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Developmental Biology

Méthodes d’étude des contributions utérines à l’établissement de la grossesse dans un modèle murin ovariectomisé

Published: April 7, 2023 doi: 10.3791/64763
Automatic Translation
*1,2, *1, 3, 1, *1, *1
1Biomedicine Discovery Institute, Department of Anatomy and Developmental Biology, Monash University, 2Gynaecology Research Centre, Royal Women’s Hospital and Department of Obstetrics and Gynaecology, University of Melbourne, 3The Ritchie Centre, Hudson Institute for Medical Research and Department of Obstetrics and Gynaecology, Monash University
* These authors contributed equally

Summary

L’établissement de la grossesse est un processus dynamique impliquant une diaphonie embryonnaire et utérine complexe. Les contributions précises de l’environnement utérin maternel à ces processus restent un domaine de recherche actif. Ici, des protocoles détaillés sont fournis pour aider à concevoir des modèles animaux in vivo pour répondre à ces questions de recherche.

Abstract

Pour qu’une grossesse soit établie, un blastocyste viable doit interagir avec succès avec une muqueuse utérine réceptive (endomètre) pour faciliter l’implantation et la formation de placenta et permettre la poursuite de la grossesse. Les limites au succès de la grossesse causées par des anomalies embryonnaires sont bien connues et ont été largement surmontées au cours des dernières décennies avec l’essor de la fécondation in vitro (FIV) et des technologies de procréation assistée. Jusqu’à présent, cependant, le domaine n’a pas surmonté les limitations causées par un endomètre insuffisamment réceptif, ce qui entraîne une stagnation des taux de réussite de la FIV. Les fonctions ovarienne et endométriale sont étroitement liées, car les hormones produites par l’ovaire sont responsables de la cyclicité menstruelle de l’endomètre. En tant que tel, lors de l’utilisation de modèles de grossesse chez les rongeurs, il peut être difficile de déterminer si un résultat observé est dû à un déficit ovarien ou utérin. Pour surmonter cela, un modèle murin ovariectomisé a été développé avec transfert d’embryons ou décidualisation artificielle pour permettre l’étude des contributions spécifiques utérines à la grossesse. Cet article fournira des instructions sur la façon d’effectuer une ovariectomie et offrira un aperçu de diverses techniques pour fournir des hormones exogènes afin de soutenir une décidualisation artificielle ou une grossesse réussie après le transfert d’embryons de donneurs sains. Ces techniques comprennent l’injection sous-cutanée, les pastilles à libération lente et les mini-pompes osmotiques. Les principaux avantages et inconvénients de chaque méthode seront discutés, ce qui permettra aux chercheurs de choisir le meilleur plan d’étude pour leur question de recherche spécifique.

Introduction

Avec l’utilisation croissante des technologies de procréation assistée au cours des dernières décennies, de nombreux obstacles à la conception ont été surmontés, permettant à de nombreux couples de fonder une famille malgré les problèmes de fertilité1. Les déficits ovocytaires ou spermatozoïdes peuvent souvent être contournés par fécondation in vitro ou injection intracytoplasmique de spermatozoïdes; Cependant, les problèmes liés à la réceptivité de l’utérus et de l’endomètre restent une « boîte noire » insaisissable du potentiel reproducteur2.

La grossesse est établie lorsqu’un embryon de haute qualité interagit avec succès avec un endomètre réceptif (muqueuse utérine). Les chances de réussite de la grossesse dans un cycle menstruel donné sont faibles, à environ 30%3,4. Parmi celles qui réussissent, seulement 50% à 60% avancent au-delà de 20 semaines de gestation, l’échec de l’implantation étant responsable de 75% des grossesses qui n’atteignent pas 20 semaines3. Malgré ces chiffres datant de la fin des années 1990, le domaine n’a pas encore surmonté les limites causées par un endomètre insuffisamment réceptif. Cela a entraîné une stagnation - et parfois une baisse - des taux de réussite de la FIV au cours des dernières années 5,6.

Les femmes souffrant d’infertilité inexpliquée ont souvent une fenêtre de réceptivité déplacée ou sont incapables d’atteindre la réceptivité pour des raisons inconnues. Récemment, le réseau de réceptivité de l’endomètre a été développé, qui évalue l’expression de centaines de gènes dans le but d’adapter le moment du transfert d’embryons à la fenêtre de réceptivité d’un individu 7,8,9. Cependant, le domaine manque encore de compréhension de la pathogenèse des complications de la grossesse qui se manifestent après la fin du processus d’implantation.

Le système reproducteur féminin est très dynamique et sous contrôle hormonal étroit. L’axe hypothalamo-hypophyso-gonadique (HPG) contrôle la libération de l’hormone lutéinisante et de l’hormone folliculo-stimulante, qui régulent les aspects du cycle ovarien, y compris la maturation des follicules et l’activité des œstrogènes et de la progestérone. À son tour, le cycle menstruel utérin est régulé par les œstrogènes et la progestérone10,11. Ainsi, l’étude des mécanismes biologiques utérins est compliquée par l’influence ovarienne. Par exemple, lorsque l’on étudie l’impact des thérapies anticancéreuses sur l’utérus, il peut être difficile de distinguer si un phénotype utérin observé (comme une perte de grossesse ou une acyclique menstruelle) est le résultat d’une insulte directe à l’utérus ou d’un effet consécutif de dommages aux ovaires.

Pour bien comprendre la fertilité, les contributions utérines à la grossesse doivent être caractérisées. Il est important de noter que cette compréhension doit s’étendre au-delà de la fonction utérine sous contrôle ovarien. Cela ne peut pas être étudié chez l’homme; Par conséquent, des modèles animaux sont souvent utilisés. En tant que telle, l’ovariectomie (OVX) est couramment utilisée pour permettre aux chercheurs de réguler les cycles œstraux des rongeurs (analogues au cycle menstruel) en fournissant des hormones exogènes. De plus, OVX permet d’étudier les réponses utérines indépendamment de l’influence ovarienne12. Cependant, si les hormones ne sont pas immédiatement fournies après OVX, un phénotype de ménopause finira par apparaître, ce qui doit être soigneusement examiné par les chercheurs.

