragene fra mors livmormiljø til disse prosessene forblir et aktivt undersøkelsesområde. Her er detaljerte protokoller gitt for å hjelpe til med å designe in vivo dyremodeller for å løse disse forskningsspørsmålene.

Abstract

For graviditet som skal etableres, må en levedyktig blastocyst vellykket samhandle med en mottakelig livmorforing (endometrium) for å lette implantasjon og morkakedannelse og muliggjøre pågående graviditet. Begrensningene til graviditetssuksess forårsaket av embryonale defekter er velkjente og har i stor grad blitt overvunnet de siste tiårene med økningen av in vitro fertilisering (IVF) og assistert reproduktiv teknologi. Foreløpig har feltet imidlertid ikke overvunnet begrensningene forårsaket av et utilstrekkelig mottakelig endometrium, noe som resulterer i stagnerende IVF-suksessrater. Ovarie- og endometriefunksjoner er tett sammenflettet, da hormoner produsert av eggstokken er ansvarlige for endometriums menstruasjonssyklisitet. Som sådan, når du bruker gnagermodeller av graviditet, kan det være vanskelig å fastslå om et observert resultat skyldes et eggstokk- eller livmorunderskudd. For å overvinne dette ble en ovariektomisert musemodell utviklet med embryooverføring eller kunstig decidualisering for å tillate studier av livmorspesifikke bidrag til graviditet. Denne artikkelen vil gi instruksjoner om hvordan du utfører ovariektomi og gi innsikt i ulike teknikker for å levere eksogene hormoner for å støtte vellykket kunstig decidualization eller graviditet etter embryooverføring fra friske givere. Disse teknikkene inkluderer subkutan injeksjon, pellets med langsom frigjøring og osmotiske minipumper. De viktigste fordelene og ulempene ved hver metode vil bli diskutert, slik at forskere kan velge det beste studiedesignet for deres spesifikke forskningsspørsmål.

Introduction

Med den økende bruken av assistert befruktning de siste tiårene, har mange barrierer for unnfangelse blitt overvunnet, slik at mange par kan starte familier til tross for fruktbarhetsproblemer1. Oocytt- eller sædunderskudd kan ofte omgås ved bruk av in vitro fertilisering eller intracytoplasmatisk spermieinjeksjon; Imidlertid forblir problemer knyttet til livmor og endometriell mottakelighet en unnvikende "svart boks" av reproduktivt potensial2.

Graviditet er etablert når et embryo av høy kvalitet vellykket interagerer med et mottakelig endometrium (livmorforing). Sjansene for vellykket graviditet i en gitt menstruasjonssyklus er lave, på rundt 30%3,4. Av de som lykkes, går bare 50% -60% forbi 20 ukers svangerskap, med implantasjonssvikt som ansvarlig for 75% av graviditetene som ikke når 20 uker3. Til tross for disse tallene som dateres tilbake til slutten av 1990-tallet, er feltet ennå ikke overvunnet begrensningene forårsaket av et utilstrekkelig mottakelig endometrium. Dette har resultert i stagnerende - og noen ganger fallende - IVF suksessrater de siste årene 5,6.

Kvinner med uforklarlig infertilitet har ofte et forskjøvet mottakevindu eller er ikke i stand til å oppnå mottakelighet av ukjente årsaker. Nylig ble endometriell reseptivitetsmatrise utviklet, som vurderer uttrykket av hundrevis av gener med det formål å skreddersy tidspunktet for embryooverføring til individets mottakelighetsvindu 7,8,9. Imidlertid mangler feltet fortsatt en forståelse av patogenesen av graviditetskomplikasjoner som manifesterer seg etter at implantasjonsprosessen er fullført.

Det kvinnelige reproduktive systemet er svært dynamisk og under stram hormonell kontroll. Den hypothalamus-hypofyse-gonadale (HPG) aksen styrer frigivelsen av luteiniserende hormon og follikkelstimulerende hormon, som regulerer aspekter av eggstokksyklusen, inkludert follikelmodning og østrogen og progesteronaktivitet. I sin tur reguleres livmorens menstruasjonssyklus av østrogener og progesteron10,11. Dermed er studier av livmorbiologiske mekanismer komplisert av ovariepåvirkning. For eksempel, når man studerer hvordan kreftbehandlinger kan påvirke livmoren, kan det være vanskelig å skille om noen livmorfenotype observert (som graviditetstap eller menstruasjonssyklisitet) er et resultat av en direkte fornærmelse mot livmoren eller en følgevirkning fra skade på eggstokkene.

For å forstå fruktbarheten grundig, må livmorbidragene til graviditet karakteriseres. Det er viktig at denne forståelsen må strekke seg utover livmorfunksjonen under ovariekontroll. Dette kan ikke studeres hos mennesker; Derfor brukes ofte dyremodeller. Som sådan brukes ovariektomi (OVX) ofte til å gjøre det mulig for forskere å regulere gnagerbrunstsykluser (analogt med menstruasjonssyklusen) ved å levere hormoner eksogent. I tillegg tillater OVX livmorresponser å bli studert uavhengig av ovariepåvirkning12. Men hvis hormoner ikke umiddelbart tilføres etter OVX, vil en overgangsfenotype slutte, som må vurderes nøye av forskerne.

OVX brukes ofte i gnagermodeller 13,14,15,16,17 og er relativt enkel å utføre etter tilstrekkelig trening. Metodene varierer avhengig av om eggstokken alene eller eggstokken og ovidukten fjernes, samt avhengig av dyrets alder (voksne sykkeldyr har større eggstokker med et synlig corpus luteum på overflaten, noe som betyr at eggstokkene er lettere å visualisere). På samme måte finnes mange metoder for hormontilskudd, inkludert subkutane injeksjoner14, pellets med langsom frigjøring 15, osmotiske minipumper18 og eggstokktransplantasjon.

