Summary
يصف هذا البروتوكول إجراء جراحيا لإنشاء كسر حاجز في عظم الفخذ للفئران ، والذي يتم تثبيته بسلك داخل النخاع ، لدراسات التئام الكسور.
Abstract
العظام لديها قدرة كبيرة على التجدد. ومع ذلك ، فإن التئام الكسور عملية معقدة ، واعتمادا على شدة الآفات والعمر والحالة الصحية العامة للمريض ، يمكن أن تحدث حالات فشل ، مما يؤدي إلى تأخر الاتحاد أو عدم الاتحاد. نظرا للعدد المتزايد من الكسور الناتجة عن الصدمات عالية الطاقة والشيخوخة ، هناك حاجة ماسة إلى تطوير استراتيجيات علاجية مبتكرة لتحسين إصلاح العظام بناء على مزيج من الخلايا الجذعية الهيكلية / الوسيطة / اللحمة اللحمية والمواد الحيوية المحاكية الحيوية. تحقيقا لهذه الغاية ، يعد استخدام النماذج الحيوانية الموثوقة أمرا أساسيا لفهم الآليات الخلوية والجزيئية الرئيسية التي تحدد نتائج الشفاء بشكل أفضل. من بين جميع النماذج ، يعد الماوس هو نموذج البحث المفضل لأنه يقدم مجموعة متنوعة من السلالات والكواشف المعدلة وراثيا للتحليل التجريبي. ومع ذلك ، قد يكون إنشاء كسور في الفئران تحديا تقنيا بسبب صغر حجمها. لذلك ، تهدف هذه المقالة إلى توضيح إجراءات التأسيس الجراحي لكسر عظم الفخذ الحجابي في الفئران ، والذي يتم تثبيته بسلك داخل النخاع ويشبه عملية إصلاح العظام الأكثر شيوعا ، من خلال تكوين الكالس الغضروفي.
Introduction
الهيكل العظمي هو عضو حيوي ومتعدد الاستخدامات وظيفيا. تمكن عظام الهيكل العظمي من وضع الجسم وحركته ، وتحمي الأعضاء الداخلية ، وتنتج هرمونات تدمج الاستجابات الفسيولوجية ، وهي موقع تكون الدم وتخزين المعادن1. في حالة كسرها ، تتمتع العظام بقدرة ملحوظة على التجدد واستعادة شكلها ووظيفتها قبل الإصابة بالكامل. تبدأ عملية الشفاء بتكوين ورم دموي واستجابة التهابية ، مما يؤدي إلى تنشيط وتكثيف الخلايا الجذعية / السلفية الهيكلية من السمحاق والإندوستيريوم ونخاع العظم وتمايزها اللاحق لتشكيل الكالس الغضروفي الرخو. ثم يحدث سد النهايات المكسورة من خلال عملية تشبه تكوين العظم الغضروفي الداخلي ، حيث تتوسع السقالة الغضروفية ثم تتمعدن ، وتشكل الكالس العظمي الصلب. أخيرا ، يتم إعادة تشكيل الكالس الصلب تدريجيا بواسطة الخلايا الآكلة للعظم وبانيات العظم لاستعادة بنية العظام الأصلية 2,3.
على الرغم من أن عملية التئام الكسور قوية إلى حد ما ، إلا أنها تنطوي على تلخيص معقد للأحداث وتتأثر بشكل كبير بالعديد من العوامل الفردية ، بما في ذلك الحالة الصحية العامة والعمر والجنس للمريض ، بالإضافة إلى عوامل الإصابة ، مثل طريقة التثبيت الميكانيكي للعظم المكسور ، وحدوث العدوى ، وشدة إصابة الأنسجة الرخوة المحيطة4 ، 5,6. لذلك ، فإن الفشل شائع ، مما يؤدي إلى تطوير عدم الاتحاد ، مما يؤثر بشكل كبير على إعادة تأهيل المريض ونوعية الحياة 7,8. نظرا للعدد المتزايد من الكسور نتيجة للصدمات عالية الطاقة والشيخوخة ، فضلا عن ارتفاع تكاليف العلاج ، أصبحت الكسور غير النقابية عبئا على النظم الصحية في جميع أنحاء العالم 9,10. يسلط هذا العبء المتزايد الضوء على الحاجة الملحة لاستراتيجيات علاجية مبتكرة لتحسين إصلاح العظام11,12 بناء على مزيج من الخلايا الجذعية الهيكلية / الوسيطة / اللحمية والمواد الحيوية للمحاكاة الحيوية13,14.