OVX est fréquemment utilisé dans les modèles de rongeurs 13,14,15,16,17 et est relativement facile à réaliser après un entraînement adéquat. Les méthodes varient selon que l’ovaire seul ou l’ovaire et l’oviducte sont enlevés, ainsi que selon l’âge de l’animal (adultes, les animaux cyclistes ont des ovaires plus gros avec un corps jaune visible à leur surface, ce qui signifie que leurs ovaires sont plus faciles à visualiser). De même, de nombreuses méthodes de supplémentation hormonale existent, notamment les injections sous-cutanées14, les pastilles à libération lente 15, les minipompes osmotiques18 et la greffe ovarienne.

Dans cet article, des instructions détaillées sont fournies sur la façon d’effectuer une ovariectomie et de préparer trois types de supplémentation hormonale, y compris les injections sous-cutanées, les granulés à libération lente et les mini-pompes osmotiques. Deux protocoles détaillés sont fournis pour les critères expérimentaux qui bénéficient d’OVX suivi d’une supplémentation en hormones exogènes (transfert d’embryons et décidualisation artificielle). Cet article traite des forces et des faiblesses de chaque approche dans le but de guider les chercheurs sur la façon de mener des études pour isoler les impacts sur l’utérus, en particulier dans les domaines de la grossesse et de la fertilité.

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Protocol

Tous les animaux ont été logés dans des installations à haute barrière à température contrôlée (laboratoire de recherche animale de l’Université Monash) avec un accès gratuit à la nourriture et à l’eau et un cycle lumière-obscurité de 12 heures. Toutes les procédures ont été effectuées conformément à l’approbation du comité d’éthique de la plate-forme de recherche animale Monash (# 21908, 17971) et conformément au code de pratique du Conseil national de la santé et de la recherche médicale pour le soin et l’utilisation des animaux.

1. Préparation chirurgicale

  1. Autoclaver tous les instruments chirurgicaux, gaze et essuie-tout nécessaires aux procédures sur un cycle de marchandises dures/sèches à 121 °C avec un temps de maintien de 30 min et un temps de séchage de 30 min.
  2. Disposez un banc de paillasse stérile pour l’espace de travail chirurgical et préparez des analgésiques.
    1. Diluer le carprofène dans une solution saline stérile à 1 mg/ml et diluer la bupivacaïne dans une solution saline stérile à une solution à 0,5 % (p/v).
    2. Ajouter 3,5 mL de méloxicam dans une bouteille d’eau de cage de 400 mL.
  3. Préchauffez le(s) coussin(s) chauffant(s) pour les cages de récupération et installez des lampes chauffantes pour éclairer indirectement les animaux en convalescence.
  4. Assurez-vous que tout l’EPI approprié est porté, y compris un filet à cheveux, un masque facial, une blouse et des gants.
  5. Pratiquez une bonne technique stérile, notamment en pulvérisant régulièrement les gants avec de l’éthanol et en les laissant s’évaporer avant de manipuler l’animal ou les outils chirurgicaux pour éviter la contamination par l’éthanol.

2. Réalisation d’une ovariectomie

  1. À l’aide d’une machine d’anesthésie gazeuse à l’isoflurane, préremplir la boîte d’induction pendant 3 à 5 min à 5 % d’isoflurane avec un débit réglé à 4 L/min.
  2. Placez la souris à l’intérieur du boîtier d’induction et, une fois inconsciente, déplacez-la vers le cône de nez et réduisez le débit à 0,4 L / min, avec le vaporisateur d’isoflurane réglé sur ~2,5%.
    REMARQUE : Le pourcentage d’isoflurane utilisé pour le reste de l’intervention varie en fonction de la souche de souris, de l’âge et de l’exposition aux traitements (p. ex. chimiothérapie) et doit être ajusté en fonction d’une évaluation minutieuse des habitudes respiratoires de chaque animal. Les schémas respiratoires doivent rester comme des respirations abdominales régulières. Des respirations thoraciques rapides peuvent indiquer qu’un plan chirurgical profond n’a pas été atteint ou maintenu; Dans ce cas, réglez le pourcentage du vaporisateur d’isoflurane si nécessaire.
  3. Appliquez généreusement le lubrifiant pour les yeux en pressant le tube et en tamponnant doucement l’œil.
  4. Rasez une petite zone (2 cm x 2 cm) au niveau et au-dessous de l’inclinaison de la colonne vertébrale.
  5. Administrer 5 mg/kg de carprofène à partir d’une solution diluée de 1 mg/mL par voie sous-cutanée au niveau de la peau du cou.
  6. Testez la profondeur de l’anesthésie avec le réflexe de pincement des orteils en pinçant l’orteil arrière de la souris. S’il n’y a pas de réaction de pincement des orteils, l’animal est dans le plan chirurgical profond et la procédure peut continuer.
  7. Appliquez de la bétadine sur la zone chirurgicale et couvrez d’un champ chirurgical (une gaze avec une fenêtre découpée de 2 cm x 2 cm).
  8. À l’aide d’une pince à dents de rat, tirez la peau à la bosse du dos vers le haut et faites une incision longitudinale de ~5 mm.
    REMARQUE : Une incision cutanée à cette hauteur sur le dos de l’animal est préférable pour la mise en place d’une pince chirurgicale afin de réduire le risque que l’animal retire les clips et nécessite des réparations de clip.
  9. À l’aide d’une pince émoussée, procéder à la dissection émoussée de la peau loin de la couche musculaire sous-jacente, en descendant et d’un côté vers le rein.
  10. Identifiez visuellement le coussinet adipeux des reins, des ovaires et des ovaires à travers la paroi musculaire.
    REMARQUE: Le rein apparaîtra d’une couleur rouge foncé, le coussinet adipeux apparaîtra blanc brillant et, s’il est visible, l’ovaire ressemblera à un petit point rose dans le coussinet adipeux.
  11. À l’aide de forceps, saisissez et soulevez la couche musculaire. Faites une incision de ~0,5-1 cm avec des ciseaux chirurgicaux tranchants. Continuez à tenir la paroi musculaire avec une pince et passez des ciseaux aux pinces contondantes pour tirer le coussinet adipeux ovarien à travers l’incision.
  12. À l’aide d’un porte-aiguille incurvé, serrez sous l’ovaire et l’oviducte à l’extrémité distale de la corne utérine.
    REMARQUE: Alternativement, l’ovaire seul peut être enlevé, laissant l’oviducte intact. Cependant, un microscope à dissection est nécessaire pour visualiser avec précision la distinction entre l’ovaire et l’oviducte.
  13. Retirez l’ovaire avec des ciseaux ou un scalpel. Continuez à serrer pendant 30 s pour éviter les saignements excessifs.
  14. Retirez la pince et tamponnez-la avec de la gaze stérile si nécessaire.
  15. Pour fermer l’incision de la paroi musculaire, utilisez une pince pour soulever le haut de l’incision afin que l’incision se rapproche naturellement.
  16. Utilisez des sutures en soie (taille 3-0) pour fermer l’incision de la paroi musculaire avec un nœud de chirurgien.
  17. Appliquez deux à trois gouttes de bupivacaïne par voie topique à l’aide d’une seringue de 1 ml sans aiguille et répétez les étapes 2.9-2.17 de l’autre côté.
  18. Pour fermer l’incision cutanée, utilisez de la gaze pour tamponner la zone sèche de l’excès de bupivacaïne et pressez les deux côtés de la peau ensemble.
  19. Appliquez un à deux clips chirurgicaux de 7 mm, laissant de l’espace pour l’enflure dans le cadre du processus de guérison.
  20. Déplacez la souris vers une cage de récupération et surveillez étroitement pendant 15 minutes.
    REMARQUE: Les animaux doivent se réveiller rapidement; Assurez-vous de surveiller de près la respiration pour les habitudes respiratoires thoraciques normales.