I denne artikkelen er det gitt detaljerte instruksjoner om hvordan du utfører ovariektomi og forbereder tre typer hormontilskudd, inkludert subkutane injeksjoner, pellets med langsom frigjøring og osmotiske minipumper. To detaljerte protokoller er gitt for eksperimentelle endepunkter som drar nytte av OVX etterfulgt av eksogent hormontilskudd (embryooverføring og kunstig decidualisering). Denne artikkelen diskuterer styrker og svakheter ved hver tilnærming med mål om å veilede forskere om hvordan man utfører studier for å isolere virkningene på livmoren, spesielt i forskningsfeltene graviditet og fruktbarhet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyrene ble plassert i temperaturkontrollerte, høybarriere fasiliteter (Monash University Animal Research Laboratory) med gratis tilgang til mat og vann og en 12 timers lys-mørk syklus. Alle prosedyrene ble utført i samsvar med godkjenning fra Monash Animal Research Platform Ethics Committee (#21908, 17971) og utført i samsvar med National Health and Medical Research Council Code of Practice for omsorg og bruk av dyr.

1. Kirurgisk forberedelse

  1. Autoklav alle kirurgiske instrumenter, gasbind og tørkepapir som kreves for prosedyrene på en hard-/tørrvaresyklus ved 121 °C med en holdetid på 30 minutter og en tørketid på 30 minutter.
  2. Legg ut en steril benkpute for det kirurgiske arbeidsområdet og klargjør smertestillende midler.
    1. Fortynn karprofen i steril saltoppløsning til 1 mg/ml, og fortynn bupivakain i steril saltoppløsning til en 0,5 % (w/v) oppløsning.
    2. Tilsett 3,5 ml meloksikam til en 400 ml burvannflaske.
  3. Forvarm varmeputen(e) for gjenvinningsburene, og sett opp varmelamper for å skinne indirekte lys på dyrene som kommer seg.
  4. Sørg for at alt riktig PPE er slitt, inkludert et hårnett, ansiktsmaske, kjole og hansker.
  5. Øv god steril teknikk, inkludert regelmessig sprøyting av hanskene med etanol og la dem fordampe før du håndterer dyret eller kirurgiske verktøy for å unngå etanolforurensning.

2. Utføre ovariektomi

  1. Bruk en gassanestesimaskin med isofluran til å forfylle induksjonsboksen i 3-5 minutter ved 5 % isofluran med strømningshastigheten satt til 4 l/min.
  2. Plasser musen inne i induksjonsboksen, og når den er bevisstløs, flytt den til nesekjeglen og reduser strømningshastigheten til 0,4 l/min, med isofluran fordamper satt til ~2,5 %.
    MERK: Prosentandelen isofluran som brukes for resten av prosedyren varierer basert på musestamme, alder og eksponering for behandlinger (f.eks. kjemoterapi) og bør justeres basert på en nøye vurdering av hvert enkelt dyrs pustemønstre. Pustemønstre bør forbli som vanlige magepust. Raske, torakale pust kan indikere at et dypt kirurgisk plan ikke er nådd eller opprettholdt; I dette tilfellet justeres prosentandelen av isofluran etter behov.
  3. Påfør øye smøremiddel sjenerøst ved å klemme røret og forsiktig dabbing øyet.
  4. Barber et lite (2 cm x 2 cm) område på og under ryggraden.
  5. Administrer 5 mg/kg karprofen fra en fortynnet oppløsning på 1 mg/ml subkutant i halsskrubben.
  6. Test dybden av anestesi med tåklemmerefleksen ved å klemme musens baktå. Hvis det ikke er noen tåklemmereaksjon, er dyret i det dype kirurgiske planet, og prosedyren kan fortsette.
  7. Påfør betadin på operasjonsområdet, og dekk med en kirurgisk drapering (en gasbind med et 2 cm x 2 cm vindu kuttet ut).
  8. Bruk rottetannet tang, trekk huden på ryggen oppover, og gjør et ~ 5 mm langsgående snitt.
    MERK: Et hudsnitt i denne høyden på dyrets rygg er best for kirurgisk klipsplassering for å redusere sjansen for at dyret fjerner klipsene og krever klippreparasjoner.
  9. Bruk stump tang, fortsett å stumpe dissekere huden vekk fra det underliggende muskellaget, bevege seg ned og til den ene siden mot nyrene.
  10. Identifiser nyre-, eggstokk- og eggstokkfettputen visuelt gjennom muskelveggen.
    MERK: Nyren vil vises en mørk rød farge, fettputen vil virke lys hvit, og hvis den er synlig, vil eggstokken se ut som en liten rosa prikk i fettputen.
  11. Bruk tang, ta tak i og løft muskellaget. Lag et snitt på ~0,5-1 cm med skarp kirurgisk saks. Fortsett å holde muskelveggen med tang, og bytt fra saks til stump tang for å trekke eggstokkfettputen gjennom snittet.
  12. Bruk en buet nåleholder, klemme under eggstokken og ovidukten i den distale enden av livmorhornet.
    MERK: Alternativt kan eggstokken alene fjernes, slik at ovidukten er intakt. Imidlertid er det nødvendig med et dissekerende mikroskop for å nøyaktig visualisere skillet mellom eggstokken og ovidukten.
  13. Fjern eggstokken med saks eller en skalpell. Fortsett å klemme i 30 s for å unngå overdreven blødning.
  14. Fjern klemmen, og drypp den med sterilt gasbind om nødvendig.
  15. For å lukke muskelveggen snitt, bruk tang for å løfte toppen av snittet slik at snittet naturlig trekker sammen.
  16. Bruk silkessuturer (størrelse 3-0) for å lukke muskelveggsnittet med kirurgens knute.
  17. Påfør to til tre dråper bupivakain lokalt med en 1 ml sprøyte uten påsatt nål, og gjenta trinn 2,9-2,17 på den andre siden.
  18. For å lukke huden snitt, bruk gasbind til å tørke området tørt av overflødig bupivakain, og trykk de to sidene av huden sammen.
  19. Påfør en til to 7 mm kirurgiske klips, slik at det er plass til hevelse som en del av helbredelsesprosessen.
  20. Flytt musen til et oppvåkningsbur, og overvåk nøye i 15 minutter.
    MERK: Dyrene skal våkne raskt; Sørg for å overvåke pusten nøye for normale torakale pustemønstre.