سعيا لتحقيق هذا الهدف ، تم استخدام النماذج الحيوانية على نطاق واسع في الدراسات التي تهدف إلى فهم البيولوجيا الأساسية لآليات التئام الكسور وفي الدراسات قبل السريرية لإثبات المفهوم التي تهدف إلى وضع استراتيجيات علاجية جديدة لتعزيز إصلاح العظام15،16،17. تعتبر النماذج الحيوانية الصغيرة ، مثل الفأر ، ممتازة لدراسات التئام الكسور بسبب التوافر الواسع للسلالات والكواشف المعدلة وراثيا للتحليلات التجريبية وتكاليف صيانتها المنخفضة. بالإضافة إلى ذلك ، تتمتع الفئران بدورة زمنية سريعة للشفاء ، مما يسمح بالتحليل الزمني لجميع مراحل عملية الإصلاح15. ومع ذلك ، فإن صغر حجم يمكن أن يشكل تحديات للإنتاج الجراحي للكسور مع أنماط التثبيت مماثلة لتلك المطبقة في البشر. يصف هذا البروتوكول نموذجا بسيطا ومنخفض التكلفة لالتئام الكسور في الفئران باستخدام قطع عظم الفخذ المفتوح المستقر بسلك داخل النخاع ، والذي يشبه عملية إصلاح العظام الأكثر شيوعا ، من خلال تكوين الكالس الغضروفي ، ويمكن استخدامه في كل من التحقيقات الأساسية والانتقالية التي تتطلب الوصول إلى موقع الكسر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع التجارب من قبل لجنة استخدام ورعايتها التابعة لمركز العلوم الصحية بجامعة ريو دي جانيرو الفيدرالية (رقم البروتوكول 101/21). تم استخدام ذكور Balb / c الفئران في عمر 10-12 أسبوعا (25-30 جم من وزن الجسم) في هذه الدراسة. تستغرق العملية الجراحية حوالي 15-20 دقيقة لكل فأر. قبل كل إجراء ، يجب تنظيم الأدوات المطلوبة (المدرجة في جدول المواد) على مجال جراحي معقم يغطي طاولة العمليات (الشكل 1 أ). يجب تعقيم الأدوات الجراحية المعدنية في مظاريف ذاتية الختم عند 123 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. يجب شراء العناصر التي تستخدم لمرة واحدة ، مثل الإبر ومنصات الشاش ، معقمة.
1. إعداد
- تخدير الفأر وإجراء التسكين وفقا للنظام الموصى به من قبل الطبيب البيطري المعتمد من قبل البرنامج المؤسسي لرعاية واستخدام.
ملاحظة: إذا كان ذلك متاحا ، يفضل إجراء التخدير بالاستنشاق. يمكن العثور على وصف لبروتوكول التخدير بالاستنشاق في تقرير Ewald et al.18. ومع ذلك ، إذا تم إنتاج الكسر لدراسات علم المناعة العظمية ، فيجب تجنب هذا النوع من التخدير ، حيث تشير الأدلة إلى أن العديد من أدوية التخدير المتطايرة ، بما في ذلك الأيزوفلوران ، تؤثر على نشاط كل من الخلايا المناعية الفطرية والتكيفية19,20. - بمجرد أن يصبح الفأر غير متحرك ، احلق الساق اليسرى ، ثم انقله إلى طاولة الجراحة على وسادة تدفئة دافئة (انظر جدول المواد) عند 37 درجة مئوية مغطاة بستارة جراحية معقمة.
- قم بإجراء غسل مطهر لمنطقة الشق عن طريق فرك الجلد بإسفنجة بوفيدون يود بنسبة 10٪. يجب أن يبدأ التطهير على طول خط الشق ويمتد إلى الخارج في نمط دائري. قم بتجفيف المنطقة المفركة باستخدام وسادات شاش معقمة ، واغسلها بنسبة 70٪ من الإيثانول ، وجففها مرة أخرى باستخدام وسادة شاش معقمة. كرر هذا الإجراء ثلاث مرات.
- ضع الماوس في وضع الاستلقاء الجانبي الأيمن ، وشل حركة الكفوف بشريط جراحي (الشكل 1 ج).
- قم بثني الماوس بحيث تكون منطقة الشق مرئية فقط (الشكل 1 د).
2. الإجراء الجراحي
- أثناء العملية الجراحية ، تحقق باستمرار من أن الفأر يتنفس وقدم قطرات للعين في عينيه لتجنب الجفاف ومنع الفأر من أن يصبح أعمى.