3. Préparation hormonale: injection sous-cutanée

  1. Préparer une solution mère d’œstradiol à 1 mg/mL.
    1. Peser 0,001 g (1 mg) de poudre d’œstradiol dans un tube stérile de 1,5 mL.
    2. Ajouter 1 mL d’éthanol à 100 % dans le tube et vortex pendant quelques secondes.
      NOTE: L’éthanol restera clair avec des taches visibles de poudre d’œstradiol.
    3. Enveloppez le tube avec un film pour empêcher toute évaporation d’éthanol.
    4. Enveloppez le tube dans du papier d’aluminium et placez-le sur une bascule pendant la nuit pour dissoudre complètement la poudre d’œstradiol.
    5. Diluer ce stock de 1 mg/mL dans de l’huile de sésame jusqu’à la concentration finale désirée.
      NOTE: Des doses de 100 ng pendant 3 jours sont nécessaires pour l’amorçage avant la décidualisation artificielle, et de faibles doses supplémentaires de 25 ng sont nécessaires lorsque la progestérone est administrée. Il s’agit de lutter contre la boucle de rétroaction contrôlant l’expression du récepteur de la progestérone. Pour le transfert d’embryons, deux doses de 100 ng le jour 1 et le jour 3 avant le transfert d’embryons le jour 4 sont nécessaires. Au moment du transfert d’embryons, une faible dose de 25 ng est également nécessaire.
    6. Aspirez la quantité requise d’œstradiol dans l’huile dans une seringue de 1 mL, puis fixez un embout d’aiguille de 26 G.
    7. Injecter la dose appropriée par voie sous-cutanée (soit au niveau de la peau ou du flanc; 100 ng/100 μL ou 25 ng/100 μL pour l’amorçage avant le transfert d’embryons ou la décidualisation artificielle ou au moment du transfert d’embryons) à la fréquence requise.
      REMARQUE: L’huile est très visqueuse, alors assurez-vous d’injecter lentement et de faire une pause de quelques secondes avant de retirer l’aiguille. Cela minimisera la quantité d’huile qui s’échappe du site d’injection.
  2. Faire une solution mère de 200 mg/mL de progestérone.
    1. Peser 0,4 g (400 mg) de poudre de progestérone dans un tube stérile de 5 mL.
    2. Ajouter 2 mL d’éthanol à 100 % dans le tube et vortex pendant quelques secondes.
      REMARQUE: L’éthanol deviendra de couleur blanche.
    3. Répétez les étapes 3.1.3-3.1.4.
    4. Diluer le bouillon de 200 mg/mL dans l’huile de sésame jusqu’à la concentration finale désirée.
      REMARQUE: Des doses de 2 mg par jour sont nécessaires pour soutenir le transfert d’embryons.
    5. Injecter la dose appropriée (p. ex. 2 mg/100 μL par jour pour soutenir la grossesse) par voie sous-cutanée comme aux étapes 3.1.6 à 3.1.7.