3. Hormonpreparat: Subkutan injeksjon

  1. Lag en 1 mg / ml stamløsning av østradiol.
    1. Vei ut 0,001 g (1 mg) østradiolpulver i en 1,5 ml steril slange.
    2. Tilsett 1 ml 100% etanol til røret, og virvel i noen sekunder.
      MERK: Etanolen vil forbli klar med synlige flekker av østradiolpulver.
    3. Pakk røret med film for å forhindre fordampning av etanol.
    4. Pakk røret i aluminiumsfolie, og legg det på en vippe over natten for å fullstendig oppløse østradiolpulveret.
    5. Fortynn denne 1 mg/ml stamdosen i sesamolje til ønsket endelig konsentrasjon.
      MERK: Doser på 100 ng i 3 dager er nødvendig for priming før kunstig decidualization, og ytterligere lave doser på 25 ng er nødvendig når progesteron er gitt. Dette er for å bekjempe tilbakemeldingssløyfen som kontrollerer progesteronreseptoruttrykk. For embryooverføring er det nødvendig med to doser på 100 ng på dag 1 og dag 3 før embryooverføring på dag 4. På tidspunktet for embryooverføring er det også nødvendig med en lav dose på 25 ng.
    6. Trekk opp den nødvendige mengden østradiol i olje i en 1 ml sprøyte, og fest deretter en 26 G nålespiss.
    7. Injiser riktig dose subkutant (enten i skrubben eller flanken; 100 ng/100 μL eller 25 ng/100 μL for priming før embryooverføring eller kunstig decidualisering eller på tidspunktet for embryooverføring) med ønsket frekvens.
      MERK: Oljen er svært tyktflytende, så sørg for å injisere sakte og ta en pause i noen sekunder før du fjerner kanylen. Dette vil minimere mengden olje som lekker ut av injeksjonsstedet.
  2. Lag en 200 mg / ml stamløsning av progesteron.
    1. Vei ut 0,4 g (400 mg) progesteronpulver i en 5 ml steril slange.
    2. Tilsett 2 ml 100% etanol til røret, og virvel i noen sekunder.
      MERK: Etanolen blir hvit i fargen.
    3. Gjenta trinn 3.1.3-3.1.4.
    4. Fortynn 200 mg/ml beholdningen i sesamolje til ønsket endelig konsentrasjon.
      MERK: Doser på 2 mg daglig er nødvendig for å støtte embryooverføring.
    5. Injiser riktig dose (f.eks. 2 mg/100 mikrol daglig for å støtte graviditet) subkutant som i trinn 3.1.6-3.1.7.

4. Hormonpreparat: Pellets med langsom frigjøring

  1. Legg en folie over overflaten av en laminær strømning eller klasse II biosikkerhetshette.
  2. Plasser alt utstyret (hansker, petriskåler, 1 ml sprøyter, fine tang) i hetten, og slå på UV i 20 min.
    NOTAT: Ikke slå på UV-lampen med tetningsmassen inne i hetten, da den vil stivne.
  3. Vask silastslangen i 100% etanol, og la den lufttørke i hetten. Når det er tørt, merk ~ 1 cm lengder langs slangen, og kutt med en skalpell.
  4. Fjern stempelet fra en sprøyte, og klem inn ~200 μL tetningsmasse. Sett stempelet på plass, og press en liten mengde tetningsmasse ut av sprøyten.
  5. Påfør en liten mengde tetningsmasse til den ene enden av slangen, og glatt den over med en hansket finger.
  6. La tørke over natten eller i 20-30 minutter i UV-lys inne i hetten.
  7. Hell en passende mengde progesteron i en sterilisert petriskål. Bruk tang, øs pellets inn i progesteronpulveret for å fylle pelleten.
    1. Trykk på den forseglede enden av pelleten på hetteoverflaten for å kondensere progesteronet ned. Alternativt kan du bruke enden av sterilisert tang til å stappe progesteronet ned. Tillat nok plass til mer tetningsmasse.
  8. Forsegl den åpne enden med tetningsmasse, som beskrevet i trinn 3.4-3.5.
  9. Pakk petriskålen som inneholder progesteronpellets i folie for å beskytte den mot lys.
  10. Aktiver pelletsene i minimum 72 timer før subkutan innsetting ved å inkubere i 1 % kullstrippet FCS (cs-FCS: PBS) ved 37 °C.
    NOTAT: Pellets kan lages i bulk med en enkelt forseglet ende på forhånd. Imidlertid bør fersk progesteron brukes til å fylle dem hver gang. Forsikre deg om at de ferdiglagde pellets er UV-sterilisert før du fyller med progesteron. Pellets vil utskille ~ 500 μg / dag i 6-10 dager, noe som er tilstrekkelig støtte for kunstig decidualization og embryooverføringsprosedyrer, selv om en ekstra lavdose østrogeninjeksjon kan være nødvendig for å opprettholde progesteronreseptoraktivitet utover 4-5 dager. Utover 10 dager kan det være nødvendig med en erstatning av progesteronpellet.