ملاحظة: عادة ما يستغرق الإجراء الجراحي بأكمله ~ 15-20 دقيقة عندما يقوم به جراح مدرب. لذلك ، يجب أن يكون تطبيق قطرات العين مرة واحدة في بداية الإجراء كافيا. إذا بدأ الإجراء في أن يصبح أطول ، يمكن إجراء تطبيقات إضافية كلما تم تحديد أن العيون بدأت في الجفاف. - قبل الشروع في الشق ، قم بتقييم عمق التخدير عن طريق الضغط على الذيل للتحقق من منعكس استجابة الألم وفحص معدل التنفس بصريا (حساب عدد الحركات الصدرية في الدقيقة)21. تحت التخدير الأمثل ، يجب ألا يستجيب الماوس لقرصة الذيل ، ويجب أن يكون معدل التنفس حوالي 55-65 نفسا / دقيقة21.
- قم بعمل شق جلدي جانبي شبه رضفي بطول 1 سم بشفرة مشرط (رقم 11 ، انظر جدول المواد) ، بدءا من مستوى الحدبة الظنبوبية ويمتد إلى مستوى الرضفة ثم ، لمسافة متساوية ، نحو عظم الفخذ البعيد (الشكل 1E).
- باستخدام مقص حاد النهاية ، قم بتشريح اللفافة تحت الجلد حول خط الشق لفضح اللفافة لاتا ، والأوعية الجانبية ، وعضلات العضلة ذات الرأسين الفخذية22.
- باستخدام شفرة المشرط رقم 11 ، قم بعمل شق آخر في اللفافة لاتا مشابه للشق المصنوع في الجلد ، بدءا من مستوى الحدبة الظنبوبية ويمتد على طول العضلة ذات الرأسين الفخذية حتى مستوى عظم الفخذ البعيد ، لفتح الكبسولة المفصلية والوصول إلى مفصل الركبة (الشكل 1F ، G).
- قم بإجراء خلع إنسي للرضفة عن طريق وضع طرف ملقط دقيق مسنن مستقيم (انظر جدول المواد) تحته ودفعه إلى الجانب مع الأربطة الرضفية ورباعية الرؤوس ، وبالتالي كشف لقمة عظم الفخذ (الشكل 1H).
- أمسك عظم الفخذ بملقط طرف مسنن ، وثني الركبة بزاوية 90 درجة ، وقم بثقب القناة داخل النخاع يدويا لعظم الفخذ من خلال الحفرة بين اللقمتين بإبرة تحت الجلد 26 جم (الشكل 1I ، J).
- مع الحفاظ على ثني الركبة عند 90 درجة ، أدخل جزءا من 1.0 سم من سلك قضيب من الفولاذ المقاوم للصدأ 0.016 بوصة (0.40 مم) (الشكل 1K ، إدراج) (انظر جدول المواد) من خلال الفتحة في القناة النخاعية لعظم الفخذ باتجاه المدور الكبير (الشكل 1K).
ملاحظة: يعد الحفاظ على ثني الركبة عند 90 درجة أمرا بالغ الأهمية لإدخال السلك بشكل صحيح في القناة النخاعية. سيؤدي عدم القيام بذلك إلى تسرب السلك من العظم وآفات الأنسجة الرخوة المحيطة. - اضبط الطرف البعيد المثني مسبقا للسلك باستخدام ملقط ذو طرف مسنن مستقيم لتثبيته بإحكام في اللقمة الجانبية (الشكل 1L). بالإضافة إلى تثبيت السلك في مكانه ، فإن الطرف المثني سيسهل إزالة السلك بعد الوفاة.
- افصل بين الأوعية الدموية الجانبية وعضلات العضلة ذات الرأسين الفخذية من خلال تشريح نهاية حادة باستخدام ملقط مسنن للوصول إلى الحجاب الحاجز البعيد لعظم الفخذ (الشكل 1M).
- أدخل مقصا تشريحيا حول عظم الفخذ بزاوية 90 درجة تقريبا ، وقم بإجراء قطع العظم القشري الكامل برفق (الشكل 1N).
ملاحظة: يتم قطع عظم الفخذ الفئران بسهولة. الامتناع عن استخدام القوة المفرطة أثناء قطع العظم لتجنب ثني السلك داخل النخاع وكسر واسع النطاق. - أعد وضع العضلات والرضفة عن طريق دفع طرف ملقط دقيق مسنن مستقيم فوق منطقة اللقمة اللقيمة.
- أغلق اللفافة العضلية بخياطة قابلة للامتصاص 6-0 ثم الجلد باستخدام خياطة نايلون 6-0 (انظر جدول المواد) ، كلاهما بطريقة بسيطة متقطعة (الشكل 1O).
- نقل الماوس إلى قفص نظيف فردي للانتعاش. بمجرد الاستيقاظ ، يجب أن يكون الماوس قادرا على التحرك بحرية مع تحمل الوزن غير المقيد.