4. Préparation hormonale : granulés à libération lente

  1. Poser une feuille sur la surface d’une hotte de biosécurité à écoulement laminaire ou de classe II.
  2. Placez tout le matériel (gants, boîtes de Petri, seringues de 1 mL, pinces fines) dans la hotte et allumez les UV pendant 20 min.
    REMARQUE: N’allumez pas l’UV avec le scellant à l’intérieur de la hotte car il se fixera.
  3. Lavez le tube silastique dans de l’éthanol à 100 % et laissez-le sécher à l’air libre dans la hotte. Une fois sec, marquez ~1 cm de longueur le long du tube et coupez avec un scalpel.
  4. Retirez le piston d’une seringue et insérez ~200 μL de scellant. Replacez le piston et retirez une petite quantité de scellant de la seringue.
  5. Appliquez une petite quantité de scellant à une extrémité du tube et lissez-le avec un doigt ganté.
  6. Laisser sécher pendant la nuit ou pendant 20-30 minutes à la lumière UV à l’intérieur de la hotte.
  7. Versez une quantité appropriée de progestérone dans une boîte de Petri stérilisée. À l’aide d’une pince, versez des pastilles dans la poudre de progestérone pour remplir la pastille.
    1. Tapotez l’extrémité scellée de la pastille sur la surface du capot pour condenser la progestérone. Alternativement, utilisez l’extrémité des forceps stérilisés pour bourrer la progestérone. Laissez suffisamment d’espace pour plus de scellant.
  8. Scellez l’extrémité ouverte avec du scellant, comme décrit aux étapes 3.4 à 3.5.
  9. Enveloppez la boîte de Petri contenant les granulés de progestérone dans du papier d’aluminium pour la protéger de la lumière.
  10. Activer les pastilles pendant au moins 72 h avant l’insertion sous-cutanée en les incubant dans du FCS dénudé à 1 % (cs-FCS: PBS) à 37 °C.
    REMARQUE: Les granulés peuvent être fabriqués en vrac avec une seule extrémité scellée à l’avance. Cependant, de la progestérone fraîche doit être utilisée pour les remplir à chaque fois. Assurez-vous que les granulés préfabriqués sont stérilisés aux UV avant de les remplir de progestérone. Les pastilles sécrèteront ~ 500 μg / jour pendant 6-10 jours, ce qui est un soutien suffisant pour la décidualisation artificielle et les procédures de transfert d’embryons, bien qu’une injection supplémentaire d’œstrogènes à faible dose puisse être nécessaire pour maintenir l’activité du récepteur de la progestérone au-delà de 4-5 jours. Au-delà de 10 jours, une pastille de progestérone de remplacement peut être nécessaire.

5. Préparation hormonale: mini-pompes osmotiques

  1. Préparer la progestérone à la concentration désirée dans une solution aqueuse et choisir le modèle de mini-pompe osmotique approprié (voir le tableau des matériaux).
    NOTE: Pour la section 7 (procédure expérimentale: transfert d’embryons), l’administration de 2 mg / jour pendant 12 jours est requise. Par conséquent, dissoudre 28 mg de progestérone dans ~100 μL d’eau stérile par animal (suivez les instructions du fabricant pour le volume spécifique). Des dilutions en série peuvent être nécessaires. Pour la section 8 (procédure expérimentale: décidualisation artificielle), l’administration de 500 μg par jour pendant 3 jours est requise. Par conséquent, dissoudre 1 500 μg de progestérone dans ~100 μL d’eau stérile par animal. Préparez une solution supplémentaire pour tenir compte du volume perdu pendant la procédure de remplissage.
  2. Installez l’équipement (gants, lingettes à faible peluche, boîtes de Petri, solution saline stérile, seringues de 1 mL, petits bateaux de pesée, papier d’aluminium et balances d’une précision de 0,01 g) dans une cagoule de biosécurité de classe II, puis allumez les UV pendant 20 minutes.
  3. Aspirez la solution hormonale dans une seringue de 1 mL, puis fixez un tube de remplissage stérile, en veillant soigneusement à ce qu’il n’y ait pas de bulles d’air.
  4. Pesez la pompe et son modérateur de débit dans un bateau de pesage stérile.
  5. Insérez le tube de remplissage par l’ouverture située en haut de la pompe jusqu’à ce qu’il ne puisse plus aller plus loin.
  6. En tenant la pompe à la verticale, poussez lentement le piston de la seringue pour remplir le tube.
    REMARQUE: Le remplissage rapide doit être évité car cela peut introduire des bulles d’air dans la pompe.
  7. Lorsque la solution déborde du haut de la pompe, retirez délicatement le tube de remplissage et essuyez l’excès de solution avec une lingette stérile à faible peluche.
  8. Insérez le modérateur de débit par l’ouverture située en haut de la pompe jusqu’à ce qu’il ne puisse plus aller plus loin. Une fois complètement enfoncé, appuyez fermement sur la pompe et le modérateur de débit ensemble.
  9. Pesez la pompe remplie avec le modérateur de débit en place.
    REMARQUE : La différence de poids obtenue à l’étape 5.3 et à l’étape 5.8 donnera le poids net de la solution chargée (c.-à-d. une augmentation de 0,1 g = 100 μL de solution ajoutée).
  10. Placez la pompe remplie dans une boîte de Petri stérile remplie de solution saline stérile.
  11. Une fois toutes les pompes remplies, enveloppez la boîte de Petri dans du papier d’aluminium et placez-la dans un incubateur à 37 °C pour amorcer pendant au moins 4 à 6 h (ou jusqu’à ce qu’elle soit prête à l’emploi).