5. Hormonpreparat: Osmotiske minipumper

  1. Klargjør progesteron ved ønsket konsentrasjon i en vandig løsning, og velg riktig mini osmotisk pumpemodell (se materialfortegnelse).
    MERK: For avsnitt 7 (eksperimentell prosedyre: embryooverføring) er tilførsel av 2 mg/dag i 12 dager nødvendig. Oppløs derfor 28 mg progesteron i ~ 100 μL sterilt vann per dyr (følg produsentens instruksjoner for det spesifikke volumet). Serielle fortynninger kan være nødvendig. For seksjon 8 (eksperimentell prosedyre: kunstig decidualisering) er det nødvendig å levere 500 μg per dag i 3 dager. Oppløs derfor 1,500 μg progesteron i ~ 100 μL sterilt vann per dyr. Forbered ekstra oppløsning for å ta hensyn til volumet som går tapt under fyllingsprosedyren.
  2. Sett opp utstyret (hansker, våtservietter med lite lo, petriskåler, sterilt saltvann, 1 ml sprøyter, små vektbåter, folie og vekter nøyaktig til 0,01 g) i en klasse II biosikkerhetshette, og slå deretter på UV-væsken i 20 minutter.
  3. Trekk opp hormonoppløsningen i en 1 ml sprøyte, og fest deretter et sterilt påfyllingsrør, og sørg forsiktig for at det ikke er luftbobler.
  4. Vei pumpen og dens strømningsmoderator i en steril veiebåt.
  5. Sett påfyllingsrøret gjennom åpningen på toppen av pumpen til det ikke går lenger.
  6. Hold pumpen loddrett, skyv stempelet på sprøyten sakte for å fylle slangen.
    MERK: Rask fylling bør unngås, da dette kan introdusere luftbobler i pumpen.
  7. Når løsningen renner over fra toppen av pumpen, fjern forsiktig påfyllingsrøret og tørk av overflødig løsning med en steril våtserviett med lite lo.
  8. Sett strømningsmoderatoren gjennom åpningen på toppen av pumpen til den ikke kan gå lenger. Når pumpen og strømningsmoderatoren er helt inn, trykker du den bestemt sammen.
  9. Vei den fylte pumpen med strømningsmoderatoren på plass.
    MERK: Forskjellen i vekt oppnådd fra trinn 5.3 og trinn 5.8 vil gi nettovekten av den lastede løsningen (dvs. en økning på 0,1 g = 100 mikroliter tilsatt oppløsning).
  10. Plasser den fylte pumpen i en steril petriskål fylt med sterilt saltvann.
  11. Når alle pumpene er fylt, pakk petriskålen inn i folie og plasser den i en 37 °C inkubator for å grunne i minst 4-6 timer (eller til den er klar til bruk).

6. Kirurgisk prosedyre: Innsetting av subkutan hormonpellets og minipumper

  1. Forbered området i henhold til avsnitt 1 (kirurgisk forberedelse).
  2. Bedøv dyrene i henhold til trinn 2.1-2.3.
  3. Barber et lite område på skrubben i nakken (~ 1 cm x 1 cm).
  4. Administrer 5 mg/kg karprofen fra en fortynnet oppløsning på 1 mg/ml subkutant i benflanken.
  5. Test for tåklemmerefleksen. Hvis det ikke er refleks, er dyret i det dype kirurgiske planet, og prosedyren kan begynne.
  6. Påfør betadin på operasjonsområdet, og dekk det med et kirurgisk drap (en gasbind med et vindu på 2 cm x 2 cm).
  7. Bruk rottetannet tang, trekk huden på skrubben i nakken (halvveis mellom den sanne skrubben og hakken på ryggen) oppover, og gjør et ~ 5 mm langsgående snitt.
  8. Ved hjelp av butt tang dissekerer stump huden bort fra det underliggende muskellaget i en nedadgående retning.
    MERK: For innsetting av osmotisk minipumpe, lag en lomme langs den ene siden av dyret slik at pumpen ikke begrenser dyrets bevegelse eller presser opp mot snittstedet.
  9. Når det er gjort tilstrekkelig plass til hormonpelleten eller minipumpen, bruk steril tang for å plukke opp pelleten eller minipumpen, og sett den inn i den subkutane lommen laget med stump disseksjon.
  10. For å lukke hudsnittet, sørg for at pelleten eller minipumpen er langt nok i lommen til at kirurgiske klips ikke vil skade den.
  11. Påfør bupivakain lokalt i henhold til trinn 2.17.
  12. Lukk såret med ett kirurgisk klipp. Flytt musen til et oppvåkningsbur, og overvåk nøye i 15 minutter. Siden dette er en kort prosedyre, bør dyrene være ambulerende i løpet av få minutter.

7. Eksperimentell prosedyre: Embryooverføring

  1. For ovariektomerte dyr, hormon-prime 3 dager før embryooverføring ved en subkutan injeksjon av 100 ng/100 μL østradiol (trinn 3.1).
  2. En dag før embryooverføringen, hormon-prime dyrene med en subkutan injeksjon av 2 mg/100 μL medroksyprogesteronacetat (trinn 3.2).
  3. Forbered området i henhold til avsnitt 1 (kirurgisk forberedelse).
  4. Bedøv dyrene i henhold til trinn 2.1-2.3.
  5. Begynn prosedyren i henhold til trinn 2.4-2.10.
  6. Under et dissekerende mikroskop, opprett et intrauterint injeksjonspunkt med en 26 G nålespiss.
  7. Pipetter fem blastocyster inn i en M2 mediedråpe, og overfør deretter disse til livmorhornet.
  8. For å lukke muskelveggsnittet, løft toppen av snittet ved hjelp av tang slik at snittet naturlig trekker sammen.
  9. Bruk silke suturer, lukk muskelveggstedet med en kirurgs knute. Påfør dråper bupivakain lokalt.
  10. Gjenta trinn 7.5-7.8 på den andre siden.
  11. For å lukke huden snitt, bruk gasbind til å tørke området tørt av overflødig bupivakain, og trykk de to sidene av huden sammen.
  12. Påfør en til to kirurgiske klipp, slik at plass til hevelse som en del av helbredelsesprosessen.
    MERK: Hvis dyrene er ovariektomiserte, kreves eksogene hormoner på tidspunktet for embryooverføring. Injiser enten progesteron (2 mg) subkutant eller sett inn en subkutan progesteronpellet eller osmotisk minipumpe. For å bekjempe overflødig progesteron, er det nødvendig med en subkutan injeksjon av lav dose (25 ng / 100 μL) østrogen på tidspunktet for embryooverføring.
  13. Bær musen forsiktig til et oppvåkningsbur, og overvåk nøye i 15 minutter.
    MERK: Dyrene skal våkne raskt; Sørg for å overvåke pusten nøye for normale torakale pustemønstre.