- في الأيام التالية بعد الجراحة ، قم بإجراء تسكين الألم وفقا للنظام الموصى به من قبل الطبيب البيطري المعتمد من قبل البرنامج المؤسسي لرعاية واستخدامها.
3. التصوير بالأشعة السينية
- تخدير الماوس كما هو موضح في الخطوة 1.1.
ملاحظة: إذا تم إجراء التصوير الشعاعي مباشرة بعد العملية الجراحية وكان الفأر لا يزال تحت التخدير الأمثل (الخطوة 2.2) ، فليس من الضروري إجراء هذه الخطوة. - للحصول على رؤية جانبية نظيفة لعظم الفخذ المكسور ، ضع الماوس في وضع الاستلقاء الظهري ، واسحب الطرف الخلفي الذي تم تشغيله قليلا إلى الجانب.
- شل الكفوف بشريط جراحي.
- إجراء التصوير الشعاعي وفقا لبروتوكول المعدات المتاحة.
ملاحظة: في هذه الدراسة ، تم استخدام مولد الأشعة السينية الرقمي للأسنان مع المعلمات التالية: جهد 70 كيلو فولت ، تيار 7 مللي أمبير ، ووقت تعرض 0.2 ثانية.
4. معالجة الأنسجة وتلطيخ H& E
- القتل الرحيم للفئران بجرعة زائدة داخل الصفاق من التخدير (يرجى الرجوع إلى النظام الموصى به من قبل الطبيب البيطري المعتمد من قبل البرنامج المؤسسي لرعاية واستخدامها). بعد التحقق من عمق التخدير مع قرصة الذيل ، قم بإجراء خلع عنق الرحم. بعد ذلك ، اجمع العظم المكسور ، وقم بإزالة الأنسجة العضلية المحيطة الزائدة23 ، وقم بتثبيت العظم في محلول فورمالين مخزن بنسبة 10٪ (درجة الحموضة 7.4) لمدة 3 أيام.
- ضع عينات العظام في أشرطة الأنسجة الموسومة (انظر جدول المواد) ، واغمرها في 10٪ EDTA في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، درجة الحموضة 7.4 ، لمدة 14 يوما لإزالة الكلس. قم بتغيير محلول إزالة الكلس مرتين في الأسبوع.
- تجفيف العينات في سلسلة من المحاليل لزيادة تركيزات الإيثانول (70٪ ، 80٪ ، 90٪ ، 100٪ ، 100٪) لمدة 1 ساعة لكل منهما.
- امسح العينات في حمامين متتاليين من الزيلين لمدة 30 دقيقة لكل منهما.
- لتسلل الشمع ، اغمر العينات في حمامين متتاليين من البارافين عند 60 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، قم بتضمين العينات في كتل للتقسيم24.
ملاحظة: لعرض الكالس بشكل أفضل ، قم بتضمين العظم بمحوره الطويل في الوضع الأفقي للسماح بإجراء تخفيضات طولية. - قطع الأنسجة إلى أقسام بسمك 4 ميكرومتر مع ميكروتوم (انظر جدول المواد).
- قم بتعويم الأقسام في حمام مائي بدرجة حرارة 56 درجة مئوية ، وقم بتركيب الأقسام على شرائح نسيجية (انظر جدول المواد).
- بالنسبة لتلطيخ H&E ، قم بإزالة الشرائح في ثلاثة حمامات متتالية من الزيلين لمدة 5 دقائق ، وأعد ترطيب الأنسجة في سلسلة من المحاليل لتقليل تركيزات الإيثانول (95٪ و 80٪ و 70٪) لمدة 5 دقائق.
- اشطف الشرائح بماء الصنبور لمدة 30 ثانية ، وقم بتلطيخ الشرائح باستخدام هاريس هيماتوكسيلين (انظر جدول المواد) لمدة 6 دقائق ، ثم اشطفها بماء الصنبور لمدة 30 ثانية أخرى.
- اغمر الشرائح في 1٪ حمض الهيدروكلوريك في الإيثانول لمدة 30 ثانية ثم في 70٪ إيثانول لمدة 30 ثانية.
- تلطخ مع eosin (انظر جدول المواد) لمدة 2 دقيقة ، وتغسل بماء الصنبور لمدة 30 ثانية.
- جفف الشرائح بالإيثانول (70٪ و 80٪ و 95٪ لمدة 5 دقائق) ، وقم بتوضيحها باستخدام حمامين من الزيلين لمدة 5 دقائق لكل منهما.