6. Intervention chirurgicale: Insertion de pastilles d’hormones sous-cutanées et de mini-pompes

  1. Préparez la zone conformément à la section 1 (préparation chirurgicale).
  2. Anesthésiez les animaux conformément aux étapes 2.1-2.3.
  3. Rasez une petite zone au niveau de la peau du cou (~1 cm x 1 cm).
  4. Administrer 5 mg/kg de carprofène à partir d’une solution diluée de 1 mg/mL par voie sous-cutanée dans le flanc de la jambe.
  5. Testez le réflexe de pincement des orteils. S’il n’y a pas de réflexe, l’animal est dans le plan chirurgical profond et la procédure peut commencer.
  6. Appliquez de la bétadine sur la zone chirurgicale et couvrez-la d’un champ chirurgical (une gaze avec une fenêtre de 2 cm x 2 cm découpée).
  7. À l’aide d’une pince à dents de rat, tirez la peau au niveau de la peau du cou (à mi-chemin entre la vraie peau et l’intuition du dos) vers le haut et faites une incision longitudinale de ~5 mm.
  8. À l’aide d’une pince émoussée, disséquer la peau loin de la couche musculaire sous-jacente vers le bas.
    REMARQUE: Pour l’insertion osmotique de la mini-pompe, créez une poche le long d’un côté de l’animal afin que la pompe ne limite pas le mouvement de l’animal ou ne appuie pas contre le site d’incision.
  9. Une fois que suffisamment d’espace a été fait pour la pastille d’hormone ou la mini-pompe, utilisez des pinces stériles pour ramasser la pastille ou la mini-pompe et insérez-la dans la poche sous-cutanée réalisée par dissection contondante.
  10. Pour fermer l’incision cutanée, assurez-vous que la pastille ou la mini-pompe est suffisamment loin dans la poche pour que les clips chirurgicaux ne l’endommagent pas.
  11. Appliquer localement la bupivacaïne conformément à l’étape 2.17.
  12. Fermez la plaie avec un clip chirurgical. Déplacez la souris vers une cage de récupération et surveillez étroitement pendant 15 minutes. Comme il s’agit d’une procédure courte, les animaux devraient être ambulatoires en quelques minutes.

7. Procédure expérimentale : Transfert d’embryons

  1. Pour les animaux ovariectomisés, amorcer l’hormone 3 jours avant le transfert embryonnaire par injection sous-cutanée de 100 ng/100 μL d’œstradiol (étape 3.1).
  2. Un jour avant le transfert d’embryons, amorcer les hormones avec une injection sous-cutanée de 2 mg/100 μL d’acétate de médroxyprogestérone (étape 3.2).
  3. Préparez la zone conformément à la section 1 (préparation chirurgicale).
  4. Anesthésiez les animaux conformément aux étapes 2.1-2.3.
  5. Commencez la procédure conformément aux étapes 2.4-2.10.
  6. Sous un microscope à dissection, créez un point d’injection intra-utérin avec une pointe d’aiguille de 26 G.
  7. Pipeter cinq blastocystes dans une goutte de milieu M2, puis les transférer dans la corne utérine.
  8. Pour fermer l’incision de la paroi musculaire, soulevez le haut de l’incision à l’aide d’une pince afin que l’incision se rapproche naturellement.
  9. À l’aide de sutures en soie, fermez le site de la paroi musculaire avec un nœud de chirurgien. Appliquer des gouttes de bupivacaïne par voie topique.
  10. Répétez les étapes 7.5-7.8 de l’autre côté.
  11. Pour fermer l’incision cutanée, utilisez de la gaze pour tamponner la zone sèche de l’excès de bupivacaïne et pressez les deux côtés de la peau ensemble.
  12. Appliquez un à deux clips chirurgicaux, laissant de l’espace pour l’enflure dans le cadre du processus de guérison.
    NOTE: Si les animaux sont ovariectomisés, des hormones exogènes sont nécessaires au moment du transfert d’embryons. Injectez de la progestérone par voie sous-cutanée (2 mg) ou insérez une pastille de progestérone sous-cutanée ou une mini-pompe osmotique. Pour lutter contre l’excès de progestérone, une injection sous-cutanée d’œstrogène à faible dose (25 ng / 100 μL) est nécessaire au moment du transfert d’embryons.
  13. Transportez soigneusement la souris dans une cage de récupération et surveillez de près pendant 15 minutes.
    REMARQUE: Les animaux doivent se réveiller rapidement; Assurez-vous de surveiller de près la respiration pour les habitudes respiratoires thoraciques normales.

8. Procédure expérimentale : décidualisation artificielle

  1. Hormone amorce les animaux avec 100 ng/100 μL d’estradiol le jour 1, le jour 2 et le jour 3, conformément à la section 3 (préparation hormonale: injection sous-cutanée) 8 jours avant la décidualisation artificielle.
  2. Hormone amorce les animaux avec 5 ng/100 μL d’estradiol aux jours 7, 8 et 9, conformément à la section 3 (préparation hormonale : injection sous-cutanée) 2 jours avant la décidualisation artificielle.
    NOTE: L’injection finale doit avoir lieu au moins 3 heures (et au maximum 4 heures) avant la procédure de décidualisation artificielle.
  3. Animaux à taux hormonal de première qualité munis d’une pastille de progestérone sous-cutanée ou d’une mini-pompe osmotique (500 μg/jour), conformément aux sections 4, 5 et 8, 2 jours avant la décidualisation artificielle.
  4. Préparez la zone conformément à la section 1 (préparation chirurgicale).
  5. Anesthésiez les animaux conformément aux étapes 2.1-2.2.
  6. Testez la profondeur de l’anesthésie avec le réflexe de pincement des orteils. S’il n’y a pas de réaction de pincement des orteils, l’animal est dans le plan chirurgical profond et la procédure peut continuer.
  7. Placez la souris en position couchée, soulevez la queue et insérez lentement un spéculum de 6 mm de diamètre dans le vagin.
  8. Tout en gardant le nez de l’animal dans le cône nasal anesthésique, placez le bas du corps de l’animal entre le premier et le deuxième doigt de la main non dominante. Utilisez le pouce pour pousser doucement la queue vers le haut pour garder l’ouverture vaginale en vue.
  9. Transférer 20 μL d’huile de sésame dans une corne utérine à l’aide d’une pointe de transfert d’embryons non chirurgicale (fixée à une pipette de 20 μL).
    1. En gardant la pipette au niveau de l’ouverture vaginale, insérez la pointe dans le vagin et à travers le col de l’utérus dans la corne utérine. Une fois que la pointe est dans la corne utérine, appuyez doucement sur la pointe contre la surface de l’endomètre (si vous utilisez la technique de manipulation ci-dessus, ce mouvement sera ressenti contre le deuxième doigt) et expulsez lentement l’huile.
      REMARQUE: Gardez le piston de la pipette enfoncé, attendez 10 secondes pour vous assurer que toute l’huile s’est dispersée et retirez lentement l’embout de transfert tout en maintenant le piston enfoncé.
  10. Retirez le spéculum du vagin.
  11. Transportez soigneusement la souris vers la cage de récupération et surveillez de près pendant 15 minutes.
    REMARQUE: Les animaux doivent se réveiller rapidement. Surveillez de près leur respiration pour les habitudes respiratoires thoraciques normales.
  12. Limitez la manipulation des animaux et gardez-les dans un environnement calme pendant 96 heures après l’intervention.
    REMARQUE: Des bruits forts ou des changements brusques à leur cycle de lumière et d’obscurité auront un impact sur le succès de la procédure. Au moment de la dissection tissulaire, l’étendue du succès de la décidualisation peut être mesurée en fonction du rapport entre le poids utérin et le poids corporel. La procédure de décidualisation artificielle a un taux de réussite de 80%. Par conséquent, excluez les animaux qui ne décident pas et tenez-en compte lors de la sélection de la taille des échantillons pour les expériences.