8. Eksperimentell prosedyre: Kunstig decidualisering

  1. Hormon-prime dyrene med 100 ng / 100 μL østradiol på dag 1, dag 2 og dag 3, i henhold til avsnitt 3 (hormonpreparat: subkutan injeksjon) 8 dager før kunstig decidualisering.
  2. Hormon-prime dyrene med 5 ng / 100 μL østradiol på dag 7, dag 8 og dag 9, i henhold til avsnitt 3 (hormonpreparat: subkutan injeksjon) 2 dager før kunstig desidualisering.
    MERK: Den endelige injeksjonen må skje minst 3 timer (og maksimalt 4 timer) før den kunstige decidualiseringsprosedyren.
  3. Hormonprime dyr med subkutan progesteronpellet eller mini osmotisk pumpe (500 μg/dag), i henhold til avsnitt 4, avsnitt 5 og avsnitt 8, 2 dager før kunstig decidualisering.
  4. Forbered området i henhold til avsnitt 1 (kirurgisk forberedelse).
  5. Bedøv dyrene i henhold til trinn 2.1-2.2.
  6. Test dybden av anestesi med tåklemmerefleksen. Hvis det ikke er noen tåklemmereaksjon, er dyret i det dype kirurgiske planet, og prosedyren kan fortsette.
  7. Plasser musen i mageleie, løft halen og sett sakte inn et spekulum på 6 mm diameter i skjeden.
  8. Mens du holder nesen til dyret i bedøvelsens nesekegle, plasser underkroppen av dyret mellom første og andre fingre på den ikke-dominerende hånden. Bruk tommelen til å skyve halen forsiktig oppover for å holde skjedeåpningen synlig.
  9. Overfør 20 μL sesamolje til ett livmorhorn ved hjelp av en ikke-kirurgisk embryooverføringsspiss (festet til en 20 μL pipette).
    1. Hold pipettnivået med vaginalåpningen, sett spissen inn i skjeden og gjennom livmorhalsen inn i livmorhornet. Når spissen er i livmorhornet, trykk forsiktig spissen mot endometrieloverflaten (hvis du bruker håndteringsteknikken ovenfor, vil denne bevegelsen kjennes mot den andre fingeren), og sakte utvise oljen.
      MERK: Hold pipettestempelet inne, vent i 10 sekunder for å sikre at all oljen har spredt seg, og fjern sakte overføringsspissen mens du holder stempelet inne igjen.
  10. Fjern spekulumet fra skjeden.
  11. Bær musen forsiktig til oppvåkningsburet, og overvåk nøye i 15 minutter.
    MERK: Dyrene skal våkne raskt. Overvåk pusten nøye for normale thoraxpustemønstre.
  12. Begrens håndteringen av dyrene, og hold dem i rolige omgivelser i 96 timer etter inngrepet.
    MERK: Høye lyder eller brå endringer i deres lyse og mørke syklus vil påvirke suksessen til prosedyren. På tidspunktet for vevsdisseksjon kan graden av decidualiseringssuksess måles som et forhold mellom livmorvekt og kroppsvekt. Den kunstige decidualiseringsprosedyren har en 80% suksessrate. Ekskluder derfor dyr som ikke desidualiserer, og ta dette med i beregningen når du velger utvalgsstørrelser for forsøkene.

9. Kirurgisk prosedyre: Postkirurgisk gjenoppretting, overvåking og klippreparasjoner

  1. La dyrene komme seg halvt på, halvt av varmeputer over natten før de returnerer dem til hjemmeburet.
  2. Overvåk dyrene daglig i 5 dager etter operasjonen, og følg nøye med på sårstedet for tegn på infeksjon.
  3. Utfør klippreparasjon om nødvendig.
    1. Forbered området i henhold til avsnitt 1 (kirurgisk forberedelse).
    2. Bedøv dyrene i henhold til trinn 2.1-2.3.
    3. Fjern det eksisterende klippet med en klippfjerner hvis klippet fortsatt er til stede.
    4. Påfør et nytt kirurgisk klipp, i henhold til trinn 2.19-2.21.
  4. Fjern de kirurgiske klippene 7 dager etter operasjonen i henhold til trinn 9.3.1-9.3.3 eller når dyret neste gang er under anestesi (for eksempel for en embryooverføring, den kunstige decidualiseringsprosedyren eller en subkutan injeksjon etter operasjonen).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En godt karakterisert modell for kunstig decidualisering er beskrevet i dette protokollpapiret (figur 1A). Her gjennomgikk unge voksne hunnmus (8 uker gamle) kirurgisk ovariektomi som beskrevet i avsnitt 1 og avsnitt 2. Musene ble deretter hvilt i 2 uker for å sikre at de endogene eggstokkhormonene forsvant før de ble støttet med eksogene hormoner som beskrevet i avsnitt 3-7 og avsnitt 9. Kunstig desidualisering ble indusert av en intravaginal injeksjon av sesamolje, og deretter ble dyrene hvilt til vevssamling, som beskrevet i avsnitt 9. I denne studien ble kunstig decidualisering utført i C57BL6 / J-mus, en vanlig musestamme. Ved vevsinnsamling ble kroppsvekten registrert, og uterusen ble dissekert og godt trimmet før veiing (figur 1B). Graden av desidualresponsen ble registrert ved å uttrykke livmorvekten som et forhold mellom kroppsvekten. I denne studien decidualiserte 80 % av C57BL6/J-musene (0,01012 ± 0,001515, n = 15), mens 20 % av dyrets livmor ikke decidualiserte (0,002108 ± 0,0001764, n = 3) (figur 1C).