- للتركيب ، قم بالتنقيط قطرة أو قطرتين من وسيط التركيب (انظر جدول المواد) على كل شريحة ، وقم بتغطية الشريحة بغطاء نظيف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الطريقة الأكثر بساطة وفورية لتقييم نجاح العملية الجراحية في إنتاج الكسر هي التصوير بالأشعة السينية. يمكن إجراء الصور الشعاعية مباشرة بعد الجراحة ، مع بقاء الفأر تحت التخدير ، وبعد ذلك 7 أيام و 14 يوما و 21 يوما بعد الكسر لتقييم تكوين الكالس وتقدمه. أنماط الكسر المقبولة هي تلك التي تتمزق فيها القشرة بالكامل ، ويتم وضع الأسلاك بشكل صحيح داخل القناة النخاعية ، وتكون خطوط الكسر مستعرضة (بزاوية 90 درجة إلى محور العظم) ، مائل (نمط منحني أو مائل بدون إزاحة شظية) ، أو مائل قصير (حوالي 30 درجة بالنسبة لمحور العظم) (الشكل 2A-D). هذه الأنماط مقبولة لأنها ستتقدم جميعها للإصلاح من خلال تكوين العظام داخل الغضروف (أي مع تكوين الكالس) إذا تم محاذاة شظايا العظام بشكل صحيح (تقليل) ، وبالتالي تحقيق الهدف الرئيسي للنموذج. لذلك ، فإن الكسور غير المقبولة هي فقط تلك التي لها تقاطعات واسعة (شظايا عظمية صغيرة متعددة) ، مع تقصير الطرف نتيجة لسوء المحاذاة ، ومع أسلاك في غير محلها (الشكل 3). يجب استبعاد ذات أنماط الكسور غير المقبولة من الدراسة. مع مرور الوقت ، يجب ملاحظة الكالس القوي والمرئي في موقع الكسر (الشكل 4).
بالإضافة إلى ذلك ، يمكن إجراء الفحص النسيجي في 7 أيام و 14 يوما و 21 يوما بعد الكسر لتقييم تكوين الأنسجة داخل المنطقة المكسورة. نظرا لأن التثبيت بالأسلاك داخل النخاع يسمح بدرجة معينة من حركة شظايا العظام ، فإن عملية التجدد تتبع آلية التعظم داخل الغضروف ، حيث تظهر مناطق قوية من الغضروف الزجاجي حول خط الكسر في اليوم 7 (الشكل 5 أ ، ب). في اليوم 14 ، لوحظت جبهات التعظم حول منطقة الغضروف ، وشكلت عظما تربيقيا وتجاويف مملوءة بنخاع العظم المعاد تشكيله (الشكل 5C ، D). أخيرا ، في اليوم 21 ، يتم استبدال مناطق الغضاريف بالكامل تقريبا بالعظم التربيقي ، مما يشير إلى نجاح الجسور العظمية (الشكل 5E ، F) وصلاحية النموذج لدراسات التئام الكسور.
الشكل 1: صور مجهرية توضح خطوات الإجراء الجراحي لإنتاج كسور عظم الفخذ الحجابي المثبتة بسلك داخل النخاع في الفأر. (أ) تنظيم الأدوات الجراحية المعقمة على طاولة العمليات. ب: حقن التخدير داخل الصفاق. (ج) وضع الفأر في وضع الاستلقاء الجانبي وتثبيت الكفوف. (د) لف الفأرة ، وترك المنطقة التي سيتم تشغيلها مكشوفة فقط. ه: الشق الجلدي الجانبي شبه الرضفي. (و ، ز) مناظر لشق اللفافة لاتا. (H) خلع الرضفة الإنسي ، مما يكشف منطقة اللقمة الفخذية. (I) وضع الإبرة في الحفرة بين اللقمتين. (ي) انثقاب القناة النخاعية الفخذية. ك: إدخال السلك داخل النخاع من خلال فتحة الفخذ. (L) ضبط الطرف المثني للسلك في اللقمة الجانبية. م: فصل حاد النهاية للعضلات المحيطة. ن: قطع العظم الفخذي القشري الكامل. (س) إغلاق الأنسجة الرخوة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: صور شعاعية تمثيلية لأنماط الكسر المقبولة. (أ ، ب) كسور الحجاب الحاجز المستعرضة (خطوط الكسر بزاوية 90 درجة لمحور العظم). (ج) الكسر المائل القصير (خط الكسر أقل من 30 درجة بالنسبة لمحور العظم). د: كسر مجزأ قابل للاختزال (تظهر شظايا صغيرة قليلة من العظم، لكن المحاذاة التشريحية للعظم تبقى). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: صور شعاعية تمثيلية لأسلاك موضوعة بشكل غير صحيح. (أ) في هذا الفأر، لا يوجد السلك داخل القناة النخاعية لجزء عظم الفخذ القريب، مما يؤدي إلى تثبيت العظم المكسور تثبيتا غير صحيح. (ب) في هذه الحالة، لم يمر السلك عبر أي جزء من العظم، والعظم المكسور غير محاذ تماما. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: الكالس المرئي في موقع الكسر. صور شعاعية تمثيلية لنسيج الكسر في (أ) اليوم 14 و (ب) اليوم 21 بعد الجراحة ، مما يدل على أن عملية التجدد للنموذج تتبع المسار غير المباشر (داخل الغضروف). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: التحليل النسيجي لنسيج الكسر. صور تمثيلية للعظام المكسورة في (A ، B) اليوم 7 ، (C ، D) اليوم 14 ، و (E ، F) اليوم 21 بعد الجراحة ملطخة ب H &E. لاحظ تطور الكالس. يظهر الكالس في البداية مع مناطق واسعة من الغضروف الزجاجي حول خط الكسر (إدراج في A ، مكبرة في B) ، ثم تعمل هذه المناطق كقوالب لتشكيل العظم التربيقي (إدراج في C ، مكبرة في D) ، وتبلغ العملية ذروتها في الاستبدال الكامل للغضروف بالعظام ، وبالتالي ، سد العظام (أدخل في E ، مكبرة في F). قضبان المقياس: (A ، C ، D) 500 ميكرومتر ؛ (ب ، د ، و) 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
مع زيادة عدد الكسور في جميع أنحاء العالم9،10،25 ، أصبحت العلاجات المبتكرة لعدم الاتحاد ملحة بشكل متزايد. نظرا لأن التئام الكسور ينطوي على جمع معقد ومنظم بإحكام للأحداث التي تحدث على نطاق زمنيطويل 3 ، فإن استخدام نماذج حيوانية صالحة أمر أساسي لتحسين فهمنا للآليات التي تحدد نجاح إصلاح العظام واختيار الأدوية الفعالة والبروتوكولات العلاجية16،17.
في الفأر ، يمكن استخدام كل من عظم الفخذ والساق لدراسات التئام كسور العظام الطويلة. في هذا النموذج ، تم اختيار عظم الفخذ بدلا من الساق لأنه عظم مستقيم بقطر أكبر وتغطية أفضل للأنسجة الرخوة. من ناحية أخرى ، فإن الحجاب الحاجز في قصبة الفأر منحني ، ويتناقص عياره تدريجيا على طول النهاية البعيدة ، مما يعقد إدخال أجهزة التثبيت داخل النخاع26. لذلك ، فإن خصائص عظم الفخذ تجعله مثاليا للنماذج التي يقصد بها التثبيت داخل النخاع. فيما يتعلق بالجنس ، تم استخدام ذكور الفئران ، حيث توجد أدلة على أن الذكور يظهرون التئام أسرع للكسر مع تكوين الكالس الغضروفي الأكثر بروزا مقارنة بالإناث27. ومع ذلك ، إذا لزم الأمر ، يمكن تكييف هذه التقنية بسهولة مع الإناث ببساطة عن طريق ضبط حجم السلك داخل النخاع ليناسب الطول الأصغر قليلا لعظم الفخذ الأنثوي.
بالمقارنة مع نماذج الكسر المغلقة التي تستخدم آلية الانحناء ثلاثية النقاط مع المقصلة28 ، فإن نموذج الجراحة المفتوحة الموصوف هنا مفيد أيضا لأنه يكشف موقع الكسر ، مما يسمح للباحث برؤية الكسر الذي يتم إنتاجه بصريا. يساعد هذا التصور على تجنب الأخطاء الفنية التي تؤدي إلى أنماط الكسر غير المقبولة التالية: إزاحة شظية شديدة ، والتي لا تسمح بإعادة التنظيم التشريحي للعظم (الكسور غير القابلة للاختزال) ؛ تجزئة واسعة النطاق للعظم إلى عدة قطع صغيرة (comminution) ، وهي حالة قد تضعف عملية الإصلاح ؛ و / أو وضع أجهزة التثبيت في غير موضعها. نظرا لأن الكسر ناتج عن قطع العظم اللطيف في هذا النموذج ، فلا يتم ملاحظة إزاحة الشظايا و / أو التبادل بشكل عام.
ومع ذلك ، فإن التقنية محدودة بمعنى أنها تتطلب مهارات جراحية تقنية أكبر ومعرفة بتشريح الفأر مقارنة بالطرق الأخرى. بالإضافة إلى ذلك ، فإن صغر حجم الماوس يجعل التلاعب أكثر صعوبة مقارنة بالفئران أو النماذج الحيوانية الكبيرة. بمجرد التغلب على هذه القيود بالتدريب ، فإن معدل النجاح في إنتاج الكسور المقبولة يقارب 100٪ ، مما يقلل من عدد عمليات إزالة من الدراسة.