9. Procédure chirurgicale : récupération post-chirurgicale, surveillance et réparation des clips

  1. Laissez les animaux récupérer les coussins chauffants à moitié sur et à moitié enlevés pendant la nuit avant de les ramener dans leur cage familiale.
  2. Surveillez les animaux quotidiennement pendant 5 jours après la chirurgie, en accordant une attention particulière au site de la plaie pour détecter tout signe d’infection.
  3. Effectuez une réparation du clip si nécessaire.
    1. Préparez la zone conformément à la section 1 (préparation chirurgicale).
    2. Anesthésiez les animaux conformément aux étapes 2.1-2.3.
    3. Retirez le clip existant à l’aide d’un dissolvant de clip si le clip est toujours présent.
    4. Appliquez un nouveau clip chirurgical, conformément aux étapes 2.19-2.21.
  4. Retirez les clips chirurgicaux 7 jours après la chirurgie conformément aux étapes 9.3.1 à 9.3.3 ou lorsque l’animal est sous anesthésie (comme pour un transfert d’embryons, la procédure de décidualisation artificielle ou une injection sous-cutanée après la chirurgie).

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Representative Results

Un modèle bien caractérisé de décidualisation artificielle est décrit dans ce document de protocole (figure 1A). Ici, les jeunes souris femelles adultes (âgées de 8 semaines) ont subi une ovariectomie chirurgicale comme décrit aux rubriques 1 et 2. Les souris ont ensuite été reposées pendant 2 semaines pour s’assurer que les hormones ovariennes endogènes se dissipaient avant d’être soutenues par des hormones exogènes comme décrit dans les sections 3-7 et 9. La décidualisation artificielle a été induite par une injection intravaginale d’huile de sésame, puis les animaux ont été reposés jusqu’à la collecte de tissus, comme décrit à la rubrique 9. Dans cette étude, la décidualisation artificielle a été réalisée chez des souris C57BL6/J, une souche de souris couramment utilisée. Au moment de la collecte des tissus, le poids corporel a été enregistré et l’utérus a été disséqué et bien taillé avant d’être pesé (figure 1B). L’étendue de la réponse déciduale a été enregistrée en exprimant le poids utérin en rapport avec le poids corporel. Dans cette étude, 80 % des souris C57BL6/J ont décidualisé (0,01012 ± 0,001515, n = 15), tandis que 20 % des utérus animaux n’ont pas décidualisé (0,002108 ± 0,0001764, n = 3) (Figure 1C).

Figure 1
Figure 1 : Résultats schématiques et représentatifs. (A) Chronologie schématique pour induire expérimentalement une décidualisation artificielle dans un modèle murin. Abréviations : OVX = ovariectomie; E2 = œstradiol (100 ng jours 1-3, 5 ng jours 7-9); P4 = progestérone. Remarque : Une pastille P4 a été utilisée pour générer les résultats présentés ici. Les méthodes alternatives pour l’administration de progestérone comprennent les injections sous-cutanées quotidiennes et les pompes mini-osmotiques. (B) Images représentatives d’utérus non décidualisé (ND) et décidualisé (D) de jeunes souris adultes C57BL6/J. Barres d’échelle = 5 mm.(C) Comparaison du rapport poids utérin / poids corporel (UW:BC) chez les animaux non décidualisés et décidualisés. Les données sont moyennes ± SEM; Test de Mann-Whitney, **p = 0,003; ND : n = 3, D : n = 15. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Méthode d’administration d’hormones Forces Faiblesses
Injections sous-cutanées Aucune intervention chirurgicale requise Manipulations quotidiennes répétées
Technique accessible qui ne nécessite pas de formation chirurgicale (par rapport à l’implantation de granulés) Les hormones dans l’huile peuvent s’échapper du site d’injection, donc la quantité absorbée par chaque animal peut varier
Granulés à libération lente Pas besoin de manipulation quotidienne Intervention chirurgicale requise
Peut être fabriqué en interne Non disponible dans le commerce
Alternative abordable aux mini-pompes osmotiques
Petit et très bien toléré par les animaux
Minipompes osmotiques Pas besoin de manipulation quotidienne Intervention chirurgicale requise
Disponible dans le commerce Cher
Mode de livraison le plus précis Beaucoup plus gros que les granulés à libération lente

Tableau 1 : Forces et faiblesses des méthodes d’administration d’hormones.

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Discussion

Cet article fournit des instructions étape par étape sur la façon d’effectuer OVX et de fournir des hormones exogènes pour les études axées sur la compréhension des contributions utérines à la grossesse et à la fertilité. Deux protocoles détaillés sont fournis sur deux applications expérimentales de ces méthodes, y compris la réalisation du transfert d’embryons et l’induction artificielle de la décidualisation.