Figure 1
Figur 1: Skjematiske og representative resultater . (A) Skjematisk tidslinje for eksperimentelt å indusere kunstig decidualisering i en musemodell. Forkortelser: OVX = ovariektomi; E2 = østradiol (100 ng dager 1-3, 5 ng dager 7-9); P4 = progesteron. Merk: En P4-pellet ble brukt til å generere resultatene som presenteres her. Alternative metoder for progesteron levering inkluderer daglige subkutane injeksjoner og mini-osmotiske pumper. (B) Representative bilder av ikke-desidualiserte (ND) og decidualiserte (D) uteri fra unge voksne C57BL6/J-mus. Skalastenger = 5 mm.(C) Sammenligning av forholdet mellom livmorvekt og kroppsvekt (UW:BW) hos ikke-decidualiserte og decidualiserte dyr. Data er gjennomsnittlige ± SEM; Mann-Whitney test, **p = 0,003; ND: n = 3, D: n = 15. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Hormon leveringsmetode Styrker Svakheter
Subkutane injeksjoner Ingen kirurgisk inngrep nødvendig Gjentatt daglig håndtering
Tilgjengelig teknikk som ikke krever kirurgisk trening (sammenlignet med pelletimplantasjon) Hormoner i olje kan lekke ut av injeksjonsstedet, derfor kan mengden absorbert av hvert dyr variere
Pellets med langsom frigjøring Ingen behov for daglig håndtering Kirurgisk prosedyre kreves
Kan lages i huset Ikke kommersielt tilgjengelig
Rimelig alternativ til osmotiske minipumper
Liten og veldig godt tolerert av dyr
Osmotiske minipumper Ingen behov for daglig håndtering Kirurgisk prosedyre kreves
Kommersielt tilgjengelig Dyr
Mest nøyaktige leveringsmetode Mye større enn pellets med langsom frigjøring

Tabell 1: Styrker og svakheter ved hormontilførselsmetodene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne artikkelen gir trinnvise instruksjoner om hvordan du utfører OVX og gir eksogene hormoner for studier som fokuserer på å forstå livmorens bidrag til graviditet og fruktbarhet. To detaljerte protokoller er gitt på to eksperimentelle anvendelser av disse metodene, inkludert å utføre embryooverføring og indusere decidualization kunstig.

Selv om det kan være utfordrende å utføre OVX i utgangspunktet - spesielt for forskere som er nye til gnagermodeller - er det en relativt enkel prosedyre når den er riktig trent og praktisert. De viktigste trinnene i prosedyrene inkluderer nøye overvåking av dyrene mens de er under anestesi og sikre at det ikke er noe eggstokkvev igjen. I noen modeller kan ovidukten bli intakt. Det skal imidlertid bemerkes at ovidukten er et hormonresponsivt vev med rikelig østrogen- og progesteronreseptorer19. Den kirurgiske protokollen for å fjerne eggstokken og ovidukten er mye enklere sammenlignet med å fjerne bare eggstokken, da den tidligere kan fullføres med det blotte øye. For å fjerne bare eggstokken og la ovidukten være på plass i sistnevnte tilfelle, er det nødvendig med et dissekerende mikroskop, da dette er en mye mer intrikat prosedyre. Følgelig kan driftstiden forlenges, da dyret må flyttes mellom dissekeringsmikroskopstadiet og operasjonsfeltet for forskjellige deler av prosedyren, for eksempel suturering av den indre kroppsveggen.

De smertestillende protokollene som er beskrevet her, er standard og godkjent av Monash University Animal Ethics-komiteen, så de kan variere avhengig av den enkelte institusjons etiske komitékrav eller preferanser. Det skal bemerkes at ingen analgesi ble gitt for den kunstige decidualiseringsprosedyren, da typiske ikke-steroide antiinflammatoriske midler forstyrrer decidualiseringsprosessen. Dersom forskeren ønsker å gi smertestillende midler ved kunstig desidualisering, bør dette tas i betraktning.

Dette arbeidet presenterer tre metoder for hormontilførsel for å supplere eggstokkhormoner etter OVX, og hver metode har sine egne styrker og svakheter (tabell 1). Subkutane injeksjoner av hormoner i olje er vanlig i litteraturen14,16,17. Denne teknikken har mange styrker, inkludert det faktum at ingen kirurgisk prosedyre er nødvendig, og dermed er det ikke nødvendig med formell opplæring i gnagerkirurgi eller gassbedøvelse. Dette gjør subkutan injeksjon til et tilgjengelig alternativ for nesten alle forskningsgrupper. Injiseringer er også rimelige og enkle å utføre. Praktisk sett har de imidlertid noen begrensninger, spesielt i modeller av graviditet. For å opprettholde graviditet hos et OVX-dyr, må hormontilskudd med progesteron gis daglig for å støtte graviditeten. Det kan være mulig å stoppe de daglige injeksjonene når morkaken er tilstrekkelig utviklet til å overta som hovedkilden til progesteron, selv om dette ikke er prøvd i protokollene som presenteres her. Anekdotisk er det mulig for hormoner i olje å lekke fra injeksjonsstedet etter subkutan injeksjon. Delvis kan dette skyldes nålstørrelsen som kreves (26 G) for enkelt å dispensere noe så tyktflytende som sesamolje. Derfor må denne lekkasjen overvåkes og registreres når du utfører injeksjoner i olje for å korrelere dette med de eksperimentelle resultatene.