علاوة على ذلك ، يسمح نموذج كسر الجراحة المفتوحة بالتطبيق المحلي للعوامل العلاجية ، مثل الخلايا الجذعية / السلفية ، والمواد الحيوية ، و / أو الأدوية الصيدلانية ، والتي لن يكون من الممكن تطبيقها باستخدام الولادة عن طريق الجلد أو الجهازية26. أخيرا ، يعد التثبيت بالأجهزة داخل النخاع أسهل وأرخص وأكثر قابلية للتخصيص من الأجهزة اللوحية والأجهزة الخارجية ويحاكي الإستراتيجية السريرية الأكثر استخداما لعلاج كسور العظام الطويلة29. لذلك ، يمثل النموذج الموصوف هنا نموذجا منخفض التكلفة لدراسة التئام الكسور ، سواء في الإعدادات الأساسية أو الانتقالية ، مما يعني أن هذه الدراسة لا تساهم فقط في زيادة المعرفة ببيولوجيا التئام الكسور ولكن أيضا في تطوير استراتيجيات علاجية جديدة لإصلاح العظام.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس للمؤلفين مصالح مالية متضاربة.
Acknowledgments
تم تمويل هذا العمل من قبل مؤسسة كارلوس شاغاس فيلهو لدعم البحوث في ولاية ريو دي جانيرو (FAPERJ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol 70º | Merck | 109-56-8 | Or any general available supplier |
| Canada balsam (mounting medium) | Merck | C1795 | Or any general available supplier |
| Cefazoline | ABL | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Coverslip | Merck | CSL284525 | Or any general available supplier |
| Dental X-Ray Generator | Focus | - | Sold by Instrumentarium Dental Inc. |
| DEPC water | Merck | W4502 | Or any general available supplier |
| Dissecting Scissor | ABC Instrumentos | 0327 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| EDTA | Vetec | 60REAVET014340 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Eosin solution | Laborclin | EA-65 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Ethanol P.A | Vetec | 60REAVET012053 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Gauze pads | Cremer | Not applicable | Or any general available supplier |
| Harris Hematoxylin Solution | Laborclin | 620503 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Heating pad | Tonkey Electrical Technology | E114273 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Histological slides | Merck | CSL294875X25 | Or any general available supplier |
| Histology cassettes | Merck | H0542-1CS | Or any general available supplier |
| Hydrochloric acid - 37% | Merck | 258148 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Insulin syringe | BD | 324918 | Or any general available supplier |
| Iodopovidone sponge | Rioquímica | 372106 | Or any general available supplier |
| Ketamine hydrochloride | Ceva | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Lacribel collyrium | Cristalia | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Microtome | Leica | 149AUTO00C1 | |
| Mouse Tooth Forceps Tweezer | ABC Instrumentos | 0164 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Needle 26 G | BD | 2239 | Or any general available supplier |
| Needle Holder | Golgran | 135-18 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Nonresorbable Nylon Suture thread nº 6 | Atramat | C1546-NT | Or any general available supplier |
| Paraffin | Exodo | 8002 - 74 - 2 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| PBS 1x | Lonza | BE17-516F | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Resorbable Nylon Suture thread nº 6 | Atramat | C1596-45B | Or any general available supplier |
| Rod Wire SS CrNi 0.016" | Orthometric | 56.50.2016 | |
| Scalpel nº 11 | Descarpak | 15782 | Or any general available supplier |
| Serrated Tip Tweezer | Quinelato | QC.404.12 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Shaver | Phillips | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Surgical tape | 3M | 2734 | Or any general available supplier |
| Surgical tnt field | Polarfix | 6153 | Or any general available supplier |
| Tramadol hydrochloride | Teuto | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Water bath for histology | Leica | HI1210 | |
| Xylazine hydrochloride | Ceva | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Xylene | Dinamica | 60READIN001105 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
References
- Florencio-Silva, R., Sasso, G. R., Sasso-Cerri, E., Simoes, M. J., Cerri, P. S. Biology of bone tissue: Structure, function, and factors that influence bone cells. BioMed Research International. 2015, 421746 (2015).
- Bahney, C. S., et al.
- Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: Mechanisms and interventions. Nature Reviews Rheumatology. 11 (1), 45-54 (2015).
- Perren, S. M. Fracture healing: Fracture healing understood as the result of a fascinating cascade of physical and biological interactions. Part II. Acta Chirurgiae Orthopaedicae et Traumatologiae Cechoslovaca. 82 (1), 13-21 (2015).
- Giannoudis, P. V., Krettek, C., Lowenberg, D. W., Tosounidis, T., Borrelli, J. Fracture healing adjuncts-The world's perspective on what works. Journal of Orthopaedic Trauma. 32, Suppl 1 43-47 (2018).
- Kates, S. L., et al. Outside the bone: What is happening systemically to influence fracture healing. Journal of Orthopaedic Trauma. 32, Suppl 1 33-36 (2018).
- Ding, Z. C., Lin, Y. K., Gan, Y. K., Tang, T. T.
- Calori, G. M., et al.
- Ekegren, C. L., Edwards, E. R., de Steiger, R., Gabbe, B. J. Incidence, costs and predictors of non-union, delayed union and mal-union following long bone fracture. Internation Journal of Environmental Research and Public Health. 15 (12), 2845 (2018).
- Aziziyeh, R., et al. The burden of osteoporosis in four Latin American countries: Brazil, Mexico, Colombia, and Argentina. Journal of Medical Economics. 22 (7), 638-644 (2019).
- Kostenuik, P., Mirza, F. M. Fracture healing physiology and the quest for therapies for delayed healing and nonunion. Journal of Orthopaedic Research. 35 (2), 213-223 (2017).
- Gomez-Barrena, E., et al. fracture healing: cell therapy in delayed unions and nonunions. Bone. 70, 93-101 (2015).
- Schlundt, C., et al. Clinical and research approaches to treat non-union fracture. Current Osteoporosis Reports. 16 (2), 155-168 (2018).
- Gomez-Barrena, E., et al. Feasibility and safety of treating non-unions in tibia, femur and humerus with autologous, expanded, bone marrow-derived mesenchymal stromal cells associated with biphasic calcium phosphate biomaterials in a multicentric, non-comparative trial. Biomaterials. 196, 100-108 (2018).
- Ryan, G., et al. Systemically impaired fracture healing in small animal research: A review of fracture repair models. Journal of Orthopedic Research. 39 (7), 1359-1367 (2021).
- Marmor, M. T., Dailey, H., Marcucio, R., Hunt, A. C. Biomedical research models in the science of fracture healing - Pitfalls & promises. Injury. 51 (10), 2118-2128 (2020).
- Schindeler, A., Mills, R. J., Bobyn, J. D., Little, D. G. Preclinical models for orthopedic research and bone tissue engineering. Journal of Orthopedic Research. 36 (3), 832-840 (2018).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5563 (2011).
- Stollings, L. M., et al. Immune modulation by volatile anesthetics. Anesthesiology. 125 (2), 399-411 (2016).
- Sedghi, S., Kutscher, H. L., Davidson, B. A., Knight, P. R.
- Tsukamoto, A., Serizawa, K., Sato, R., Yamazaki, J., Inomata, T. Vital signs monitoring during injectable and inhalant anesthesia in mice. Experimental Animals. 64 (1), 57-64 (2015).
- Komárek, V. Chapter 2.2. Gross anatomy. The Laboratory Mouse (Second Edition). Hedrich, H. J. , Academic Press. Cambridge, MA. 145-159 (2012).
- Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. Journal of Visualized Experiments. (110), e53936 (2016).
- An, Y. H., Moreira, P. L., Kang, Q. K., Gruber, H. E. Principles of embedding and common protocols. Handbook of Histology Methods for Bone and Cartilage. An, Y. H., Martin, K. L. , Humana Press. Totowa, NJ. 185-197 (2003).
- Enninghorst, N., McDougall, D., Evans, J. A., Sisak, K., Balogh, Z. J. Population-based epidemiology of femur shaft fractures. Journal of Trauma and Acute Care Surgery. 74 (6), 1516-1520 (2013).
- Gunderson, Z. J., Campbell, Z. R., McKinley, T. O., Natoli, R. M., Kacena, M. A. A comprehensive review of mouse diaphyseal femur fracture models. Injury. 51 (7), 1439-1447 (2020).
- Haffner-Luntzer, M., Fischer, V., Ignatius, A. Differences in fracture healing between female and male C57BL/6J mice. Frontiers in Physiology. 12, 712494 (2021).
- Bonnarens, F., Einhorn, T. A. Production of a standard closed fracture in laboratory animal bone. Journal of Orthopaedic Research. 2 (1), 97-101 (1984).
- Streubel, P. N., Desai, P., Suk, M. Comparison of RIA and conventional reamed nailing for treatment of femur shaft fractures. Injury. 41, Suppl 2 51-56 (2010).