Bien que la réalisation d’OVX puisse être difficile au début - en particulier pour les chercheurs novices dans les modèles de rongeurs - il s’agit d’une procédure relativement simple une fois correctement formée et pratiquée. Les étapes clés des procédures comprennent la surveillance étroite des animaux pendant qu’ils sont sous anesthésie et s’assurer qu’il n’y a pas de tissu ovarien laissé derrière. Dans certains modèles, l’oviducte peut être laissé intact. Cependant, il convient de noter que l’oviducte est un tissu hormono-sensible avec des récepteurs abondants d’œstrogènes et de progestérone19. Le protocole chirurgical pour enlever l’ovaire et l’oviducte est beaucoup plus simple que l’ablation de l’ovaire seulement, car le premier peut être complété à l’œil nu. Pour enlever seulement l’ovaire et laisser l’oviducte en place dans ce dernier cas, un microscope à dissection est nécessaire, car il s’agit d’une procédure beaucoup plus complexe. Par conséquent, la durée de l’opération peut être prolongée, car l’animal doit être déplacé entre l’étape du microscope à dissection et le champ opératoire pour différentes parties de la procédure, telles que la suture de la paroi interne du corps.

Les protocoles analgésiques détaillés ici sont standard et approuvés par le comité d’éthique animale de l’Université Monash, de sorte qu’ils peuvent varier en fonction des exigences ou des préférences du comité d’éthique de chaque institution. Il convient de noter qu’aucune analgésie n’a été fournie pour la procédure de décidualisation artificielle, car les anti-inflammatoires non stéroïdiens typiques interfèrent avec le processus de décidualisation. Si les chercheurs souhaitent fournir des analgésiques au moment de la décidualisation artificielle, il faut en tenir compte.

Ce travail présente trois méthodes d’administration d’hormones pour compléter les hormones ovariennes après OVX, et chaque méthode a ses propres forces et faiblesses (tableau 1). Les injections sous-cutanées d’hormones dans l’huile sont courantes dans la littérature14,16,17. Cette technique a de nombreux atouts, y compris le fait qu’aucune intervention chirurgicale n’est requise et, par conséquent, aucune formation formelle en chirurgie des rongeurs ou en anesthésie gazeuse n’est requise. Cela fait de l’injection sous-cutanée une option accessible pour presque tous les groupes de recherche. Les injections sont également abordables et faciles à réaliser. En pratique, cependant, ils ont certaines limites, en particulier dans les modèles de grossesse. Pour maintenir la gestation chez un animal OVX, une supplémentation hormonale en progestérone doit être administrée quotidiennement pour soutenir la grossesse. Il peut être possible d’arrêter les injections quotidiennes une fois que le placenta est suffisamment développé pour prendre le relais en tant que principale source de progestérone, bien que cela n’ait pas été testé dans les protocoles présentés ici. De manière anecdotique, il est possible que des hormones dans l’huile s’échappent du site d’injection après une injection sous-cutanée. Cela peut être dû en partie à la taille de l’aiguille requise (26 G) pour distribuer facilement quelque chose d’aussi visqueux que l’huile de sésame. Par conséquent, cette fuite doit être surveillée et enregistrée lors de l’exécution d’injections dans l’huile afin de corréler cela avec les résultats expérimentaux.

Les granulés à libération lente sont préférables aux injections sous-cutanées, car ils sont rentables et simples à fabriquer en interne. Cependant, ils nécessitent plusieurs étapes de nuit, ce qui devrait être pris en compte lors de la planification des délais expérimentaux. Ces pastilles sécrètent environ 500 μg par jour (tel qu’évalué au cours d’une incubation temporelle dans un milieu de culture cellulaire et d’une progestérone ELISA subséquente). Il convient de noter qu’il s’agit d’une concentration inférieure par rapport aux injections sous-cutanées quotidiennes décrites ci-dessus, ce qui est dû à la constance dans l’administration de progestérone de la pastille. Comme mentionné ci-dessus, les injections d’huile peuvent s’échapper du site d’injection, réduisant ainsi la concentration globale délivrée. Dans des études antérieures, ces pastilles n’ont été actives in vivo que jusqu’à 10 jours après leur insertion chirurgicale. Par conséquent, dans les études sur la grossesse, il n’est pas clair s’il peut être nécessaire d’insérer une deuxième pastille au milieu de la gestation ou si le placenta pourrait fournir un soutien endocrinien suffisant pour la grossesse à ce stade. Ces pastilles sont donc optimales pour les modèles de grossesse à court terme, y compris le protocole de décidualisation artificielle présenté ici, ainsi que pour les études de grossesse jusqu’à 10 jours après le transfert embryonnaire. Bien que les granulés à libération lente annulent la nécessité de manipuler et d’injecter quotidiennement les animaux, certaines injections d’œstrogènes à faible dose sont toujours nécessaires pour équilibrer la boucle de rétroaction des récepteurs de la progestérone. Cette stratégie a été utilisée précédemment20,21.

Enfin, les minipompes osmotiques sont la méthode d’administration d’hormones la plus précise et sont disponibles dans le commerce, mais elles sont l’option la plus chère. Les minipompes osmotiques peuvent fournir une concentration définie d’hormones par jour jusqu’à 28 jours, selon le modèle sélectionné. Semblable aux granulés à libération lente, bien que les mini-pompes osmotiques évitent la manipulation quotidienne des animaux, certaines injections d’œstrogènes à faible dose sont toujours nécessaires.

Le protocole de décidualisation artificielle décrit ici permet l’étude d’un jalon précoce de la grossesse indépendamment de l’influence ovarienne et embryonnaire. Alors que les humains subissent une décidualisation à chaque cycle menstruel, les rongeurs ne décidualisent que pendant l’établissement de la grossesse. Ainsi, ce modèle a une immense valeur pour étudier les étapes de la grossesse de type humain dans un modèle de rongeur manipulable. La procédure détaillée ici est relativement non invasive, car elle utilise un dispositif de transfert d’embryons non chirurgical (NSET) pour administrer l’huile de sésame directement dans la corne utérine via le vagin et le col de l’utérus. Bien que cette procédure soit moins invasive que d’autres méthodologies, elle peut devenir assez coûteuse lors de l’utilisation de NSET commerciaux. En comparaison, d’autres modèles publiés de décidualisation artificielle nécessitent une intervention chirurgicale pour effectuer des injections intra-utérines d’huile17. Cela nécessite une configuration chirurgicale similaire à celle décrite à la section 1 et aux étapes 2.1-2.11. Cependant, chez les animaux qui ont déjà été ovariectomisés, il peut être plus difficile d’identifier et d’exposer la corne utérine. Il peut également y avoir des adhérences formées à partir de l’intervention chirurgicale précédente pour l’ovariectomie. Ainsi, bien qu’il puisse être plus rentable d’effectuer des injections intra-utérines chirurgicales pour induire la décidualisation, le temps chirurgical et anesthésique est considérablement plus long que l’alternative consistant à utiliser des NSET. Il existe des protocoles établis pour les solutions de rechange fabriquées à l’interne22 aux NSET disponibles dans le commerce, qui sont beaucoup plus rentables.

Bien que la procédure de transfert d’embryons soit décrite ici, nous avons déjà publié ce modèle et ses taux de réussite sur différentes souches de souris14. De plus, alors que la méthode de transfert d’embryons décrite ici utilise une approche chirurgicale, les NSET pourraient également être intégrées dans cette procédure.

Les orientations futures dans ce domaine devraient inclure des études axées sur les contributions utérines spécifiques à l’établissement et au maintien de la grossesse. Ces connaissances sont essentielles pour approfondir notre compréhension de l’infertilité idiopathique, de l’échec de l’implantation et des complications de la grossesse. L’élargissement de nos connaissances dans ces domaines est également fondamental pour améliorer les résultats cliniques pour les patientes de FIV/ICSI, ainsi que notre compréhension de la grossesse en tant que processus biologique.

En conclusion, OVX est une procédure simple qui peut être intégrée dans des modèles animaux pour étudier les contributions utérines à la grossesse et à la fertilité. À l’avenir, les modèles bénéficieront de l’intégration d’OVX et de l’administration d’hormones exogènes afin que des comparaisons puissent être faites entre les contributions spécifiques à l’ovaire et à l’utérus à la fertilité et à la grossesse.

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Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier ou autre concurrent.

Acknowledgments

Ce travail a été rendu possible grâce au soutien de l’infrastructure opérationnelle du gouvernement de l’État de Victoria et à l’IRIRIISS du Conseil national de la santé et de la recherche médicale (NHMRC) du gouvernement australien. Ce travail a été soutenu par la subvention d’accès à la plateforme de la Faculté de médecine, des soins infirmiers et des sciences de la santé de l’Université Monash à A.L.W. (Winship-PAG18-0343) pour accéder à la plate-forme Monash Reproductive Services. A.L.W. est soutenu par le financement DECRA DE21010037 de l’Australian Research Council (ARC). J.N.H. et L.R.A. sont soutenus par une bourse du programme de formation à la recherche du gouvernement australien. L.R.A. est soutenu par une bourse d’excellence Monash. K.J.H. est soutenu par une bourse ARC Future FT190100265.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ALZET 1002 mini osmotic pumps BioScientific 1002 Delivers 0.25 µL/h for 14 days. Use for section 7 (Experimental procedure - Embryo transfer).
ALZET 1003D mini osmotic pumps BioScientific 1003D Delivers 1 µL/h for 14 days. Use for section 8 (Experimental procedure - Artificial decidualization).
ALZET Reflex 7 mm clips BioScientific 0009971 Either Reflex clips or Michel clips can be used for wound closure, depending on preference
ALZET Reflex clip applicator BioScientific 0009974 Either Reflex clips or Michel clips can be used for wound closure, depending on preference
ALZET Reflex clip remover BioScientific 0009976 Either Reflex clips or Michel clips can be used for wound closure, depending on preference
Bupivicaine injection Pfizer NA Stock 0.5%. Use at 0.05% in saline
Estradiol Sigma E8875
Meloxicam Ilium NA Active constituent 0.5 mg/mL. Use 3.5 mL per 400 mL cage water bottle, or as your institution's vet prescribes.
Michel clips Daniels NS-000242
Multi purpose sealant Dow Corning 732
Non-surgical embryo transfer (NSET) device ParaTechs 60010 Contains 6 mm speculum. Single use only.
Progesterone Sigma P0130 Soluble in ethanol. Use for  section 3 (Hormone preparation - subcutaneous injection) and  section 4 (Hormone preparation - slow-release pellets)
Progesterone Sigma P7556 Soluble in water. Use for section 5 (Hormone preparation - osmotic mini pumps)
Refresh eye ointment Allergan NA 42.5% w/v liquid paraffin, 57.3% w/v soft white paraffin
Rimadyl Carprofen Zoetis NA Stock 50 mg/mL. Use at 1 mg/ml (for 5 mg/kg dose)
Rubber tubing Dow Corning 508-008 Washed in 100% ethanol and cut into 1 cm pieces. Inside diameter 1.57 mm ±  0.23 mm; outside diamater 3.18 mm ± 0.23 mm; wall 0.81 mm.
Sesame oil Sigma S3547
Sofsilk Silk sutures size 3-0 Covidien GS-832

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Rétraction numéro 194 Fertilité grossesse utérus ovariectomie réceptivité décidualisation
Méthodes d’étude des contributions utérines à l’établissement de la grossesse dans un modèle murin ovariectomisé
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Griffiths, M. J., Higgins, J. N.,… More

Griffiths, M. J., Higgins, J. N., Cousins, F. L., Alesi, L. R., Winship, A. L., Hutt, K. J. Methods for Studying Uterine Contributions to Pregnancy Establishment in an Ovariectomized Mouse Model. J. Vis. Exp. (194), e64763, doi:10.3791/64763 (2023).

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