Pellets med langsom frigjøring er å foretrekke fremfor subkutane injeksjoner, da de er kostnadseffektive og enkle å lage internt. Imidlertid krever de flere overnattingstrinn, som bør vurderes når du planlegger eksperimentelle tidslinjer. Disse pellets skiller ut ca. 500 μg daglig (vurdert under en tidsforløpsinkubasjon i cellekulturmedium og påfølgende progesteron ELISA). Det skal bemerkes at dette er en lavere konsentrasjon sammenlignet med de daglige subkutane injeksjonene beskrevet ovenfor, og dette skyldes konsistensen i levering av progesteron fra pelleten. Som nevnt kan oljeinjeksjoner lekke ut av injeksjonsstedet, og dermed redusere den totale konsentrasjonen som leveres. I tidligere studier har disse pellets bare vært aktive in vivo i opptil 10 dager etter at de er kirurgisk satt inn. I graviditetsstudier er det derfor fortsatt uklart om det kan være nødvendig å sette inn en ny pellet midt i svangerskapet, eller om morkaken i tilstrekkelig grad kan gi endokrin støtte til graviditeten på det stadiet. Disse pelletsene er derfor optimale for kortsiktige modeller av graviditet, inkludert den kunstige decidualiseringsprotokollen som presenteres her, samt graviditetsstudier opptil 10 dager etter embryooverføring. Mens pellets med langsom frigjøring negerer behovet for daglig dyrehåndtering og injeksjoner, er det fortsatt nødvendig med noen lavdose østrogeninjeksjoner for å balansere progesteronreseptorens tilbakemeldingssløyfe. Denne strategien har vært brukt tidligere20,21.

Til slutt er osmotiske minipumper den mest nøyaktige hormonleveringsmetoden og er kommersielt tilgjengelige, men de er det dyreste alternativet. Osmotiske minipumper kan levere en innstilt konsentrasjon av hormon daglig i opptil 28 dager, avhengig av hvilken modell som er valgt. I likhet med pellets med langsom frigjøring, mens osmotiske minipumper unngår behovet for daglig dyrehåndtering, er det fortsatt nødvendig med noen lavdose østrogeninjeksjoner.

Den kunstige decidualiseringsprotokollen beskrevet her tillater studier av en tidlig graviditetsmilepæl uavhengig av ovarie- og embryonal påvirkning. Mens mennesker gjennomgår decidualization med hver menstruasjonssyklus, gnagere bare decidualize under graviditet etablering. Dermed har denne modellen enorm verdi for å studere menneskelignende graviditetsmilepæler i en manipulerbar gnagermodell. Prosedyren som er beskrevet her, er relativt ikke-invasiv, da den bruker en ikke-kirurgisk embryooverføringsanordning (NSET) for å levere sesamolje direkte til livmorhornet via skjeden og livmorhalsen. Selv om denne prosedyren er mindre invasiv enn andre metoder, kan det bli ganske dyrt når du bruker kommersielle NSETs. Til sammenligning krever andre publiserte modeller av kunstig decidualisering en kirurgisk prosedyre for å utføre intrauterin injeksjoner av olje17. Dette krever et kirurgisk oppsett som ligner det som er beskrevet i avsnitt 1 og trinn 2.1-2.11. Men hos dyr som har blitt ovariektomisert tidligere, kan det være mer utfordrende å identifisere og eksponere livmorhornet. Det kan også være vedheft dannet fra den tidligere kirurgiske prosedyren for ovariektomi. Selv om det kan være mer kostnadseffektivt å utføre kirurgiske intrauterine injeksjoner for å indusere decidualisering, er kirurgisk og anestesitid vesentlig lengre enn alternativet med å bruke NSET. Det er etablert protokoller for interne fabrikkerte alternativer22 til kommersielt tilgjengelige NSET-er, som er mye mer kostnadseffektive.

Mens embryooverføringsprosedyren er beskrevet her, har vi tidligere publisert denne modellen og dens suksessrater på tvers av forskjellige musestammer14. Dessuten, mens embryooverføringsmetoden beskrevet her bruker en kirurgisk tilnærming, kan NSETs også integreres i denne prosedyren.

Fremtidige retninger på dette området bør omfatte studier fokusert på de spesifikke livmorbidragene til etablering og vedlikehold av graviditet. Denne kunnskapen er avgjørende for å fremme vår forståelse av idiopatisk infertilitet, implantasjonssvikt og graviditetskomplikasjoner. Å utvide vår kunnskap på disse områdene er også grunnleggende for å forbedre kliniske resultater for IVF / ICSI-pasienter, samt vår forståelse av graviditet som en biologisk prosess.

Avslutningsvis er OVX en enkel prosedyre som kan integreres i dyremodeller for å studere livmorens bidrag til graviditet og fruktbarhet. Modeller i fremtiden vil dra nytte av å integrere OVX og eksogen hormonlevering, slik at sammenligninger kan gjøres mellom eggstokkspesifikke og livmorspesifikke bidrag til fruktbarhet og graviditet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne oppgir ingen konkurrerende økonomiske eller andre interesser.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble gjort mulig gjennom Victorian State Government Operational Infrastructure Support og Australian Government National Health and Medical Research Council (NHMRC) IRIISS. Dette arbeidet ble støttet av Monash University Faculty of Medicine, Nursing and Health Science Platform Access Grant til A.L.W. (Winship-PAG18-0343) for å få tilgang til Monash Reproductive Services Platform. A.L.W. støttes av DECRA finansiering DE21010037 fra Australian Research Council (ARC). JNH og LRA støttes av et australsk regjerings forskningsopplæringsprogramstipend. LRA støttes av et Monash Graduate Excellence Scholarship. K.J.H. støttes av et ARC Future Fellowship FT190100265.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ALZET 1002 mini osmotic pumps BioScientific 1002 Delivers 0.25 µL/h for 14 days. Use for section 7 (Experimental procedure - Embryo transfer).
ALZET 1003D mini osmotic pumps BioScientific 1003D Delivers 1 µL/h for 14 days. Use for section 8 (Experimental procedure - Artificial decidualization).
ALZET Reflex 7 mm clips BioScientific 0009971 Either Reflex clips or Michel clips can be used for wound closure, depending on preference
ALZET Reflex clip applicator BioScientific 0009974 Either Reflex clips or Michel clips can be used for wound closure, depending on preference
ALZET Reflex clip remover BioScientific 0009976 Either Reflex clips or Michel clips can be used for wound closure, depending on preference
Bupivicaine injection Pfizer NA Stock 0.5%. Use at 0.05% in saline
Estradiol Sigma E8875
Meloxicam Ilium NA Active constituent 0.5 mg/mL. Use 3.5 mL per 400 mL cage water bottle, or as your institution's vet prescribes.
Michel clips Daniels NS-000242
Multi purpose sealant Dow Corning 732
Non-surgical embryo transfer (NSET) device ParaTechs 60010 Contains 6 mm speculum. Single use only.
Progesterone Sigma P0130 Soluble in ethanol. Use for  section 3 (Hormone preparation - subcutaneous injection) and  section 4 (Hormone preparation - slow-release pellets)
Progesterone Sigma P7556 Soluble in water. Use for section 5 (Hormone preparation - osmotic mini pumps)
Refresh eye ointment Allergan NA 42.5% w/v liquid paraffin, 57.3% w/v soft white paraffin
Rimadyl Carprofen Zoetis NA Stock 50 mg/mL. Use at 1 mg/ml (for 5 mg/kg dose)
Rubber tubing Dow Corning 508-008 Washed in 100% ethanol and cut into 1 cm pieces. Inside diameter 1.57 mm ±  0.23 mm; outside diamater 3.18 mm ± 0.23 mm; wall 0.81 mm.
Sesame oil Sigma S3547
Sofsilk Silk sutures size 3-0 Covidien GS-832

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Szamatowicz, M. Assisted reproductive technology in reproductive medicine - Possibilities and limitations. Ginekologia Polska. 87 (12), 820-823 (2016).
  2. Evans, J., et al. Fertile ground: Human endometrial programming and lessons in health and disease. Nature Reviews. Endocrinology. 12 (11), 654-667 (2016).
  3. Norwitz, E. R., Schust, D. J., Fisher, S. J. Implantation and the survival of early pregnancy. The New England Journal of Medicine. 345 (19), 1400-1408 (2001).
  4. Zinaman, M. J., Clegg, E. D., Brown, C. C., O'Connor, J., Selevan, S. G. Estimates of human fertility and pregnancy loss. Fertility & Sterility. 65 (3), 503-509 (1996).
  5. Kupka, M. S., et al. Assisted reproductive technology in Europe, 2010: Results generated from European registers by ESHRE†. Human Reproduction. 29 (10), 2099-2113 (2014).
  6. Gleicher, N., Kushnir, V. A., Barad, D. H. Worldwide decline of IVF birth rates and its probable causes. Human Reproduction Open. 2019 (3), (2019).
  7. Diaz-Gimeno, P., et al. A genomic diagnostic tool for human endometrial receptivity based on the transcriptomic signature. Fertility & Sterility. 95 (1), 50-60 (2011).
  8. Amin, J., et al. Personalized embryo transfer outcomes in recurrent implantation failure patients following endometrial receptivity array with pre-implantation genetic testing. Cureus. 14 (6), e26248 (2022).
  9. Patel, J. A., Patel, A. J., Banker, J. M., Shah, S. I., Banker, M. R. Personalized embryo transfer helps in improving in vitro fertilization/ICSI outcomes in patients with recurrent implantation failure. Journal of Human Reproductive Sciences. 12 (1), 59-66 (2019).
  10. Khan, K. N., et al. Biological differences between functionalis and basalis endometria in women with and without adenomyosis. European Journal of Obstetrics, Gynecology, and Reproductive Biology. 203, 49-55 (2016).
  11. Richards, J. S., Ren, Y. A., Candelaria, N., Adams, J. E., Rajkovic, A. Ovarian follicular theca cell recruitment, differentiation, and impact on fertility: 2017 update. Endocrine Reviews. 39 (1), 1-20 (2018).
  12. Corciulo, C., et al. Pulsed administration for physiological estrogen replacement in mice. F1000Research. 10, 809 (2021).
  13. Greaves, E., et al. A novel mouse model of endometriosis mimics human phenotype and reveals insights into the inflammatory contribution of shed endometrium. The American Journal of Pathology. 184 (7), 1930-1939 (2014).
  14. Griffiths, M. J., Alesi, L. R., Winship, A. L., Hutt, K. J. Development of an embryo transfer model to study uterine contributions to pregnancy in vivo in mice. Reproduction & Fertility. 3 (1), 10-18 (2022).
  15. Cousins, F. L., et al. Evidence from a mouse model that epithelial cell migration and mesenchymal-epithelial transition contribute to rapid restoration of uterine tissue integrity during menstruation. PLoS One. 9 (1), e86378 (2014).
  16. Cousins, F. L., et al. Androgens regulate scarless repair of the endometrial "wound" in a mouse model of menstruation. FASEB Journal. 30 (8), 2802-2811 (2016).
  17. Fullerton, P. T., Monsivais, D., Kommagani, R., Matzuk, M. M. Follistatin is critical for mouse uterine receptivity and decidualization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (24), E4772-E4781 (2017).
  18. Rowland, R. R., Reyes, E., Chukwuocha, R., Tokuda, S. Corticosteroid and immune responses of mice following mini-osmotic pump implantation. Immunopharmacology. 20 (3), 187-190 (1990).
  19. Barton, B. E., et al. Roles of steroid hormones in oviductal function. Reproduction. 159 (3), R125-R137 (2020).
  20. Lee, J. E., et al. Autophagy regulates embryonic survival during delayed implantation. Endocrinology. 152 (5), 2067-2075 (2011).
  21. Hamatani, T., et al. Global gene expression analysis identifies molecular pathways distinguishing blastocyst dormancy and activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (28), 10326-10331 (2004).
  22. Cui, L., et al. Transcervical embryo transfer in mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 53 (3), 228-231 (2014).

Tags

Retraksjon utgave 194 Fertilitet graviditet livmor ovariektomi mottakelighet decidualisering
Metoder for å studere livmorbidrag til svangerskapsetablering i en ovariektomert musemodell
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Griffiths, M. J., Higgins, J. N.,… More

Griffiths, M. J., Higgins, J. N., Cousins, F. L., Alesi, L. R., Winship, A. L., Hutt, K. J. Methods for Studying Uterine Contributions to Pregnancy Establishment in an Ovariectomized Mouse Model. J. Vis. Exp. (194), e64763, doi:10.3791/64763 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter